PCR:Reaccinencadenadelapolimerasa

GonzaloGreif.
UnidaddeBiologaMolecular.InstitutPasteurMontevideo
ndice:

Historia
LaReaccinencadenadelapolimerasa(PCR)
Algunostipsexperimentales
VariantesdelaPCR
Unavarianteespecial:PCRentiemporeal

1. Historia

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls: Polymerase chain reaction) fue
concebidaporelDr.KaryMullis(verrecuadro)aprincipiosdeladcadadel80.Sibiensediscutequeen
el desarrollo final de la tcnica participaron varios investigadores y que el proceso para la puesta a
puntodelatcnicainvolucrvariosaos,hayunconsensoquelaideaoriginalfuedesarrolladaporel
Dr.Mullis,yporelloobtuvoelpremioNobelunosaosmstarde.EnellibroMakingPCR:astoryof
biotechnology, Paul Rabinow cuenta en detalle los acontecimientos histricos que dieron lugar a la
invencindelatcnica.

Segncuentaensupginaweb(www.karymullis.com),laprimeraideasurgienlamedianochedeun
viernesenabrilde1983,conduciendoconsuHondagrisentreCloverdaleyBonevilleeimaginandola
reaccin. La historia completa se encuentra
contada de forma muy potica en su pgina KaryMullis(1944).
web.
KaryBanksMullisnacien1944enLenoir,Carolinadel
Hasta ese momento obtener cantidad Norte.EstudienelInstitutodeTecnologadeGeorgiay
suficiente de ADN puro para realizar en1972obtuvoundoctoradoenbioqumicadela
experimentosconstitualaetapalimitante.La UniversidaddeCalifornia,Berkeley.Luegodeun
aparicin de las enzimas de restriccin en la posdoctoradoenlaUniversidaddeSanFrancisco,se
dcadadel70yeldesarrollodelatecnologa incorporalaCorporacinCetuscomoqumico.Enlos7
del ADN recombinante a fines de los 70 aosqueestuvoall(19791986)trabajenlasntesisde
haban hecho posible la obtencin de oligonuclotidosydesarrollelconceptodelaPCR.
fragmentosprecisosdecidosnucleicospara
ser estudiados en detalle. Sin embargo, la En1986fuedesignadodirectordebiologamolecularen
invencin de la reaccin en cadena de la XytronyxInc.enSanDiego,dondecontinusutrabajoen
polimerasa produjo un salto tecnolgico, tecnologasdeADNyfotoqumica.
permitiendo a los investigadores producir
cantidades ilimitadas de ADN especfico, sin En1993recibielpremioNobelporsuinvencindela
dependerdelclonadodefragmentosdeADN reaccinencadenadelapolimerasa.Elprocesoque
en organismos vivos. Por otra parte la PCR Mullisconceptualizen1983,esunodelosprincipales
mostr tanta versatilidad, que ao a ao se avancesdelabiologamoleculardelsigloXX.
fueron desarrollando nuevas aplicaciones y
variantes. Hoy es una herramienta ActualmenteesunInvestigadorenelHospitaldeNiose
InsitutodeInvestigacinenOakland.Viveconsuesposa,
enCoronadelMaryenAndersonValley,California.

Fuente:www.karymullis.com
fundamen
ntalencualqu
uierlaboratorriodebiologamolecular.

encadenadelapolimerassa(PCR).
2. EllmtododelaReaccine

La PCR es
e una tcnicca enzimticca in vitro utilizada paraa amplificar exponencialm mente una rregin
determinaada de ADN situada entre dos region nes de ADN, cuya secuencia se conoce, a partir dee una
mezclaco omplejadeccidosnucleicos.Paraello requiere:(i) elmoldeap partirdelcuaalsegenerarnlas
copias,(ii)dosoligonu
ucletidos(ce ebadoresoprrimers)especcficoscompleementariosaunaporcindela
ue se desea amplificar,
regin qu a (iii) una enzima capaz de ssintetizar ADN utilizando como moldee ADN
(una ADN N polimerasaa) o ARN (una ADN polimerasa ARN N dependien nte) en el caaso de la RTTPCR
(retrotran
nscripcin segguida de PCR R) y (iv) los deoxinucleti
d idos (dNTPs) que sern incorporados a las
cadenas nacientes
n de ADN (Figuraa 1). El resulltado de la rreaccin son varios millones de copiaas del
fragmento odeADNcommprendidoen ntrelosdosoligonuclotiddosespecfico os.

Figura1.D
DescripcindelprocesodePC CRenlosprime
eros3ciclosdeereaccin(tom
madodeLauraaEspinosaAsuaar,
2004:Guaaprcticasobre
elatcnicadePCR).

Generalm mente,lareacccindeampllificacindeP PCRsedescriibeentrespaasoscaracterrsticos.Laprimera

fase,denoominadafasselag,enlo osprimeros5 510ciclos(deependiendod delacantidaaddemolde inicial
presente en la reacci
n), dnde noo se produce en todava loss fragmentoss especficos. La segunda,, es la
faseexponencial,en nla cualen cada
c ciclose duplicanlos fragmentos producidoseenel cicloanterior
(figura1)yporltimo,lafaseplateeau,enlacu ualnoseprodducemsamplificacin(Fiiguras1,2).

Ciclo Copiasd
deADN
1 2
2 4
3 8
4 16
5 32
6 64
7 128
8 256
9 512
10 1024
11 2048
12 4096
13 8192
14 16384
15 32768
Figura2.C
CinticadelaP
PCR.Enlagrficcasemuestran
nlasdiferentessfasesdel
16 65536
PCRgraficaandolacantidaaddeADNgen neradaenfunccindeloscicloosde 17 131072
amplificacin. 18 262144
19 524288
20 1
1048576
bla 1 se mue
En la tab ponencial y l a duplicacin
estra la ampllificacin exp n del 21 2
2097152
fragmento oespecficoe encadaciclo..Partiendode eunamolcuuladelfragmento, 22 4
4194304
23 8
8388608
al cabo de 30 ciclos se
e obtienen en N del
e teora 1 biilln de molculas de ADN
24 166777216
fragmento o amplificado (aunque la tabla no contempla rrealmente lo o que 25 333554432
sucede en
e la reacci n, permite visualizar el
e poder de la amplificaacin 26 677108864
exponenccial). 27 1344217728
28 2688435456
29 5366870912
Tabla1.Amplificacinexponenccial.Latablain dicalacantidaadde
30 10733741824
fraggmentosproduucidostericam
menteencada ciclo,siseparrtiera
deuunacopianicaadeADNmold
de.

Engeneraalcadaciclod
delareaccinsedivideen3partes(figuura3):

a.. Desnaturalizacin:ene estaetapa,elADNmolde doblecadenasedesnaturalizaysush hebras

seseparann.Estoselogrraaumentand dolatemperraturadelareeaccin,engenerala94oCCpara
asegurar que
q todas lass molculas se
s encuentrann en simple hebra y perm
mitir que ocu
urra el
segundoppaso.
b. Anilladoo annealing:e enestaetapaa,latemperatturadelareaaccindismin nuyeparapeermitir
quelosoligonucletido oscebadoresquedelimitaanelfragmentoquesed deseaamplificcarse
 unan a su regin blanco. La temperatura de unin de los cebadores depender de la
composicindebasesdelosmismos(verapartado:Cebadores).
c. Extensin:enestepaso,latemperaturadelareaccinesaquellaquepermitelaactividad
ptimadelaenzimapolimerasapresenteenlareaccin(verapartado:ADNPolimerasas).

Cebadores: ADNPolimerasas:

Los cebadores o iniciadores de la reaccin son
oligonucletidos cortos (entre 18 y 30
nucletidos), complementarios a la secuencia
blanco que se desea amplificar. Se utilizan dos
cebadores en cada reaccin, cada uno
complementario a uno de las hebras del ADN
molde, delimitando la regin que se desea
amplificar.Amododeejemplo:
5.AATCGTAGCTACCGTCGAC..3
ATGGCAGCTG5
Reverso
Directo
5 AATCGTAGC
3.TTAGCATCG.ATGGCAGCTG..3 polimerasas requieren Magnesio como cofactor
Delasecuenciadeestoscebadoresdependerla
especificidaddelareaccin.Veintenucletidos
permiten una alta especificidad? Una molcula
de ADN puede contener 4 tipos de nucletidos:
A, T, C o G. La probabilidad de encontrar cada
uno de ellos es 1/4=0,25, entonces la
probabilidaddeencontrarunadeterminadaden
bases es (0,25)n. Un cebador de 20 bases, tiene
en teora una probabilidad de (0,25)20=9,9e13
de ser encontrada por azar. La respuesta a la
preguntaplanteadamsarriba,entonces,ess.
Temperaturadeanillado.Enelsegundociclode
lareaccindePCR,latemperaturautilizadaestal
que permite la unin de los cebadores a su
secuenciablanco.Estatemperaturasedetermina
dependiendo de la temperatura de
desnaturalizacin o melting de los mismos. La
temperaturadedesnaturalizacin(Tm)sedefine
como la temperatura a la cual el 50% de las
molculas se encuentran desnaturalizadas. Hay
varios algoritmos que permiten calcular dicha
temperatura. En la prctica, una frmula muy
utilizada es la siguiente: Tm=4(G+C)+2(A+T), (ej:
para la secuencia AGGTCGTGCA, la
Tm=4(4+2)+2(2+2)=32C, y en general se utiliza
estatemperaturamenos5grados,comoprimera
aproximacinalatemperaturadeanillado.
Las ADN polimerasas son enzimas que
intervienen en la replicacin del ADN. Son
capacesdeadicionardNTPSapartirdelaregin
3de uncebador y copiar una secuenciamolde.
LaspolimerasassintetizanelADNenladireccin
5' a 3'. Ninguna ADN polimerasa conocida es
capaz de comenzar una nueva cadena. Ella slo
puede aadir un nucletido en un grupo 3'OH
queyaexiste.Porestaraznlaenzimaprecisaun
cebador que presente un grupo 3' OH al cual
puede aadir el primer nucletido. Las ADN
paraserfuncionales.
Eneldesarrollodelatcnica,laenzimautilizada
era una polimerasa aislada de E.coli (fragmento
KlenowdelaADNpolimerasaI),quepresentasu
actividadptimaa37oC,yseinactivaa94oC,es
porelloqueencadacicloeranecesarioagregar
ms enzima. Luego, se sustituy por una
polimerasa termoestable aislada de Thermus
aquaticus (Taq),una bacteria termfila que vive
en la proximidad de las fuentes de agua termal
(entre 50 y 80 oC), es por esto que su enzima
polimerasaesmsestable,ypermitesoportarlas
temperaturas elevadas durante los ciclos de la
PCR.
En la actualidad se han descrito y utilizado
diferentespolimerasasenlareaccindePCR.La
eleccin de la enzima depender de factores
tales como: la fidelidad de la enzima o tasa de
error (capacidad de producir errores o no
durante el copiado), la velocidad (cantidad de
nucletidos incorporados por segundo en la
cadena naciente de ADN), la procesividad
(capacidad de unirse al molde), la actividad
exonucleasa (capacidad de correccin de
errores),extremosdelADNresultante,etc.
Figura3.P
Pasosdurantee
elciclodereacccindelaPCR
R.

3. AlgunosTipse
A experimentales:

Conceptualmente, la tcnica de lal reaccin en

e cadena dde polimerassa es sumam mente sencilla, sin
embargo la puesta a punto
p de unaa reaccin en
n particular ddebe consideerar algunos aspectos, para ser
exitosa.Enlapresente
eseccin,repasaremossom meramenteaalgunosdeestoselemento os.

a. Compo
onentes

UnareacccinconvenciionaldePCRssepuederealizarconlasigguientefrm
mula:

Com
mponente Concentraacininicial Concentraciinfinal V
Volumenparaa20uL
ensoluccinstock enlareacccin (uL)
dNTPs
d 2,5
5mM 0,25m mM 2
Tampn ndereaccin 10X
1 1X 2
Oliggodirecto 10uM(110pmol/uL) 1a5uuM 0,10,5
Oliggoreverso 10uM(110pmol/uL) 1a5uuM 0,10,5
Polimerasa 5UU/uL 1U 0,2
Molde
M Deppende Dependde Dependee
AgualibredeADNasaa csp.20uL

Lacantidaaddemolderrequeridadep
pendedeltip
podeADNqu esetrate(AD
DNgenmico
o,plasmdico,etc).

nqueseincluyenconlas enzimascom
Engeneraallostamponesdereacci mercialmentedisponibleinncluye
unaconceentracinestndardeClorurodeMagn nesio,quepeermiteunaacctividadcomp
pletadelaen
nzima.
La concentracin de MgCl2 presente en la reaccin es una de las variables con las cuales se pueden
ponerapuntoalgunasreacciones.

Enlarealizacindelareaccin,unpuntoimportanteeslahomogenizacindelosreactivos.Lasenzimas
seencuentranenglicerollocuallashacemsdensasytiendenaestarenelfondodeltubodereaccin.

b. CiclosyTemperaturas:

Encuantoalaeleccindelosciclosylastemperaturas,losmismosdependerndelacantidadinicialde
lasecuenciadianaquesedeseaamplificarylascaractersticasdecomposicindebases,tantodelADN
blanco como de los cebadores. Tpicamente, una reaccin convencional utiliza 35 ciclos, siendo cada
etapadedesnaturalizacin,anilladoyextensinde30segundos.Eltiempodeextensintambinvara
de acuerdo al tamao del fragmento que se desea amplificar y la velocidad de la enzima con la cual
estamos realizando la reaccin. Cuando los fragmentos que se desea amplificar son mayores a 5000
bases,laextensinpuedenecesitarde5a10minutos.Lastemperaturasdedesnaturalizacinutilizadas
sonengeneral94o95 oC,yladeextensindependedelaenzimautilizada,comnmentesiseutilizala
Taq se recomienda una temperatura de extensin de 72 oC. La temperatura de anillado es clave para
tenerxitoenlareaccin,estatemperaturadependebsicamentedelacomplejidaddelADNblancoy
lacomposicindebasesdeloscebadores(verapartado:Cebadores).

c. Diseodecebadores:

Unpuntoclavedelaoptimizacin,quizseldemayorimportanciapararealizarunareaccinexitosa,es
eldiseodeloscebadores.Algunospuntosaconsiderarsedetallanacontinuacin.Lasecuenciadelos
cebadoresdebertenerunacomposicindebasestalquesucontenidoGCseencuentreentre40y60
%(estodependerdelacomplejidaddelADNblancoapartirdelcualrealizaremoslaamplificacin,por
loquenosiemprelopodemosrespetar).Amboscebadoresdebentenerunacomposicindebases,oal
menos un contenido GC, y un largo similar. Estos factores estn implicados en la temperatura de
melting,quenodeberavariarmsde5oCentreuncebadoryelotro.Elextremo3delcebadoresmuy
importanteysebuscaqueseaunabaseGoC(locualprovocamayorespecificidad,debidoaqueson
basesqueseunenmediante3puentesdehidrgeno,encontrasteconAyTqueseunenmediante2
puentes de hidrgeno). En los extremos 5 de los cebadores, no es necesario que haya un 100 % de
complementariedadconlasecuenciablanco,dehechopuedenadicionarsecolasde10omsbasesque
luego permiten la clonacin de estos fragmentos o la secuenciacin con cebadores universales. Otro
puntoimportanteaconsiderareslacapacidaddeesoscebadoresdehibridarseconsigomismosoentre
s.Siuncebadorposeeunasecuenciapalindrmicainterna,puedeformarunahorquilla(plegarsesobre
s mismo por complementariedad) y de este modo no estar disponible en la reaccin. Adems, si los
extremos 3 de ambos cebadores son complementarios entre s, pueden dar lugar a dmeros de
cebadores,evitandoaslaamplificacindelfragmentodeseadoyamplificandonicamentelosdmeros.
Generalmente,estosdmerosseformaninespecficamenteyseobservancomofragmentosdeltamao
de la suma del largo de ambos cebadores. Finalmente, para evitar la amplificacin de secuencias
inespecficas, es importante chequear en bases de datos de secuencias de ADN (ej. GeneBank:
ww.ncbi.nlm.nih.gov)laposibilidaddeamplificacindeotrosblancos.
 d. Otrasconsideraciones:

Otrospuntosatenerencuentasonlacalidadycantidaddelmoldeapartirdelcualqueremosrealizarla
amplificacin. Se recomiendan relaciones espectrofotomtricas 260/280 y 260/230 mayores a 1,82,0.
Estas medidas aseguran una buena calidad de ADN con baja contaminacin de protenas y otros
inhibidores.LautilizacindekitsdepurificacincomercialesfacilitalaobtencindeunADNoARN(enel
casodeunaRTPCR)debuenacalidadeliminandomuchosdelosposiblesinhibidoresdelareaccin.

e. Contaminacin:

UnpuntoclaveenlasreaccionesdePCReslaminimizacindelaposibilidaddecontaminacin.Debidoa
lasensibilidaddelatcnica(dadaporlaamplificacinexponencialdefragmentos),esnecesariotomarla
mayor cantidad posible de recaudos para evitarla. En primer lugar, lo ideal es trabajar en tres reas
diferentes,separadasenloposiblefsicamente,yalascualessedebeaccedersiguiendouncaminoenel
cualunavezllegadaalaltimareanoesposiblevolveratrs(flujounidireccional).Laprimeradelas
reas,consujuegodepipetasexclusivoyzonaUVparadescontaminacin,esparalarealizacindelas
mezclasdereaccin(enestareaslodebemoshacerlamezclaqueincluyeeltampndereaccin,la
enzima, los dNTPs, el agua y los cebadores), esta rea en general es conocida como rea de prePCR.
Unavezfinalizadaestaetapa,dondesepreparanlacantidaddereaccionesnecesariasparaeltrabajo,se
pasaalasiguienterea,dndenicamenteseagregaratuboatuboelADNmolde(reaPCR).Siempre,
debemos incluir un tubo blanco de reaccin que debe tener todos los componentes de la mezcla
excepto el molde, que sustituiremos con agua. Idealmente se pueden realizar 2 blancos, uno que
cerraremosenelreadeprePCR,quepermitedetectarsi
hay contaminacin de los reactivos, y otro que dejaremos Termocicladores:
abiertodurantetodalamanipulacinparaasegurarqueno Enloscomienzosdelatcnicanoexistan
hubocontaminacindurantelamisma.Tambin,enelcaso equipos de PCR automatizados, por lo
de contar con un control positivo, la incorporacin del cual se utilizaban diferentes baos
termostatizados (a las temperaturas de
mismo en cada tanda de reacciones es recomendable. Por
desnaturalizacin,anilladoyextensin)y
ltimo se pasa al termociclador (ver apartado: manualmentesecambiabanlostubosde
Termocicladores) y a la visualizacin de los fragmentos un bao a otro. El primer equipo
amplificados (ver apartado: Visualizacin de productos de desarrollado, de hecho, nicamente
automatiz el cambio manual de tubos.
PCR).EstaltimareaesconocidacomoreadepostPCR.
Los equipos actuales constan,
De acuerdo al flujo unidireccional, estos tubos nunca bsicamente,deunbloquedemetalque
debenpasaralreadeprePCR.Serecomiendatrabajarcon puede ser calentado o enfriado
tnicas diferentes en cada rea. Idealmente, tambin se rpidamente (generalmente mediante el
sistema peltier), con posibilidad de
puede hacer uso de presiones diferenciales en las programar las temperaturas, rampas de
diferentes salas para minimizar los problemas de subida y bajada de las mismas y los
contaminacin. Como veremos ms adelante, la aparicin tiempos de cada etapa de los ciclos, as
de la PCR en tiempo real, minimiz uno de los mayores como la cantidad de ciclos. En general
presentan una tapa trmica que evita la
problemas de contaminacin al evitar la apertura de los evaporacin de la mezcla de reaccin
tubos una vez finalizada la reaccin (principal fuente de durantelaetapadedesnaturalizacin.
contaminacindereacciones).
Por ltimo, el trabajo siguiendo procedimientos y normas GLP (Good Laboratory Practices) es
recomendableparaevitarcontaminaciones.

VisualizacindeproductosdePCR:
El procedimiento ms comn para el anlisis de los fragmentos obtenidos en la PCR es la
electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida. La electroforesis permite separar

fragmentos de acuerdo a su tamao. Los fragmentos de ADN (cargados negativamente) se

desplazanporelgelatravsdeuncampoelctricohaciaelpolopositivo.Losfragmentosms

pequeosmigranmsrpidoysonlosquevemosmsabajoenelgel.Laeleccindelamatriz
(agarosaoacrilamida)yelporcentajeenlacualsepararlosproductos,dependerdeltamao
de los mismos y los largos diferentes que deseemos separar. Generalmente, los geles de
agarosa se visualizan agregando Bromuro de etidio, un agente que se intercala en el ADN y
fluorescecuandoesexpuestoalaluzUV,yenelcasodelosgelesdeacrilamida,latincinse
realizaconnitratodeplata,queporinteraccioneselectrostticasseunealADN.

PM1234567




500pb
EjemploGelAgarosa:
Geldeagarosa1%teidoconbromurodeEtidio 250pb
dndesevisualizanproductosdeamplificacin
100pb
dediferentestamaos(carriles1,2,3y7)entre

250y500bases.Enloscarriles3a6,eltamao
pareceserelmismo.Sinembargo,laresolucin
deestetipodegelnohaceposibleestaafirmacin.

4. VariantesdelaPCR

UnavezqueelusodelaPCRsemasific,apartirdeladcadade1990,hansurgidovariantesynuevas
aplicacionesalatcnica.Eldetalledecadavarianteescapaalafinalidaddelcaptulo,porlocualsolose
harmencinaalgunadeellasyexplicaradeformaresumida.

a. RTPCR:EsunavariantedelaPCRmuyutilizadaenlaqueseutilizaARNcomomoldeinicialenvezde
ADN,yempleaunatranscriptasareversa(unapolimerasadeADNARNdependiente)pararealizarla
sntesisdeunADNcomplementarioalARN(ADNc).Enestaprimeraronda,comocebadorsepueden
utilizarhexmeros(oligonucletidosde6nucletidosdesecuenciaaleatoria)queseunenalazaren
cualquier regin del ARN molde, o un oligonucletido (en general un oligo dT) que permite la
capturaylarealizacindelADNcapartirdelARNmoARNconcolaspoliA.Unavezqueseobtieneel
ADNc,serealizalareaccindePCRconvencionalcomosedetallmsarriba.
b. PCRanidadaonested:SetratadeunatcnicaqueaumentalasensibilidaddelaPCR.Enestecaso
setrabajacon4cebadores,enunaprimerarondaseamplificademaneraconvencionalconlosdos
cebadores ms externos a la regin que se desea amplificar. El producto de este primer PCR se
utilizacomomoldeparaunasegundarondaqueutilizacebadoresinternosalareginpreviamente
amplificada.Ladesventajadeestatcnicaeslaposibilidadaumentadadecontaminacin,yadems
nopermitecuantificarlacantidadinicialdeADNmoldepresentaenlamuestraanalizada.

c. PCRinsitu:LaPCRinsituconsisteenunareaccindePCRenseccioneshistolgicasoclulas,donde
los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre
preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera
amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con
sondasdeADN/ARN.

d. PCRmltiplex:PCRenlacualseamplificamsdeunasecuenciaenunamismareaccin.Empleados
o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente diferentes
fragmentos de ADN. Consiste en combinar en un nico tubo de reaccin todos los pares de
cebadores de las secuencias que queremos amplificar, junto con el resto de los reactivos de la
reaccinencantidadessuficientes.Susventajas:seobtienelainformacindevarioslocienunasola
reaccin, requiere menor cantidad de molde para el anlisis y menor cantidad de reactivos. Los
ejemplos de PCR mltiplex son muy comunes en el diagnstico de agentes infecciosos, donde se
intenta amplificar varios tipos virales en el mismo tubo y al mismo tiempo (ej. Amplificacin de
HerpesVirusenmuestrasbiolgicas).

OtrasvariantesdelaPCRincluyenlaPCRinversa,PCRdecolonia,PCRasimtrica,PCRaleloespecfica,
entreotras.

5. PCRentiemporeal:

LaPCRentiemporealeshoyunadelasvariantesmsutilizadas.Estatcnicapermite,adiferenciadel
PCRconvencional,lacuantificacindelosproductosdeamplificacin,ademsdeotrasoportunidades.
Lacuantificacinesmuyutilizadaenloquerefierealanlisisdeexpresingnica.

La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artculo de Higuchi y colaboradores (R.
Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos autores, utilizando una cmara para monitorear
reaccionesdePCRduranteelcursodeltermociclado,detectaronlaacumulacindeADNdoblecadena
en cada ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la adicin de
BromurodeEtidioenlareaccin.Elaumentodefluorescenciaserelacionadirectamenteconelnmero
de copias de la molcula que est siendo amplificada, presentes inicialmente en la reaccin. A menor
nmero de copias presentes inicialmente, menor el nmero de ciclos necesarios para detectar
fluorescencia.

MedianteestavariacindelaPCResposibleseguirlacinticadecadareaccinentiemporeal,porlo
quepermiteunacuantificacinsensibleyespecficadelblancoquesedeseaanalizar,alutilizarlafase
exponenccialdelacurvvadeamplificacin.Adem
ms,estatcnnicapresentaaunampliorrangodinmiicode
cuantificaacin.

En 1997 surgen los primeros

p equ
uipos comercciales de PCR
R en tiempoo real, producidos por Appplied
Biosystem
ms. Desde entonces han surgido
s numeerosos equip os con difereentes propiedades, entree ellos
destacamoselLigthCyyclerdeRoch he(hoydiscon
ntinuado),y elRotorGeneeQ(producid doenlaactuaalidad
porQiage
en).

Junto al surgimiento o de los eq quipos de PCR en tiem mpo real, ssurgieron taambin diferrentes
aproximacionesyestrrategiaspara detectarlaffluorescencia .Enestesen ntido, elBrom murodeEtidiiofue
o por el SYBR
sustituido R Green, una molcula quue tambin sse intercala een el ADN dooble cadena,, pero
presentamayorafinidaadyespecificcidadqueelB BromurodeEEtidio.SibienelSYBRGreeencontinassiendo
utilizado en la actualidad, existe un amplio espectro
e de estrategias b basadas en ssondas especcficas
marcadassfluorescente ementequem muestranmayyorespecificiidadypermittenademsd delacuantificcacin
otrasalternativascomoeldiagnsticodepolimo orfismospunttuales,porejemplo.

Acontinuacinnoscen
ntraremosen
ncuatroelementosimporttantes:

Cinticadereaaccionesyconceptodeciccloumbral
Qumicasutiliz
Q zadasenPCRentiempore eal
Cuantificacinabsolutayreelativa
Curvasdedesn nydeteccindepolimorfiismos
naturalizacin

a. Cinticadereaaccionesyconceptodeciccloumbral

Cmoobsservamosen lafigura2deeestecaptulo,lacinticaadereaccindelPCResloqueobservvamos
encadacorridadePCR
Rentiemporrealquerealizzamos(figuraa4).

Figura 4. Curva de amplificacin reaalizada con diluciones seria das en base 10 de un fraagmento de in
nters,
utilizandoSYBRGreenenequipoRotorG Gene6000.

Loquese
eobservaen lafigura4,co
orrespondeaadilucioness eriadasenbaase1:10del moldeinicial,,ylas
curvasde
eamplificacindecadaun nadeellas(10
00.000,10.0000,1.000y100copiasmo oldeporreacccin).
La lnea roja horizontal representa el valor umbral de intensidad, a partir del cual las muestras
comienzansufaseexponencialdeamplificacin.Elcicloumbraldecadamuestra,eselcicloenelcul
pasanenelumbral(indicadoconlacrculorojoparalamuestrademayorconcentracin).Enelejemplo,
queda clara la relacin inversamente proporcional entre el ciclo umbral y la concentracin inicial de
moldepresenteenlasreacciones.Amayorconcentracin,antesamplificarlamuestraymenorsersu
cicloumbral.Arribaalaizquierda,enlamismafigura,seobservalacurvadecuantificacingeneradaa
partirdeestosdatos,graficandoelcicloumbralenlasordenadasyellogaritmodelaconcentracinen
las abscisas. Por lo tanto, dado una muestra, de la cual se desea conocer su concentracin inicial de
molde,slodeberemosinterpolarelcicloumbraldeesamuestraennuestragrficadecuantificaciny
obtenerunvalordeconcentracin(estoloveremosconmsdetallecuandohablemosdecuantificacin
absoluta).

b. QumicasutilizadasenPCRentiemporeal:

Cmomencionamosantesexistendiferentesaproximacionesqueutilizanlafluorescenciaparamedirla
cinticadelPCR,unaformadeclasificarloseslasiguiente:

Agentesintercalantes:Enestecaso,seutilizanmolculasfluorescentesqueaumentansuemisin
cuandoseunenalADNdoblecadena,eselcasodelBromurodeEtidioySYBRGreen.Ladesventaja
de esta estrategia es la inespecificidad, ya que los agentes intercalantes se unen a cualquier
productoqueestesiendoproducidodurantelareaccin,yaseaelespecficoquequeremosmedir,
comoproductosinespecficos,dmerosdecebadores,etc.Otradesventajadeestaestrategiaesque
no puede utilizarse en reacciones multiplex. Como veremos ms adelante en este captulo, es
posible realizar curvas de desnaturalizacin y evidenciar presencia de dmeros de cebadores,
aunquenoesposibleeliminaresasealqueserunruidoennuestrasmedidas,cuandodeseemos
cuantificar.Laventajadeutilizaragentesintercalantesradicaenquepuedeutilizarseparacualquier
reaccindePCRyqueeseconmico.
Sondas:Lautilizacindesondasmejorasensiblementelaespecificidaddelmtodo.Haydiferentes
estrategiasquesebasanensondas(Taqman,FRET,Molecularbeacon,etc.).Aqudesarrollaremos
nicamentelassondasdehidrlisis(ej.:Taqman)ylasdehibridacin(ej.:FRET)yaquesonlasms
utilizadas.

SondasTaqman:

LassondasTaqmansehibridandemaneraespecficaaunasecuenciadelproductodeamplificacin.
En uno de los extremos de la sonda (el 5) se encuentra unido un fluorocromo reportero el cual
mientras la sonda permanece intacta la emisin es apagada o quencheada por una segunda
molcula unida al extremo opuesto de la sonda (el 3). Esta molcula es un quencher, es decir
absorbe la emisin del fluorocromo reportero pero no la emite. Entonces, cuando la sonda est
intactanohayemisindelfluorocromo(Figura5).

 Figura 5. Esquema de la estrategia de sondas Taaqman. Se muuestra la sond
da intacta, antes de produccirse la
amplificaccin,conelflu
uorocromouniddoalextremo5(F)yelquenncherenel3 (Q).Semuestrraelsitiodeun
ninde
loscebadoresforward(F)yreverso(RR).

Cuand do se producce la amplificacin, come enzando desdde uno de lo

os cebadoress (en este caaso el
directto o forward) la actividad
d 53 exonucleasa de la enzima ADN polimerasa degrada la ssonda,
separrando fsicammente el flu uorocromo y y el quencheer, permitiendo ahora s la emisi n de
fluore
escencia. Cunto mayor cantidad
c de producto geenerado, mayyor sonda deegradada y m mayor
emisindeluz(Figgura6).

Figura6.EsquemadelaestrategiadessondasTaqman n.Semuestra lasondadegraadada,luegodelaamplificaccinde

laenzimaaapartirdelceb
badorforward(F),yelfluoro
ocromoseparaddodelquencher.Ennaranjasemuestralahebra
deADNreccinsintetizada.

Sonda
asFRET:

Las so
ondas FRET tambin
t se hibridan de manera
m especcfica dentro del producto o de amplificaacin,
peroe enestecasosetratadedossondas.En nlaprimeraddelassondassseadicionau unfluorocrom moen
elexttremo3yen nlasegundassonda,qued debehibridar cercadelaaanterior,seaagregaunseggundo
fluoroocromounido oalextremo 5.Lascaracctersticasde losfluorocro omossontalees,quelalon ngitud
de onnda emisin del fluorocrromo de la primera sonnda, coincide con la longgitud de ond da de
excitaacin del segundo fluoroccromo. En estte caso, se dda un intercambio de eneerga, y cund
do las
sondaas se aproximman, se excitta el primer fluorocromoo pero se ob bserva la emisin del seggundo
(Figurra7).
Figura 7. Esquema de la estrategia de
d sondas FREET. Se muestrra la interacci
n entre amb
bas sondas y aambos
fluorocrommossobreunadelashebras delADN.Elfluuorocromoverrdeseexcitaaalalongituddeeondaqueirraadiael
equipo,peeroalestarpr
ximolasegun ndasondalaen
nergaemitida porlestransferidaalfluorrocromorojo, elque
emiteenuunalongituddeeondamayor,queesladete ectadaporeleqquipo.

Enestecaso,lasssondasnose degradan,sinoquesehibbridanydesh hibridansiguiendoloscicllosde

tempe eraturadelareaccin.A mayorcantid daddeprodu ctogenerado o,mspares desondaspu ueden
interaactuaraumen ntandolainteensidaddese eal.Unadel asventajasd deutilizarestaestrategiarradica
en la posibilidad de
d realizar cu
urvas de desn naturalizacinn al finalizar la reaccin. Esto permitee, por
ejemp plo,laidentifficacindepo
olimorfismos puntuales(SSNPs).Sidise amoslason ndademaneratal,
quelaamutacinquequeremossdetectarseencuentraennlaregindeeunindeun nadelassond das,la
tempe eratura de desnaturalizac
d cin de la sonda ser d iferente paraa cada uno de los aleloss que
estemmos amplificcando y estte hecho hace h que ppodamos disstinguir med diante curvaas de
desnaaturalizacinlapresenciae enhomocigossis,heterociggosisoausencciadelamutaacinbuscada(ver
ejemp plomsadelaante).Tambi npermitecu uantificar,aliggualquelasssondasTaqman,ypresenttauna
especcificidad an mayor debid do a que utilizamos dos ssondas en lugar de una. Asimismo, hay un
incremmentodelassensibilidadproductodelFFRET.

Algun
nostipseneld
diseodeson
ndas:

Al igu os cebadoress se juega graan parte del xito de unaa reaccin dee PCR
ual que en el diseo de lo
conve encional,elbuendiseodelassondas esfundamenntalparaobteenerbuenas reaccionesdePCR
tiemp poreal.Lassoondasdeben tenersuextrremo3fosfoorilado,yaquedeotromo odopodranaactuar
como o cebador. Addems no se recomienda que la base a la cual uniiremos el fluo orocromo sea una
Guanina, ya que esta base tie ene propiedaades de quenncher. Las teemperaturas de melting d de las
sondaasdebenser talesqueestnunidasalmoldecuanndolapolimeerasaestcopiandoelAD DN(se
recom mienda que se encuentrre 10 gradoss por encim ma de la temmperatura de melting d de los
cebad dores).Enelccasodelasso ondasFRET,lastemperatuurasdeanilladodeambasssondasdebeenser
similaares, ya que e ambas deb ben estar unnidas al moolde para qu ue se obten nga una seal de
fluoreescencia.Lad distanciaentrresondas(en nelcasodeFFRET)debeseerentre1y5 5nucletidos,para
permitir el intercaambio de en nerga de fluo
orescencia. AAdems, en rreacciones dnde utilizarremos
sondaasFRET,laenzimanodebe eposeeractivvidadexonuc leasa53paaranodegrad darlassondass.

 c. Cuantificacinabsolutayrelativa:

Lacuantificacinabsoluta,esaquellaenlacualseutilizaunacurvaestndarconstruidaapartirde
concentracionesconocidasdelblancoquesedeseaamplificarycuantificar.Eslaestrategiaelegida
enmuchoskitscomercialesdePCRentiemporealparacuantificarcantidaddeviruspresentesen
muestras biolgicas (ej. Carga viral de HIV, HCV). Como comentamos ms arriba, se aprovecha la
relacin entre el ciclo umbral y la concentracin inicial de molde presente en las muestras o
estndares.

Las curvas de calibracin son altamente reproducibles, especficas y sensibles. Sin embargo
debemos asegurarnos la calidad de los estndares que utilizamos ya que de ellos depende el
resultadofinaldelacuantificacin.Elrangodinmicodecuantificacinpuedellegara9rdenesde
magnitud(ej.1021011copiasinicialesdecidonucleico).

Enelcasodeloskitsdediagnstico,muchasvecesseutilizauncontrolinternoqueseagregaala
muestra antes de ser extrado el cido nucleico (ARN o ADN), que sigue todo el proceso de
extraccin y amplificacin. Idealmente este control interno debe amplificarse con los mismos
cebadoresqueelblancoquesedeseacuantificar.Enestoscasosseutilizansondas,especficaspara
cadaunodelosamplicones,marcadasconmolculasfluorescentescondiferentespropiedadesque
permitadistinguirlos.Unaestrategiadecuantificacinimplicalarealizacindedoscurvasestndar,
unoparacadablanco(eldeintersyelcontrolinterno)yluegounacuantificacinrelativaalcontrol
interno que se agreg al comienzo del procesamiento de la muestra, lo cual asegura una
cuantificacinprecisaconsiderandolasprdidasdematerialdurantelaextraccin.

Lacuantificacinrelativaeslaestrategiautilizadaparaestudiarloscambiosenlaexpresingnica
entre diferentes muestras. En este caso, se realiza una RTPCR en tiempo real, la que permite
determinarloscambiosdelosnivelesdeexpresindeundeterminadogenendiferentesmuestrasy
se expresa el resultado relativo a un mensajero que no cambia durante el proceso que estamos
estudiando(ej.ungenhousekeeping)ouncontrolinternoqueagregamosacadamuestra(comoen
elcasoquemencionamosenelprrafoanterior).

Existen diferentes modelos matemticos para hacer estudios de expresin gnica diferencial
mediantecuantificacinrelativa.Aqumostraremosdosmtodos,unodeellosnotieneencuentala
eficienciadelareaccindePCRyelotrostieneencuentaestefactor.Enelprimercasoseasume
unaeficienciade100%(esdecirqueelblancodeamplificacinseduplicaencadaciclo):Ecuacin1.

Ecuacin1.R=2(CtgdiCtgh)Experimental(CtgdiCtgh)Control=2(Ct)

Dndegdi=gendeintersygh=genhousekeeping,deestemodo,seobtieneunarelacinentredos
condiciones (experimental vs. control) para un gen de inters utilizando para normalizar un gen
housekeeping.(Referencia:LivakandSchmittgen.AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsing
RealTimeQuantitativePCRandtheCtMethod.Methods25,2001).

 Enelsegundocaso,serealizaunacorreccinbasndoseenlaeficienciade cadareaccin(parael
gendeintersyparaelgennormalizador):Ecuacin2.

Ecuacin2.R=Eficienciagdi(CtgdiControlCtgdiMuestra)
Eficienciagh(CtghControlCtghMuestra))

En este mtodo desarrollado por Pfaff y colaboradores (Nucleic Acids Res. 2001 29(9): E45), se
consideralaeficienciadelaamplificacindecadaunodelosblancosqueseanalizan.Paraellose
realiza una curva de calibracin (sin necesidad de conocer realmente la cantidad de molculas
iniciales en la reaccin, sino haciendo diluciones seriadas a partir de un stock) y a partir de la
pendientedeestacurvasecalculalaeficienciadelareaccinmediantelaEcuacin3:

Ecuacin3.Eficiencia(E)=[10(1/pendiente)]1

Deestamaneraserealizaunaaproximacinmsrealista,yaquelaeficienciadeunexperimentode
PCRdifcilmentealcanceel100%comoplanteaelprimermtodo.

d. Curvasdedesnaturalizacinydeteccindepolimorfismospuntuales.

Las curvas de desnaturalizacin pueden realizarse cuando se utilizan agentes intercalantes y en

estrategiasconsondasdehibridacin(noenelcasodesondasdehidrlisis).Estascurvasserealizan
alfinalizarlareaccin,esdecir,cuandolasreaccionesalcanzanlafaseplateau.Paraelloseaumenta
la temperatura gradualmente desde por ejemplo 5060 oC hasta 95 oC. De esta manera, los
productosqueseencuentranhibridados,yconunaintensidaddefluorescenciaalta(yaseaporel
agente intercalante o por la sonda hibridada) comienzan a desnaturalizarse provocando que el
agente intercalante del ADN doble cadena, o que las sondas se separen de su blanco, este hecho
provoca una disminucin de la seal de fluorescencia que puede seguirse en funcin de la
temperatura.Cuandohayunpuntodeinflexinenestacurva(Figura8),elmismocorrespondeal
puntodedesnaturalizacinotemperaturademelting(Tm).AlcalcularladerivadadelaIntensidad
de fluorescencia en funcin de la Temperatura, y graficarla nuevamente en funcin de la
temperaturaseobservangrficascomolasdelaFigura9.
 15
Fluorescence

10

0
72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96
C
Figura 8. Curva de desnaturalizacin. Se grfica la fluorescencia en funcin de la temperatura. Las lneas verdes
corresponden a las muestras de la Figura 4. La lnea negra es la curva correspondiente a un blanco de
amplificacin.

1,5
dF/dT

0,5

0
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97
C
Figura 9. Curva de desnaturalizacin derivatizada. Se grfica la derivada de la fluorescencia en funcin de la
temperaturaenlasordenadas,ylatemperaturaenlasabscisas.Loqueseobservaesunpicocorrespondienteala
Tmparalasmuestrasenverde.Ennegro,elblancodereaccinpresentaunpicodemenorTmquesecorresponde
conlapresenciadedmerosdecebadores.

La posibilidad de realizar este tipo de curvas permite distinguir la presencia de dmeros de

cebadoresenlareaccinoproductosinespecficosquepresentan,engeneral,unatemperaturade
desnaturalizacin menor que la del blanco especfico. En la Figura 9, puede verse un pico de
desnaturalizacinenlamuestraquecorrespondealblancodereaccin,dndealnohabermuestra
paraamplificarsefavorecelaformacindedmeros.Porlotanto,enestecaso,seobservaunaseal
deamplificacinenlascurvasdeamplificacin,quenoimplicaunacontaminacindelamuestraya
quenohayunpicoalaTmesperada.

Porltimoesposibledetectarpolimorfismospuntualesmediantelarealizacindeestascurvas,ya
sea utilizando sondas de hibridacin, como con una nueva generacin de agentes intercalantes
(Sito9 Green Fluorescent nucleic acid stain o EvaGreen dye) y la posibilidad de los equipos de
realizarcurvasdedesnaturalizacinmsprecisas(HRM:porhighresolutionmelting)(Figura10).

Figura 10. Curvas de de
esnaturalizaci
n obtenidas con
c HRM. Se oobserva los differentes punto os de inflexin
n en el
na mutacin puntual
caso de un p G por A y se muestran los tres poosibles genotip
pos. A la dereecha se observvan las
mismas cu urvas pero mo ostrando la diferencia respecto a una m muestra normaal, en este caaso se acentan las
diferenciass y es ms fcil
f determin nar los diferentes genotipoos (imgenes obtenidas dee http://www w.gene
quantificattion.de/abhrm mguide.pdf). Las curvas ene rojo correesponden al homocigota normal, en verde
correspond dealhomocigotamutadoy enazulelhete erocigotaparaalamutacin((esdecirunalelonormalG Gyun
alelomutaadoA)

Enelcasodelasso
ondasdehibrridacin(com
moFRET),elppolimorfismo provocaunainestabilidad
denla
sondaaenelcasoddeestarpresente(alnote
enerunacom mplementarieedadperfectaa)provocandouna
disminucinenlattemperaturadedesnaturaalizacinenloosalelosqueposeenlamu
utacin.

Figura11.Curvasdedessnaturalizacin
nobtenidacon
nsondasFRET. Seobservalossdiferentespuuntosdeinflexxinen
elcasodeunamutacinpuntualGporrAysemuestrranlostrespossiblesgenotipo
os(enestecasoparticular,laacurva
rojacorresspondeaunhomocigotanormal,lacurva verdeaunhoomocigotamu utadoylacurvvaazul,quemuestra
ambospico os,aunhetero udiada).
ocigotaparalamutacinestu

Comentariosfinales:

ParafinalizarestecaptulomencionaremosalgunasdelasaplicacionesdelaPCRyPCRentiempo
real.Lasmismasabarcandesdelainvestigacinbsicahastalaaplicada,pasandoporeldiagnstico
humano a la deteccin de Organismos Genticos Modificados en vegetales. Algunos ejemplos de
aplicacionesdelPCRson:

Investigacin:

Clonacin
Bsquedadenuevosgenes
Metagenmica
Anlisisfilogenticos
Anlisisdeancestra
Anlisisdeexpresindiferencial
etc.

Diagnstico:

Deteccin de mutaciones puntuales e Inserciones/Deleciones asociadas a enfermedades

genticas
Anlisisdeparentesco
Cuantificacinviral
Pronstico de enfermedades mediante anlisis de cuantificacin de la expresin de
determinadosgenes.
etc.

Lecturasrecomendadas:

1. Mullis y colaboradores. Specific Enzymatic Amplification of DNA In Vitro: The Polymerase Chain
Reaction.ColdSpringHarbSympQuantBiol.1986;51Pt1:26373.).
2. Saiki y colaboradores. Enzymatic amplification of Globin genomic sequences and restriction site
analysisfordiagnosisofsicklecellanemia.Science.1985Dec20;230(4732):13504.Primerartculo
publicado dnde se describe mtodo de PCR. Y se observa una aplicacin directa. Este grupo
incluyeaMullis,yaotrosinvestigadoresqueparticiparonenlapuestaapuntodelatcnicayla
hicieronposible.MsallqueseconsidereaMulliselautorconceptualdelatcnica.
3. NobelLecture:DrKaryB.Mullis,LaJolla,California,U.S.A.,forhisinventionofthepolymerasechain
reaction(PCR)method.13octubre1993.
4. WilhelmyPingoud.RealTimePolymeraseChainReaction.ChemBioChem2003,4,11201128
5. Espinosa Asuar Laura. 2007. Gua prctica sobre la tcnica dePCR. En: L. E. Eguiarte, V. Souza y X.
Aguirre(edEcologamolecular.INE,CONABIOyUNAM.)
6. LivakySchmittgen.AnalysisofRelativeGeneExpressionDataUsingRealTimeQuantitativePCRand
the2[Delta][Delta]CTMethod.Methods,25(4):402408,2001.
7. Michael Pfaff. A new mathematical model for relative quantification realtime PCR. Nucleic Acids
Research,29(9):20022007,2001.
8. StephenA.Bustin.AZofQuantitativePCR.InternationalUniversityLine(ISBN0963681788).

Otrosrecursosinteresantes:

1. www.Karymullis.com(pginapersonaldeKaryMullis)
2. http://www.genequantification.info/ (pgina web realizada y mantenida por Pfaff y
colaboradoresconmuchomaterialsobrelaPCRentiemporeal).
3. www.idtdna.com (pgina web de la empresa IDT, proveedora de oligonucletidos, se puede
encontrarmaterialeducativoysoftwareparaeldiseodecebadoresysondas).
4. www.wikipedia.com