BACTERIOCINAS PARA LA ESTABILIZACIN MICROBIOLGICA

Y REDUCCIN DE LA DOSIS DE SO2

Ruiz-Larrea, F.; B. Rojo-Bezares; Y. Senz; L. Navarro; L. Dez ; M. Zarazaga; C.

Torres.

Departamento de Agricultura y Alimentacin. Facultad de Ciencias. Universidad de La Rioja, Av. Madre de

Dios 51. 26006 Logroo, Espaa (e.mail: fernanda.ruiz@unirioja.es)

Las bacteriocinas
Las bacteriocinas son pptidos con actividad antimicrobiana segregadas por las bacterias para
inhibir el crecimiento de otros microorganismos competidores. En la actualidad las
bacteriocinas producidas por las bacterias lcticas (BAL) son las que encierran un mayor
inters ya que las BAL tienen el estatus de QPS (qualified presumption of safety), es decir son
consideradas como microorganismos seguros para la salud, ya que tanto ellas como sus
metabolitos han sido consumidos en alimentos fermentados por innumerables generaciones
sin que hubiera efectos adversos en la poblacin. Por otro lado las BAL acompaan al ser
humano desde su mismo nacimiento, tanto en la composicin de la microbiota del aparato
digestivo como de la piel. Las bacteriocinas segregadas por las BAL han encontrado una
importante aplicacin como conservantes alimentarios naturales.
La primera descripcin de actividades relacionadas con las bacteriocinas se public hace ms
de ochenta aos, cuando se descubri un antagonismo entre cepas de Escherichia coli.
Originalmente, estas sustancias fueron llamadas colicinas (Gratia, 1925). Sin embargo las
primeras observaciones en BAL comenzaron en 1928, cuando se describi cmo ciertas cepas
de Lactococcus empleadas en la fabricacin de quesos producan un efecto inhibidor del
crecimiento de otras BAL (Rogers and Whittier, 1928) y potencialmente podan inhibir el
crecimiento de bacterias patgenas y nocivas para la conservacin del queso. En 1933 se
describi por primera vez esa sustancia de naturaleza peptdica con actividad antimicrobiana
producida por cepas de la especie Lactococcus lactis subsp. lactis, que posteriormente se
denomin nisina (Mattick and Hirsch, 1947). La nisina es por tanto la bacteriocina que tiene
un historial ms largo de uso seguro en alimentacin y la que ha sido ms estudiada. En 1953
se comercializ por primera vez en Inglaterra, en 1969 se aprob su uso en alimentacin por
la OMS (Joint Food and Agriculture Organization/World Health Organization Expert
Committee on Food Additives) y en 1983 se incluy en la lista de aditivos de la U.E. con el
nmero E234; poco despus, en 1988, fue aprobada por la FDA (Food and Drug
Administration) norteamericana (Cotter et al., 2005). La nisina se puede adquirir en grado
alimentario bajo el nombre de NisaplinR (Danisco) y consiste bsicamente en un preparado
que contiene un 2,5 % de nisina, con NaCl (77,5 %) y leche descremada en polvo (12 %
protena y 6 % carbohidratos). El producto Nisaplin ND (non-dairy nisin) no contiene las
protenas lcteas, lo cual favorece su solubilidad en medio acuoso, contiene un 6,25 % de
nisina, NaCl (90 %), carbohidratos (2 %) y protena (aproximadamente un 3 %). Se utiliza en
la reparacin de productoos lcteos (especialmente quesos), embutidos, huevo lquido, zumos
y alimentos enlatados. Su actividad cubre un espectro amplio de bacterias Gram positivas,
entre las que cabe destacar Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes (Cintas et al.,
2001) y Clostridium sp. (O'Sullivan et al., 2002).

1
Junto con la nisina, la pediocina es otra bacteriocina que ha encontrado un amplio campo de
aplicacin en el sector alimentario como bioconservante. La pediocina PA-1 (AcH) es
producida por cepas de las especies Pediococcus acidilactici de origen crnico, Pediococcus
parvulus de origen vegetal, y una cepa Lactobacillus plantarum aislada de queso (Cintas et
al., 2001). La caracterstica ms notable de la pediocina es su alta actividad anti-listeria y es
lo que la convierte en una bacteriocina de enorme inters tecnolgico. Su espectro de
actividad es mucho ms especfico que el de la nisina, de modo que no acta sobre muchas
otras BAL que se pueden emplear como cultivos iniciadores, y es ms eficaz contra la listeria.
En la actualidad la pediocina se comercializa y est incluida en varias patentes europeas y
norteamericanas (Chen and Hoover, 2003). Un fermentado que contiene pediocina PA-1,
denominado AltaTM (Kerry Bio-Science) est comercializado y se utiliza como conservante
alimentario en productos crnicos listos para su consumo, ensaladas y salsas.
Estructuras de la nisina y de la pediocina
En 1971 se caracteriz la nisina A como un miembro de la familia de los lantibiticos (clase I
de bacteriocinas), es un pptido pequeo (34 aminocidos), termorresistente, que contiene el
aminocido modificado lantionina. La sntesis de la nisina A es compleja, requiere procesos
de transcripcin, traduccin, modificaciones post-traduccionales, secrecin y procesamiento
de seales celulares muy variadas (Engelke et al., 1992; Montville and Chen, 1998). Es un
pptido policclico compuesto por residuos aminoacdicos deshidratados (dehidroalanina y
dehidrobutirina) y cinco anillos de lantionina y/o -metil-lantionina formados por puentes
disulfuro, en su cadena aminoacdica (Rollema et al., 1996; Cotter et al., 2005; Cheigh and
Pyun, 2005). Tiene carcter catinico y es una molcula anfiptica ya que posee el extremo
N-terminal hidrofbico y el extremo C-terminal contiene la mayora de los aminocidos
cargados e hidroflicos. Adems los cinco anillos de su estructura tienen una cara hidrofbica
y otra hidroflica. Existen dos variantes de esta bacteriocina, la nisina A y nisina Z, que
difieren nicamente en el aminocido 27 (Figura 1).

5 15
10 25 30
COOH
H2 N
34
1 20
Asn

(Nisina Z)
Figura 1.- Estructura primaria de la nisina A. Ala-S-Ala representa al anillo de lantionina, Abu-S-Ala representa
al anillo de -metil-lantionina y los aminocidos deshidratados: Dha (dehidroalanina) y Dhb (dehidrobutirina).
La flecha indica la sustitucin del aminocido His27 por Asn27 que convierte la nisina A en la nisina Z
(adaptado de Cotter et al., 2005; Cheigh and Pyun, 2005).

La pediocina PA-1 pertenece al grupo de bacteriocinas (clase IIa) que no tienen aminocidos
modificados, de pequeo tamao (tiene 44 aminocidos), termorresistentes, que poseen un
fuerte carcter catinico e hidrofbico. Su estructura primaria contiene una secuencia N-
terminal comn con todas las bacteriocinas de este grupo: YGNGVxC, a la cual han atribuido
algunos autores su actividad anti-listeria (Ennahar et al., 2000). Tiene una fuerte carga
positiva (+ 6; pI = 8,6) y en vez de poseer anillos de lantionina, tiene dos puentes disulfuro en
su estructura, uno de los cuales se postula que estabiliza las dos cadenas que forman una
estructura de horquilla en el extremo N-terminal (Ennahar et al., 2000). La prediccin de la
estructura secundaria del extremo C-terminal es de -hlice (Figura 2). y se considera que

2
ste sera el segmento transmembranal que se inserta en la membrana de la clula que va a
inhibir.

Figura 2: Estructura tridimensional propuesta para la

pediocina insertada en micelas lipdicas. Los segmentos
azules representan vueltas, la flecha verde representa la
-hlice y las lneas marrones las cadenas as como
los dos puentes disulfuro (adaptado de PDB 1OHN en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure).

Modo de accin de las bacteriocinas

Las bacterias Gram-positivas se caracterizan por poseer una alto contenido en lpidos
aninicos en su membrana. El modo de accin propuesto para las bacteriocinas es una unin
inicial a la membrana bacteriana por atraccin electrosttica entre los lpidos cargados
negativamente y las bacterocinas con su carga neta positiva localizada fundamentalmente en
uno de sus extremos (extremo C-terminal de la nisina, extremo N-terminal de la pediocina). A
continuacin se producira la insercin de las bacteriocinas en la bicapa lipdica, en el caso de
la nisina esta insercin se realiza por su extremo N-terminal (Moll et al., 1999) y en el caso de
la pediocina, a travs de su -hlice transmembranal del extremo C-terminal (Ennahar et al.,
2000). De este modo se forman poros en la membrana bacteriana (Figura 3), la cual queda
permeabilizada, la clula empieza a perder iones y metabolitos fundamentales para su
supervivencia y eventualmente se produce la muerte bacteriana.

Figura 3: Mecanismo de accin de las bacteriocinas por formacin de poros en la membrana bacteriana (tomado
de Moll et al., 1999).

Las bacteriocinas y la industria alimentaria

Las bacteriocinas para uso en la industria alimentaria deben cumplir una serie de requisitos:
ser producidas por bacterias de grado alimentario (con estatus de QPS); - preferiblemente han
de ser termorresistentes; - tener actividad inhibidora de bacterias patgenas o alterantes del
alimento; - no deben llevar asociado ningn riesgo para la salud humana; - su adicin debe

3
conllevar un efecto beneficioso, como puede ser un aumento de la seguridad, la calidad o la
conservacin del aroma y propiedades organolpticas del alimento, y nunca se han de
adicionar en concentraciones superiores a las encontradas en sus fuentes naturales; - y por
ltimo, han de poseer una actividad altamente especfica y actuar nicamente contra bacterias
patgenas o alterantes. Todas estas cualidades las han demostrado las dos bacteriocinas
descritas anteriormente: la nisina y la pediocina, que hoy en da son bioconservantes
ampliamente utilizados en la industria alimentaria, tanto individualmente como en
combinacin con otras tecnologas de conservacin, tales como el tratamiento trmico, altas
presiones o empaquetados en atmsferas modificadas (Allende et al., 2006).
Las bacteriocinas se pueden emplear en la elaboracin de alimentos de tres modos distintos:
1) como cultivos vivos iniciadores de la fermentacin en alimentos fermentados, de modo que
las bacteriocinas se producen in situ por el cultivo iniciador o por alguna de las cepas de BAL
incluida en el cultivo mixto iniciador, 2) purificada o semipurificada (el caso de la Nisaplina)
como aditivo alimentario y conservante, o 3) como un ingrediente ms contenido en un
extracto fermentado con calidad alimentaria, obtenido a partir de la cepa productora de la
bacteriocina. Y en cualquiera de estos casos, el empleo de las bacteriocinas encierra una serie
de beneficios en comparacin con el uso de los conservantes qumicos tradicionales:
Han demostrado un uso seguro en la cadena alimentaria humana y con menos limitaciones
que los conservantes qumicos, ya que son molculas producidas de forma natural por
microorganismos fermentativos endgenos de alimentos tradicionales.
No existen resistencias conocidas, ni impacto medioambiental puesto que son rpidamente
degradadas en la cadena alimentaria humana.
Poseen un espectro de accin muy definido.
Las bacteriocinas en si, presentan un impacto sensorial nulo en el producto final.
Su actividad se ve potenciada con el pH y poseen efecto complementario al de otros
agentes antimicrobianos.
Su aplicacin es compatible con el etiquetado de producto ecolgico sin conservantes
qumicos ni de sntesis.
Sin embargo, tambin encierra inconvenientes:
Son menos conocidas que los conservantes qumicos, puesto que la nisina fue la primera
bacteriocina conocida, y se descubri en 1933 como ya se ha mencionado anteriormente.
No son indestructibles y se degradan rpidamente por las enzimas proteolticas.
Son necesarios conocimientos tcnicos especializados para prepararlas y utilizarlas
correctamente, todo lo cual encarece su empleo.
Son eficaces slo frente a un tipo determinado de bacterias.
Existen limitaciones legales en su empleo como aditivos alimentarios que exigen
validaciones especficas y su aprobacin antes de ser empleadas de forma purificada o
semipurificada.
Objetivos de trabajo
El trabajo que viene desarrollando el grupo investigador de Bioqumica y Biologa Molecular
del Departamento de Agricultura y Alimentacin de la Universidad de la Rioja se centra en
tres aspectos:
El estudio tanto in vitro como en bodega de la nisina y otras bacteriocinas empleadas en la
industria alimentaria, como agentes inhibidores del crecimiento bacteriano para la
conservacin del vino, as como de posibles efectos sinrgicos con el anhdrido sulfuroso.
El estudio en el laboratorio de cultivos de cepas de BAL que produzcan actividad
bacteriocina y que puedan dar lugar a extractos fermentados activos frente a una serie de
bacterias de origen enolgico.

4
 Caracterizar BAL enolgicas que sean productoras de bacteriocinas y que posean potencial
como cultivos iniciadores, de modo que puedan crecer en el mosto y en el vino.

Resultados del estudio in vitro del efecto de la nisina

Para el estudio del efecto in vitro de los agentes antimicrobianos: etanol, el metabisulfito y la
nisina frente a microorganismos del vino, bien de forma aislada o combinados, se utiliz una
coleccin de 64 cepas de BAL, 23 cepas de bacterias acticas (BAA) y 20 levaduras, todas
ellas de origen enolgico. Los resultados se muestran en la siguiente tabla.
Tabla 1.- Valores de CMIs y CMBs de los agentes antimicrobianos frente a las BAL, BAA y levaduras enolgicas.
Agentes Microorganismosa N de CMI50 CMI90 CMB50 CMB90
antimicrobianos cepas
Etanol BAL* 41 14% 18% ND ND
O. oeni 23 8% 10% ND ND
BAA 23 6% 10% ND ND
Levaduras 20 12% >20% ND ND
Metabisulfito BAL* 41 200 400 800 >12800
O. oeni 23 50 100 100 200
BAA 23 25 50 50 50
Levaduras 20 100 200 100 400
d
Metabisulfito+ etanol BAL* 41 12.5 50 25 100
O. oeni 23 100 100 100 400
BAA 23 25 50 50 100
Levaduras 19 100 200 100 400
Nisina BAL* 41 12.5 100 25 400
O. oeni 23 0.024 0.024 0.024 0.048
BAA 23 200 400 400 400
Levaduras 20 400 400 400 >400
d
Nisina + etanol BAL* 41 6.25 200 25 >400
O. oeni 23 0.012 0.024 0.012 0.048
BAA 23 200 200 400 400
Levaduras 20 >400 >400 >400 >400
e
Nisina + metabisulfito BAL* 41 12.5 400 400 >400
O. oeni 23 0.012 0.024 0.012 0.048
BAA 23 50 200 100 400

Metabisulfito + Nisina f BAL* 41 25 25 50 200

O. oeni 14 25 100 100 200
BAA 23 25 50 50 50
a
BAL*: bacteria lctica excepto O. oeni, BAA: bacteria actica.

5
b
Concentracin de etanol expresada como % (vol/vol).
c
ND: no determinado.
d
Concentraciones subinhibitorias de etanol utilizadas: 6% para BAL*, O. oeni y levaduras, y 3% para BAA.
e
Concentraciones subinhibitorias de metabisulfito utilizadas: 50 mg/L para todos los microorganismos
analizados
f
Concentraciones subinhibitorias de nisina utilizadas: 0.39 mg/L para BAL*, 0.01 mg/L para O. oeni y 1.5 mg/L
para BAA.
Como puede observarse en la tabla, los valores de las CMI del metabisulfito en presencia de
nisina bajan respecto a los valores de CMI del metabisulfito en ausencia de nisina, tanto para
la especie Oenococcus oeni como para el resto de las BAL. Estos resultados indican un efecto
sinrgico de la nisina y el metabisulfito en la inhibicin del crecimiento de las BAL. Cuando
se aadi al medio una cantidad de subinhibitoria de nisina (0,01 mg/L para O. oeni y 0,39
mg/L para el resto de BAL), el valor de CMI50 del metabisulfito disminuy significativamente
en el caso de O.oeni (50 a 25 mg/L) (p<0,001) y para el resto de las BAL la disminucin fue
de 200 a 25 mg/L (p<0,001). En el caso de las BAA, no hubo diferencias significativas entre
los valores de CMI50 (25 mg/L) ni de CMI90 (50 mg/L) del metabisulfito en ausencia y en
presencia de una concentracin subinhibitoria de nisina (1,5 mg/L).
Resultados del estudio en bodega del efecto de la nisina

Se realiz el estudio en bodega del efecto de la nisina combinada con metabisulfito en un vino
tinto con la fermentacin malolctica acabada. El vino fue sometido a la accin combinada de
distintas concentraciones de metabisulfito (12.5, 25, 50 y 100 mg/L) y de nisina (0, 0.78, 6.25
y 50 mg/L), se embotell y se realiz el seguimiento de la poblacin microbiana (bacterias
lcticas, bacterias acticas y levaduras) al cabo del mes y dos meses de conservacin. Todos
los experimentos se realizaron por triplicado y fueron sometidos a tratamiento estadstico. Se
observ una sensible reduccin en la poblacin microbiana en las muestras con baja
concentracin de metabisulfito en combinacin con la bacteriocina nisina.
MEDIA ARITM TICA LOG(UFC/ml)

0
1A 1B 1C 1D 2A 2B 2C 2D 3A 3B 3C 3D

18 mg MBS/ml MUESTRA
25 mg MBS/ml 100 mg MBS/ml
Figura 4: Poblacin de BAL en vinos conservados con distintas combinaciones de distitnas cncentraciones de
nisina y de metabisulfito.
A: 0 mg nisina/l; B: 0.78 mg nisina/l; C: 6.25 mg nisina/l; D: 50 mg nisina/l.

Estudio en el laboratorio de cultivos de cepas de BAL productoras de bacteriocinas

6
Se realiz el estudio in vitro, por el mtodo de spot-on-the-lawn en medio de TSA y
siembra de la capa sensible en medio semislido BHI, o MLO en el caso de O. oeni, de la
actividad inhibidora del crecimiento de una coleccin de BAL enolgicas, de dos cepas
productoras respectivamente de las bacteriocinas pediocina y nisina. Un resultado positivo es
aquel en el que se observa halo de inhibicin del crecimiento de la cepa sensible. La Tabla 2
muestra los resultados obtenidos en el estudio.

Tabla 2: Porcentaje de cepas de BAL enolgicas cuyo crecimiento es inhibido por dos cepas productoras de
pediocina y de nisina.
Bacteriocina N de cepas Pediocina PA-1 Nisina
(cepa productora) totales (C652) (C144)
Cepas estudiadas
Lc. lactis (n = 3) 0 100
L. hilgardii (n = 2) 0 100
L. fermentum (n = 1) 0 100
L. paracasei (n = 4) 0 100
L. pentosus (n = 1) 100 100
L. plantarum (n = 22) 5 100
L. sakei (n = 1) 100 100
L. sp. (n = 1) 100 100
Le. mesenteroides (n = 3) 100 100
P. acidilactii (n = 3) 33 100
P. parvulus (n = 2) 100 100
P. pentosaceus (n = 5) 100 100
O. oeni (n = 23) 94 100
Tambin se estudi la actividad bacteriocina en medio lquido y en presencia de distintas
concentraciones de etanol, de las cepas Lactococcus lactis C653, productora de nisina,
Pediococcus pentosaceus C652, productora de pediocina PA-1 y Lactobacillus plantarum
J51, productora de plantaricina. Se prepararon los cultivos en medio MRS con
concentraciones de etanol en el rango de 0 a 12%, y se tomaron muestras en diversos
momentos de la incubacin para determinar el crecimiento bacteriano y la actividad
bacteriocina, la cual se determin mediante el test de difusin en agar y el ensayo en placa
microtiter (Rojo-Bezares et al., 2007). Los resultados se muestran en las Figuras 5, 6 y 7.

7
 2 20

1,6 16

1,2 12

ACT
0,8 8

0,4 4

0 0
0h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 36h 48h
Time (hours

CB 0% ethanol CB 2% ethanol CB 4% ethanol

CB 8% ethanol ACT 0% ethanol ACT 2% ethano
ACT 4% ethanol ACT 8% ethanol
Figura 5: Efecto de distintas concentraciones de etanol (0 %, 2 %, 4 % y 8 %) sobre el crecimiento y la
produccin de bacteriocina de la cepa L. lactis C653 (productora de nisina).
OD660: Densidad ptica a 660 nm. ACT: actividad bacteriocina. CB: crecimiento bacteriano.

2 20

1,6 16

1,2 12
ACT
0,8 8

0,4 4

0 0
0h 10h 12h 14h 16h 18h 20h 22h 24h 36h 48h
time (hours

CB 0% ethanol CB 2% ethanol CB 4% ethanol

CB 8% ethanol ACT 0% ethanol ACT 2% ethanol
ACT 4% ethanol ACT 8% ethanol

Figura 6: Efecto de distintas concentraciones de etanol (0 %, 2 %, 4 % y 8 %) sobre el crecimiento y la

produccin de bacteriocina de la cepa P. acidilactici C652 (productora de pediocina PA-1).
OD660: Densidad ptica a 660 nm. ACT: actividad bacteriocina. CB: crecimiento bacteriano.

8
 ACT

A C T

ACT 0% e

CB 0% ete

Figura 7: Efecto de distintas concentraciones de etanol (0 %, 6 %, 8 %, 10 % y 12 %) sobre el crecimiento y la

produccin de bacteriocina de la cepa L. plantarum J51 (productora de plantaricina).
OD660: Densidad ptica a 660 nm. ACT: actividad bacteriocina. CB: crecimiento bacteriano.
Como se ve en las figuras, la presencia de pequeas cantidades de etanol (en el rango de 2 a 6
%) en el medio de cultivo aumenta la produccin y liberacin de las bacteriocinas en las tres
cepas productoras Lactococcus lactis C653, productora de nisina, Pediococcus pentosaceus
C652, productora de pediocina PA-1 y Lactobacillus plantarum J51, productora de
plantaricina, a pesar de que el crecimiento bacteriano se encuentra disminuido bajo esas
condiciones. Tambin se observa que la produccin de las bacteriocinas comienza durante el
inicio de la fase estacionaria de crecimiento bacteriano y se mantiene durante varias horas en
plena fase estacionaria.
Tambin se ha estudiado la produccin en medio lquido de actividad antimicrobiana de la
cepa enolgica O. oeni IS-53. Los resultados se muestran en la Figura 8 y esta cepa continua
siendo objeto de estudio.

2,5 10

2 8

1,5 6
ACT

1 4

0,5 2

0 0
0 10 12 14 16 18 20 22 24 36 48
Time (hours)

CB IS 53 ACT IS 53

Figura 8: Curva de crecimiento de la cepa O. oeni IS-53 y actividad antimicrobiana.

OD660: Densidad ptica a 660 nm. ACT: actividad bacteriocina. CB: crecimiento bacteriano.

9
Caracterizacin de BAL enolgicas productoras de bacteriocinas

Se realizaron varios screenings mediante el mtodo de spot-on-the-lawn para buscar cepas

enolgicas productoras de actividad antimicrobiana en una coleccin de 58 cepas de BAL
aisladas de mostos y vinos de la D.O.Ca. Rioja. Entre todas ellas aparecieron 14 cepas con
actividad inhibitoria del crecimiento de alguna de las 50 BAL empleadas como indicadoras de
actividad, y todas ellas pertenecan a la especie L. plantarum.
Tabla 3: Nmero total de cepas de BAL enolgicas estudiadas y nmero de cepas que muestran actividad
antimicrobiana

BAL estudiadas N BAC+

L. plantarum 38 14

L. brevis 8 0

L. paracasei 2 0

Le. mesenteroides 6 0

P. damnosus 1 0

P. pentosaceus 1 0

P. acidilactici 1 0

Lc. lactis 1 0
BAC+: actividad antimicrobiana, siendo un resultado positivo aquel en el que se observa halo de inhibicin del
crecimiento de la cepa indicadora.
De todas ellas destacaban las cepas L. plantarum J23 y L. plantarum J51 que inhiban el
crecimiento de ms del 50 % de las cepas indicadoras estudiadas. En la Tabla 4 se muestran
los resultados del estudio en mayor profundidad del espectro de actividad de ambas cepas.
Tabla 4: Actividad bacteriocina detectada por el mtodo "spot-on-the-lawn" de las cepas L. plantarum J23 y L.
plantarum J51
Inhibicin del crecim iento Inhibicin del crecim iento
B acteria indicadora
prod ucido por L . plantarum J23 a prod ucido por L . plantarum J51 a
(N de cepas)
++ + - ++ + -
O enococcus oeni (23) 14 6 3 21 2 -
Pediococcus pentosaceus (5) 5 - - 5 - -
P. acidilactici (3) 2 1 - 3 - -
P. parvulus (2) - 2 - - 2 -
Lactobacillus plantarum (22) 1 7 14 14 4 4
L. hilgardii (3) 3 - - 3 - -
L. paracasei (2) - - 2 2 - -
L. brevis (1) - - 1 - - 1
L. ferm entum (1) - - 1 1 - -
L. pentosus (1) 1 - - 1 - -
L. sakei (1) - - 1 - - 1
Lactococcus lactis (3) - - 3 - 1 2
Leuconostoc m esenteroides (3) - - 3 - - 3

10
* Fuerte inhibicin del crecimiento (++), dbil inhibicin (+), sin inhibicin (-).
Ambas actividades antimicrobianas se estudiaron en cultivos lquidos y demostraron ser
termorresistentes, de naturaleza peptdica, resistentes al tratamiento con los disolventes
orgnicos cloroformo y etanol, y de un tamao molecular menor de 10 Kda, por lo que
reciben el nombre de plantaricinas. Puesto que la cepa J-51 presentaba una mayor actividad
frente a otras cepas de BAL, se eligi para estudios posteriores.

10 4 UFC/m l 10 5 UFC/m l 10 6 UFC/m l 10 7 UFC/m l 10 8 UFC/m l

Figura 9: Curvas de crecimiento y actividad plantaricina de J-51. Las flechas indican el inicio de la produccin
de la actividad.

Figura 10: Microscopia de fluorescencia de clulas de L. plantarum J-51 en presencia de distintas cantidades de
etanol y durante diversos periodos de tiempo

8 % etanol 12 % etanol

10 min 10 min

1h 1h

11
Colores de la figura: en rojo se tien las clulas daadas, en verde las clulas viables.
La cepa J-51 fue preparada en forma de lofilo activo para su inoculacin directa en vino por
la empresa Lallemand, y fue inoculada en vinos tintos de la D.O.Ca. Rioja. Esta cepa llev a
cabo la fermentacin de los vinos cuando stos haban sido previamente filtrados
amicrbicamente a travs de un filtro de 0.42 m, sin embargo no logr imponerse a la
microbiota endgena de los vinos y las clulas de L. plantarum J-51 nicamente
permanecieron en el vino durante los primeros 8 das de la fermentacin malolctica, siendo
el grado alcohlico del vino 13.5 % (vol/vol) (Lpez et al., 2007).
Perspectivas futuras

Como se ha visto, el potencial de las bacterias productoras de bacteriocinas es muy alto, y es

adems un campo en el que la investigacin bsica de los mecanismos celulares implicados en
la respuesta al medio externo y a la presencia de otras clulas en el mismo debe continuar
desarrollndose. Las perspectivas futuras de trabajo del grupo de investigacin son, en primer
lugar, realizar el estudio in vitro y en vinos de la pediocina sola y en combinacin con el
metabisulfito sdico para la conservacin de los vinos, puesto que cepas productoras de esta
bacteriocina son capaces de crecer en medios acidificados. Se continuar con la bsqueda de
fermentados de BAL productoras de bacteriocinas que sean activos y tengan una composicin
similar al de un extracto de uva. Y asimismo, se continuar con la caracterizacin de BAL
endgenas de los vinos que demuestren una actividad bacteriocina y que tengan la capacidad
de crecer en un vino y de llevar a cabo la fermentacin malolctica con el fin de que puedan
ser utilizadas como cultivos iniciadores.
Referencias bibliogrficas
Allende, A., Toms-Barbern, F.A. and Gil, M.I. 2006. Minimal processing for healthy
traditional foods. Trends in Food Sc. Technol. 17: 513-519.
Cheigh, C. I., and Y. R. Pyun. 2005. Nisin biosynthesis and its properties. Biotechnol. Lett.
27: 1641-1648.
Chen, H. and Hoover, D.G. 2003. Bacteriocins and their food applications. Comprehensive
reviews in food science and food safety, 2: 82-100.
Cintas, L. M., M. P. Casaus, C. Hrranz, I. F. Nes, and P. E. Hernndez. 2001. Review:
Bacteriocins of lactic acid bacteria. Food. Sci. Tech. Int. 7: 281-305.
Cotter, P. D., C. Hill, and R. P. Ross. 2005. Bacteriocins: developing innate immunity for
food. Nat. Rev. Microbiol. 3: 777-788.
Engelke, G., Z. Gutowski-Eckel, M. Hammelmann, and K. D. Entian. 1992. Biosynthesis of
the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein.
Appl. Environ. Microbiol. 58: 3730-3743.
Ennahar, S., T. Sashihara, K. Sonomoto, and A. Ishizaki. 2000. Class IIa bacteriocins:
biosynthesis, structure and activity. FEMS Microbiol. Rev. 24:85-106.
Gratia, A. 1925. Sur un remarquable exemple dantagonisme entre deux souches de
colibacille. C. R. Soc. Biol. 93: 10401041.

12
Lpez, I., Lpez, R., Santamara, P., Torres, C. and Ruiz-Larrea, F. 2007. Performance of
malolactic fermentation by inoculation of selected Lactobacillus plantarum and Oenococcus
oeni strains isolated from Rioja red wines. Vitis (in press).
Mattic, A.T.R. and Hirsh, A. 1947. Further observations on an inhibitory substance (nisin)
from lactic streptococci. Lancet 2, 5-7.
Moll, G. N., N. Konings, and A. J. Driessen. 1999. Bacteriocins: mechanism of membrane
insertion and pore formation. Antonie van Leeuwenhoek. 76: 185-198.
Montville, T. J., and Y. Chen. 1998. Mechanistic action of pediocin and nisin: recent progress
and unresolved questions. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 511-519.
O'Sullivan, L., R. P. Ross, and C. Hill. 2002. Potential of bacteriocin-producing lactic acid
bacteria for improvements in food safety and quality. Biochimie 84: 593-604.
Rogers, L. A., and E. D Whittier. 1928. Limiting factors in lactic fermentation. J. Bacteriol.
16: 211229.
Rojo-Bezares, B., Saenz, Y., Navarro, L., Zarazaga, M., Ruiz-Larrea, F. and Torres, C. 2007.
Coculture-inducible bacteriocin activity of Lactobacillus plantarum strain J23 isolated from
grape must. Food Microbiol. 24(5):482-91.
Rollema, H.S., J. W. Metzger, P. Both, O. P. Kuipers, and R. J. Siezen. 1996. Structure and
biological activity of chemically modified nisin A species. Eur. J. Biochem. 241: 716-722.

13