Mtodos para inducir

mutagnesis en plantas

Claudia Stange
Curso Biologa Molecular
Enero 2012
METODOS PARA INDUCIR MUTAGNESIS
EN PLANTAS

Gentica clsica:
Del fenotipo (natural o inducido) al gen

Gentica Reversa:
Mutacin de un gen y observar fenotipo
 GENTICA CLSICA

TMVU1

TABACO Xanthi NN TABACO Xanthi nn

POR QU ESTA PLANTA NO SE ENFERMA FRENTE A

UN VIRUS Y LA OTRA SI?

IDENTIFICAR EL O LOS GENES INVOLUCRADOS

 GENTICA CLSICA

CRUZAMIENTO DE LINEAS CON DISTINTOS FENOTIPOS

MARCADORES MOLECULARES: microsatelites, SSLP, CAPS

CLONAJE POSICIONAL

MAPA GNICO

IDENTIFICACIN DEL GEN

CRUZAMIENTO DE LINEAS CON DISTINTOS FENOTIPOS

S: CARCTER DE
RESISTENCIA

s: CARCTER DE
SENSIBLIDAD

N: Otra
Caracterstica
allica
CRUZAMIENTO DE LINEAS CON DISTINTOS FENOTIPOS

RETROCRUCE DE F1 CON LNEA PARENTAL SENSIBLE

(O RESISTENTE)

Se realiza anlisis
con marcadores
moleculares a
parentales y lneas
segregantes

F2
 MARCADORES MOLECULARES

Hibridacin tipo Southern

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

PCR: STS (Sequence

(Sequence--Tagged Site)
RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
SCAR: Sequence Characterized Amplified Region
CAPS: Cleaved Amplified Polymorphic Sequences.
Muestra restricciones polimrficas dada por la
digestion de PCR.

SSLP: Simple Sequence Length Polymorphism ,

muestra variabilidad en secuencias cortas
repetidas.
 Marcadores RFLP

Ventajas: Uso de sondas heterlogas, reproducibles,

codominantes.
Desventajas: Bajo nivel de polimorfismo, requiere disponer
de sondas conocidas, uso de radiactividad, alta cantidad
DNA, laborioso y lento
 (Sequence--Tagged Site) Marcadores tipo PCR
STS (Sequence
RAPD
Un nico oligonucletido de 10 bases, al azar, GC
Ms polimrfico que RFLP
Mltiples bandas.
No se requiere conocimiento previo del genoma
Marcadores moleculares dominantes
Una banda no necesariamente es un nico fragmento
Baja Reproducibilidad ISB2F1 F2

RAPD de Sorgo para segregacin de carcter de

resistencia a brotado precosecha. DNAs de IS, B2
(parentales), F1 y F2 amplificados con
el primer OP H02. Eduardo Hepp
SCAR
SSLP, CAPS, dCAPS

Permiten
establecer mapas
en los
cromosomas

Permiten establecer
marcadores asociados a
la caracterstica
estudiada
CLONAJE POSICIONAL

Mapa de ligamiento, muestra

los grupos de ligamiento.

Cada locus est delimitado

indicando el fenotipo que
Identific al locus

A la izq
izq:: locus normal,
derecha: variante.
Los nuevos loci que se
Encuentran se mapean
relativo a los ya existentes.
 CLONAJE POSICIONAL
Mmolec.. STS, Clones YAC, Clones BAC
Mmolec

Se identifica el gen responsable de la caracteristica

 IDENTIFICACIN DEL GEN ?

Una vez encontrado el posible gen:

Ensayos de complementacin
Anlisis molecular de genes candidatos

Problemas:
Carcter controlado por varios genesdominancia,
semidominancia.
Regiones genmicas con bajo nivel de recombinacin
Poca cantidad de secuencias repetidas
 GENTICA REVERSA

HERRAMIENTAS

MUTAGNESIS:: Knock out

MUTAGNESIS

-T-DNA
-TRANSPOSONES INSERCIONAL
- GEN TRAP
-EMS = MUTACION PUNTUAL
-NEUTRONES = DELECION

SILENCIAMIENTO GNICO: Knock down

-ANTISENTIDO
-VIGS
 GENTICA REVERSA

MUTAGENESIS INSERCIONAL
Transposones Retrotransposn de maz
(En/Spm, Ac/Ds y Mu).
Facilidad en la generacin de grandes colecciones
Posibilidad de reversin
Inestables

T-DNA
Menor nmero de copias
Mayor estabilidad
Sin preferencias por el sitio de insercin
Necesidad de transgnesis
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES

Al conocer la
secuencia del
transposn Ac,
permite la
identificacin por
PCR de la secuencia
interrumpida, peor
son inestables
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES

Caracterizacin:
Complementacin
en plantas
sensibles a TMV
que no poseen gen
N.
 MUTAGNESIS INSERCIONAL: T-
T-DNA

Banco de mutantes de arroz mediante el T-

T-DNA.
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES o T-
T-DNA

Como identificar una mutacin... en un gen especfico entre los 25.500

genes en el genoma de Arabidopsis y en un conjunto de 100.000 plantas con
mutaciones distribuidas al azar?
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES o T-
T-DNA

9 plantas en cada
Mini pool se agrupan
en grupos de 25pools
9x25=225en total
son 60750 plantas,
entonces hay 270
pools de 225 (9x25)

Los 270 pools se

agrupan en 30 super
pools de 9 pools c/u
(9X9x25)
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES o T-
T-DNA

Extraer DNA a los 30 superpooles

(con muestras de todas las plantas)
Combinacion de partidores para
realizar el anlisis molecular
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES o T-
T-DNA

Super pool 4 tiene 9 pools de (25x9) plantas.

Ahora analizar cual de esos 9 pools tiene la planta mutante, luego
identificar que pool de 9x25 sigue con la marca hasta identificar aquella
mutante del gen de inters.
Esta se deja semillar y de las planas homocigotas se vuelve a realizar el
estudio
MUTAGNESIS INSERCIONAL: TRANSPOSONES o T-
T-DNA

Inconvenientes mutagenesis insercional

-No se puede estudiar la falta de funcin de
genes duplicados en tndem
-Requiere un nmero bastante grande de lneas
para conseguir la saturacin
-Slo se puede llevar a cabo en especies
transformables o con transposones internos
MUTAGNESIS INSERCIONAL: GEN-
GEN-TRAP

En rojo, gen de inters

En celeste gen reportero GUS,
GFP, YFP

Se evala al transformar al azar

Si la insercin ocurri:
B: cercano a un enhancer de un
genX
C y D: dentro de un gen X,
obtenindose una protena trunca
fusionada a GUS.
 MUTAGNESIS INSERCIONAL: GEN-
GEN-TRAP

El gen es identificado sin necesidad de un fenotipo mutante, lo cual es til

para Genes redundantes y Genes activos en distintos estadios de
desarrollo .
La funcin gnica puede caracterizarse en base a resultados de actividad
del gen reportero.
 GENTICA REVERSA

HERRAMIENTAS

MUTAGNESIS::
MUTAGNESIS

-T-DNA
-TRANSPOSONES INSERCIONAL
- GEN TRAP
-EMS = MUTACION PUNTUAL
-NEUTRONES = DELECION

SILENCIAMIENTO GNICO

-ANTISENTIDO
-VIGS
 MUTACIN PUNTUAL: EMS

TILLING: Targeting Induced Local Lesions IN Genomes

PCR a los super pools

y a pools!!

Pilar Cubas, Madrid

 MUTACIN PUNTUAL: EMS

TILLING: Targeting Induced Local Lesions IN Genomes

Identificacin del pool..

Y asi se llega al gen
Pilar Cubas, Madrid
 GENTICA REVERSA

HERRAMIENTAS

MUTAGNESIS::
MUTAGNESIS

-T-DNA
-TRANSPOSONES INSERCIONAL
- GEN TRAP
-EMS = MUTACION PUNTUAL
-NEUTRONES = DELECION

SILENCIAMIENTO GNICO

-ANTISENTIDO
-VIGS
DELECIN: MUTAGNESIS POR NEUTRONES
 DELECIN: MUTAGNESIS POR NEUTRONES

partidores
especficos

Pilar Cubas, Madrid

Ventajas:
Ventajas:
Posibilidad de analizar genes ubicados en tandem,
no requiere transformacin por lo que es til en especies no
transformables, genera nuevas variedades.
Desventajas:: si la mutacin abarca uno de los oligos. Resultados difieren
Desventajas
entre especies
 GENTICA REVERSA

HERRAMIENTAS

MUTAGNESIS::
MUTAGNESIS

-T-DNA
-TRANSPOSONES INSERCIONAL
- GEN TRAP
-EMS = MUTACION PUNTUAL
-NEUTRONES = DELECION

SILENCIAMIENTO GNICO (SG)

-ANTISENTIDO
-VIGS
 Mecanismo SGPT
pBIN19/L-AS y pBIN19/L-ASD pBIN19/L-S
RNA antisentido RNA endgeno RNA sentido

RNApd

RNA doble hebra

DICER

Propagacin
sistmica

siRNA
Risc
 Mecanismo SGPT
Fenmeno en el cual RNA de doble hebra (dsRNA) induce
SGPT.
Silenciamiento Secuencia-especfico. > 81% de identidad
nucleotdica. Es sistmico: se propaga a toda la planta.
Cosupresin y antisentido
Correspondera a un mecanismo de defensa contra Virus y
Transposones. (Respuesta inmune innata?)
 Mecanismo SGPT
Se transforman plantas con la secuencia del gen en estudio

Vector que posee un fragmento del gen de inters en sentido

y en antisentido induce SG por la formacin directa de dsRNA, y por
ende el siRNA

dsRNA
.Pero se pueden
obtener diferentes
Si RNA grados de acuerdo a la
sistmicamente. eficiencia y a la expresion
del antisentido
 Mecanismo SG
wt silenciadas
Silenciamiento en eschscholzia del
gen de fitoeno desaturasa (pds
pds))
involucrado en la sntesis de
carotenoides. Las plantas quedan
albinas (fotosensibles) de acuerdo
al grado de SG ya que el gen
interfiere en tolerancia a luz

FLORES

HOJAS

Wege et al, 2007

SGPT para identificar la funcin de genes
SGPT para identificar la funcin de genes