Tutora de Biologa

Fundamentos de Biologa Molecular

Primer Ciclo - Paralelo E

Docente: Dra. Nancy Villegas

Integrantes:
Daniela Aguirre
Nicolas Santelli
Gino Valdano
Jean Carlos Hidalgo
ndice
Fundamentos de biologa molecular
Resumen.. 3
Herencia, genes y ADN. 4
Genes y cromosomas.. 4
Genes y enzimas.. 5
Identificacin del ADN como el material gentico 5
Estructura del ADN.. 5
Expresin de la informacin gentica........... 6
Colinealidad de genes y protenas... 6
Papel de ARN mensajero. 6
Cdigo gentico 7
Virus ARN y transcripcin inversa.. 8

ADN recombinante. 9
Endonucleasas de restriccin 9
Generacin de molculas de ADN recombinante. 9
Vesctores para ADN recombinante.. 10
Secuenciacin de ADN. 12
Expresin de genes clonados 12

Deteccin de cidos nucleicos y protenas 12

Amplificacin del ADN con la reaccin en la cadena de la polimerasa 13
Hibridacin de cidos nucleicos. 13
Sondas de anticuerpos para protenas. 16

Funcin de los genes en eucariotas. 17

Anlisis gentico en la levaduras 17
Transferencia de genes en plantas y animales... 18
Mutagnesis de ADN clonados 18
Introduccin de mutaciones en genes celulares.. 18
Interferencia con la expresin gentica celular 19
Conclusin. 19
Bibliografa.. 23

1
Anexos. 24

2
Resumen

En la siguiente tutora hablaremos sobre la importancia de del ADN como portadora

de genes y material gentico para la herencia y su estructura. Tomando en cuenta la

importancia de la expresin de la informacin gentica el cual encontramos varios tipos de

ARN; tales como el mensajero, el cual tiene la funcin de intermediario del transporte de

ADN hasta los ribosomas para producir protenas y el ARN de transferencia que se lo utiliza

como adaptador entre los aminocidos. Por otro lado tenemos el ADN recombinante, es una

molcula de ADN artificial y que sirve para unir dos secuencia de ADN de distintos orgenes.

Y por ltimo tenemos la deteccin de cidos nucleicos y protenas con su amplificacin del

ADN mediante la reaccin en cadena de la polimerasa y la funcin de los genes en

eucariotas.

3
Fundamentos de biologa molecular

Herencia, genes y ADN

Todos los seres vivos se reproducen y heredan informacin gentica de sus progenitores.

las clulas provienen de otras clulas preexistente. Las clulas hijas recibe la informacin

gentica que en su progenitora fue replicada. Este proceso lo llamamos transmisin gentica.

Genes y cromosomas

Gregor Mendel descubri la herencia que consiste en la transmisin de los genes y

cromosomas de los progenitores. Que otorgan caractersticas de ellos. Los rasgos heredados

de los progenitores se llaman genes y los rasgos de los genes son llamados alelos. Los genes

pueden tener dos caractersticas, una dominante y otra recesiva. El gen dominante es el que

predomina y se expresa mientras que el recesivo no se manifiesta pero sigue estando

presente en el material gentico que todo ser vivo.

El genotipo es la composicin gentica mientras que el fenotipo es la apariencia fsica que

va a tener el material gentico del ser vivo. Los cromosomas son los portadores de los genes

y son clulas diploides, esto quiere decir que cada cromosoma tiene dos copias. Los seres

humanos contiene 23 pares de cromosomas y el par 23 es diferente al resto de ellos debido a

que este cromosomas es el reproduccin y lo llamamos gameto (espermatozoide y vulo).

Este cromosomas es diferente al resto debido a que son haploides. La divisin celular de las

clulas haploides es por meiosis el cual un nico cromosoma de cada par se transmite a cada

clula hija. Y al juntarse dos clulas haploides van a forman una diploide.

4
Genes y Enzimas

Luego de varios experimentos como el de George Beadle y Edward Tatum sobre el

hongo Neurospora crassa se lleg a la conclusin que los genes determinan la estructura de

las enzimas y tambin algunos genes pueden codificar ARN funcional, como el ARN de

transferencia o ribosmico en vez de las protenas.

Identificacin del ADN como material gentico

Para la confirmacin del ADN es el material gentico hicieron un experimento de

intercambio de informacin gentica entre 2 bacterias. Una bacteria tena un virus mientras la

otra no. Se le agregaba una porcin del ADN patgeno al sano y de esta forma el sano, a

futuro se convierte en patolgico. Al observar esto, aceptaron que el ADN transporta el

material gentico y al crear una nueva generacin gracias a los genes del ADN se debe la

herencia.

Estructura del ADN

La estructura tridimensional que tiene el ADN fue descubierto por los cientficos

James Watson y Francis Crick. Ellos determinaron que el ADN es un polmero que est

formado por dos nucletidos de ADN que tiene forma de doble hlice y est conformado por

4 bases, Adenina, Guanina, Citosina y Timina los cuales se unen a travs de puentes de

hidrgeno. Cada base nitrogenada es complementaria a la otra, por esta razn, adenina y

timina se juntan y guanina con citosina. Adems el esqueleto del ADN tambin contienen un

grupo fosfato y un azcar.

5
Expresin de la informacin gentica:

La funcin principal de los genes es estructurar o formar las protenas, y estas a su vez

son las encargadas de llevar a cabo el metabolismo celular porque forman enzimas. La

estructura de una molcula de ADN esta depende de las distintas bases nitrogenadas (adenina,

citosina, guanina, y timina) y las protenas son polmeros de 20 aminocidos que por su

secuencia u orden se determina su estructura y funcin. Solo hace falta que un aminocido

est en desorden en la secuencia para que provoque una mutacin gentica.

Colinealidad de genes y protenas

La relacin entre genes y enzimas es que el orden de los nucletidos en el ADN

determinarn la secuencia de aminocidos y por tanto su funcin y estructura, es decir que, si

la secuencia del ADN tiene alguna alteracin habr una mutacin en el gen, y esto producir

cambios en la secuencia de aminocidos de la protena codificada por ese gen. Charles

Yanofsky y su equipo trabajaron en mutaciones en el gen que codifica una enzima

sintetizadora del triptfano (gen de E. Coli). La conclusin que obtuvieron fue que el orden

de las mutaciones de la secuencia de aminocidos eran las mismas sustituciones de las

mutaciones del ADN.

Papel del ARN mensajero

Aunque existe una relacin directa entre la secuencia de nucletidos del ADN y la

secuencia de aminocidos, no quiere decir que el ADN forma las protenas. Esto es verdad

por el hecho de que el ADN se localiza en el ncleo y las protenas son sintetizadas en el

citoplasma. El ARNm (mensajero) ser el que lleve la informacin del ncleo hacia el

citoplasma para que ah se sinteticen las protenas.

6
 El ARN posee un sola cadena de azcares de ribosa, tiene la base pirimidnica Uracilo

en lugar de Timina, y se localiza en el citoplasma. Gracias a estas caractersticas el ARN

forma parte de la va para el flujo de informacin gentica, esta va tiene el nombre de dogma

central. Francis Crick deca y afirmaba que, la informacin fluye del ADN hacia el ARN y

despus del ARN a la protena. Esto quiere decir que las molculas de ARN se forman en el

en el ncleo a partir de moldes de ADN, este proceso se llama transcripcin. Finalmente, a

partir del ARN se van a formar las protenas en el citoplasma por un proceso llamado

traduccin.

En la sntesis de protenas en el citoplasma participan molculas diferentes. Primero,

ARN mensajero que sirve como molde para para formar las protenas y son transcritas por

una enzima llamada ARN polimerasa. Adems, estn presentes el ARN ribosmico y el ARN

de transferencia. El ribosmico es un componente de los ribosomas y el de transferencia que

alinea los aminocidos para el molde del ARN mensajero.

Cdigo Gentico

Cmo se alinean los aminocidos sobre los moldes de ARNm durante la sntesis

de protenas?

En la expresin gentica se pasa informacin entre cidos nucleicos y protenas que

no estn qumicamente relacionadas, pero la funcin del ARNt har posible el apareamiento

complementario de bases del ARN con los aminocidos durante la traduccin. El

apareamiento es posible debido a que antes de la sntesis los aminocidos, se juntan a su

ARNt gracias a una enzima especfica. En conclusin, el apareamiento de bases entre una

secuencia complementaria de ARNt y una y una secuencia complementaria de ARNm pondr

al aminocido en su posicin correspondiente en el molde de ARNm.

7
Cmo se determina el cdigo gentico?

A partir de experimentos con el bacterifago T4, se lleg a la conclusin de que los

genes se leen en grupos de tres nucletidos pero desde un punto fijo. Cuando se adicionan o

quitan 1 o 2 nucletidos se altera el marco de lectura de todo el gen y como producto se

obtiene una protena inactiva (fago mutante). Por el otro lado, cuando se adicionan o se

quitan 3 aminocidos el marco de lectura ser normal y como producto habr una protena

activa (fago TS).

El desciframiento del cdigo gentico se convirti en un problema de asignar tripletes

de nucletidos a sus correspondientes aminocidos. Se usaron sistemas in vitro para realizar

traducciones in vitro, y extractos celulares que posean los componentes necesarios para

sintetizar protenas. Uno de los primeros experimentos fue realizado por Marshall Nirenberg

y Heinrich Matthaei, estos hicieron una traduccin in vitro de un polmero de ARN que

estaba compuesto solo de Uracilo (molde de poli-U). El resultado fue que el triplete UUU

forma el aminocido fenilalanina. As se determin la composicin de todos los aminocidos

conocidos, gracias a la traduccin in vitro.

Virus ARN y transcripcin inversa

Muchos de los virus tienen ARN en lugar de ADN como material gentico. Los

genomas de ARN fueron vistos por primera vez en virus vegetales y constaban de ARN y

protenas. Ms adelante, en los aos 50, se descubri que el ARN de los virus acta como

material gentico, es decir que pueden hacer las mismas funciones que el ADN. El ARN

mediante el apareamiento de bases complementarias forma ARN a partir de molde de ARN,

exactamente igual al ADN.

En los virus animales como el del polio e influenza se pudo observar tambin la

replicacin de estos por sntesis de ARN mediada o dirigida por ARN, pero este proceso no

8
daba explicacin a la replicacin de una familia de virus animales (tumorignicos). Entonces,

Howard Temin en los aos 60 descubri con experimentos que los virus tumorignicos de

ARN se replicaban por un nuevo ADN, el ADN intermediario, el provirus del ncleo. Esta

formacin de ADN a partir de ARN es denominada transcripcin inversa, que fue aceptada

como un nuevo mtodo de transferencia de informacin gentica. No solo sirve para los

retrovirus o virus tumorales tambin es responsable de la transposicin de secuencias de

ADN de un lugar a otro del cromosoma.

ADN recombinante

Es una molcula artificial que proviene de la unin artificial de dos fragmentos de adn

por lo tanto la tecnologa de ADN recombinante es el conjunto de tcnicas en aislar a un gen

de un organismo para su posterior manipulacin en otro diferente.

Endonucleasas de restriccin:

Son tipos de protenas cuya funcin es cortar la doble cadena de ADN a travs del

esqueleto de fosfato, son producidas por bacterias como mtodo de defensa contra virus y

tambin consiste en degradar el ADN extrao, tambin cortan dejando extremos cohesivos la

cual estos extremos son generados cuando la enzima corta las dos hebras y no quedan

simtrica es decir q al cortar quedan asimtrica, por lo tanto, esto sucede cuando la enzima

corta las dos hebras por el mismo lugar.

Generacin de molculas de ADN recombinante

Luego de la endonucleasas de restriccin cuando los extremos cohesivos de dos

molculas de ADN que son diferentes se aparean mediante el ADN ligasa el resultado es la

generacin de molculas de ADN recombinante.

9
 Para la generacin de molculas de ADN recombinante se necesita principalmente la

intervencin de los plsmidos que son pequeas molculas de ADN circular presentada en

muchas bacterias, los plsmidos contienen uno o ms genes de resistencia, antibiticos y son

capaces de autoreplicarse. Llegan a contener una secuencia de iniciacin, ya que estos

permiten replicarse de una manera independiente del ADN genmico, se puede generar una

molcula de ADN recombinante usando un plsmido.

Vectores para ADN recombinante

Los vectores son importantes en el proceso de formacin de ADN recombinante.

Diferentes tipos de vectores son usados; dependiendo del tamao del ADN se pueden usar

distintos vectores de clonacin para producir molculas recombinantes. Los organelos de las

clulas vegetal sirven para clonar insertos de ADN de miles de pares que son de 2 a 4 Kb de

ADN .La secuencia del ADN incluyendo origen de replicacin que seala a la del ADN

polimerasa. Los vectores plasmdicos llevan genes que son resistentes a antibiticos como la

penicilina y esas colonias que contienen el ADN plasmdico son seleccionadas, de esta

manera algunas bacterias que tienen el plsmido pueden ser escogidas por que cada plsmido

recombinante forma una sola colonia resistente a los antibiticos (Cooper, 2014).

Las molculas que resultan del ADN recombinante son utilizadas en para el E.coli.

Las bacterias que estn presentes tendrn solo un inserto de ADN y las que tengan el

plsmido de inters crecern en grandes cantidades y extraern el ADN y las de pequeas

molculas circulares del ADN plasmdico podrn separarse del ADN cromosmico

bacteriano y el resultado es ADN plasmdico purificado[JV1] vlido para el inserto clonado.

Los vectores bacterifagos pueden ser empleados para aislamiento del ADN

genmico como clones de ADNc a partir de las clulas eucariotas que pueden agrupar

fragmentos ms grandes de ADN inserto que los plsmidos. En vectores de clonacin los

10
genomas del bacterifago que son dispensables para replicacin viral se eliminan y sustituyen

por lugares nicos de restriccin para insercin del ADN clonado. Las molculas

recombinantes se pueden utilizar para E.coli y producir millones de fagos progenie que

tienen un solo inserto ADN, estos fagos se pueden aislar formando molculas recombinantes

con un solo fragmento de ADN clonado de hasta 15 Kb formando un genoma

recombinante.

En estudios de ADN genmico es importante la clonacin de fragmentos de ADN

ms grande de las que el fago puede llevar ya que existen cinco tipos de vectores tipo

csmico que agrupan insertos aproximados de 45 Kb y contienen secuencias de

bacterifagos del ADN clonado en partculas de fago y los csmicos dan origen a

replicacin y genes para resistencia de antibiticos caractersticos de los plsmidos que

pueden replicarse como plsmidos en el interior de la clula bacteriana y otros vectores se

derivan del bacterifago P1 que puede acomodar fragmentos de ADN de 70 a 100 Kb que

agrupan molculas recombinantes in vitro en partculas de fago P1 para replicarse como

plsmidos en E.coli.

Los vectores de cromosomas artificial P1 tambin contienen secuencias de

bacterifago P1, se introducen en E.coli como plsmidos y sitan insertos mayores de 130 a

150kb.

Los vectores de tipo BAC provienen de un plsmido natural en E.coli, hay secuencias

del factor F que permite a los BAC objetar como plsmidos estables que contienen insertos

de 120 a 300 kb. Los vectores mayores de ADN contienen principios de replicacin de

levaduras a parte de otros procesos que permite hacer una copia como molcula lineares

dentro de la levadura en la parte ms adentro de la clula.

11
Secuenciacin de ADN

Tcnica utilizada para determinar el nucletido secuencia de ADN. El nucletido de

secuencia es el nivel ms fundamental de los conocimientos de un gen o genoma. Es el plano

que contiene las instrucciones para construir un organismo, y no hay comprensin de la

funcin gentica o la evolucin podra ser completa sin la obtencin de esta informacin.

Gracias a este proceso que es preciso y rpido se facilita la clonacin y secuenciacin de

ADN. el mtodo ms comn de secuenciacin se basa en la interrupcin prematura de la

sntesis del ADN por la inclusin de dideoxinucletidos terminadores de la cadena en

reacciones del ADN polimerasa

Expresin de genes clonados

La expresin de genes clonados facilita la obtencin de protenas. Muchas protenas

importantes se encuentran en las clulas eucariotas y no se pueden conseguir una gran

cantidad de las mismas en esta clase de clula. El proceso de extraccin de genes clonados

nos ayuda a conseguir una mayor cantidad de esta protena mediante la clonacin de los

genes usando los vectores de ADN recombinantes correctos.

Por ejemplo, en la levadura se produce la interaccin de protenas mediante el sistema

de doble-hbrido, gracias a este sistema se pueden reconocer las protenas que interaccionan

entre s. Este sistema cambia la levadura mediante ADN hbrido provocando dicha

interaccin.

Deteccin de cidos nucleicos y protenas

La clonacin molecular ha permitido el aislamiento y caracterizacin de genes

individuales provenientes de las clulas eucariotas. En esta seccin, los procedimientos

12
bsicos empleados para la deteccin de cidos nucleicos y protenas especficas son

analizados. Estas tcnicas son importantes para una amplia variedad de estudios,( el mapeo

de genes a cromosomas, el anlisis de la expresin gnica, la localizacin de protenas en

orgnulos subcelulares). (Cooper, 2014)

La clonacin molecular tambin permite producir y aislar grandes cantidades de un

ADN en particular. La cadena de la polimerasa (PCR), desarrollado por Kary Mullis en 1998,

es un mtodo alternativo para conseguir una gran amplificacin del ADN.

Si se sabe suficientemente una secuencia de un gen de modo que puedan especificarse

cebadores, la amplificacin de PCR proporciona un mtodo muy poderoso de deteccin de

pequeas cantidades de molculas especficas de ADN y ARN en una mezcla compleja de

otras clulas.

Las nicas molculas de ADN que sern agrandadas por PCR son aquellas que tienen

secuencias complementarias a los cebadores empleados en reaccin. Por esto, la PCR puede

ampliar selectiva un molde especfico desde mezclas complejas como el ADN o ARN total de

las clulas. Adems se han desarrollado tcnicas que permiten usar cuantitativamente por la

PCR para definir las cantidades de molcula especficas de ADN o ARN presentes en una

muestra.

Los segmentos de ADN agrandados por PCR pueden secuenciarse directamente o

ligados a vectores y esparcidos como clones moleculares. La PCR permite el agrandamiento

y la clonacin de cualquier segmento de ADN para el que puedan disearse cebadores.

Hibridacin de cidos nucleicos

La clave para la deteccin de secuencias especficas de cidos nucleicos es el

apareamiento de bases entre hebras complementarias de ARN o ADN. Son metidas (90 a 100
O
C) las hebras complementarias de ADN se separan dando molculas de cadena simple.

13
Estas hebras se desnaturalizadas de ADN se incuban en condiciones adecuadas (65 C) se

naturalizaron para formar molculas de doble cadena por apareamiento complementario de

bases un proceso denominado hibridacin de cidos nucleicos.

Como se ha dicho anteriormente, la hibridacin entre cebadores y ADN molde proporciona la

especificidad que la amplificacin por PCR. El ADN clonado es marcado con nucletidos

radiactivos o con nucletidos modificados que puedan detectarse por fluorescencia o

quimioluminiscencia. Este ADN marcado es despus empleado como sonda para la

hibridacin con secuencias de ADN o ARN complementario que son detectados mediante

radiactividad.

La transferencia de Sotuer se utiliza de modo generalizado para la deteccin de genes

especficos de ADN celular. El ADN problema es dirigido por una endonucleasa de

restriccin y los fragmentos obtenidos se separan por electroforesis. El gel se adhiere de un

filtro de nitrocelulosa de nylon, al cual se transfieren los fragmentos de ADN que contienen

la secuencia complementaria permitiendo la visualizacin de estos fragmentos especficos de

ADN celular.

La ADN polimerasa se emplea para replicar repetidamente un segmento determinado

de ADN. El nmero de secuencia de ADN va incrementando de modo exponencial,

doblndose con cada ciclo de recopilacin por lo que se pueda obtener una cantidad

sustancial de copias a partir de un pequeo nmero.

Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos

marcados con radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la protena

que me interesa localizar

14
 Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA

(molculas de DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para

identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA

(molculas de RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para

identificar qu bandas del gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Esto tambin permite identificar regiones especficas de ADN que han sido

fragmentadas por una enzima de restriccin. El ADN se separa mediante electroforesis en gel

de agarosa. Tras teirlo con bromuro de etidio, el gel se fotografa bajo luz ultravioleta.

Posteriormente se trata con hidrxido sdico o a altas temperaturas para desnaturaliza el

ADN y romper la unin entre sus dos cadenas. Entonces el gel se neutraliza con un buffer

adecuado. En una cubeta se extiende una pieza de papel de filtro grueso sobre un soporte

elevado, con los extremos del papel de filtro sumergidos en una solucin altamente salina. Se

sita el gel sobre la pieza de papel de filtro y sobre el gel se coloca una membrana de nylon

especial. Encima de todo ello se pone una pila de toallas de papel. (Cooper, 2014)

Por ltimo se presionan todas las capas con un peso. La solucin altamente salina

asciende a travs de la pieza de papel y atraviesa el gel por accin capilar, llevando consigo el

ADN desnaturalizado. El ADN es transportado hasta la membrana de nitrocelulosa, a la cual

se adhiere. De este modo el filtro se convierte en una rplica del gel original. Cuando se ha

completado la transferencia, el ADN puede ser irreversiblemente unido al filtro mediante

calor o exposicin a luz ultra violeta. El producto del Southern puede ser hibridado con una

sonda de ADN marcada radiactivamente especfica para el gen o regin del ADN objeto de

15
estudio. Despus de varias horas en contacto con el filtro se elimina la sonda. La localizacin

de la unin de la sonda con el filtro se identifica mediante una autorradiografa.

Para determinar el tamao del fragmento de restriccin que contiene la secuencia de

inters, se puede hacer una comparacin con marcadores de peso molecular en un gel de

agarosa.

Sondas de Anticuerpos para protenas

Las protenas se someten a desnaturalizacin tratndolas con un detergente inico

(sulfato de dodecilo sdico o SDS) a 100C. Luego, se realiza electroforesis en geles de

poliacrilamida (SDS-PAGE). El detergente cubre de manera uniforme a todas las protenas,

negativizando la carga de la superficie de la protena.

Las protenas migran dentro del campo elctrico con base en la cantidad de molculas de

SDS unidas a ellas, cantidad que depende a su vez del tamao de la protena.

Con esto obtendremos un patrn de bandas que depender del nmero de protenas presentes

en la muestra y de su tamao. (Cooper, 2014)

Por lo tanto este mtodo separa protenas conforme a su peso molecular.

La tcnica del Western Blot (tambin llamado inmunoblotting debido a que se

utilizan anticuerpos para detectar el antgeno o los antgenos especficos de inters) es una

tcnica que nos permite detectar la presencia de una protena en un homogeneizado o extracto

de tejido.

En esta tcnica, se analizan las protenas que reaccionan con anticuerpo en la mezcla

separando primero las protenas de dicha mezcla mediante una electroforesis en gel

desnaturalizante.

La especificidad de la unin antgeno anticuerpo permite la deteccin de una nica

protena dentro de una mezcla compleja de otras protenas.

16
Se da cuando la reaccin Antgeno - Anticuerpo a determinadas condiciones, el complejo

formado se inestabiliza y precipita, de tal forma que el precipitado formado es fcilmente

detectable y cuantificable.

La tcnica de ELISA es una tcnica de inmunoprecipitacin pero a la vez es una

tcnica inmunoenzimtica ya que se basa en el uso de antgenos y anticuerpos marcados con

una enzima que al aadirle un sustrato se observar un color fcilmente detectable y

cuantificable.

Funcin de los genes en eucariotas

Anlisis gentico en levaduras

Las levaduras por tener un genoma pequeo y por tener un tiempo de divisin de 2

horas han sido beneficiosas para el estudio de la biologa molecular. Estas poseen defectos en

genes necesarios para procesos celulares muy importantes y se llaman genes mutantes

termosensibles, es decir que codifican a determinadas temperaturas. El aislamiento de dichos

genes permiti ver qu genes controlan los distintos procesos celulares, por ejemplo la

formacin del ARN y el transporte de protenas.

La simple estructura del sistema gentico le da a la levadura la posibilidad de poder

clonar genes mutantes. Primero, se estructura una biblioteca genmica de ADN normal de

levadura en vectores que se replican como plsmidos. Luego se mezclan los miles de

plsmidos para formar una levadura termo-sensible y las cepas que crecen a temperatura no

permisiva son elegidas. Estas cepas ahora contienen una copia del gen buscado es decir el que

se quera aislar. (Cooper, 2014)

Gracias a esto se logra ver en la levadura que gen produce determinada protena

esencial. Ms importante an, este descubrimiento ha permitido la clonacin de genes.

17
Transferencia de genes en plantas y animales

Introduccin de ADN en clulas animales

Un gen de inters es clonado e introducido en el ADN de la clula animal en cultivo.

Luego un grupo de clulas que toman y expresan transitoriamente el ADN del plsmido

(expresin transitoria). Luego hay una seleccin en un medio que contiene el frmaco y las

clulas transformadas forman colonia que contiene secuencias de plsmidos integradas en el

ADN cromosmico. (Cooper, 2014)

Vectores retrovirales.

El vector se compone de secuencias retrovirales clonadas en un plsmido que puede

propagarse en E. Coli. El ADN extrao se inserta se inserta en las secuencias virales y los

plsmidos recombinantes pueden ser aislados a partir de las bacterias. En este momento pasa

la transfeccin con el ADN recombinante de las clulas animales en cultivo. El ADN es

captado por una pequea parte de la clulas, que producen retrovirus recombinantes, los

cuales contienen el ADN insertado. Estos retrovirus recombinantes pueden ser utilizados para

infectar de manera eficaz nuevas clulas, donde el genoma viral con los genes insertados se

integra en el ADN cromosmico en forma de provirus. (Cooper, 2014)

Introduccin de mutaciones en genes celulares

Mutagnesis de ADN clonados

Provocar una alteracin en un gen clonado para ver el efecto de la mutacin en

funcin de los genes es gentica inversa, se introduce la mutacin y se observan los

resultados. Mediante la mutagnesis in vitro es que se alteran los genes clonados por

inserciones o deleciones de nucletidos especficos, por ejemplo el de oligonucletidos para

18
producir cambios de nucletidos en la secuencia de ADN. En resumen, la mutagnesis in

vitro nos permite reconocer el papel funcional de las secuencias reguladoras y codificantes.

Interferencia con la expresin gnica celular

Mediante la recombinacin homloga pueden usarse variedades de formas para

manipular la expresin o funcin gnica. El mtodo utilizado para un gen diana deseado son

los cidos nucleicos en clulas de cultivo. ARN O ADN monocatenario complementario al

ARNm del gen inters hibrido con el ARNm y bloquea la traduccin de la protena(La

Celula, 5ta edicin, pgina 144) adems, los hbridos ARN-ADN que resultan de la

introduccin de molculas de ADN anti sentido son degradados dentro de la clulas. Los

ARN antisentido se introducen directamente en las clulas, o estas pueden ser trastocadas con

los vectores que se disearon para expresar ARN anti sentido.

ltima mente la interferencia por ARN (ARNi) ha surgido como algo eficaz y muy

utilizado que interfiere con la expresin gentica atreves del ARNm. Esto fue descubierto en

1998 en donde Andrew Fire, Craig Mello y colaboradores descubrieron que la infeccin de

ARN de doble hebra inhibe la expresin de un gen complementario, esta observacin

demuestra un papel para el ARN de doble hebra que tiene un papel no anticipado. Cuando

estos ARN de doble hebra se introducen en la clula son degradados en pequeas molculas

de doble hebra.

Los ADN clonados que codifican las protenas mutantes que son dominantes

inhibitorios se introducen en la clula mediante transferencia gentica y se estudian los

efectos de bloquear a la funcin gentica normal. (Cooper, 2011, pg. 146)

Conclusin

La herencia es el proceso gentico el cual transmitimos los genes a los hijos. Esto se

debe, cuando se fecunda un vulo de la madre con un espermatozoide del padre, cada uno de

19
ellos le otorga 23 cromosomas haploides a sus hijos. Ambas cantidades formarn los 23 pares

de cromosomas diploides. Cada cromosoma contiene genes y alelos los cuales otorgan las

caractersticas fsicas y genticas del cuerpo. Adems los genes son los que codifican la

estructura de una cadena polipeptdica.

El ADN es el encargado de transportar el material gentico de las clulas y tiene una

estructura de doble hlice que est compuesto de un grupo fosfato, un azcar y bases

nitrogenadas que se unen mediante enlaces de hidrgeno.

En cuanto a la expresin de la informacin gentica debemos mencionar que los

genes y las protenas estn estrechamente relacionados, hay una colinealidad entre ellos, es

decir que si uno de los dos sufre una alteracin el otro se ver afectado tambin. Por el otro

lado, sin el ARNm no fuera posible la sntesis de protenas ya que ellos son los

intermediarios, es decir lo que llevan la informacin hacia los otros ARN para que se d la

sntesis. Para que la sntesis culmine el ARNt cumple un papel fundamental. Otro problema

para la sntesis de protenas es determinar el cdigo gentico, cada gen se lee en grupos de

tres nucletidos (UUU). A esta conclusin se lleg gracias a traduccin in vitro que hizo

posible este descubrimiento. Ya con el tema del cdigo gentico claro, descubrieron que los

virus poseen ARN en lugar de ADN pero que puede cumplir las mismas funciones que el

ADN. Entonces se replica por sntesis de ARN mediada por ARN. Pero adems puede crear

ADN en las clulas que invade, es decir puede hacer transcripcin inversa. (Cooper, 2014)

El ADN recombinante consiste en aislar a un gen de un organismo para su

manipulacin en otro diferente. Para aislar un gen de un organismo se usa un proceso llamado

endonucleasis de restriccin en el cual ciertos tipos de protena se encargan de cortar la doble

20
cadena del ADN; estas protenas las generan bacterias como mtodo de defensa que degradan

el ADN extrao. Despus de que el ADN de las dos molculas distintas fue cortado los

extremos cohesivos de las mismas se unen gracias al ADN ligasa y as se forma el ADN

recombinante. En el proceso de formacin del ADN recombinante es importante la presencia

de los plsmidos que son capaces de replicarse y contienen una secuencia de iniciacin.

Los vectores son importantes en el proceso de formacin de ADN recombinante.

Diferentes tipos de vectores son usados dependiendo del tamao del ADN se pueden utilizar

distintos vectores de clonacin para producir molculas recombinantes.

La secuenciacin de ADN es una tcnica utilizada para determinar el nucletido

secuencia de ADN. El nucletido de secuencia es el nivel ms fundamental de los

conocimientos de un gen o genoma. Es el plano que contiene las instrucciones para construir

un organismo, y no hay comprensin de la funcin gentica o la evolucin podra ser

completa sin la obtencin de esta informacin.

La expresin de genes clonados facilita la obtencin de protenas. Muchas protenas

importantes se encuentran en las clulas eucariotas y no se pueden conseguir una gran

cantidad de las mismas en esta clase de clula.

Por otro lado, la detencin de cidos nucleicos y protenas son procesos de los genes

individuales procedentes de las clulas eucariotas estos proceso requieren de anlisis de

organizacin intracelular y de la expresin de los genes individuales y de las protenas que

los codifican.

Despus se da la clonacin de ADN con la reaccin de la cadena de polimerasa que permite

producir y aislar grandes cantidad de un ADN en particular. Fue desarrollada por Kary Mullis

en 1998 y este es un mtodo alternativo para conseguir un gran nmero de fragmentos de

material gentico a partir de una nica copia de ADN.

21
Existen tipos de transferencia como la de Southern que es la cual se utiliza de modo

generalizado para la deteccin de genes especficos en el ADN celular. Tambin est la

transferencia de Northern que es utilizada para la deteccin de ARN en vez de ADN.

Por ltimo las sondas anticuerpos para protenas que no solo requiere la deteccin de ADN y

ARN sino tambin de protenas especficas.

La estructura y rapidez de la replicacin de la levadura permite la clonacin molecular de

cualquier gen que corresponda a una mutacin de la levadura. Para entender los genes y sus

funciones se usa la mutagnesis in vitro, que es un proceso en el cual se introducen

mutaciones en ADN clonado para luego ver el efecto de dicha mutacin.

Para poder inhibir la expresin de un gen diana se ha empleado un mtodo que es la

introduccin de cidos nucleicos antisentido en clulas de cultivo, adems los hbridos ARN-

ADN resultantes de las molculas de ADN antisentido se degrada en el interior de la clula.

Este ADN antisentido est por lo general en forma de oligonucletidos cortos, los cuales en

muchos casos son introducidos en las clula mediante un cultivo.

22
Bibliografa

Cooper, H. (2014). La Clula. Madrid: Marbn.

23
Anexos

1.1Estructura del ADN (Cooper, 2014, pg. 109)

1.2Colinealidad de genes y protena (Cooper, 2014, pg. 112)

24
1.3Evidencia gentica del cdigo de tripletes (Cooper, 2014, pg. 114)

1.4El triplete UUU codifica a la fenilalanina. (Cooper, 2014, pg. 114)

1.5Transcripcin inversa y replicacin de retrovirus. (Cooper, 2014, pg. 116)

Amplificacin del ADN por PCR (Cooper, 2014, pg. 128)

25
Deteccin de ADN por hibridacin de cidos nucleicos. (Cooper, 2014, pg. 129)

Transferencia Southern (Cooper, 2014, pg. 130)

26
Bsqueda por hibridacin en una biblioteca recombinante. (Cooper, 2014, pg. 131)

Microarrays de ADN (Cooper, 2014, pg. 132)

27
Imunotransferencia (Cooper, 2014, pg. 133)

Mutagnesis con oligonucletidos sintticos. (Cooper, 2014)

28
 Figura 1 Esquema de las secuencias de reconocimiento de endonucleasas de

restriccin representativas (Cooper, 2011, Pg 118)

Unin de las molculas de ADN (Cooper, 2011, Pg 121)

29
Expresin de bacterias de genes clonados ( Cooper, 2011, Pg 126)

30