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UNIDAD 6
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Biotecnologia
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Profesor: Victoriano Velasquez Ku

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EQUIPO
Jose Rafael Ramirez Magaa

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Ruben Israel Ek May
Jose Domingo Chi Moo

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 INDICE
INTRODUCCION................................................................................3
6.1.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA......................................................4
6.1.2 TEJIDOS EMPLEADOS.................................................................6
6.1.3. RUTAS: ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA....................8
6.1.4 APLICACIONES EN LA AGRONOMIA...............................................11
6.2. PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS..................................................12
6.2.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA....................................................12
6.2.2 CULTIVO DE MERISTEMOS APICALES............................................15
6.2.3 CULTIVO DE APICES MERISTEMATICOS..........................................17
6.2.4 CULTIVO DE EMBRIONES............................................................18
6.2.5. MICROINJERTO.......................................................................20
6.2.6. FACTORES QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA POSIBILIDAD DE OBTENER
PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS.......................................................21
6.2.7. APLICACIN EN LA AGRONOMIA.................................................22
BIBLIOGRAFIA................................................................................25

1
 INTRODUCCION.

La micropropagacin consiste en la propagacin de plantas en un ambiente

artificial controlado, empleando un medio de cultivo adecuado. El cultivo es as
una herramienta muy til en los programas de mejoramiento, ya que tiene el
potencial de producir plantas de calidad uniforme a escala comercial, a partir de un
genotipo selecto y con una tasa de multiplicacin ilimitada.

Esto es posible gracias a la propiedad de totipotencia que tienen las clulas

vegetales; esto es la capacidad de regenerar una planta completa cuando estn
sujetas a los estmulos adecuados.

1
 6.1.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA.

El cultivo de tejidos vegetales es una tcnica en la cual rganos o pequeas

secciones de tejido, son disectados de una planta donadora y cultivados
aspticamente en un medio nutritivo. Por manipulacin de la composicin qumica
del medio y de otros parmetros ambientales, el crecimiento y el desarrollo de los
tejidos puede ser dirigido en diferentes formas:

a) Biosintticos, mediante los cuales es posible la sntesis y/o trasformacin de

metabolitos secundarios o

b) Morfogenticos, por lo que es posible inducir procesos de desdiferenciacin y

diferenciacin celular; lo cual es aprovechado para obtener clulas individuales
aisladas o ms comnmente, crecimientos amorfos de clulas en activa divisin
celular (callos) y llegar a inducir su desarrollo hasta plantas completas
(regeneracin).

Con base en la teora celular, la totipotencialidad de las clulas hace posible que,
tericamente, cualquier clula pueda regenerar un nuevo individuo, ya que, en la
prctica, los tejidos inmaduros, meristemos y embriones han resultado con mayor
poder regenerativo que otros.

En la respuesta de los tejidos, estn implicados varios factores: gentico,

fisiolgico y bioqumico; requerimientos nutritivos como sales orgnicas (macro y
micronutrientes), vitaminas, aminocidos y de manera muchas veces fundamental,
los reguladores del crecimiento como son auxinas, citocininas y menos
comnmente giberelinas.

En trminos generales, la tcnica del cultivo de tejidos vegetales es relativamente

sencilla. Se fundamenta en incubar pequeos trozos de semillas o tejido, en un
medio de cultivo estril conteniendo los nutrimentos, vitaminas y hormonas
necesarios para estimular y soportar su crecimiento; pudiendo obtenerse callos,
races, tallos, hojas y flores o plantas completas.

1
El empleo de un medio qumicamente definido puede no bastar para lograr una
respuesta deseada, siendo en esta circunstancia que se recomienda la adicin de
complejos orgnicos, como son jugos de frutos: jitomate, pia, verduras y agua de
coco verde, entre otros. Los medios pueden contener agar para hacerlos
semislidos o pueden ser lquidos y requerir de agitacin continua para mantener
la oxigenacin y la distribucin homgenea de los nutrimentos.

De los diferentes medios de cultivo que existen (Knudson C, White, Vacin y Went),
el de Murashige-Skoog (1962) es el ms ampliamente usado por los excelentes
resultados que brinda. Los componentes principales de este medio son: macro y
microelementos, una fuente de carbono, vitaminas, aminocidos y pH de 5.7-5.8.

Actualmente se cuenta con una serie de modalidades de esta tcnica como son:
propagacin vegetativa, obtencin de plantas libres de virus, transformacin de
clulas carentes de pared celular (protoplastos), obtencin de lneas puras a
travs del cultivo de granos de polen para la obtencin de plantas haploides,
seleccin de clulas individuales (en medios lquidos con agentes mutagnicos),
fusin de especies diferentes para la generacin de hbridos somticos.

El uso del cultivo de tejidos vegetales para la multiplicacin y preservacin de

genotipos valiosos en bancos de germoplasma, formando clones, con variedades
o especies importantes a nivel econmico, es ya un hecho, por lo que la tcnica
ofrece una gran cantidad de posibilidades importantes, como apoyo a la
investigacin en ciencia bsica trascendiendo al rea aplicativa.

Etapas de la micropropagacin

La micropropagacin presenta cuatro etapas principales: 1) establecimiento del

cultivo, 2) desarrollo y multiplicacin de vstagos o embriones, 3) enraizamiento y
4) aclimatacin de las plntulas. Generalmente, las etapas de enraizamiento y
aclimatacin pueden combinarse en condiciones ex vitro. En el caso de la
embriognesis somtica, el enraizamiento es reemplazado por una etapa de
maduracin y germinacin de los embriones para la diferenciacin de los pices
caulinar y radicular. En algunos casos tiene importancia considerar una etapa

1
previa (Etapa 0) que es la etapa de preparacin de los explantos para el
establecimiento.

6.1.2 TEJIDOS EMPLEADOS.

Los factores que influyen sobre la calidad del explante son: el tipo de rgano que
sirve como explante, la edad ontognica y fisiolgica del mismo, la estacin en la
cual se colecta el material vegetal, el tamao y el estado sanitario general de la
planta donante.
La planta donante debe elegirse en base a una seleccin masal positiva para las
caractersticas agronmicas deseables. Una vez seleccionados los individuos, es
preciso definir el tipo de explante a establecer en condiciones in vitro. En general,
los rganos jvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el
establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos.
El empleo de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de
patgenos puede resolver el problema de la contaminacin por hongos y bacterias
durante el establecimiento del cultivo in vitro. Se recomienda colectar explantes
primarios a campo durante la estacin primaveral y estival, cuando existe una
brotacin activa de las yemas, ya que el empleo de yemas en estado de dormicin
ocasiona serios problemas de contaminacin.
A fin de lograr explantes de ptima calidad es conveniente hacer crecer las plantas
donantes por un tiempo mnimo en condiciones de invernculo. De esta forma es
posible incidir directamente sobre el estado sanitario y la calidad de los explantos
mediante el control de la intensidad lumnica, temperatura y reguladores de
crecimiento.
Para especies ornamentales tropicales y subtropicales se recomienda mantener
las plantas donantes en condiciones de alta temperatura (25C) y baja humedad
relativa (75%) a fin de reducir la proliferacin de patgenos.
Los procesos morfognicos de floracin, dormicin y bulbificacin son controlados
por el fotoperodo y la temperatura. Controlando estos factores tambin es posible
obtener plantas donantes y explantos ms homogneos durante todo el ao.

1
 Pueden aplicarse adems pretratamientos con reguladores de crecimiento a las
plantas donantes, as como tambin a los explantos mismos. En especies leosas
suele utilizarse como pretratamiento la inmersin de los explantes primarios en
soluciones con citocininas a fin de inducir la brotacin de yemas.

Los tejidos empleados en micropropagacin son :

Cultivo de meristemos

Cultivo de tubrculos

Cultivo de embriones

Cultivo de rizomas

Cultivo de segmentos nodales

Cultivo de semillas

Cultivo de races, hojas, tallos, cambium

Cultivo de anteras

Cultivo de pice

Cultivo de bulbos

6.1.3. RUTAS: ORGANOGENESIS Y EMBRIOGENESIS SOMATICA.

La embriognesis somtica y la organognesis son dos procesos morfognicos

muy frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales.
La embriognesis somtica es el proceso por el cual se obtiene una estructura
similar a un embrin cigtico sin que medie la fertilizacin de las gametas,
mientras que por organognesis pueden obtenerse tallos, races o flores. Estos
rganos son inducidos a partir de una clula o de un grupo de clulas que, segn
las condiciones de cultivo, tienen la propiedad de mantenerse en activa divisin.
Esta totipotencialidad celular fue enunciada por Haberlandt en 1902, quien
propuso la teora de que todas las clulas vegetales tienen la capacidad de

1
regenerar plantas completas. Haberlandt no lleg a demostrar su hiptesis debido
a que no pudo lograr la divisin celular.

La organognesis puede darse por induccin de yemas axilares o adventicias. La

induccin de yemas axilares comprende la multiplicacin de yemas preformadas,
usualmente sin formacin de callo. La induccin de yemas adventicias comprende
la induccin de tejido meristemtico localizado mediante un tratamiento con
reguladores de crecimiento, conduciendo a la diferenciacin del primordio y
desarrollo del vstago, esto ltimo generalmente en ausencia del regulador de
crecimiento que indujo la organognesis.

La principal desventaja del primer mtodo es que el nmero de yemas axilares por
explanto limita la cantidad de vstagos. Esto se ve compensado, sin embargo, por
un aumento en la tasa de multiplicacin con los sucesivos subcultivos. La
formacin de yemas adventicias ofrece mayor potencial para la produccin de
vstagos, ya que ocurre en sitios distintos al de los meristemas.
La embriognesis somtica es una va ms conveniente porque permite saltar las
etapas de formacin de yemas y enraizamiento, regenerando plantas en una
forma mucho ms rpida y eficiente. A su vez, la disponibilidad de protocolos para
la obtencin de embriones somticos es clave para la automatizacin de la
micropropagacin y la consecuente reduccin de costos para su implementacin a
escala comercial.
Como se mencion anteriormente la Organognesis: Se refiere a la va de
morfognesis que sigue el explante para llegar a convertirse en plntula.
Dependiendo del tipo de explante puede seguir las siguientes rutas:

Organognesis directa: Consiste en la generacin de plantas sin races

directamente del explante, esta ruta generalmente se sigue cuando se utilizan
meristemos vegetativos terminales o laterales.

1
 Embriognesis directa: Previa a la generacin de la plntula se requiere la
formacin de un embrin de origen sexual que llegar a ser una planta completa,
es el caso de explantes provenientes de granos de polen que forman un embrin
haploide, o embriones diploides de semillas o tejido ovular.

Organognesis indirecta: El explante genera la formacin de una masa

indiferenciada de clulas llamada callo, a partir de ste se forman partes
vegetativas diferenciadas como brotes o races, de las cuales se obtiene la
plntula segn sea la especie y las hormonas utilizadas. Este es el caso
principalmente del cultivo de protoplastos.

Embriognesis indirecta: El explante genera la formacin de una masa

indiferenciada de clulas llamada callo a partir de ste se forman embriones
somticos, del cual se obtiene la plntula segn sea la especie y las hormonas
utilizadas. Este es el caso de secciones de tallo, hoja o raz y protoplastos

1
 6.1.4 APLICACIONES EN LA AGRONOMIA.

La tcnica micropropagacin in vitro de plantas est siendo empleado

eficientemente en muchos cultivos hortcolas ornamentales y recientemente en
especies leosas.
Cuando ya se tiene establecido el protocolo de laboratorio, sta presenta con
relacin a los mtodos convencionales anteriormente expuestos importantes
ventajas como:

Incremento acelerado del nmero de plantas por cada genotipo, reduccin del
tiempo de multiplicacin, produccin permanente de material (no hay
estacionalidad), posibilidad de multiplicar grandes cantidades de plantas en una
superfi cie reducida (en tiempos y costos econmicamente viables), mayor control
sobre la sanidad del material propagado, facilidad para el transporte del material,
posibilidades de multiplicar con rapidez una variedad o ecotipo del cual se posea
pocos individuos.

Los costos iniciales cuando se emplean estas tcnicas son altos debido a la
inversin en equipos, los precios de los reactivos y la utilizacin de personal
calificado. Sin embargo, los incrementos en la eficiencia por el gran nmero de
plantas sanas que se pueden obtener a partir de un solo pice en un corto tiempo
en una pequea rea, hacen que esta tcnica est siendo ampliamente empleada
en plantas que con otras condiciones de propagacin presentan menos ventajas.

Los mtodos ms comunes para la transformacin de plantas son el uso de

bacterias del suelo y la biobalstica o bombardeo de tejidos vegetales con
partculas cubiertas con el DNA forneo. El mtodo bacteriano usa Agrobacterium
tumefasciens o Agrobacterium rhizogenes (Park y Facchini 2000). Con el primero
se obtiene un tumor celular o callo transgnico, conocido como agalla de cuello o
agalla de la corona (Figura 2), mientras que con el segundo el producto es la

1
induccin de races areas pilosas (hairy roots). En cualquier caso el tejido con el
DNA forneo puede rediferenciarse hasta generar plantas transgnicas con
propiedades genticas, bioqumicas y morfolgicas diferentes a la planta madre.
Las plantas transgnicas pueden destinarse a la produccin de frutas y semillas
mejoradas o como fuente directa de alimento tanto humano como animal. Tambin
pueden ser usadas para la obtencin de compuestos naturales de importancia
farmacutica e industrial como frmacos, sabores y aromas, o usarse como
biorreactores para la produccin de nuevas biomolculas como protenas,
antgenos y anticuerpos.

6.2. PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS.

Actualmente las tcnicas utilizadas para obtener plantas libres de patgenos se

basan en que los pices caulinares (meristemo apical ms 1-3 primordios foliares
con tamao comprendido entre 01 y 0'5 mm) estn normalmente libres de
patgenos aunque el resto de los tejidos de la planta estn infectados y en que se
pueden regenerar plantas enteras a partir de estos pequeos pices.

6.2.1 DESCRIPCION E IMPORTANCIA.

Las enfermedades causadas por virus y otros patgenos transmisibles por injerto
(viroides, fitoplasmas, bacterias) causan graves daos econmicos y su control es
esencial para obtener una adecuada rentabilidad de los cultivos. Para realizar este
control es imprescindible iniciar las plantaciones con material sano, adems de
adoptar medidas complementarias para paliar los daos ocasionados por los
patgenos transmisibles por vectores.

En las especies propagadas por semilla la obtencin de plantas sanas es muy

sencilla, ya que la mayora de los patgenos no se transmiten por semillas y los
que lo hacen es con incidencia relativamente baja. En cambio la obtencin de
plantas sanas de especies que se propagan vegetativamente es mucho ms
complicada. Estas especies son normalmente muy heterocigticas, por lo que la
propagacin por semillas no mantiene las caractersticas especficas de la

1
 variedad o clon Adems, los virus y patgenos similares se transmiten con alta
eficiencia en el proceso de propagacin vegetativa, por lo que en numerosas
ocasiones todas las plantas disponibles de un clon estn infectadas. Por ello es
necesario utilizar tcnicas especficas para obtener plantas sanas a partir de
plantas enfermas.

Vas de obtencin de material de propagacin libre de patgenos:

1.- SELECCIN DE RBOLES EN CAMPO: Es probable encontrar en las

plantaciones, mediante el diagnstico con las pruebas apropiadas, rboles que no
presenten enfermedades y considerar entonces la factibilidad de tomarlos como
fuente de material de propagacin de determinados clones. No obstante, resulta
difcil tener xito en esta bsqueda y en relacin con los conocimientos actuales,
con el desarrollo de tcnicas altamente confiables en la eliminacin de patgenos
conocidos y por las garantas ms amplias que ofrecen, como se explica ms
adelante, no se recomienda esta va para obtener material sano de ctricos.

2.- TERMOTERAPIA: La termoterapia es el mtodo clsico de obtencin de

plantas libres de patgenos. Consiste en someter las plantas infectadas, durante
perodos comprendidos entre semanas y meses, a temperaturas elevadas (38
40 C) a las que se inactivan los patgenos termosensibles. Aunque resulta
exitosa para eliminar un nmero considerable de patgenos en material de ctricos
infectado, la termoterapia presenta como inconvenientes que algunos cultivares
son sensibles a las altas temperaturas y que es ineficaz en la eliminacin de
ciertos patgenos como los virus yellow vein y dweet mottle, Spiroplasma citri
causante de stubborn, exocortis y cachexia, estos dos ltimos viroides de amplia
difusin.

3.-PLANTAS DE ORIGEN NUCELAR:

1. a) Germinacin convencional de semillas de variedades poliembrinicas: Es
conocido que los patgenos en su mayora no se transmiten a las semillas de los
frutos de un rbol enfermo, por lo que las plantas que se logran al sembrar dichas

1
 semillas estarn libres de patgenos. La poliembriona caracterstica de la mayor
parte de los ctricos permite obtener plantas sanas por esta va mediante la
seleccin de los descendientes nucelares. Se han desarrollado mtodos
bioqumicos y moleculares que permiten distinguir entre la progenie a estos
descendientes - que son los que interesan por presentar el mismo genotipo de la
planta de la que proceden de los de origen cigtico, pero como inconveniente de
esta va debe sealarse el largo perodo que es preciso que transcurra hasta que
los caracteres juveniles (marcada espinosidad, excesivo vigor de las plantas, fruta
de baja calidad y tarda entrada en produccin) de las plantas nucelares
disminuyan y sean aceptables para la propagacin comercial.

2. b) Cultivo in vitro de vulos de variedades poliembrinicas sin semillas y

de nucelas de variedades monoembrinicas: Con el propsito de lograr
descendientes nucelares en estos casos en que no es posible por la siembra de
semillas a que se hizo referencia anteriormente, se desarrollaron estos cultivos in
vitro a partir de los cuales se obtienen plantas libres de patgenos, mas con el
mismo inconveniente de la juvenilidad que caracteriza a las plantas nucelares
arriba explicado, a lo que se suma la presencia de anomalas en una considerable
proporcin de las plantas logradas, especialmente a travs del cultivo de nucelas
in vitro.

4.- PICES CAULINARES IN VITRO: El cultivo de pices caulinares in vitro que

resulta eficaz para obtener plantas libres de patgenos en numerosas especies
vegetales, no ha resultado exitoso en los ctricos por no haberse alcanzado
regeneracin de plantas completas a partir de esos pices. Como alternativa para
lograr plantas de ctricos libres de patgenos, se ha desarrollado la tcnica de
microinjerto de pices caulinares in vitro que constituye en la actualidad la va por
excelencia para disponer del material de propagacin certificado que se lleva a las
plantaciones comerciales, as como la forma de garantizar el estado sanitario de
las accesiones de un banco de germoplasma de ctricos para su utilizacin en los
programas de mejoramiento gentico y para la conservacin adecuada de estos

1
valioso recursos fitogenticos. Esta tcnica ha demostrado ser muy eficaz en la
eliminacin de todos los patgenos probados hasta el presente, incluyendo los
que no pueden ser eliminados por termoterapia, adems de que las plantas sanas
obtenidas por esta va presentan caractersticas idnticas a la planta madre.

6.2.2 CULTIVO DE MERISTEMOS APICALES.

Esta tcnica consiste en aislar el meristemo y sembrarlo en un medio de cultivo

adecuado que posibilite el desarrollo de una planta completa.
El trmino cultivo de meristemo, por lo general, no es correctamente empleado, ya
que en la mayora de los casos se siembra el domo meristemtico acompaado
por uno o dos primordios foliares.

El domo es una estructura de menos de 0,1 mm de dimetro muy difcil de extraer

con xito en forma aislada, y de la cual resulta con frecuencia complicado obtener
plantas completas. Para ello es necesario un medio de cultivo con una
concentracin de nutrientes muy equilibrada y condiciones ambientales muy
estrictas. Por consiguiente los resultados en ese sentido han sido muy pobres. Por
esta razn, en la mayora de los casos, se utiliza el domo acompaado de uno
ms primordios foliares. Tal vez lo ms aconsejable sera utilizar el trmino cultivo
de yema, o brote, o tallo. A pesar de ello, en este captulo utilizaremos la
denominacin cultivo de meristemo por ser esta la terminologa ms difundida,
aunque no sea estrictamente correcta.

En general se considera que las plantas provenientes del cultivo de meristemo son
idnticas u homlogas a la planta madre de donde se extrajo el explante. Por el
contrario, las plantas derivadas de otros tejidos como callos, nucela, primordios
florales o protoplastos, usualmente presentan distintos grados de variabilidad. Esto
ltimo no es deseable para la produccin de plantas libres de virus, donde el
objetivo que se persigue es mejorar la sanidad de la planta pero conservar el resto
de sus caractersticas agronmicas. Sin embargo, es importante aclarar que han
sido sealadas ciertas mutaciones en plantas provenientes de cultivo de

1
meristema, pero con mucha menos frecuencia y menos importantes que las
detectadas con otros sistemas de obtencin de plantas in vitro.
El meristema apical incluye las clulas meristemticas iniciales y sus derivadas
inmediatas del pice de la raz o del brote. El nmero de clulas iniciales es
variable y pueden presentarse en una o ms filas. Dentro del meristema apical se
distinguen dos zonas de tejido: la tnica, que consta de una o ms capas
perifricas de clulas, y el cuerpo, masa celular rodeada por la tnica.

Mtodo de saneamiento

La tcnica de cultivo in vitro de meristemos, como mtodo de saneamiento, se

fundamenta en la distribucin no uniforme de los microorganismos (virus,
bacterias, micoplasmas) en los tejidos de las plantas infectadas, y su disminucin
progresiva hacia el pice del tallo. Por tanto, son mayores las posibilidades que
las clulas del meristemo apical se encuentren libres de microorganismos, a
diferencia de los tejidos ms organizados de las plantas.

Desde que Morel y Martin (1955) mostraron la posibilidad de regenerar clones

de papa (Solanum tuberosum L), libres de virus, mediante el cultivo in vitro de
meristemos, varios trabajos han confirmado la existencia de esta tcnica de
saneamiento, para el saneamiento de numerosas especies portadoras de
enfermedades.

Algunos estudios han demostrado la presencia de partculas virales en las clulas

del meristemo pical; sin embargo plantas obtenidas a partir del cultivo de
meristemos resultaron libres de virus.

La obtencin de plantas libres de patgenos, por medio del cultivo de meristemos,

hace suponer que las zonas meristemticas tienen propiedades o caractersticas
especiales, en relacin con el resto de los tejidos, para mantenerse libre de virus.
Este hecho supone la existencia de otros factores, los cuales probablemente

1
operan en el momento del cultivo in vitro y son responsables de la inactivacin del
virus en las nuevas plantas. Una interrupcin temporal de la organizacin normal
del tejido meristemtico ocasiona la inhibicin de la multiplicacin de los virus,
debido a la no-disponibilidad de enzimas claves.

Para explicar la sanidad o limpieza del meristemo se han formulado varias

hiptesis, una de ellas plantea, que debido a la ausencia de tejido vascular en la
proximidad del meristemo apical y que las conexiones plasmodermticas en las
clulas de este tejido son muy pequeas, por tanto los microorganismos se
desplazan muy lentamente hacia esta zona. Esta caracterstica morfolgica, unida
a la activa multiplicacin celular que all ocurre, puede explicar la baja
concentracin o la ausencia de patgenos en este tejido.

Existe la hiptesis sobre la produccin en las clulas meristemtica, de sustancias

inhibitorias de los microorganismos y que el efecto de las hormonas en el medio
de cultivo, influyen en la inhibicin de los virus mediante el cultivo de meristemos.
Otra de las hiptesis se basa en la activa multiplicacin celular en que se
encuentra la zona meristemtica, invirtiendo la totalidad de la maquinaria
bioqumica celular para la formacin de macromolculas, membranas y otras
estructuras de las clulas nuevas, dejando por tanto a los virus, parsitos
obligados, en condiciones desventajosas para su propia multiplicacin.

6.2.3 CULTIVO DE APICES MERISTEMATICOS

La regeneracin de plantas sanas partiendo de cultivos in vitro de pices

meristemtico de ciertos vegetales exige la bsqueda de tcnicas complejas y su
empleo acertado. Estas tcnicas permiten al explante sortear frecuentes
dificultades como la oxidacin, la heterogeneidad de respuestas, la reversin al
estado juvenil, la presencia de inhibidores de enraizamiento y sobre todo la
sobrevivencia al trasplante en condiciones auttrofas. Buscando la mejor
respuesta del pice meristemtico de algunos plantas Murashige et al. (1972) y

1
Navarro et al. (1975) plantearon la posibilidad del microinjerto in vitro de pices
sobre plntulas provenientes de semillas, logrando as el desarrollo de plantas
libres de numerosos virus. Una tcnica denominada microinjerto in vivo de pices
meristemtico pretratados in vitro, fue propuesta por Mosella et al. (1980), con
esta tcnica se lograron obtener plantas sanas de Prunus prsica L. Batsch y son
menos complicaciones que con la tcnica original in vitro. En 1983, Ascui aplico
estos nuevos procedimientos a diversos ctricos y obtuvo resultados promisorios
que esperan los indizajes virolgicos correspondientes.

6.2.4 CULTIVO DE EMBRIONES

Esta tcnica se ha utilizado para los siguientes propsitos: estudiar los

requerimientos nutricionales de embriones en desarrollo, rescatar embriones
hbridos que se hayan derivado de cruzamientos interespecficos e intergenricos,
producir monoploides y superar la latencia de las semillas, etc.
El desarrollo de embriones vegetales se caracteriza por dos estados distintos: el
estado temprano (heterotrfico) y el estado tardo (autotrfico).

Cultivo de embriones
Ha sido efectivo en el mejoramiento de la cebada.
Otra aplicacin del cultivo de embriones es el rescate de material de propagacion
en los frutales deciduos cuyas semillas son generalmente de baja viabilidad.
Tambin ha servido para obtener hbridos en especies como peras y albaricoques.
Por otro lado, esta tcnica ha ayudado al mejoramiento gentico de especies
arbreas porque acorta el periodo de siembra-floracin y el periodo de de latencia
de semillas.
Factores que afectan el cultivo
Medio de cultivo: el medio modificado de Murashige et al. (1962) parece estar
mas cerca del medio ideal.
Para embriones aislados de vulos muy jvenes se usan algunos medios
relativamente complejos; pueden incluir aminocidos, vitaminas y varios extractos
de plantas, adems de los componentes orgnicos y minerales del medio. El agua

1
de coco no esterilizada por medio de filtracin, ha sido muy benfica para el cultivo
de embriones de ciertas especies de plantas, con la adicin de glutamina o CH
aumenta su efecto.

Osmolaridad: el endosperma liquido empleado en los medios para embriones

muy jvenes tienen una osmolaridad alta, incrementando la concentracin de
sacarosa en el medio es posible cultivar embriones muy jvenes provenientes de
varias espacies de plantas.
Reguladores de crecimiento: su efecto en el cultivo de embriones no es muy
claro.

Cultivo de embriones para la hibridacin

Esta tcnica se ha utilizado para rescatar embriones derivados de cruzamientos
interespecficos (algodn, papaya, etc.). Tambin ha sido til para rescatar
hbridos intergenrios y para rescatar embriones abortados en uvas sin semillas.

Factores que afectan el cultivo

Placenta: la velocidad del desarrollo embrionario en los cultivos de vulos se
puede aumentar, algunas veces, por medio del cultivo de vulos con la placenta
todava adherida a ellos.
Osmolaridad: la concentracin osmtica del medio afecta el desarrollo de los
embriones separados y tambin el cultivo de vulos.
Reguladores de crecimiento: el agua de coco esterilizada por filtracin y la KIN
usadas conjuntamente, estimulan el crecimiento y el desarrollo de embriones en
los cultivos de vulos.

6.2.5. MICROINJERTO

El microinjerto es una variante del cultivo de meristemos que consiste en colocar

el pice caulinar sobre una microplanta in vitro. El meristemo sera el injerto y la
microplanta el patrn. En los ctricos se pueden obtener microplantas libres de

1
virus a partir de los embriones nucelares presentes en las semillas. Teniendo en
cuenta que los embriones nucelares estn libres de virus y los meristemos
tambin, las plantas que se desarrollen del microinjerto tambin lo estarn.

Esta tcnica se puede ensayar con microplantas de naranjo establecidas in vitro a

partir de embriones nucelares y meristemos de plantas adultas.

6.2.6. FACTORES QUE AYUDAN A INCREMENTAR LA POSIBILIDAD DE

OBTENER PLANTAS LIBRES DE PATOGENOS.

Varios factores pueden afectar el buen desarrollo in vitro de una planta a partir de
un meristemo: el medio de cultivo empleado, el estado fisiolgico del explante, la
concentracin de hormonas endgenas del explante, las contaminaciones internas
o externas producidas durante el desarrollo del cultivo, el tamao y localizacin del
explanto, etc.

El tipo de patgeno es muy importante. Las bacterias endgenas, fitoplasmas y

micoplasmas son muy fciles de eliminar, debido a que su gran tamao relativo
hace difcil que puedan infectar las clulas de los pices.
La eliminacin de virus y viroides es ms difcil, pero existe una gran variabilidad
en los resultados. Algunos son muy fciles de eliminar y prcticamente el 100% de
las plantas obtenidas estn sanas, pero otros son muy difciles y slo se eliminan
de un pequeo porcentaje de las plantas obtenidas. Probablemente estas
diferencias estn relacionadas con la mayor o menor facilidad de estos patgenos
de moverse de clula a clula en los tejidos del husped. Este factor es tambin

1
probablemente responsable de que un mismo patgeno sea ms fcil de eliminar
en unos clones que en otros de una misma especie.
Las condiciones de cultivo de las plantas infectadas fuente de pices tambin
influencian la eliminacin de patgenos. Las condiciones ptimas de cultivo que
favorezcan la formacin de brotes vigorosos favorecen la eliminacin de
patgenos. La temperatura de cultivo de las plantas es muy importante. El cultivo
de las plantas infectadas a temperaturas altas dificulta la replicacin y movimiento
de los patgenos termosensibles, por lo que se facilita su eliminacin.

Temperaturas de 30-32C durante 2-3 semanas pueden ser suficientes para

incrementar de forma muy importante la incidencia de eliminacin de algunos
patgenos, e incluso tratamientos de termoterapia seguidos de cultivo o
microinjerto de pices se utilizan rutinariamente en algunos programas.
El tamao del pice juega un papel importante en la eliminacin de patgenos. El
aumento de tamao incrementa el porcentaje de regeneracin y de prendimiento,
pero reduce la proporcin de plantas sanas obtenidas

6.2.7. APLICACIN EN LA AGRONOMIA

El cultivo de tejidos es la biotecnologa moderna que probablemente ha tenido

mayor impacto en la agricultura en los ltimos aos. Una de sus aplicaciones ms
importantes es la obtencin de plantas libres de patgenos. La primera
demostracin de eliminacin de virus mediante cultivo de pices in vitro la realiz
el Dr. Morel en Francia en 1948 que obtuvo plantas de dalia libres de virus a partir
de plantas infectadas.

El cultivo de meristemos ha sido utilizado con xito para distintos objetivos, entre
ellos los ms frecuentes son la rpida clonacin de material deseable
(micropropagacin), conservacin de germoplasma a baja temperatura o
criopreservacin y para la obtencin de plantas libres de patgenos sistmicos

1
La facilidad de usar la tcnica de cultivo de tejidos vegetales para la multiplicacin
masiva produce material vegetal in vitro por la iniciacin de brotes adventicios,
bulbos, tubrculos, embriones asexuales o por crecimiento de brotes de yemas
axilares y produccin masiva de plntulas a partir de meristemos.

Los propagadores comerciales ya tienen estandarizado el mtodo de

mantenimiento de un lote comercial de material madre in vitro, en donde, adems
de tener la ventaja de mantener este material, se considera el gran nmero que se
puede mantener en un espacio reducido con las condiciones ambientales
requeridas y la calidad y sanidad deseables. Esto es debido al potencial
morfogentico que tienen los meristemos y otros tejidos de la planta en la
produccin de brotes.

Existen muchos gneros vegetales que se propagan por cultivo de tejidos para la
obtencin de grandes cantidades de plantas de importancia comercial, como son
Anturium andreanum, Dieffenbachia amoena Snow, D. picta Perfection,
Philodendron oxycurdium, Scindapsus aureus, Syngonium podophyllum,
Chrysanthemum morifolium, Gerbera jamesonni, Begonia spp, Saxifraga
sarmontosa Tricolo, etc

1
 BIBLIOGRAFIA.

ALIBERTA B., SELLIERA H., SOUVRE A. (2005). A combined method to

study gene flow from cultivated sugar beet to ruderal beets in the
glasshouse and open field. European Journal of Agronomy 23(2): 195-
208.

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quequisque (Xanthosoma sagittifolium (L.) Schott). Trabajo de
Diploma. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua. 40 p.

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