INMUNOLOGA APLICADA

Tema 12: Tcnicas de deteccin de antgenos y anticuerpos

Interaccion Ag-Ac

Una de las primeras observaciones sobre la reaccin Ag-Ac es la capacidad de

los inmunocomplejos de precipitar cuando se alcanzan ciertas condiciones de
concentracin. Bsicamente la formacin de este precipitado refleja la formacin de
una red de inmunocomplejos estable (lattice), en la que los varios Acs comparten Ags
entrecruzndose. Esta red de gran tamao precipita. La precipitacin depende de
varios factores:

- De que el Ag tenga muchos determinantes antignicos (epitopos) o slo

uno (haptenos), los haptenos no son capaces de dar lugar a redes de ICs
de gran tamao.

- De la afinidad (intensidad de la unin entre antgenos y anticuerpos) y la

avidez (valencias) del Ac; los Acs IgM tienen 10 valencias de manera que
entrecruzan antgenos con mayor eficacia que las IgG.

- De la especie animal en que se producen los Acs. Para algunas especies

un antgeno puede comportarse como inmungeno dbil, generando
anticuerpos de baja afinidad.

- De la relacin entre concentracin de Ag y Acs (cintica de la reaccin Ag-

Ac), que es el parmetro ms importante.

CINETICA DE LA PRECIPITACION

Tambin es denominada cintica de la reaccin antgeno-anticuerpo. Si a una

concentracin fija de Ac le aadimos cantidades crecientes de Ag, inicialmente se
formarn ICs en pequea cantidad, la lattice no ser estable y el precipitado ser
pequeo (condiciones de exceso de Ac). Al aumentar la concentracin de Ag, los
Acs son eficazmente entrecruzados por mltiples Ags, formndose una red estable y
precipitando (zona de equivalencia). Si seguimos aumentando la concentracin de
Ag, cada Ac hipotticamente puede encontrar un Ag, no lo comparte, la red es
inestable y no se produce la precipitacin (condiciones de exceso de antgeno o
efecto prozona).

Las consecuencias directas de esta cintica son que los anticuerpos

monoclonales difcilmente darn lugar a reacciones de precipitacin, ya que todos
compiten por el mismo determinante antignico en las molculas de antgeno.

1. TECNICAS DE INMUNODIFUSIN

La reaccin de precipitacin no se lleva a cabo en un sistema lquido, ya que

sera muy poco sensible. Ags y Acs difunden en una matriz semislida de gran
porosidad que habitualmente es agar o agarosa. El agar estn formado por
polisacridos complejos derivados de algas, con la propiedad de fundir a unos 90C y
formar un gel al enfriarse por debajo de los 50C aproximadamente. Este gel es tan
poroso que hipotticamente no va a limitar el movimiento de las molculas en su seno

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en funcin del tamao (peso molecular de estas molculas). La formacin de
inmunocomplejos en el gel de agarosa se observa en forma de precipitados.

Existen numerosas modalidades de inmunodifusin:

a) Inmunodifisin doble: difunden Acs y Ags, en el lugar del gel en que se

produce la concentracin de equivalencia se forma un precipitado de ICs
visible macroscpicamente. Aparecen tantas lneas de precipitacin como
antgenos diferentes sean reconocidos en la mezcla de antgenos.

Puede ser cualitativa (tcnica de Ouchterlony), permitiendo tanto

determinar la presencia de un determinado antgeno en una mezcla de
antgenos o la presencia de anticuerpos frente a un antgeno en un suero
problema. La forma en que se cruzan las lneas de precipitacin de dos
sueros frente a una misma mezcla de antgenos nos indica si reconocen o
no el mismo antgeno.

Existen tres patrones tpicos:

- Identidad completa: forman un ngulo perfecto sin cruzarse. Reconocen el

mismo antgeno.
- No identidad: se cruzan completamente. Reconocen antgenos diferentes.
- Identidad parcial: se cruzan parcialmente. Uno de los sueros reconoce
determinantes que no estn presentes en el antgeno reconocido por el otro
suero, se trata de antgenos con reactividad cruzada, no del mismo
antgeno.

Esta tcnica tambin se utiliza de manera semicuauantitativa, haciendo

titulacin por dilucin lmite, por ejemplo, cuando queremos comprobar el
ttulo de anticuerpos de un antisuero.

b) Inmunodifusin radial: (anlisis de Mancini) la difusin no es doble, el Ac

est disuelto en la agarosa y slo difunde el Ag formando un gradiente de
concentracin a partir del pocillo. Donde se alcanza la equivalencia se
produce un halo de precipitacin. Cuando la difusin es completa (punto
final), el dimetro de este halo es directamente proporcional a la
concentracin del Ag que difunde.

Se trata de un anlisis cuantitativo porque podemos construir una curva de

calibracin con estndares de concentracin conocida (representando
dimetro del halo frente a concentracin), para determinar la concentracin
en muestras problema.

a. Modificacin de Fahei: La difusin se determina antes de que sea

completa (antes de 48 h), la correlacin en este caso es lineal si
tomamos el logaritmo de la concentracin en los estndares.
b. Sensibilidad de la tcnica de inmunodifusin radial: 10-50 g/ml.
c. Aplicaciones: Determinacin de niveles de protenas plasmticas.

Problemas asociados a esta tcnica:

- Si el estndar se construye con muestras normales (por ejemplo,

estndar con IgM de suero humano normal en una determinacin de
IgM) y los problemas contienen formas anormales de la protena (por

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 ejemplo, IgM monomrica o agregados de IgM pentamrica), la
concentracin estimada en el problema ser errnea (las propiedades
de difusin de estas molculas aberrantes son diferentes de las de la
molcula normal que se encuentra en el estndar).

- Otro problema es la posible existencia de Acs en el suero problema

frente a los propios Acs del antisuero que hemos disuelto con la
agarosa, que formarn precipitados.

2. TECNICAS ELECTROFORTICAS

Si en la ID las molculas difunden libremente, aqu se utiliza un campo elctrico

para dirigir Ags contra Acs= contrainmunoelectroforesis (CIE).

El medio se pone a un pH algo alcalino, los Ags estn mayoritariamente

cargados negativamente y se dirigen hacia el nodo, mientras que los Acs son neutros
o catinicos. En el gel hay grupos sulfato inmovilizados (polisacridos sulfatados),
neutralizados por cationes que se mueven hacia el ctodo (-) y arrastran agua por
smosis (electroendosmosis- EEO). El agua arrastra a su vez a las molculas neutras-
catinicas. De esta forma se encuentran Ags y Acs, acomplejndose y formando
precipitados.

Ventajas:
- Ms sensible que la DID.
- Ms rpida (aprox media hora frente a 20 horas).

Modalidades cuantitativas: rocket CIE, similar a DID, se forman precipitados de

longitud proporcional a la concentracin de Ag. Sensibilidad: detecta concentraciones
por debajo de los 20 g/ml.

3. TCNICAS DE AGLUTINACIN

En este caso los Acs forman puentes entre partculas recubiertas por Ags
aglutinndolas. Estas partculas pueden ser tanto hemates humanos o animales,
como partculas sintticas de ltex o gelatina.

Tipos:

- Aglutinacin directa: el Ag reconocido por los Acs es una sustancia propia

de las partculas aglutinadas, p ej grupo sanguneo ABO sobre los
hemates.

- Aglutinacin pasiva: las partculas son recubiertas con un Ag exgeno

frente al que queremos determinar la presencia/ausencia de Acs en una
muestra problema.

- Aglutinacin reversa: las partculas son recubiertas con Acs y aglutinan en

presencia del Ag, sirve para determinar la presencia de este Ag (p ej buscar
-HCG en orina en un test de embarazo). til para la deteccin de
molculas pequeas.

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 - Otras modalidades: Inhibicin de la aglutinacin, til si queremos utilizar
Ac Monoclonales o determinar la presencia de haptenos.

Globalmente son tcnicas muy sensibles, detectan niveles de hasta 20-50 ng/ml

4. TECNICAS POR DISPERSION DE LUZ

Son la NEFELOMETRIA y la TURBIDIMETRIA

CONCEPTOS BASICOS

EFECTO TYNDALL: cuando un haz de luz atraviesa una suspensin coloidal

(lquido con partculas en suspensin), parte de la luz es dispersada en todas las
direcciones del espacio sin que se altere su longitud de onda e independientemente
del tipo de partculas.

El grado de dispersin de luz depende del tamao de las partculas, es mnimo

con partculas muy pequeas (solutos) y aumenta conforme aumenta el tamao de las
partculas (turbidez de las soluciones).

Cuando el tamao de las partculas es pequeo en relacin a la longitud de

onda de la luz incidente, existe una considerable dispersin, que es mxima en el eje
de la propia luz incidente (EFECTO RAYLEIGH).

A medida que aumenta el tamao de las partculas en suspensin, la dispersin

se produce mayoritariamente hacia delante (EFECTO RAYLEIGH-DEBYE). La
mayora de tcnicas nefelomtricas aprovechan este ltimo efecto.

Las tcnicas NEFELOMTRICAS determinan el incremento en la dispersin de

luz que se produce en una mezcla de antgenos y anticuerpos cuando se forman
inmunocomplejos. Por el contrario, las tcnicas denominadas TURBIDIMTRICAS
(turbidimetra) determinan el incremento de la absorbancia de la solucin asociada a
la formacin de inmunocomplejos; no nos referiremos a estas tcnicas porque se
utilizan muy poco como inmunoensayos en la actualidad.

CINETICA DE LA REACCIN

Las variaciones en la dispersin de luz en funcin de la concentracin de Ag

(para una concentracin fija de Ac), sigue una cintica similar a la de las reacciones de
precipitacin (exceso de Ac, equivalencia y exceso de Ag).

Aadiendo concentraciones crecientes de antgeno, se forman ICs de tamao

suficiente para producir un efecto Rayleigh-Debye significativo, como los ICs son de
tamao ms o menos cte, la dispersin es directamente proporcional a la cantidad de
IC, es decir a la cantidad de Ag., hasta que se alcanzan las condiciones de exceso de
Ag y los complejos comienzan a ser ms pequeos.

Cintica de la reaccin en el tiempo: cuando se mezclan Ag y Ac, al cabo de

pocos segundos (unos 20 segundos), comienza a aparecer efecto de R-D, la
dispersin aumenta rpidamente hasta alcanzar un mximo en que la dispersin ya no
se incrementa (platteau), un tiempo despus los complejos llegan a ser tan grandes
que precipitan, quedan fuera de la solucin y no dispersan luz, disminuyendo la

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dispersin. Esta cintica en el tiempo da lugar a las dos maneras de recoger los
resultados de la dispersin:

- NEFELOMETRA CINTICA: determina la velocidad en el tiempo con que

se alcanza el mximo de dispersin, que tambin es proporcional a la
concentracin del Ag.

- NEFELOMETRA DE EQUILIBRIO O PUNTO FINAL: determina el mximo

de dispersin de luz que se alcanza cuando se llega a la zona de platteau
(proporcional a la concentracin de Ag).

Utilizando una solucin estndar de concentracin conocida del Ag se

construye una curva de calibracin a varios puntos y en ella se extrapolan las
dispersiones mximas (nf a punto final) o las velocidades de reaccin (nf Cintica) de
las muestras problema.

VARIABLES IMPORTANTES

El objetivo es habitualmente determinar la concentracin de una protena en

una muestra clnica. Por lo tanto los resultados pueden ser normales (rango de
concentracin normal) o patolgicos (bajos o altos), la tcnica debe ser capaz de
medir el Ag en todas estas situaciones.

Las variables que definen la utilidad del ensayo son:

- Caractersticas de los antisueros: para la nf cintica se necesitan antisueros

con alta afinidad (reaccionan rpidamente), en la de punto final es mejor
que los Acs sean de alta avidez, que forman complejos de gran tamao,
aunque lentamente.

- Sensibilidad del equipo; pticas con lser.

- Rango dinmico del ensayo; niveles de Ag y Acs en que la relacin dosis de

Ag/dispersin de luz es lineal.

- Cintica de la reaccin; necesitamos conocer los niveles en que se

encuentran las situaciones de exceso de Acs y sobre todo de exceso de Ag.

Los problemas que se plantean ms frecuentemente son de:

- Sensibilidad (capacidad de detectar niveles bajos), directamente

relacionados con la sensibilidad del equipo, el rango dinmico del ensayo y
las caractersticas de los antisueros. La sensibilidad de estos ensayos se
aumenta aadiendo polmeros (PEG) a la reaccin. En estas condiciones
se alcanzan niveles de sensibilidad por debajo de 1 g/ml.

- El problema ms serio son las situaciones de exceso de Ag, podemos

detectar niveles normales o bajos con concentraciones muy altas de Ag;
esto habitualmente se soluciona repitiendo todas las determinaciones con
resultado bajo, aadiendo cierta cantidad de Ag, si el resultado aumenta es
que era realmente bajo, si no aumenta o disminuye es que haba exceso de
Ag.

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 - Existen otros problemas relacionados con la turbidez intrnseca de las
muestras (p ej si hay lpidos), esto es importante en la nf a punto final y se
suele solucionar manipulando las muestras (extraccin con cloroformo).

5. RADIOINMUNOENSAYO

RIA CLASICO (COMPETITIVO)

Competicin entre cantidades fijas y limitantes de antgeno marcado

radiactivamente y cantidades variables de antgeno no marcado, por la unin a Ac
especficos de ese Ag.

Utilizando estndares de valores conocidos se construye una curva de

calibracin representando cpm frente a concentracin, de manera que a mayor
concrentracin de Ag no marcado menores sern las cpm. En esta curva se extrapolan
las cpm que da el problema.

Sobre la tcnica base, en fase lquida se han desarrollado variaciones,

utilizando fase slida para inmovilizar el Ac.

Tambin inmovilizando en fase slida el Ag (mtodo IRMA), utilizando en este caso

un Ac marcado. Ventajas del IRMA: Sencillo, especfico (los Ac Mo funcionan bien) y
sobre todo, no requiere disponer del Ag demasiado purificado.

ELEMENTOS IMPORTANTES EN EL RIA

- ANTISUERO: En el RIA se utilizan Antisueros de elevada avidez (grandes

captadores de Ag) para que la sensibilidad sea ptima y el ensayo
reproducible. El problema de esto es que generalmente estos antisueros
tienen problemas de especificidad. Dado que es necesaria una elevada
avidez, los Ac Mo no suelen funcionar (salvo en el IRMA).

- Marcaje del Ag; generalmente se utiliza 125I. Los problemas son que
ocasionalmente produce alteraciones estructurales en el Ag y que la
actividad se extingue rpidamente. Existen alternativas (3H, 14C).

- Medios de separacin de los complejos: Los mtodos en que no se

utiliza una fase slida requieren que se aada un medio de separacin para
precipitar los inmunocomplejos (carbn activado para molculas pequeas,
anti-Ig, sulfato amnico, PEG, etc).

- Curva estndar; construida representando cpm vs log de la concentracin.

Tambin se puede utilizar en lugar de las cpm la expresin:

cpm problema/(cpm mximas-cpm problema)

donde cpm mximas se obtiene midiendo cpm en ausencia de Ag no marcado.

Para determinar la concentracin se utiliza la parte lineal de la curva.

Consideradas durante muchos aos como las tcnicas de mayor sensibilidad,

detectan niveles en el rango de los pg/ml.

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 6. ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA)

ENZIMOINMUNOENSAYOS

Tcnicas cada vez ms utilizadas, tienden a reemplazar al RIA porque no

utilizan radiactividad y alcanzan una sensibilidad comparable.

Se basan en la utilizacin de anticuerpos (antisueros) marcados con enzimas

como elementos de deteccin (trazadores).

En general dos tipos:

- HOMOGNEOS: la actividad del enzima se modifica durante la reaccin

Ag-Ac. Caractersticamente no es necesario separar los diferentes
componentes de la reaccin a lo largo de la tcnica (no hay que lavar), til
para detectar sustancias de pequeo tamao (hormonas).

- HETEROGENEOS: la actividad enzimtica del trazador no se modifica con

la formacin de ICs, hay que lavar para separar las diferentes fases del
ensayo y retirar el exceso de reactivos. A su vez los ELISAs heterogneos
se pueden clasificar en:

a) COMPETITIVOS, con Ac marcado o con Ag marcado, en este caso

la seal obtenida al final de la tcnica ser inversamente
proporcional a la concentracin del Ag detectado. La caractersticas
fundamentales de los ELISAs competitivos son que tienen una
elevada especificidad; al intervenir un solo anticuerpo la reaccin
frente al Ag es ms especfica. El problema es que son de baja
sensibilidad, el rango dinmico del ensayo es bastante estrecho. Por
otro lado son tiles para cuantificar molculas de pequeo tamao
(ELISA con Ag marcado) y cuando el antisuero es difcil de obtener
(son equivalentes al IRMA).

b) NO COMPETITIVOS, son los modelos ms habituales de ELISA.

Los dos tipos ms habituales son los siguientes:

ELISA INDIRECTO

Utilizado para detectar Acs frente a un Ag, estos Ac son detectados por un
segundo Ac marcado. Esto permite seleccionar el isotipo de Ig que queremos detectar
y por lo tanto diferenciar entre seroconversin o infeccin activa o infeccin pasada.

ELISA SANDWICH O DE CAPTURA

Un primer Ac es fijado a la fase slida a concentracin elevada (saturacin de

la fase slida) y se utiliza para capturar el Ag que a su vez es detectado por un
segundo Ac marcado. Este tipo de ensayo es de una elevada sensibilidad, aunque
tiene problemas de especificidad (reacciones inesperadas con cualquiera de los dos
Acs). Este tipo de ensayos en la actualidad es capaz de detectar niveles por debajo de
1 pg/ml.

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PROBLEMAS COMUNES EN EL ELISA

- FONDO: lecturas elevadas en ausencia de cualquiera de los reactivos que

intervienen (Acs en el indirecto o Ag en el sandwich). Como solucin al
problema del fondo se ha sugerido mejorar los lavados y en el caso del
ELISA de captura, descartar el efecto de los anticuerpos heterfilos.

- EFECTO HOOK (gancho): al construir una curva de calibracin, la parte

ms alta de la curva da lecturas inferiores a las de la parte media. Este
efecto es frecuente en el ELISA sandwich, sin embargo, tiene diversas
soluciones (ensayar siempre varias diluciones de las muestras (hay efecto
hook si la muestra ms diluida da lecturas superiores a la ms
concentrada), mejorar los lavados o probar el ensayo repetidamente hasta
localizar las situaciones en que aparece este efecto).

- ANTICUERPOS HETERFILOS: Acs que reconocen protenas animales

(incluyendo Igs animales). Se piensa que pueden aparecer como respuesta
frente a Ags alimentarios. Son Acs de tipo IgM, de baja afinidad y aparecen
a ttulo muy bajo normalmente, por lo que suponen un problema en los
ensayos en que se diluye muy poco las muestras de suero. Son muy
frecuentes en la poblacin normal; se han descrito entre el 0,5 y el 40% de
individuos.

Los efectos de estos anticuerpos heterfilos son variables y, generalmente

dan lugar a lecturas falsamente elevadas (sobre todo en ELISA de captura).

Se han ensayado varias soluciones en las que se ha calentado el suero a

70C para que desnaturalicen las IgM y desaparezcan los Ac heterfilos,
pero aparecen otros artefactos. Tambin se puede eliminar la IgM
precipitando el suero con PEG. La solucin ms habitual es eliminarlos
aadiendo al medio de dilucin de las muestras un exceso de suero normal
del animal que interviene en el ensayo.

- DETERMINACION DE Acs IgM: es realmente difcil, al bajo ttulo que

suelen alcanzar las respuesta mediadas por IgM hay que aadir otros
problemas:

a) Bloqueo por Acs IgG, que suelen estar presentes a un ttulo my

superior a las IgM e impiden que estas puedan unirse al Ag en la
fase slida. Esto es un problema especialmente grave en la
serologa en el recin nacido, que tiene todo el repertorio de IgG de
la madre (que a su vez puede tener ttulos muy altos de IgG frente al
germen o antgeno estudiado).

La solucin que se ha propuesto es un intento de eliminar las IgG

antes de ensayar el suero; tambin se ha intentado purificar las IgM
para ensayarlas directamente y ltimamente se han puesto a punto
ensayos en que primero se captura la IgM del suero en la fase slida
que a su vez captura el Ag (si haba IgM especfica de ese Ag en el
suero) y se revela el ensayo con un Ac especfico del Ag capturado.