Desarrollo de un mtodo de diagnstico molecular para la leishmaniasis

canina en Argentina
Resumen extendido:
INTRODUCCIN:
La leishmaniasis es una enfermedad zoontica causada por parsitos del gnero
Leishmania (Trypanosomatidae) y transmitida a los mamferos a travs de la
picadura de insectos flebtomos. Se clasifica dentro del grupo de Enfermedades
Tropicales Desatendidas y afecta generalmente a las regiones socioeconmicas
ms vulnerables. La leishmaniasis es endmica en ms de 90 pases; afecta
predominantemente a los pases en desarrollo, y se considera que hay 350 millones
de personas en riesgo de contraerla. Se calcula que existen 12 millones de personas
infectadas en el mundo y 2 millones de casos nuevos por ao (OMS 2010; Medina &
Lucero 2014). Es transmitida a un husped susceptible mayormente por artrpodos
flebtomosdel gnero Lutzomyia(Diptera: Psychodidae).Estos insectos se cran en
tierra hmeda, rica en materia orgnica (como frutos, guano y desechos de
animales). Condiciones culturales y econmicas dificultan el control del vector
(Mahmud et al. 2013).
En nuestro pas existen predominantemente dos tipos de leishmaniasis en humanos:
la forma visceral y la forma tegumentaria. La leishmaniasis visceral (LV) es la forma
ms severa; es causada por Leishmaniainfantum (sinnimo de L. chagasi),
generando un cuadro clnico severo y pudiendo originar la muerte en caso de no ser
tratada (OMS 2010). La leishmaniasis tegumentaria americana (ATL), por otro lado,
es causada por Leishmania braziliensis, y afecta principalmente la piel y las
mucosas.El principal reservorio de la LV es el perro domstico; y diversos estudios
han demostrado que ste tambin puede contraer leishmaniasis tegumentaria,
constituyendo un posible reservorio para ATL(Reithinger & Davies 1999; Dantas-
Torres 2007; Padilla et al. 2002).As como en el caso humano, la leishmaniasis
canina se puede presentar de dos formas: como leishmaniasis visceral canina (LVC)
donde el agente etiolgico es L. infantum; o como leishmaniasis tegumentaria
canina, donde el agente etiolgico es L. braziliensis. Los sntomas para ambas
infecciones son similares, presentndose usualmente adelgazamiento generalizado,
alopecia, ulceraciones en orejas y ojos, y onicogrifosis, entre otros.
En Argentina se diagnosticaron casos de LVC en 7 provincias (Misiones, Corrientes,
Chaco, Formosa, Entre Ros, Salta y Santiago del Estero); mientras que para LTC, el
nmero de provincias con casos autctonos asciende a 11 (Nevot et al. 2013).
En la ciudad de Mercedes, provincia de Corrientes, durante 2010 y 2011, se
analizaron alrededor de 600 muestras de caninos; registrndose 26 de ellas
positivas paraLVC.
Las leishmaniasis humana y canina en Argentina son enfermedades de denuncia
obligatoria (Ley 15465, Decreto Nacional 3640/1954), y los mtodos recomendados
para el diagnstico de la misma son: (I) el diagnstico parasitolgico, que consiste
en la observacin directa del parsito en un frotis de mdula sea, o raspado
cutneo; y (II) el diagnstico serolgico, que consiste en analizar la seropositividad
del canino mediante una tira inmunocromatogrfica (por ej.: Kalazar Detect Canine
Rapid Test). Ambos mtodos diagnsticos son utilizados de rutina en el diagnstico
de LVC. En el caso del primero, es un mtodo que depende de la habilidad del
operario, lo que restringe su sensibilidad; mientras que el segundo es un mtodo
sensible y eficaz, pero los kits comerciales resultan costosos para su aplicacin a un
relevamiento epidemiolgico y, a su vez, presentan algunas limitaciones en cuanto a
su especificidad ya que se han reportado reacciones cruzadas en perros que
presentan coinfeccin con otros protozoos patgenos (por ej.: Trypanosoma cruzi)
(Lemos et al. 2008). A su vez, estos estudios se pueden complementar con el
diagnstico molecular. Este procedimiento usualmente tiene un costo elevado para
el diagnstico veterinario, pero este es un aspecto que se puede mejorar, por
ejemplo, aplicando tcnicas menos costosas en la extraccin de ADN.
El objetivo del presente trabajo fue aplicar una tcnica que permita el diagnstico de
leishmaniasis canina y, a su vez, generar un procedimiento sencillo, econmico y
reproducible para la extraccin de ADN a partir de muestras de sangre, de manera
de prescindir de kits comerciales y abaratar as el costo del diagnstico. Por otro
ladose propuso aplicar esto a un relevamiento epidemiolgico de leishmaniasis
canina en la ciudad de Mercedes.
MATERIALES Y MTODOS:
Comparacin de diferentes mtodos de extraccin:
Para la comparacin de mtodos de extraccin se utiliz una muestra de sangre
canina perteneciente a un perro infectado con Leishmania infantum, diagnosticado
previamente positivo por serologa por la Estacin Experimental Agropecuaria
INTA Mercedes.Los amastigotes se pudieron observar por microscopaen un frotis
de mdula sea perteneciente al mismo canino. La muestra de sangre y el frotis de
mdula sea fueron cedidos por la EEA-INTA Mercedes.
De la muestra antes mencionada se separaron 10 alcuotas a las cuales se le
realizaron extracciones de ADN mediante 3 mtodos diferentes: extraccin por kit
comercial DNeasy Blood &Tissue (Qiagen), extraccin estndar con Fenol-
Cloroformo, y extraccin mediante la resina Chelex-100 (Biorad). A su vez, las
alcuotas fueron tratadas con diferentes protocolos en orden de identificar cul de
ellos resulta el ms eficiente, teniendo en cuenta su sensibilidad, economa y
sencillez.
Evaluacin de la conservacin de muestras de sangre y ADN:
En primer lugar, se evalu la conservacin de muestras de sangre a -20C a tiempo
cero (t0), 45 das (t45), 90 das (t90) y 135 das (t135). Luego de cada perodo, a la
muestra se le realiz una extraccin de ADN siguiendo el protocolo elegido en el
punto anterior. Al ADN extrado se le realizaron diluciones seriadas y posteriormente
se amplificaron por PCRpara evaluar el nivel de deteccin de la misma en cada
muestra; de modo tal de poder evidenciar la degradacin del ADN. En segundo
lugar, se procedi a evaluar la conservacin a -20C de muestras de ADN extradas
con el protocolo anterior, empleando ciclos de congelacin/descongelacin en
intervalos de 30 das (t0, t30, t60 y t90). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo
utilizando los cebadores 13A (5-GTGGGGGAGGGGCGTTCT-3) y 13B (5-
ATTTTACACCAACCCCCAGTT-3), que amplifican una regin constante del
kinetoplasto y son especficos del gnero Leishmania (Rodgers et al. 1990). Se
utiliz un programa de ciclado que consiste en una desnaturalizacin inicial a 94C
durante 3 min., seguida de 35 ciclos de desnaturalizacin a 94C por 1 min.,
hibridizacin a 54C por 1 min. y elongacin a 72C por 1 min.; y luego una
elongacin final a 72C durante 10 min.
Relevamiento epidemiolgico de caninos de Mercedes, Corrientes:
Se recibieron en total 121 muestras de sangre canina procedentes de la ciudad de
Mercedes, Corrientes. Se les realiz una extraccin de ADN mediante la resina
Chelex-100 utilizando el protocolo elegido y luego fueron amplificadas mediante
PCR, utilizando el programa anterior pero modificando la temperatura de
hibridizacin de 54C por una de 58C para evitar amplificaciones inespecficas.
RESULTADOS:
Observacin microscpica de amastigotes en muestra positiva para L. infantum:
Se realiz la observacin microscpica de un frotis de mdula sea perteneciente a
un perro diagnosticado previamente positivo para L. infantumpor serologa. El frotis
fue coloreado con tincin de Giemsa siguiendo el protocolo del fabricante. En la
figura 1 se observan amastigotes de Leishmania circundando
un macrfago, lo que confirm el diagnstico previo.

Figura 1. Amastigotes de Leishmania.Coloracin de Giemsa. AT=1000x.

Comparacin de protocolos
os de extraccin de ADN:
Para la comparacin se realiz una extraccin de ADN mediante el mtodo estndar
de Fenol-Cloroformo (P-C),
C), una empleando el kit comercial DNeasy Blood & Tissue
(Qiagen) y varios protocolos de extraccin con la resina Chelex
Chelex-100, variando
condiciones tales como agregado de proteinasa K, el agregado de buffer de lisis y la
incubacin a 100C, entre otros.
De los protocolos probados, se eligi uno de la resina Chelex, ya que fue el ms
sencillo, rpido y econmico de todos. El protocolo seguido fue el siguiente: a una
alcuota de sangre (40l
l) se le agregaron 10 volmenes de una suspensin de
Chelex al 5% en H2O bidestilada,
bidestilada se incub a 100C durante 10 minutos, se
centrifug a 13600 g durante 10 minutos y el sobrenadante se utiliz para la
amplificacin. La figura 2 muestra la amplificacin por PCR de diluciones seriadas de
ADN extrado por los 3
mtodos.

Figura 2: Amplificacin de
diluciones seriadas de ADN extrado
mediante 3 mtodos distintos.
A: Extraccin con protocolo N3 de
Chelex-100;
100; B: Extraccin estndar con
Fenol-Cloroformo
Cloroformo y C: extraccin
mediante kit DNeasy Blood & Tissue.

En esta figura se puede observar

observar que el protocolo ms eficiente en cuanto a la
deteccin fue el kit DNeasy, ya que se observ deteccin de ADN, hasta la dilucin
1:1.000.000,, mientras que el protocolo N3
N 3 de Chelex y el mtodo P
P-C hubo
deteccin hasta las diluciones de 1:10.000 y 1:30.000,, respectivamente
respectivamente. Sin
embargo,, el protocolo N3 de Chelex result el ms rpido y sencillo de los tres. En
base a estos resultados se eligi el mismo para el relevamiento epidemiolgico.
Evaluacin de conservacin de muestras de sangre y ADN:
Respecto de la estabilidad en las muestras de sangre, se observ que a los 45 das
de almacenamiento a -20C,
20C, la deteccin por PCR disminuy a la tercera parte de la
mostrada en t0; mientras que luego de los 90 das, el nivel de deteccin disminuy
100 veces respecto del t0. Por ltimo, luego de 135 das de almacenada, la
deteccin por PCR del ADN de esta muestra no presenta cambios respecto del t90;
mientras que una muestra extrada a los 135 das, pero que fue descongelada en t45
y t90produjo una disminucin
disminuc del nivel de deteccin de ADN de 300 veces con
respecto al t0.
Respecto de la estabilidad de ADN ya extraido por el protocolo N 3 de Chelex, se
observ que los ciclos de congelamiento/descongelamiento producen una
degradacin progresiva, alcanzando a los 90 das de almacenamiento, y con 3 ciclos
de congelamiento/descongelamiento, una deteccin de ADN 300 veces menor que
en el t0.
Relevamiento epidemiolgico de caninos de Mercedes, Corrientes:
De las 121 muestras de sangre canina analizadas, se hallaron 62 positivas por PCR
para Leishmania spp. (51,2%), de las cuales 53 pertenecen a caninos que no
presentaban sntomas en el momento del muestreo; y solo 1 fue positiva por
serologa.
CONCLUSIONES Y DISCUSIN:
Respecto de los mtodos de extraccin de ADN, el protocolo N 3 de extraccin con
Chelex resulta ser el ms sencillo, rpido y econmico de todos los protocolos
evaluados, con un costo por muestra de U$S 0,20 contra los U$S 2,00 del kit
comercial. A su vez, resulta principalmente un mtodo efectivo para la deteccin de
Leishmania en muestras de sangre. Esto lo hace un buen mtodo para su
aplicacin en estudios en los cuales se emplea un nmero considerable de
muestras, abaratando 10 veces el costo de la extraccin de ADN y permite la
obtencin de muestras no invasivas.
Respecto de las estabilidades, nuestros resultados muestran que tanto muestras de
sangre como de ADN sufren una considerable degradacin durante su
almacenamiento prolongado a -20C. En concordancia con nuestros resultados,
otros estudios sugieren que el almacenamiento a -70C produce una menor
degradacin cuando se emplea en perodos prolongados.
Adems, las muestras de sangre resultan ser un mtodo mucho menos invasivo que
la toma de mdula sea o las biopsias de los rganos linfticos empleadas en los
otros mtodos. Teniendo en cuenta lo esto, podemos concluir que la tcnica
empleada resulta en una mejora a los mtodos existentes, puesto que reduce 10
veces el costo por muestra respecto del kit comercial.
Por ltimo, es importante mencionar que se registr un elevado nmero de animales
positivos por PCR en la ciudad de Mercedes respecto del nmero de positivos
observados por serologa. Adems, se registr un elevado porcentaje de perros
positivos asintomticos, lo que significa que la situacin de la leishmaniasis canina
en Mercedes es an ms grave de lo registrado hasta el momento.
Teniendo en cuenta lo expuesto, este trabajo favorecer el diagnstico de caninos
en la ciudad de Mercedes, y contribuir al mejor cuidado de la salud tanto animal
como de la poblacin de la ciudad.
BIBLIOGRAFA:
Dantas-Torres, F., 2007. The role of dogs as reservoirs of Leishmania parasites, with emphasis on
Leishmania (Leishmania) infantum and Leishmania (Viannia) braziliensis. Veterinary parasitology,
149(3-4), pp.13946. Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17703890 [Accessed May
18, 2015].
Lemos, E.M. et al., 2008. Canine visceral leishmaniasis: performance of a rapid diagnostic test (Kalazar
Detect) in dogs with and without signs of the disease. Acta tropica, 107(2), pp.2057. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18565485 [Accessed December 13, 2015].
Mahmud, I.C. et al., 2013. Leishmaniasis Visceral Infalntil: Reporte de Caso y Revisin de Literatura. ,
pp.2736.
Medina, M.G. & Lucero, H., 2014. Aplicacin de herramientas moleculares en el diagnstico y
caracterizacin de Leishmania spp. en reas endmicas de Chaco, Argentina: a propsito de un
caso. Revista Argentina de Zoonosis y Enfermedades Infecciosas Emergentes, 9(2), pp.51 53.
Nevot, C., Rosa, A. & Eiras, D., 2013. Actualidad en leishmaniasis canina. Revista Veterinaria
Argentina, XXX(309), p.8. Available at:
http://www.veterinariargentina.com/revista/2013/09/actualidad-en-leishmaniasis-canina/.
OMS, 2010. Control de las leishmaniasis Informe de una reunin del Comit de Expertos de la OMS
sobre el Control de la Leishmaniasis, Ginebra: OMS.
Padilla, A.M. et al., 2002. Canine infection and the possible role of dogs in the transmission of American
tegumentary leishmaniosis in Salta, Argentina. Veterinary parasitology, 110(1-2), pp.110.
Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12446084 [Accessed January 25, 2016].
Reithinger, R. & Davies, C.R., 1999. Is the domestic dog (Canis familiaris) a reservoir host of American
cutaneous leishmaniasis? A critical review of the current evidence. The American journal of
tropical medicine and hygiene, 61(4), pp.53041. Available at:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10548285 [Accessed January 10, 2016].
Rodgers, M.R., Popper, S.J. & Wirth, D.F., 1990. Amplification of kinetoplast DNA as a tool in the
detection and diagnosis of Leishmania. Experimental parasitology, 71(3), pp.26775. Available at:
http://linkinghub.elsevier.com/retrieve/pii/0014489490900317 [Accessed August 3, 2015].