Cromatografa

Objetiv0s materiales diagrama

2.- OBJETIVOS. -

Realizar una separacin de una mezcla de colorantes aplicando cromatografa de

columna.
Determinar los parmetros de la columna cromatogrfica y trazar un cromatograma
aproximado utilizando curvas calibratorias estndar
Separar los pigmentos presentes en un triturado de hojas de acelga con cromatografa
de columna.
Realizar la separacin aplicando CCF de una mezcla de azcares con sustancias
orgnicas neutras no polares y revelarlas con una mezcla de cido sulfrico y etanol.
Desarrollar la separacin cromatogrfica con CCF de una mezcla de aminocidos y
revelar la placa con rociado con solucin de ninhidrina.
Clculo del valor de Rf para cada uno de los compuestos. Justificacin de las diferencias
en Rf de los distintos aminocidos.
Identificacin de la naturaleza de compuestos desconocidos, comparando con el avance
de muestras patrn.
Determinar las capacidades de intercambio de resinas catinicas y aninicas.
Separacin de mezclas de cationes y de aniones coloreados en base a las diferencias
de los coeficientes de selectividad.
Ensayo de elucin con gradiente de concentracin.
3.- MATERIALES.-

Bote de vidrio (Cmara Cromatogrfica) (2)

Probeta 10 mL
Papel aluminio
Cuentagotas plstico + Puntas para CCF (2)
Cuentagotas de vidrio
Pinzas metlicas de diseccin
Placas de slice
Secador (1 por mesa)
Atomizador casero.
 4.- PARTE EXPERIMENTAL
Cromatografa de columna
a)separacin de una mezcla de colorantes
I. preparacin de la columna
Comprobar que la llave de la
columna est cerrada aadir la
Preparar una suspensin con suspensin de almina
15 g slica gel en etanol al activada en etanol al 96%.
96% (aprox. 20 ml).
Durante esta elucin inicial la
almina sedimenta y, al
El etanol que se obtiene de la finalizar la elucin, debe
columna durante esta parte del presentar un aspecto uniforme
proceso se puede reutilizar. y una superficie lisa y
perpendicular al eje
longitudinal de la columna.
II. Siembra de la muestra
Finalizada la adicin de la
Una vez compactada la columna
muestra se abre la llave de la
se proceder a sembrar,
columna y se eluye hasta que
depositar, 1 ml de la muestra sobre
la muestra sea adsorbida y el
la superficie de la slica gel con la nivel del lquido quede
ayuda de una pipeta. aproximadamente 1 mm por
encima de la superficie del
adsorbente.
. adsorbente.
III. Elucin de la columna
A medida que evoluciona el
Adicionar, con la ayuda de una
cromatograma se observa que el
pipeta Pasteur y lentamente, 10 ml
azul de metileno eluye a lo largo
de etanol en la parte superior libre
de la columna, formando una
de la columna y abrir la llave para
banda de color azul bien
permitir el flujo del etanol a travs
diferenciada que se desplaza hacia
de la almina.
la parte inferior de la misma,
mientras que el naranja de metilo
queda retenido en la parte
superior. Si es necesario se aadir
ms etanol a la columna durante el
proceso de elucin.
Golpear suavemente, con un
tubo de goma o con el dedo,
las paredes externas de la
columna para favorecer la
eliminacin de las burbujas de
aire que se puedan haber
formado.
Abrir la llave de la columna y
dejar fluir lentamente el etanol
hasta que la altura de ste
quede 2 mm por encima de la
almina.
Si la pared interna de la columna
se ha manchado con la muestra al
depositarla, se lava dejando gotear
por ella un poco del eluyente (con
la ayuda de la pipeta) y se eluye de
nuevo hasta que el nivel del
lquido vuelva a quedar 1 mm por
encima de la superficie del
Finalmente se aade 1 ml de
etanol y se eluye de nuevo hasta
que el nivel del lquido vuelva a
quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.
Cuando el azul de metileno est
prximo a la salida de la columna
se proceder a recoger fracciones
en matraces Erlenmeyer
numerados de forma consecutiva,
hasta que todo el producto se haya
recogido y el etanol no presente
coloracin azul.
 Dejar fluir el etanol a travs de la columna hasta que la altura de
ste quede 2 cm por encima de la slica y llenar la parte superior
libre de la columna de agua destilada (cambio de eluyente), con
la ayuda de una pipeta Pasteur y lentamente. Abrir la llave de la
columna y dejar fluir el agua a travs de la almina. A medida que
evoluciona el cromatograma se observa que el naranja de metilo
eluye a lo largo de la columna, formando una banda de color
naranja bien diferenciada que se desplaza hacia la parte inferior de
la misma. Cuando el naranja de metilo est prximo a la salida de
la columna se proceder a la recoleccin de fracciones siguiendo
un procedimiento anlogo al anterior para el azul de metileno,
hasta que el agua no presente coloracin.

b).- Separacin de pigmentos vegetales.

I. Preparacin de la Columna:
Similar a la del inciso (a), pero
utilizando etanol al 90%

II. Siembra de la muestra:

Finalizada la adicin de la muestra
Una vez compactada la columna
se abre la llave de la columna y se
se proceder a sembrar,
eluye con etanol 90% hasta que la
depositar, 2 ml de un extracto de
muestra sea adsorbida y el nivel
acelga o espinaca (extrado con
del lquido quede
etanol, i-propanol o hexano).
aproximadamente 1 mm por
encima de la superficie del
adsorbente.
Si la pared interna de la columna
se ha manchado con la muestra al
depositarla, se lava dejando gotear
por ella un poco del eluyente (con
la ayuda de la pipeta) y se eluye de
nuevo hasta que el nivel del
lquido vuelva a quedar 1 mm por
encima de la superficie del
adsorbente.

Finalmente se aade 1 ml de
etanol y se eluye de nuevo hasta
que el nivel del lquido vuelva a
quedar 1 mm por encima de la
superficie del adsorbente.
III. Elucin de la Columna:

Adicionar, con la ayuda de una Conforme las bandas empiezan a

Continuar aadiendo porciones de bajar y a separarse en la columna,
pipeta lentamente, 5 ml de etanol
2-3 mL del eluyente y anotar todos recolectar las fracciones de los
90% en la parte superior libre de la
los cambios en la apariencia de la pigmentos separados en tubos de
columna y abrir la llave para
columna. ensaye numerados.
permitir el flujo del etanol a travs
de la slica gel.

Si ya no hay movimiento de los Mientras el movimiento de los

pigmentos, empezar a usar como
eluyente el. solvente puro o la
mezcla de la siguiente polaridad
decreciente y continuar con el
mismo solvente hasta que
nuevamente ya no haya cambios.
pigmentos ocurra a una velocidad
apreciable, continuar aadiendo
porciones del mismo solvente, no
importa cul sea el volumen
utilizado ni cuantos tubos se llenen
con el mismo eluyente.
Cambiar de tubo cuando est lleno
hasta dos terceras partes o antes, si
se nota un cambio de coloracin
en el eluyente
 Continuar eluyendo los pigmentos
con solventes de polaridad
decreciente. El orden de solventes
que debe seguirse, para esta
prctica es el siguiente:etanol-
isopropanol-metiletileter-
ciclohexanona-hexano
Cromatografa de Capa Fina.
I. Preparacin:
Antes de comenzar compruebe que
todo el material y la zona de trabajo
estn perfectamente limpios y
secos.
Tape la cubeta con tapa de vidrio,
papel de aluminio o un vidrio de
reloj para evitar la evaporacin. El
nivel de lquido debe quedar por
debajo de la lnea de la placa para
que no pueda tocar la/s muestra/s.
Disuelva una pequea cantidad de
la/s muestra/s a analizar en un
disolvente voltil intentando que la
disolucin no est ni muy diluida ni
muy concentrada.
II) Preparacin de patrones, muestras y soluciones reveladoras:
a).- Aminocidos
Disoluciones patrn de
aminocidos: 1mg/ml en etanol al
96 %, 0,5 M en HCl. Patrn 1:
fenilalanina. Patrn 2: -alanina.
Patrn 3: cido asprtico. Patrn
4: lisina Patrn 5: prolina.
Patrn 6: serina Patrn 7:
cistena Patrn 8: triptofano
b).- Azcares
a) Disolver 0.1 ml de anilina (
0,93 gramos) , y 1.7 gramos de
cido ftlico en 100 ml de butano!.
Calentar a 100C por 10 minutos y
dejar enfriar.
Anotar los resultados en una tabla:
los colores de las fracciones
recolectadas, el solvente con el
que se eluy cada una de ellas y el
volumen aproximado de cada
fraccin.
Tome con las pinzas una placa para
cromatografa ya cortada y
depostela en una zona limpia y
seca de la mesa.
Introduzca en la/s cubeta/s de
cromatografa el eluyente (hasta
una altura de aproximadamente 0,5
cm).
n-butanol HAc agua (4;1:5)
i-propanol HAc agua (3;1:1)
Disolucin de revelado:
Ninhidrina al 0,3 % (p/v) en n-
butanol/cido actico al 3% (v/v)
Fase mvil: N-propanol:NH3 30
% (7:3, v/v)
b) Mezclar 80 ml de solucin I, y
20 ml de Solucin II
SOLUCION I: NaI04 al 2% :
Disolver 2 g de peryodato de sodio
en 100 ml de agua
Con un lpiz dibuje una lnea
horizontal a aprox. 1 cm del borde
inferior de la placa. Sobre esta lnea
marque suavemente tantas X como
muestras a analizar con especial
cuidado en no acercarse a los
Bajo cada X anote con lpiz el
cdigo que indique a que muestra
corresponde.
IMPORTANTE: las placas no
deben tocarse con los dedos en la
zona plana.
Disolucin problema (puede
contener uno o varios
aminocidos)
SOLUCION II: KMn04 al 1% en
Na2CO3 al 2%: Disolver 1 g de
permanganato de potasio en 100
ml de carbonato de sodio al 2% el
cual previamente se prepar
disolviendo 2 gramos de Na2CO3,
en 100 ml de agua.
 III) Sembrado de las muestras:

Sumerja una punta de un capilar Deje secar al aire y compruebe si

para CCF en la disolucin patrn o
muestra y una pequea cantidad de
lquido ascender por capilaridad.
Apoye suavemente la punta en la X
correspondiente sobre la placa y
deje que la disolucin descienda
hasta formar un pequeo crculo.
IV) Elucin:
hay suficiente muestra mirando la
placa a la luz UV. Se deben ver
crculos morados oscuros en los
puntos donde se ha depositado la
muestra. Si no hay suficiente
cantidad puede aadir de nuevo,
pero dejando secar antes de eluir.
Para comparar con patrones se hace
directamente la mezcla de la
muestra y el patrn (Mixto) sobre
la placa. El lquido que contiene la
punta suele ser suficiente para
depositar un poco en la X de la
muestra y poner un poco tambin
en la X del toque mixto.

Con ayuda de las pinzas introduzca
cuidadosamente la placa en la cubeta (deje
que la parte superior se apoye ligeramente en
la pared). Tape la cubeta y deje que ascienda
el eluyente por capilaridad. Asegrese de que
el frente del disolvente sube igual en toda la
placa, si sube torcido saque rpidamente la
placa y consulte al profesor/a.
Cuando el frente del eluyente llegue a aprox.
0,5 cm del borde superior, saque la placa,
marque con lpiz la lnea del frente (altura a la
que ha llegado el eluyente) y deje evaporar el
disolvente al aire en la vitrina.

V) Visualizacin de los compuestos:

a).- Separacin de mezclas de azcares

Al concluir la separacin Rociar cuidadosamente con la Visualizadas las manchas, trazar

cromatogrfica, dejar secar la disolucin de revelado un borde alrededor de cada una
placa sobre el mesn a Dejar secar nuevamente en estufa con un lpiz.
temperatura ambiente. a 80 durante 15 min. Identificar los azcares de cada
patrn y de la muestra y calcular
sus valores de Rf.
b).- Separacin de una mezcla de aminocidos.

Terminada la cromatografa se saca la placa,

se marca la distancia recorrida por el
eluyente, se seca dentro de la campana de
gases con la ayuda de un secador de aire y se
roca con un pulverizador que contiene la
solucin reveladora de Ninhidrina 0,2% p/v
(en la campana de gases). La placa se secar
hacindole llegar aire caliente con el secador.
 Intercambio Inico
I. Determinacin de la capacidad de intercambio de la resina:
a).- Resina Catinica:
Colocar un tubo de vidrio en
posicin vertical y cerrar, con pinza
de Mohr, el tubo de goma colocado
en su extremo inferior.
Cuando el pH del efluente sea
neutro al papel, suspender el
agregado de la solucin de NaCl.
Retirar el Erlenmeyer y sustituirlo
por un vaso de precipitado,
entonces hacer pasar agua destilada
a travs de la columna para lavar la
resina.
Titular el lquido del Erlenmeyer con
solucin valorada de NaOH 0,1N.
Trasvasar la resina a la probeta y medir
su nuevo volumen una vez
sedimentada. Luego volver al vaso de
precipitado y regenererla con HCl 4 M.
b).- Resina Aninica:
Proceder dem que en (a), solo que empleando NaOH 4M para la preparacin y regeneracin de
la resina y solucin valorada de HCl 0,1N para la titulacin respectiva.
II. Preparacin de las Columnas de Intercambio:
a).- Columnas delgadas para separacin de sales coloreadas.
Tomar dos buretas de 10 ml y
colocar en su interior u trozo de
algodn (no apretado),
recorrindolo al fondo de la bureta
con una varilla de vidrio.
Agregar agua destilada hasta de
su altura total. Colocar en una
probeta la resina suspendida en
agua destilada. La misma debe
estar pretratada (en contacto
batch) y en forma protnica
Agregar nuevas porciones de NaCl
cuando el lquido desciende a
menos de 5 cm por encima del
nivel de la resina. Comprobar el pH
del efluente con papel indicador
universal.
Humedecer con agua destilada y
llenar la primera con una
suspensin de resina de
intercambio catinica y la segunda
con resina de intercambio aninica;
ambas hasta un volumen de lecho
empacado de 10 ml.
Dejar penetrar la muestra en la
parte superior de la columna,
agregando a continuacin primero
unos mililitros de agua destilada y
posteriormente una solucin de
concentracin creciente de cloruro
de potasio en la columna de
intercambio aninica y de sulfato
de sodio en la columna aninica.
Dejar sedimentar y medir el
volumen de la resina. Volverla al
vaso de precipitado y transvasarla a
la columna, dejando drenar agua
destilada a un vaso, hasta que el
nivel en la columna quede unos 5
cm por encima de la resina. (nunca
dejar que el nivel del liquido quede
por debajo de la resina).
Sustituir el vaso de precipitado por
un Erlenmeyer de 500 ml y
comenzar el agregado del NaCl 5
%, en la columna, en porciones de
10-20, regulando el caudal del
efluente a unas 20 gotas por
minuto, recogindolo en el
Erlenmeyer.
Colocar un tapn de algodn ms
delgado en la parte superior y
saturar lentamente ambas a sus
formas sdica y de cloruro con una
solucin de NaCl de mediana
concentracin. (velocidad de flujo
de 1 ml/min), durante unos 15
minutos.
Lavar las dos columnas con
abundante agua destilada.
Colocar en la parte superior de la
resina catinica 1 ml de una
muestra de una mezcla de cationes
de coloraciones intensas y en la
resina aninica 1 ml de una mezcla
de aniones coloreados provistos
por el docente.
 b).- Columnas gruesas para seguimiento de la velocidad de saturacin y separacin de
sales complejas.

Humedecer con agua destilada y Colocar un tapn de algodn ms

Tomar dos ampollas de separacin
llenar la primera con una
graduadas de 50 ml y colocar en su
suspensin de resina de
interior u trozo de lana de vidrio,
intercambio catinica y la segunda
recorrindola al fondo de la
con resina de intercambio aninica;
ampolla con una varilla de vidrio.
ambas hasta un volumen de lecho
empacado de 40 - 45 ml.
delgado en la parte superior y
saturar lentamente ambas a sus
formas protonada e hidroxlica
respectivamente aadiendo para tal
efecto soluciones de HCl 4N en la
primera y de NaOH 4N en la
segunda. (velocidad de flujo de 5
ml/min), durante unos 20 minutos.

Interrumpir el flujo justo cuando el

borde superior del lquido est al
mismo nivel de la parte superior de
la columna.
Tapar las ampollas en espera de la
siembra de las muestras que se
quieren separar.

III. Elucin de las Columnas de Intercambio:

a).- Separacin de sales coloreadas.
Proceder a la elucin de las
columnas delgadas catinica y
aninica) con una velocidad de
flujo lenta (10 a 15 gotas por
minuto) haciendo un seguimiento
de la separacin de las bandas
coloreadas en cada columna.
Recolectar en frascos de vidrio
pequeos con tapa esmerilada
volmenes iguales de eluato de
cada resina y cuidando de separar
las porciones que hayan arrastrado
los cationes y aniones que van
emergiendo de la columna
Preparar en tubos de khan patrones
estndar de dilucin de cada una
de las sales coloreadas para
determinar por comparacin
colorimtrica concentraciones
aproximadas de los eluatos
recogidos

Una vez que hayan emergido todas

las bandas de color, lavar la resina
con abundante agua destilada y
repetir la experiencia si no se
hubiera realizado una separacin
adecuada.

b).- Velocidad de saturacin de una columna de intercambio catinico.

Agregar a cada porcin que se vaya Titular 5 ml de cada una de las

Lavar la columna catinica con
extrayendo 2 a 3 gotas de porciones seleccionadas con
abundante agua destilada.
fenolftalena. solucin valorada de cido
Iniciar la saturacin de la misma
Separar aquellas porciones en las clorhdrico.
con solucin de hidrxido de sodio
que se observa coloracin rosado Trazar la curva de saturacin de la
0,5M a una velocidad de 1 a 2
columna en una grfica de gasto de
ml/minuto, recogiendo el eluato en
titulante vs. Volumen eluido.
frascos de vidrio con tapa
esmerilada en porciones de
aproximadamente 10 ml c/u.
 c).- Separacin de sales complejas en una columna de intercambio aninico.
Drenar el lquido hasta que el nivel
del mismo est justo sobre el nivel
de la resina
Pipetear 0,50 ml de muestra y
sembrarla muy cuidadosamente
sobre la resina, evitando que se
produzca agitacin en la superficie
de la misma.
Se cambia nuevamente la
concentracin del eluyente a HCl
0,5M para separar la ltima banda
de hierro. Proceder en la
recoleccin al igual que en los dos
casos anterioresColocar los tubos
reolectados en tres series en una
gradilla.
Agregar a los tubos conteniendo
cobalto y hierro 5 ml de solucin de
tiocianato de potasio.
A los tubos conteniendo cobre,
adicionar solucin de amonaco 6 M y
completar a aproximadamente 15 ml en
los tubos respectivos.
Una vez que la muestra ingres a la Luego se pueden agregar
columna y cuando el nivel de fase volmenes mayores regulando a
lquida es el mismo de la resina, se su vez, el caudal en 15 a 20
comienza a agregar HCl 4 M, gotas/min.Recoger el eluato inicial
inicialmente en pequeo volumen, en un vaso de precipitacin o
hasta alcanzar una altura apenas matraz Erlenmayer de 200 ml.
sobre el nivel de la resina, de modo
que nuevos agregados no alteren su
superficie.
Cambiar la concentracin de
Cuando la banda azul de cobalto se
eluyente y usar HCl 1 M, para sacar
aproxima al extremo inferior de la
el cobre (banda amarilla) de la
columna se quita el vaso de
columna, recolectando el eluato
precipitado y se reemplaza por
nuevamente en un matraz EM.
tubos de ensayo sucesivos de 10
Cuando esta banda llegue al
ml, recogiendo el eludo hasta que
extremo inferior de la columna se
haya desaparecido la banda azul.
recoge nuevamente en tubos
sucesivos de 10 ml.
Determinar las concentraciones
aproximadas de cada tubo
comparando su coloracin con
soluciones patrn que hubieran
recibido el mismo tratamiento.
Trazar un grfico aproximado de la
elucin de dicha columna.
Potenciometria

Lo mismo

Conductimetria

Cuestionario