Bioquimia

ISSN: 0185-5751
publicacionesbioquimia@prodigy.net.mx
Sociedad Mexicana de Bioqumica A. C.
Mxico

Castagnino, Juan Miguel

Electroforesis capilar
Bioquimia, vol. 25, nm. 1, enero-marzo, 2000, pp. 13-32
Sociedad Mexicana de Bioqumica A. C.
Distrito Federal, Mxico

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=57611797003

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TEMA: BIOQUIMICA Y FISICOQUIMICA

Electroforesis capilar
Juan Miguel Castagnino 1

Adaptacin de la Conferencia presentada en el Congreso CUBRA IV, 1997,

San Miguel de Tucumn, Argentina.

Reimpresin del artculo publicado en Acta Bioqumica Clnica Latinoamericana Vol. XXXIII, No. 3, 297-329, 1999.

RESUMEN ABSTRACT

En el presente trabajo se detallan los principios fsico-qumicos In the present work the basic physical-chemical principles that
bsicos que rigen la separacin de sustancias en la electroforesis govern the separation of substances in the capillary electro-
capilar. phoresis are detailed.

Se destaca el aporte que ha significado el desarrollo de los The contribution of the development of the capillaries of 20
capilares de 20 a 50 m de dimetro, de los detectores con arreglos to 50 m of diameter, of the detectors with diodes-arrays and
de diodos y la operativa computacional para la interpretacin the operative computacional for the graphic inter-pretation of
grfica de los datos obtenidos. the obtained data is highlighted.

Se detallan los principios que rigen la electroforesis libre, zonal, The principles are detailed thad govern the free, zonal elec-
isotacoforesis, isoelectroenfoque y cromatografa micelar con trophoresis, isotachophoresis, isoelectroenfoque and micelar
surfactantes y ciclodextrinas, y distintos ejemplos sobre sus chromatography with surfactantes and ciclodextrinas, and
aplicaciones. different examples on their applications are detailed.

Palabras clave: electroforesis capilar, electroforesis zonal, Key words: capillary electrophoresis, zonal electrophoresis,
isotacoforesis, isoelectroenfoque, micelar, cromatografa isotacophoresis, isoelectroenfoque, micelar electrocinetic chro-
electrocintica, surfactantes, ciclodextrinas. matography, surfactantes, ciclodextrinas.

Historia. Surfactantes.
Definicin de electroforesis. Sectores quirales.
Electroforesis capilar. Ciclodextrinas
Breves nociones tericas. Relaciones de la qumica supramolecular/Ciclodextrinas (CD)
Corriente electroendosmtica. o (CDs)/ Estructura espacial de las CD/La conicidad/La
De la electroforesis en papel de filtro a la electroforesis capilar. cavidad/Uniones qumicas entre el husped y las CD.
El aparato para electroforesis capilar (EC). Las principales propiedades de las ciclodextrinas nativas.
Aplicaciones. Tipos de electroforesis capilar.
Desarrollos tecnolgicos que contribuyeron a la EC. MECK o MECC (Electroforesis micelar electrocintica).
Electroforesis capilar:Ventajas/Volmenes empleados/ Micelas.
Instrumentacin/ Principios fisicoqumicos/Capilares. Clases de surfactantes y propiedades.
Siembra de las muestras Separacin de especies neutras.
Voltajes/Eficacia de la separacin/Polaridad/Deteccin. Electroforesis capilar en gel (CGE o ECG).
Reactivo en electroforesis capilar Capilares. BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
Seleccin de buffers. Aplicaciones.
Tabla de buffers. Isoelectroenfoque capilar.
Buffers zw. Isotacoforesis.
Buffers zwitterinicos. Aplicaciones de la isotacoforesis.
Aditivos. Aplicaciones de la electroforesis capilar.
Electroforesis capilar en zonas (CZE) ECIF (O CIEF) /
Tamizado molecula/ MEEC.
Electrocromatografa micelar. Cromatografa micelar
1
Doctor en Qumica. Exprofesor Titular de Anlisis Biolgicos. Facultad electrocintica. MEEC/ Definicin/Resumiendo/ Efectos de
de Ciencias Exactas y Naturales. UBA.
aditivos en la fase acuosa/ Principio de separacin con la
Correspondencia: Dr. Juan Miguel Castagnino, Calle 6 No. 1344, 1900- La ciclodextrina/ Pares inicos/ Urea/ Modificadores orgnicos.
Plata. Argentina. E-mail: secgral@fbpba.org.ar Referencias bibliogrficas.

13
 HISTORIA

El desplazamiento de sustancias bajo la accin de un campo

elctrico fue citado por Reuss en 1809 en las memorias de la
Sociedad Imperial Natural (Moscow) (1809) 1.
All se describe la experiencia de la fig. 1, donde se observa el
comportamiento migratorio de pequeas partculas de arena en
un mbito de agua transparente contenido en un recipiente de
vidrio con un lecho de arena fina en su fondo y dos tubos
conteniendo electrodos de una batera.
El pasaje de la corriente produce un enturbiamiento en las
proximidades del polo positivo producido por la migracin de
partculas de arena muy pequeas que se movilizan por su carga
elctrica negativa.
Este experimento puede ser considerado como el primer
aporte bibliogrfico que revela la polarizacin de la slice, pues la
Figura 2. Fuerza electroendosmotica
arena es dixido de silicio y fundida permite obtener los capilares
que se emplean en la electroforesis capilar.
Varios aos ms tarde, en 1816, fue observado el transporte
del agua por accin de la corriente galvnica generada por la
polarizacin negativa del capilar que une los dos recipientes
electrdicos.
La pared del capilar, sabemos hoy, adquiere carga negativa (al
pasaje de la corriente elctrica) producindose la polarizacin del
agua, la que por consiguiente tiende a desplazarse hacia el polo
negativo. Esta corriente lquida que se desplaza en sentido opuesto
a la direccin de la corriente elctrica, se designa con el nombre de
Fuerza electroendosmtica (FEO) (fig. 2)

Figura 3. Distintos tipos de electroforesis

Definicin de electroforesis

Ha sido definida como el movimiento o desplazamiento

diferencial de especies cargadas (iones), sustancias neutras o
migracin pasiva, por atraccin o repulsin en un campo elctrico.
La electroforesis en solucin en medios libres sin elementos
soportes (agar, almidn, geles de poliacrilamida), fue desarrollada
por Tiselius 2, 3, el que resolvi mezclas de protenas en un tubo
aplicando un campo elctrico de corriente continua, no pulsante,
estudios que lo hicieron acreedor al Premio Nobel en Qumica.
Los problemas experimentales que se presentaron, estuvieron
vinculados a la difusin trmica y a la conveccin, lo que determin
el empleo de medios anticonvectantes como agar, agarosa y
poliacrilamidas en forma de geles.
Las tcnicas que ms se han desarrollado estn en la actualidad
aplicadas al campo de las protenas y productos de la biologa
molecular, como son los geles de agarosa y proliacrilamida en
placas o films de distinto espesor verticales u horizontales 4 (fig3).
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
Electroforesis capilar
El empleo de capilares para la separacin de sustancias neutras o
iones cargados elctricamente, apareci en 1967 en una experiencia
desarrollada por Hjerten empleando capilares milimtricos, los
que eran rotados a travs de su seccin longitudinal para evitar
los efectos de la conveccin.
Virtanen y Mikkers en 1979 desarrollaron las separaciones
empleando electroforesis en capilares de 200 m de dimetro
interno en vidrio y tefln respectivamente.
La separacin de cloruro, aspartato y glutamato por
isotacoforesis, hecha por Martin en 1942, los trabajos de
Konstantinov, Oshukova en 1963 y los de Evereast en su tesis
de graduacin en 1964, fueron los precursores en el empleo de
capilares y la medicin de la absorcin UV a travs del mismo,
permiti obtener los espectros caractersticos de la separacin 5.
Ms adelante, en 1980, Jorgenson y Lukacs empleando tcnicas

avanzadas en la obtencin de capilares de slica fundida emplean

dimetros de 75m y Jorgenson clarifica tericamente las
relaciones entre los parmetros operacionales y las cualidades de
la separacin revelando el elevado potencial analtico de esta tcnica.
Esta separacin de pptidos realizada sobre un capilar de slica
fundida a potenciales elevados 20 a 30 Kv en un campo de 400 a
500 v/cm refrigerados por aire, fue el lanzamiento de la EC 6.

Estos capilares de 75 a 100 cm de largo y con dimetros

internos de 50-70-100 m y de 300 a 400 de dimetro externo
son los que permiten una capacidad elevada de resolucin
Figura 1. Migracin de las partculas de slice N>200.000 platos/m.

14
 La corriente electroendosmtica (FEO) generada por los grupos En el estado estacionario, las fuerzas son iguales y opuestas:
silanol de la superficie interna del capilar da como resultado una
corriente plana del frente del lquido que contrasta con el frente qE=6rv (5)
parablico de la cromatografa lquida de alta resolucin (fig. 4). q E = 6 r v e E
qE
La ventaja de esta tcnica es que el capilar de slica fundida que e=
generalmente se cubre con una capa de polimina para darle mayor 6 rE
rigidez y resistencia, tiene una ventana a travs de ella que permite
el pasaje de la luz UV de tal manera que la visualizacin es on-line. q
e=
Con esta tcnica descrita es posible separar cationes, aniones, 6 r
protenas, macromolculas y sustancias no cargadas en forma
simultnea. Con lo expuesto queda en evidencia que especies altamente
cargadas tienen movilidades elevadas.
La movilidad electrofortica se le encuentra usualmente en las
Breves nociones tericas tablas de constantes fsicas.

La separacin por electroforesis est basada en la diferencia de

velocidad de los solutos en un campo elctrico. La velocidad de Corriente electroendosmtica
un ion est dada por
El componente efector ms importante en la EC es la electroen-
v = e E (1) dosmosis o corriente electroendosmtica, o fuerza
electroendosmtica.
donde: Surge como consecuencia de aplicar un campo elctrico que gen-
v : velocidad inica era una doble capa elctrica entre la solucin y la pared del capilar.
e : movilidad electrofortica En condiciones acuosas, la fase slida posee un exceso de
E : campo elctrico cargas negativas, como resultado de dos procesos fsico-qumicos,
la ionizacin de la superficie (que es un equilibrio cido-base) y
Existe una relacin entre el voltaje aplicado y la longitud del por otra parte la adsorcin de especies inicas sobre la superficie
capilar en volts/cm, la movilidad de un in es una constante, la del capilar.
que puede ser determinada por el coeficiente friccional a travs de
un medio elegido.

fuerza elctrica (FE)

e x (2)
fuerza friccional (FF)

La fuerza elctrica est representada en la siguiente ecuacin:

FE = q E (3)

Y para un in esfrico la fuerza friccional est determinada por

la ecuacin:

FF = - 6 r v (4)
donde:
q: carga inica
: viscosidad de la solucin
r: radio inico
v: velocidad del in BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000

Figura 5. Desarrollo de flujo electroendosmtico

a) Superficie de slica fundida cargada negativamente (Si-O). b) Acumu-
lacin de cationes hidratados cerca de la superficie. c) Flujo de cargas
Figura 4. Comparacin entre EC y HPLC hacia el ctodo luego de la aplicacin de un campo elctrico.

15
 Estos procesos ocurren en el capilar al paso de la corriente
elctrica y la FEO se encuentra altamente controlada por los
numerosos grupos silanoles (SiOH) que tambin pueden existir
como SiO (fig. 5a).
Los crculos en grisado representan las molculas de slica
transformadas por hidratacin en silanoles en medio acuoso
cuando pasa la corriente elctrica (fig. 5b).
Los contraiones (cationes en la mayora de los casos) mantienen
el balance de cargas; ese potencial se llama potencial zeta. Cuando
se aplica el voltaje a travs del capilar, los cationes que forman la
doble capa elctrica migran hacia el polvo positivo (fig. 5 c).
Por consiguiente, la doble capa elctrica tiene un balance que
est a su vez en equilibrio con la pared que corresponde al
potencial zeta.
La magnitud de FEO puede ser expresada en trminos de la
movilidad y velocidad por la frmula siguiente:
VFEO = ( / ) E o
FEO = ( / )
donde:
VFEO: velocidad
FEO: movilidad FEO
: constante dielctrica
: potencial Z
A pH elevados los grupos silanol son desprotonados y la
FEO es significativamente mayor que a pH bajo donde son
protonados.
De la electroforesis en papel de filtro a la electroforesis
capilar 7
El papel de filtro es un conglomerado de fibras de celulosa que se
embeben en una solucin buffer: stas por su composicin
qumica, al paso de una corriente elctrica se polarizan
negativamente mientras que el agua se carga positivamente y migra
en sentido opuesto a la direccin de migracin de la corriente.
A esta corriente lquida, conocida como corriente
electroendosmtica, se suman o se oponen las corrientes de lquido
producidas por la evaporacin e (->) y e (< -), la migracin de un
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
Figura 6. Polarizacin de las fibres de celulosa ante el paso de una
corriente elctrica
16
compuesto cargado positiva o negativamente ser hacia el ctodo
o el nodo segn acten las fuerzas (fig. 6).
Si consideramos un capilar de slice, el fenmeno es muy simi-
lar, pero la evaporacin es nula. En la pared del capilar, por pasaje
de la corriente elctrica se produce una capa elctrica negativa
(silanos) que condiciona la polarizacin del agua y
consecuentemente tiene lugar una corriente lquida en sentido
opuesto al campo elctrico aplicado.
La corriente lquida se transforma progresivamente en una
fuerza llamada fuerza electroendosmtica (FEO), que es
equivalente a la obtenida por accin de la bomba en Cromatografa
Lquida de Alta Presin (HPLC).
Esta corriente de lquido acta transportando a los compuestos
contenidos en el capilar, acorde a la carga elctrica que adquieren en
el campo elctrico (voltajes desde 20 a 50 V/cm).
El aparato para electroforesis capilar (EC)
Est constituido por una fuente de poder (FP) de alto voltaje (20
a 30 Kv) y de 0 a 200A, y un capilar de slica de 25 a 75 m de
dimetro interno y de 100 a 200 m de dimetro externo, el que
puede estar refrigerado por aire o lquido por efecto Peltier.
Los electrodos de platino se encuentran ubicados en el
recipiente que contiene el buffer, que adems de servir para su
contacto recibe los extremos del capilar.
El carrousel puede estar termostizado y contiene los buffers y
las muestras. Con un movimiento de ascenso y descenso puede
enviar cada una de las soluciones empleadas en la corrida al capilar
o a los recipientes electrdicos.
Los capilares de slica dejan pasar la luz ultravioleta visible a
distintas longitudes de onda, generando por arreglos de diodos,
los espectros para la identificacin de los compuestos separados
por electroforesis capilar (fig. 7).
Figura 7. Esquema de un aparato de electroforesis capilar
Aplicaciones
El explosivo avance de la electroforesis capilar se ha extendido
al rea biomdica, en el campo de las protenas, pptidos, ADN,
anlisis de lquidos de perfusin, monitoreo de drogas,
marcadores genticos tumorales y neurobioqumicos, drogas
xenobiticas, de abuso, y pericias forenses.
En el rea biofarmacutica, para el control de calidad de
productos farmacuticos y biotecnolgicos, quimioterpicos y de
estructura quiral.
En el rea de alimentos, se le aplica al fraccionamiento y
cuantificacin de aminocidos, hidratos de carbono, cidos
orgnicos, aditivos y contaminantes.
En el rea de control ambiental, permite la identificacin de
contaminantes y sus metabolitos, pesticidas, metales pesados e
hidrocarburos.
Como todo desarrollo de un rea analtica nueva, la
incorporacin de tcnicas acopladas como la espectroscopia de
masa, fluorescencia inducida por laser y otras variantes permiten
augurar un promisorio futuro.
Desarrollos tecnolgicos que contribuyeron a la EC
Seis desarrollos tecnolgicos han concurrido para el desarrollo
comercial de la instrumentacin, que constituye en la actualidad la
electroforesis capilar.
1. Los capilares de slica fundido revolucionaron la
cromatografa gaseosa (CG) y han producido la cmara de
separacin de la electroforesis capilar.
2. La disponibilidad de fuentes de potencia de alto voltaje 20 a
30 KV, altamente estabilizadas y automatizadas para el
mantenimiento estable de la tensin y corriente.
3. Los detectores desarrollados para la cromatografa lquida
de alta performance (HPLC), de absorbancia de alta
sensibilidad pudieron ser aplicados con modificaciones
pticas al tubo capilar.
4. Los desarrollos obtenidos por la electroforesis en geles
de tamizado molecular como los de poliacrilamida, agarosa
y otros, en las tcnicas de la separacin de protenas.
5. El desarrollo de los anfolitos, obtenidos por copulacin
del cido acrlico y las polietilen poliaminas que han permitido
generar ambientes de pH continuos y estables, donde se logra
separar protenas de puntos isoelctricos muy prximos.
6. El anlisis computacional aplicado a la resolucin de productos
obtenidos por separacin por HPLC o CE que pueden ser
estudiados, espectralmente a travs de software para tal fin.
ELECTROFORESIS CAPILAR: VENTAJAS
Las separaciones se realizan empleando mecanismos tradicionales,
en un mbito capilar, que adems ofrece ms facilidad y velocidad
que la cromatografa lquida de alta performance (HPLC).
Mientras elimina el problema de los solventes de la HPLC, la
toxicidad de los mismos y su costo, pues emplea soluciones
acuosas en su gran mayora con muy baja concentracin inica,
incorpora los principios de la automatizacin a travs de un hard-
ware creado especialmente con un software altamente optimizado.
Las separaciones se obtienen en pocos minutos, on line con la
corrida, obtenindose simultneamente resultados cuantitativos, en
oposicin a los procedimientos tradicionales que utilizan horas o das.
VOLUMENES EMPLEADOS
El empleo de microvolmenes y la rapidez de la EC en oposicin
a la HPLC, consumiendo microlitros de muestra y volmenes
del orden de los nanolitros para las soluciones electrolticas, la
hacen una tcnica altamente verstil y econmica.
INSTRUMENTACION
Los aparatos desarrollados por la industria instrumental recin
aparecieron en 1988, y el primer simposio internacional del ao
siguiente, permiti mostrar los avances extraordinarios de este
logro analtico.
Los aparatos comerciales de EC comprenden dos
compartimentos electroforticos unidos por un compartimento
que contiene un capilar, a una fuente de alta tensin de 20 a 30 kv,
el que es sometido a la luz UV con un detector unido a un
registrador, que grafica las diferencias de absorbancia; a un sistema
de administracin de datos. Las terminales de salida permiten,
por su conexin, el registro del voltaje, tiempo de corrida, y
registro de la temperatura del capilar, a travs de un software que
est incluido en una workstation computarizada (fig. 8)
Figura 8. Carrusel para muestras en una EC
PRINCIPIO FISICOQUIMICO
Las molculas son separadas por las fuerzas del campo elctrico
aplicado. Recordemos que la electroforesis ha sido definida como
el movimiento diferencial de especies cargadas (iones) o no, por
atraccin o repulsin en un campo elctrico.
Las muestras separadas en el capilar son monitoreadas por el BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
detector (fig. 9)
Los picos del electrograma son similares a los de la HPLC, y se
generan como consecuencia de la concentracin de los analitos y
de su velocidad de migracin (fig. 9 bis).
Las muestras son introducidas en el capilar por electroforesis
o por electrocintica, o por desplazamiento por inyeccin.
Durante la inyeccin electrofortica, el capilar est sumergido
en la muestra y se aplica el alto voltaje.
Los iones de la muestra migran dentro del capilar en relacin
a sus movilidades electroforticas.
Si la fuerza inica de la solucin muestra es ms baja que el
buffer electrofortico, los cambios en el campo elctrico de la interfase
17
 muestrabuffer producen un efecto de enfoque o stacking, en el
cual los iones del analito aparecen concentradas alrededor de la
zona de la interfase. Este proceso de delineamiento de la zona,
puede producir incrementos en la deteccin de la sensibilidad y
poder de resolucin (fig. 10).
El efecto de enfoque, puede producir cambios sustanciales en
la inyeccin electrofortica (fig. 11).
Figura 9. Representacin del fenmeno de polarizacin del capilar,
desplazamiento inico y deteccin.
Figura 9 bis. Electroforegrama
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Figura 10. Enfoque de la muestra en la migracin electrofortica.
18
CAPILARES
La electroforesis se efecta en capilares de slica fundida, de 25 a
75 m de dimetro interno; los capilares son recubiertos
externamente con una pelcula de poliaminas, para protegerlos
de los daos mecnicos. A los efectos de permitir el pasaje de la
luz ultravioleta se practica una ventana quemando con un
micromechero la capa plstica de proteccin.
Siembra de las muestras 8
La inyeccin electrocintica, consiste en introducir el material
empleando una combinacin de la bomba electroendosmtica y
la movilidad electrofortica.
La inyeccin por desplazamiento puede ser realizada por
aplicacin de la muestra con gas inerte a presin (por ej. nitrgeno)
o por vaco en el extremo del capilar.
Inyeccin por diferencia de altura. Idntico efecto puede
obtenerse por cambio en las alturas relativas de la muestra o de
los viales de salida del buffer (inyeccin por gravedad).
La inyeccin electrofortica, produce un desplazamiento inico,
una zona de muestra, con analitos de distinta concentracin que
en la solucin de la muestra.
Si la fuerza inica de la solucin muestra es ms baja que el
buffer electrofortico, los cambios en el campo elctrico de la
interfase muestra-buffer producen un efecto de enfoque o
stacking, en el cual los iones del analito aparecen concentrados
alrededor de la zona de la interfase. Este proceso de delineamiento
de la zona, puede producir incrementos de la sensibilidad y poder
de resolucin.
El efecto de enfoque, puede producir cambios sustanciales en
la inyeccin electrofortica (fig. 12) (tabla I).
VOLTAJES
Las fuentes estabilizadas de corriente continua generan 10 a 30 kv
y elevados campos elctricos (100 a 500 v/cm) al capilar, pueden
Figura 11. Condiciones Experimentales
TABLA 1
Volmenes inyectados para varios capilares
P 50 m 75 m 100 m
50 mbar 1,0 nL 5,2 nL 16,4 nL
75 mbar 1,5 nL 7,8 nL 24,6 nL
100 mbar 2,0 nL 10,4 nL 32,8 nL
variar de 25 a 75 m de dimetro interno, pudiendo llegar a 300
m de dimetro externo. Las longitudes pueden llegar a 1 m,
pero normalmente no exceden los 75 cm (fig. 13).
En algunos aparatos, el capilar se ofrece dentro de un soporte
de plstico en el cual se ha prealineado el capilar con una lente de
microenfocado, para obtener una deteccin ms sensible y
estable. Los cassettes de plstico que contienen el capilar son
hermticos y en su interior se hacen circular lquidos refrigerados
por efecto Peltier.
Es imprescindible mantener la temperatura a los efectos de
evitar la formacin de gradientes trmicos que producen
distorsiones en las bandas aisladas. Las zonas de falta de
definicin se reducen cuando se emplean capilares de 25 a 50 m
de dimetro interno, y de esta forma se permiten definir las
zonas y aumentar la sensibilidad.
La alta resistencia elctrica del capilar limita la corriente y el
calentamiento interno. Se logran campos elctricos muy elevados
(100 a 500 v/cm) con mnima generacin de calor. El empleo de
campos elctricos muy elevados permite reducir drsticamente el
tiempo de realizacin del examen, y la elevada relacin del rea al
volumen disipa en forma eficaz el calor que se pueda producir.
EFICACIA DE LA SEPARACION
La eficiencia del pico, frecuentemente mayor de 105 a 106 platos
tericos, se debe en parte al accionar del flujo electroendosmtico,
un fenmeno electrofortico que se genera por el flujo de la
solucin dentro del capilar.
POLARIDAD
La EC puede ser desarrollada empleando polaridad positiva o
polaridad negativa. Lgicamente, el valor del pH permite definir
el sentido de la migracin a pH bajos, muchas protenas y
pptidos son catinicos y migran hacia el ctodo negativo en el
extremo del capilar. Inversamente, a pH elevados muchas
biomolculas tienen una carga neta negativa y migran hacia el
nodo positivamente cargado.
Figura 12. Diagrama de los tres mtodos de introduccin de muestras.
El conocimiento del pK para distintos componentes de las
muestras (pptidos y aminocidos) como tambin del pI para
las protenas, permite seleccionar los buffers apropiados para
determinar el sentido de la migracin para que los compuestos se
orienten hacia el detector; normalmente se emplean campos
elctricos de 200 a 400 v/cm.
Para muchas aplicaciones, el empleo de capilares de longitud
elevada (hasta 1 m) permite y requiere voltajes mayores de 20 kv
para encontrar el campo elctrico adecuado.
DETECCION
Una amplia variedad de detectores han sido desarrollados para la
EC (incluyendo fluorescencia, electroqumica y conductividad)
pero los detectores ms usados comercialmente son los que
emplean el ultravioleta y UV visible.
Los detectores son similares a los de la cromatografa lquida
de alta performance, usando fuentes de deuterio con filtros o
deteccin con longitudes de onda seleccionadas.
Las fuentes de luz generalmente provienen de un haz de luz
entre un fotodiodo de referencia y un microenfocado ptico en el
estuche del capilar.
El scanning es a travs de un detector que ilumina el capilar
con luz blanca luego dispersada y analizada a travs de un
policromador por arreglo de fotodiodos (detector PDA para ptica
reversa).
Alternativamente, el sistema ptico convencional (forward
optic) puede ser empleado por una banda espectral aislada por
un monocromador colocado entre la fuente de luz y el capilar.
El scaneo puede ser controlado rpidamente por un sistema
computarizado que controla el movimiento del monocromador
en el rango espectral en el tiempo de milisegundos.
Este sistema de deteccin produce menos ruido de fondo, y
mucha ms sensibilidad que el detector con arreglo de diodos PDA.
Reactivos en electroforesis capilar
Una amplia variedad de buffers y aditivos puede ser usada para
las separaciones; la mayora de ellos son buffers no txicos, de
fosfato, borato y TRIS 9.
Esto no es un contraste con la cromatografa lquida de alta
performance (HPLC), pues no emplea sustancias orgnicas,
inflamables o txicas como acetonitrilo, hexano, metanol y
tetrahidro furano. Se requieren volmenes muy pequeos de
soluciones de electrolitos que no presentan los principios de
toxicidad encontrados en HPLC.
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
SELECCION DE BUFFERS
Esta es una de las etapas bsicas en la separacin por EC. La
sensibilidad de FEO al pH requiere buffers que mantengan el
Figura 13. Esquema d eun capilar
19
 TABLA II nos hemos referido oportunamente. La magnitud de la electro-
Distintos sistemas Buffers para Electroforesis Capilar endosmosis se incrementa en funcin del pH y en condiciones
alcalinas la velocidad de la FEO es usualmente mayor que la
Nombre pKa Nombre pKa velocidad de migracin de los iones de la muestra.
Esta propiedad puede ser una ventaja para analizar las muestras
Fosfato 2,12 (pKa1) TES 7,50 de especies aninicas o catinicas. En algunos casos experimen-
Citrato 3,06 (pKa1) Hepes 7,55 tales, como la separacin de pptidos o protenas, los grupos
hidrofbicos poseen determinados sitios de fijacin, lo que pro-
Formato 3,75 Hepps 8,00
duce variaciones locales en la migracin de la FEO, y por
Succinato 4,19 (pKa1) Tricina 8,15
consiguiente, alteran la reproductibilidad de los resultados.
Citrato 4,74 (pKa2) Glicina amida 8,20 Estos problemas pueden ser minimizados trabajando a pH
Succinato 5,57 (pKa2) Hidroclorhdrico bajo, donde las superficies silanol no se encuentran ionizadas.
MES 6,15 glicilglicina 8,25 En los casos en que se trabaje a pH elevado, se emplean aditivos
ADA 6,60 TRIS 8,30 que reducen la absorcin de los analitos.
BIS-TRIS 6,80 Bicine 8,35 El empleo de uniones covalentes en la superficie del capilar
propano puede reducir dramticamente la FEO, sobre todo en la separacin
Pipes 6,80 Morfolino 8,49 de las protenas (fig. 15).
ACES 6,90 Borato 9,24 Particular cobertura en la superficie interna del capilar, en
MOPSO 6,90 CHES 9,50 condiciones de pH alcalino o neutro, permiten muy buenas
Imidazol 7,00 Chapso 9,60 separaciones.
MOPS 7,20 CAPS 10,40 Estos fenmenos han motivado numerosos problemas en
Fosfato 7,21(pKa2) Fosfato 12,32 (pKa3) la separacin de protenas en las distintas variantes,
isoelectroenfoque, isotacoforesis, electroforesis en geles.
pH constante. Fundamentalmente, el control de la FEO requiere alteraciones
Los sistemas buffers efectivos tienen un rango de de la superficie cargada del capilar y de la viscosidad del buffer. En
aproximadamente dos unidades de pH alrededor del valor del la tabla III que se detalla se ponen en evidencia las condiciones
pKa (Tabla II). Los buffers polibsicos como fosfato, citrato para optimizar la FEO y la movilidad de las propiedades de los
solutos.
tienen ms de un pKa para usar, y pueden ser utilizados en un
La FEO puede ser afectada ajustando la concentracin y la
rango de pH ms amplio.
fuerza inica del buffer; elevadas concentraciones del buffer son
El buffer que se emplea en EC debe reunir una serie de tiles para la limitacin de las interacciones inicas, por
propiedades: disminucin de las alteraciones inicas contra la pared, pero el
1) Buena capacidad de pH en el rango encontrado. calentamiento de los capilares limita el uso de las concentraciones
2) Baja absorbancia en la longitud de onda empleada en la elevadas de los buffer.
deteccin. La concentracin de los buffers debe oscilar entre 10 a 50 mM,
3) Baja movilidad (para lo cual se necesita baja concentracin aunque es posible emplear concentraciones entre 100 a 500 mM.
inica). Las modificaciones de FEO pueden ser controladas alterando la
cubierta dinmica, agregando aditivos al buffer, o con cubiertas
Las separaciones de protenas y pptidos son regidas por las covalentes.
alteraciones del pH que estn ntimamente ligadas al pI. Los
cambios de pH afectan tambin al comportamiento de la electro-
endosmosis, pues a pH prximos a 3 la superficie interna del Tabla de buffers 9
capilar se encuentra cargada negativamente por los grupos silanol.
Los iones positivos del buffer son atrados y fijados sobre la
capa negativa generando una doble capa elctrica. Si imaginamos Una amplia variedad de buffers puede ser empleada en la
un corte del capilar y el plano de la hoja sumergido en el electrodo electroforesis de zona (Capillary zone electrophoresis) (CZE).
positivo, detrs tendremos el electrodo negativo, el agua migrar
al polarizarse positivamente desde el plano hacia la parte poste-
rior del plano del papel, como si lo atravesara (fig. 14).
Este es el fenmeno FEO de electroendosmosis, al cual ya
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000

Figura 14. Corte de un capilar. Figura 15. Electroendosmosis.

20
 TABLA III
CONDICIONES PARA OPTIMIZAR LA FEO Y LA MOVILIDAD DE LOS SOLUTOS

Variable Resultado Observaciones

Campo elctrico FEO proporcional al cambio Eficiencia aumenta al incrementar la FEO. El calentamiento por efecto
Joule puede modificar y daar la separacin.

pH buffer pH aumenta FEO aumenta Puede modificar la carga o la estructura del soluto. Es el mejor mtodo
pH disminuye FEO disminuye para modificar la FEO

Fuerza inica o la Disminuye el potencial zeta y Elevada fuerza inica genera elevada corriente y posible calentamiento
concentracin del buffer se incrementa la FEO por efecto Joule. Baja fuerza inica, problemtica absorcin por la
muestra. Puede distorsionar el ancho de los picos. Puede genera
conductividad distinta en la muestra. Se reduce el condensado (stack-
ing) de la muestra.

Temperatura Cambia la viscosidad 2 a 3% por C Es importante mantener controlada la temperatura

Modificaciones orgnicas Cambia el potencia zeta y la visco- Cambios complejos, determinables experimentalmente.
sidad usualmente disminuye la FEO Se puede alterar la selectividad.

Surfactante Solucin hidrofbica se adsorbe a la Surfactantes aninicos aumentan la FEO. Surfactantes catinicos
pared del capilar por accin intrnseca pueden disminuir o invertir la FEO. Puede alterar significativamente
la FEO.

Polmeros hidrofbicos Existen interacciones hidrofbicas Disminuye la FEO por cambio e incremento de la viscosidad.
neutros en la pared del capilar

Cubiertas covalentes Unin qumica con la pared capilar Pueden generarse muchas modificaciones posibles. La estabilidad
puede ser problemtica.

Por ejemplo, el ms usado es el fosfato a pH 2,5 y pH 7 y el TABLA IV

borato a pH9, siendo la concentracin de 10-50-100 mM. El Buffers ms comunes para Electroforesis Capilar
impacto del pH sobre el analito puede producir, sustancialmente,
complejos zwitterinicos especialmente en pptidos y protenas, Buffers Rango de pH Buffers Rango de pH
pues la carga de esos compuestos es dependiente del pH en zwitterinicos
forma directa.
Una regla de uso frecuente es que hay que seleccionar al pH, Fosfato 1,14-3,14 Mes 5,15-7,15
entre dos unidades de pH por arriba o por debajo del pKa del Acetato 3,76-576 Pipes 5,80-7,80
analito sometido a la ionizacin completa; a valor de pH altamente Fosfato 6,20-8,20 Hepes 6,55-8,55
alcalino, puede ser muy rpida y se pueden obtener separaciones Borato 8,14-10,14 Tricina 7,15-9-15
incompletas. Tris 7,39-9,30
Ciertas protenas pueden ser separadas a pH cido, debiendo
en estas condiciones, los capilares estar sin carga. En estas
condiciones, estn positivamente cargadas y no existen acciones sulfatos al medio, que afectan la conformacin de las protenas e
electrostticas con la pared, sin embargo, pueden ocurrir impactan sobre la separacin. BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
interacciones hidrofbicas y pueden producirse precipitaciones Tambin la adicin de las sales modifica sustancialmente la
proteicas (tablas IV y V). FEO, por ruptura de la doble capa inica de las paredes del capilar.
Esta modificacin est limitada por la cantidad de sales que pueden
Buffers zwitterinicos agregarse y producir calentamiento por efecto Joule.
TRIS-MES-CAPS-Tricine-Bicine son buffers zwitterinicos y se
emplean comnmente para la separacin de pptidos y protenas, Aditivos
siendo sus caractersticas ms importantes, siendo sus caractersticas
ms importantes, su baja conductividad, ya que se utilizan Varias sustancias pueden ser agregadas a los buffers para modificar
alrededor de sus pI. La ventaja de estos buffers reside en su baja las movilidades electroforticas; otros aditivos, tales como surfac-
conductividad, y por consiguiente reducen el calentamiento por tantes o ciclodextrinas, forman entornos heterogneos que pueden
efecto Joule. A veces se le agregan sales como cloruros, fosfatos y definir nuevos sistemas fisicoqumicos de la EC (tabla VI).

21
 TABLA V
Distintos Sistemas Buffers

Accin Observaciones

Aninicos (SDS) Desactiva la superficie del capilar Amplia variedad de surfactantes. Fciles de usar.
(dodecil sulfato de sodio) a travs de interaccin inica e hidrofbica Por encima de CMC* en MEKC.

Catinicos (CTAB) Disminuye FEO o la invierte.

(bromuro de ceil-trimetil-amonio) Puede desnaturalizar
totalmente las protenas.

No inico (BRIS)
Eteres de polietileno

Zwitterinico (CHAPS) Puede ser usado en conjunto con fase reversa

3[ (3-cholamidopropil)- Disminuye o revierte FEO Tambin actan formando pares inicos.

dimetilamonio]
1 propano sulfanato
aminas cuaternarias
*concentracin micelar mnima

TABLA VI que dividen el punto estereoisomtrico, representan la imagen

Aditivos para Electroforesis de Zona especular del compuesto como son drogas y conservadores de
alimentos en la industria.
Aditivos Funcin Comunmente, la separacin para identificarlo se realiza por
HPLC y EC. Estos exmenes son generalmente complicados y
Sales inorgnicas Cambio corformacional proteico.
Solventes inorgnicos Solubilizan y modifican la corriente de elevado costo.
endosmtica. En oposicin a la fase quiral estacionaria, el anlisis por
Urea Desnaturaliza oligonucleticos y electroforesis de zona (CZE) en un medio capilar empleando
solubiliza protenas. buffers de corrida de elevada selectividad, permite, empleando la
cido sulfnico Relaciona agentes inicos e hidrofbicos EC y aditivos quirales, separar DL aminocidos y drogas quirales.
Surfactantes catinicos Producen el cambio reverso en la pared
capilar
Derivados de la celulosa Reducen la corriente electroen- Ciclodextrinas
dosmtica y acta como tamizador.
Aminas Cubren los grupos silanol El avance producido en las tcnicas de interpretacin de imagen
molecular por aplicacin de cristalografa de Rayos X, como
Surfactantes Resonancia magntica nuclear, espectroscopia ESR, electroqumica,
medidas cinticas y termodinmicas, termogravimetra,
Numerosos tipos de surfactantes pueden ser empleados calorimetra de barrido, espectroscopia IR y UV, resonancia
(aninicos, catinicos, zwitterinicos y no inicos). paramagntica electrnica (EPR), doble resonancia electrnica y
espectroscopa Raman, han permitido el nacimiento de la qumica
En una concentracin baja, la concentracin de molculas de supramolecular.
surfactantes inicos produce la concentracin micelar crtica que Este campo de la ciencia, de carcter multidisciplinario abarca
pueda actuar como agente solubilizante por la formacin de pares aspectos qumicos, fsicos, biolgicos, y tecnologas de especies
inicos, o por interacciones hidrofbicas. qumicas de gran complejidad, las que se encuentran unidas por
Dependiendo de la carga del surfactante, puede ser que la uniones no covalentes intermoleculares.
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FEO se incremente, aumente o se invierta.

RELACIONES DE LA QUIMICA SUPRAMOLECULAR
En la figura S: (1) el capilar se polariza por el pasaje de la
corriente elctrica y produce la FEO; en (2) el surfactante en una Se ha extendido a la qumica orgnica a los mtodos sintticos
determinada concentracin produce la detencin de la corriente para la construccin de receptores qumicos, a la qumica de
electroendosmtica, y un exceso se traduce en la inversin de la
corriente (FEO) (3).

Sectores quirales

La separacin de enantimeros pticos que poseen un carbono

asimtrico y que permite obtener compuestos llamados quirales, Figura S

22
coordinacin de complejos, a la unin de complejos de ligandos
con iones metlicos, a las interacciones moleculares, a la bioqumica
y a los procesos biolgicos (como ser la unin de una enzima con
su sustrato).
Por lo tanto, para encarar una investigacin con este enfoque
multidisciplinario se hace necesario una nueva manera de encarar
y desarrollar la investigacin, la interpretacin y correlacin de
resultados.
HIDROLISIS DE ALMIDON
La degradacin enzimtica del almidn produce una mezcla de
glucosa, maltosa, malotriosa y una larga serie de cadenas lineales
o ramificadas de malto oligmeros conocida como dextrinas.
Es en realidad un verdadero proceso hidroltico pues es el
producto primario de separacin del enlace glicosdico y su reaccin
con una molcula de agua.
CICLODEXTRINAS (CD) O (CDs) 10
Cuando el almidn se degrada por la accin de la enzima glucosil
transferasa se produce una reaccin intramolecular sin que
intervenga una molcula de agua, formndose productos cclicos
mediante uniones alfa 1,4 que se conocen con el nombre de
Ciclodextrina (CDs).
Constituyen una serie de tres oligosacridos cclicos formando
una familia de alfa- CD, beta-CD y gamma-CD, los cuales se
encuentran compuestos por 6, 7, 8 unidades de D-(+)
glucoprinasoas unidos en forma alfa- 1,4 (fig. 16).
ESTRUCTURA ESPACIAL DE LAS CD
Debido a la conformacin C1 de las unidades glicopiransicas,
todos los grupos oxidrilos secundarios estn ubicados en cada
Figura 16. Su estructura le permite conformar una serie de complejos de
inclusin con una gran variedad y cantidad de especies moleculares.
uno de los bordes del anillo (de mayor dimetro) y todos los
primarios en el menor dimetro.
La cavidad interior se encuentra revestida por los tomos de
hidrgeno y los puentes de oxgeno glucosdico respectivamente.
Los pares de electrones no enlazantes de estos puentes se
encuentran orientados hacia el interior de la cavidad, generando
una alta densidad electrnica.
Esta cavidad tiene por consiguiente un marcado carcter
hidrofbico y un momento dipolar muy marcado.
LA CONICIDAD 11
Inicialmente se pens que las CD tenan forma cilndrica, pero
la rotacin de los grupos hidroxlicos primarios reduce el
dimetro efectivo de la cavidad del lado donde estn ubicados,
lo que configura en forma ms adecuada una estructura
geomtrica cnica.
La configuracin y dimensiones aproximadas se indican en
la figura 17.
Figura 17. Dimensiones moleculares de las ciclodextrinas.
LA CAVIDAD 12
Las cavidades de las CD cristalizadas a partir de soluciones acuosas
no estn vacas, sino que contienen en su interior de 2 a 8 molculas
de agua y otras tantas para integrar el cristal.
Los complejos, de inclusin de las CD se originan por
sustitucin total o parcial del agua incluida por la molcula
husped apropiada, que se traduce en una modificacin de los
espectros de RMN, de difraccin neutrocia y de Rayos X.
Las CD forman complejos con aquellos compuestos que
satisfagan:
a. Requerimientos de complementariedad estereoelectrnica
b. Posean dimensiones compatibles con las cavidades respectivas
c. Factores geomtricos que definirn qu molculas invitadas
pueden penetrar en las cavidades de las cD.
Las modificaciones pueden ser (figs. 18 y 19).
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
a. Sustitucin de 1 o ms tomos de hidrgeno de los hidroxilos
primarios y/o secundarios (teres, steres, glucosil-CDs)
b. Sustitucin de 1 o ms hidroxilos primarios o secundarios
(desoxi-halgenos, amino, etc.)
c. Eliminacin de los tomos de hidrgeno del grupo C5-CH2-
OH (C5COOH)
d. Rotura de 1 o ms enlaces C2-C3 por oxidacin con periodato.
UNIONES QUIMICAS ENTRE EL HUESPED Y LAS CD
a. Interacciones del tipo van deer Waals
b. Uniones por puente de hidrgeno
23
 Figura 18. Estructuras de los derivados de las ciclodextrinas: a)
monosubstituido sobre el lado de los hidroxilos secundarios; b)
monosubstituido sobre el lado de los hidroxilos primarios; c)
disubstituidos A-B; d) disubstituido A-C; e) disubstituido A-D; f) anexado;
g) coronado; h) doblemente coronado; doble con un solo puente; j)
doble con dos puentes..

c. Interaccin dipolo-dipolo
d. Impilsin hidrofbica Figura 19. Estructura de los derivados de las CD.
e. Liberacin de agua de mayor energa desde la cavidad
f. Desprendimiento de energa de tensin del anillo macrocclico
Las principales propiedades de las ciclodextrinas nativas 13
g. Efectos de tensin solvente superficie.
La forma de las ciclodextrinas es similar al de un cono truncado
Lo expuesto pone en evidencias las distintas fuerzas que rigen
con diferentes cavidades de distintas dimensiones, y que se
la incorporacin del husped a la CD.
encuentran relacionadas con las distintas unidades de glucosa.
Estn relacionadas con la hidrofobicidad y con los grupo no
polares (tabla VII).
Husped + CDs husped-CDs
La solubilidad de las -CD es relativamente ms baja que la
En la fig. 20 queda explicada la interaccin y se demuestra y las . Esto puede ser un problema cuando es necesario seleccionar
cmo las molculas del solvente son expulsadas del interior de un aditivo como elemento de fondo.
las CD para permitir la entrada del p-xileno. Cuando se emplean concentraciones elevadas de -CD se
puede emplear metanol-agua, etanol o mezclas de urea.
TABLA VII La solubilidad de las -CD en solucin acuosa en urea 4-8M
de urea, puede aumentar de 0.089 a 0,226 M respectivamente.
Algunas propiedades de las Ciclodextrinas Los grupos hidroxilos se presentan en las dos entradas de las
CD en posicin 2, 3 y 6 por cada glucopiranosa, puede ser
modificada por reacciones qumicas, es posibles producir CD con
Tipo de ciclodextrina Alfa Beta Gamma derivados con propiedades diferentes.

Las reacciones con los grupos hidroxilo alteran las propiedades

N de glucopiranosas
Peso molecular
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de las ciclodextrinas:
6 7 8
Mejora la solubilidad de las CD
973 1135 1297 Formacin de diferentes uniones con analitos que pueden
mejorar la complejacin

Dimetro interno (nm) 0,47-0,52 0,60-0,64 0,75-0,83 Anlisis de ismeros pticos sin carga

Profundidad (nm) 0,79-0,80 0,79-0,80 0,79-0,80

Rotacin especfica 150,5 162,5 177,4
[alfa] 25 D
Punto de ebullicin (k) 551 572 540

Solubilidad en H2O 14,5 185 23,2

(g/100 mL a 25 C)
Figura 20. Interaccin de las ciclodextrinas con las molculas del solvente.

24
 Distintos parmetros experimentales pueden influir en la
complejacin y estereoselectividad, el tipo de CD, la concentracin,
voltaje aplicado, temperatura, longitud del capilar, fuerza inica,
solventes orgnicos, corriente electrodosmtica, aditivos
polimricos.
Tipos de electroforesis capilar
Hemos citado la migracin electrofortica de acuerdo a los trabajos
desarrollados por Tiselius en el tubo en U de slice de 1937.
La separacin se efecta acorde a la movilidad de los iones (fig. 21)
En las figuras 1, 2, 3 y 4 se describen distintos tipos de
elctroforesis capilar (EC).
ELECTROFORESIS CAPILAR LIBRE
En los grficos se indica el instante cero (t=0) que corresponde al
periodo de siembra, en el cual no hay separacin. Al valor t > 0,
se produce la separacin por el empleo de la corriente aplicada (20
a 30 Kv) para un capilar de 50 m de dimetro interno y longitud
variada (20 a 70 cm).
En el primer grfico se representa la migracin de las especies
inicas ABC que se separan por distinta movilidad, generando
zonas inicas como en el caso de la electroforesis libre de Tselius,
denominada Electroforesis de Lmites Mviles.
ELECTROFORESIS DE ZONA 15
Es el mismo principio que la electroforesis libre o de lmites
mviles. La incorporacin de sustancias neutras que actan como
separadores permite su separacin en zonas, como se muestra en
la figura 21.
Figura 21. Distintos tipos de electroforesis capilar.
ELECTROFORESIS CAPILAR POR ISOELEC-
TROENFOQUE 17
Este procedimiento est destinado a la separacin de
componentes anfotricos de una mezcla en un gradiente de
pH continuo y estable que se extiende desde bajo pH en el
nodo y elevado en el ctodo.
El secreto de esta tcnica reside, fundamentalmente en la
obtencin de un gradiente de pH, continuo y estable, lo que
ha sido posible empleando anfolitos obtenidos por la unin
de poliaminas y cidos orgnicos, formando uniones
poliamnicas y policarboxlicas que en un mbito de protones
los ceden o los incorporan a las molculas, lo que acta como
un estabilizador de pH.
Cuando un medio con anfolitos se aplica un campo
elctrico, los anfolitos migran hacia un punto isoelctrico,
generando un gradiente estable de pH. Estos anfolitos son
sintetizados para obtener gradientes de pH de 2 a 11, y con
resolucin del orden de 0,001 unidades de pH.
Cuando al gradiente de pH se le introduce una protena
en ese gradiente de anfolitos, cada zona intercambia protones
con la muestra proteica, generando una separacin isoelctrica
conocida como electroenfocado o electrofocusing.
Considerando el grfico de la figura 21.3, all pueden
apreciarse las diferentes zonas de pH creadas por la migracin
de protones que en el anfolito generan el gradiente de pH
que condiciona el espectro isoelctrico de las protenas
combinadas en las zonas de su punto isoelctrico.
ISOTACOFORESIS 18
El nombre deriva de la separacin electrofortica de las
bandas que migran todas a igual velocidad (Iso= igual y
tacho = velocidad ).
La mezcla de analitos debe ser colocada entre dos
soluciones electrolticas con iones de diferente movilidad,
uno rpido llamado ion lder o inicial (L) y otro ms lento
llamado ion terminal (T) en la figura 21.4
Si se desea investigar un catin, el electrolito inicial puede
contener un catin de elevada movilidad como el ion
hidrgeno, mientras que el terminal puede contener un ion
que sea ms lento que el que se desea investigar. Por esta
razn, el electrolito lder siempre debe ser colocado para
migrar hacia el ctodo y el terminal debe migrar hacia el nodo.
Al aplicar el campo elctrico, al cabo de un tiempo todos los
iones adquieren la misma velocidad.
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
En la zona del campo donde los iones presentes tienen
baja movilidad, el campo es ms fuerte, movindose el menos
mvil de los cationes a la misma velocidad que el ms mvil
de ellos.
En el estado estacionario, cada componente de la muestra
catinica migra como si se tratara de una banda pura, como
si estuviera comprimida entre las paredes de un emparedado
o sandwich entre la zona inica de mayor y de menor
movilidad.
La caracterstica de esta tcnica es que la focalizacin
isotacofortica ocurre entre las bandas mviles produciendo
bandas definidas.
25
 MEKC o MECC (Electroforesis micelar electrocintica)
Es un hbrido entre la electroforesis y cromatografa, fue
introducida por Terable en 1984. Est ampliamente difundida y
es la nica tcnica que permite la separacin de sustancias neutras
o cargadas.
La separacin de sustancias neutras por MEKC se logra
empleando tensoactivos en el buffer de corrida. La CMC
(concentracin micelar crtica) es de 8 a 9 mM para SDS.
Se forman micelas que son agregados de molculas
individuales tensoactivas.
Las micelas son esencialmente esfricas, con los extremos
hidrofbicos orientados hacia el centro como los extremos de
una medusa, para evitar la interaccin con el centro hidroflico. El
empleo de las micelas obtenidas por soluciones surfactantes
puede dar un aumento de la separacin como en la cromatografa
lquida de fase reversa, pero con los beneficios de la EC. Tambin
la MECC produce en IEF, ITP (isoelectroforesis e isotacoforesis)
un elevado control de EOF.
Micelas
Son agregados anfolticos de molculas conocidas como
surfactantes. Ellas son largas cadenas de molculas (10-50
unidades de carbono) que estn caracterizadas por largas colas
hidrofbicas y cabezas hidroflicas.
Las micelas normales estn orientadas en solucin con la cola
hidroflica aguzada hacia adentro y la cabeza hidrofbica hacia
fuera. La cola del surfactante no puede ser solvatada en solucin
acuosa. Cuando la CMC (concentracin micelas crtica) es
conocida, el agregado puede ser total.
El agregado produce cambios fsico en la tensin superficial,
viscosidad y su habilidad para dispersar la luz que acompaa a la
formacin de la micela.
Clases de surfactantes y propiedades
El dodecil sulfato de sodio es el surfactante ms ampliamente
usado: tiene un PM de 288 y un CMC de 8 mM, siendo el nmero
de agregacin nmero de molculas/ micelas de 62. Las micelas
TABLA VIII
Clases de surfactantes y propiedades
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Surfactante Tipo CMC
SDS Aninico 8,1 x 10-3
CTAB Catinico 9,2 x 10-4
BRIJ 35 No inico 1,0 x 10-4
Sulfobetana Zwitterinico 3,3 x 10-3
26
Figura 22. Micela en migracin.
tienen la habilidad de organizar analitos a nivel molecular, basados
en interacciones hidrofbicas y electrostticas. Las molculas
neutras pueden unirse a micelas mientras que el cuerpo
hidrofbico tiene un alto poder de solubilizacin. El analito
puede ser particionado entre la micela y la mayor parte de la fase
estacionaria; este factor contribuye a la movilidad electrofortica
del analito y contribuye sobre todas las separaciones.
La interaccin entre las micelas y los solutos neutros es la que
produce la separacin. Las micelas son esencialmente
esfricas, con los extremos hidrofbicos orientados hacia el
centro para evitar la interaccin con el buffer hidroflico, y los
extremos cargados hacia el buffer.
En la fig. 22 se detallan la interaccin de las micelas y los
solutos neutros que son la causa de la separacin.
Los tensoactivos, y en consecuencia las micelas cargadas,
migran a favor o en contra de la FEO, dependiendo de la carga.
Siendo el dodecil sulfato de sodio (SDS) un tensoactivo
aninico, migran hacia el nodo, es decir en direccin opuesta a
la FEO; a pH neutro o bsico, las micelas migran hacia el nodo
en direccin opuesta a la FEO.
Como voltajes elevados la velocidad de la FEO es
generalmente mayor que la velocidad de migracin de las micelas,
a pH neutro o bsico, el movimiento resultante es en la direccin
de la FEO.
Durante la migracin, las micelas pueden interactuar con los
solutos a travs de interacciones hidrofbicas y electrostticas
como en cromatografa.
Agregacin
62 SDS: dodecil sulfato de sodio
170 CTAB: bromuro de cetilmetil amonio
40 BRIJ 35: polioxitileno 23- lauril ter
55 Sulfobetana: N dodecil - NN dimetil amonio
3-propano 1-sulfnico cido
 Durante la migracin, las micelas pueden interactuar con los
solutos en modo cromatogrfico (fig. 23).
Figura 23. Interaccin entre micelas y solutos neutros.
Separacin de especies neutras
La separacin de estas sustancias se efecta por particin dentro
y fuera de las micelas. Cuando el soluto interacta ms con la
micela, mayor ser su tiempo de migracin, pues la micela es
atrada contra la FEO; en cambio, cuando no est en contacto con
la micela, es transportado por la FEO.
Los compuestos ms hidrofbicos interactan ms
fuertemente con la micela y son ms retenidos. La separacin de
solutos neutros es esencialmente cromatogrfica y puede ser
explicada usando relaciones cromatogrficas modificadas. La
selectividad puede ser manipulada variando la naturaleza fsica
(tamao, carga, geometra) de la micela, usando diferentes
tensoactivos, similares a los empleados en las diferentes fases
estacionarias; estos pueden ser aninicos, catinicos, no inicos,
zwitterinicos o mezclas de ellos. Tambin pueden emplearse
sales biliares o microemulsiones.
Como ocurre en cromatografa, pueden ser empleados
modificadores orgnicos para manipular soluto micela (ej.:
metanol-acetonitrilo 2-propanol).
Electroforesis capilar en gel (CGE o ECG) 16
La separacin de molculas de gran tamao y peso molecu-
lar ha requerido el desarrollo de la electroforesis en gel. Esta
separacin tiene en especial que emplea procedimientos o
principios basados en el tamao y empleando un polmero que
acta como tamiz molecular.
En la fig. 24, se ilustra el principio de la electroforesis zonal, en
la cual los solutos migran a travs del retculo del polmero que
ofrece mayor obstculo al movimiento, cuanto mayor es su
tamao.
TABLA IX
Polimeros de la EC en GEL
Polmero Concentracin
Entrecruzados 2,6% T, 3-6 C
Lineales. Poliacrilamina <0,1-6%
Hidroxi alquil celulosa dextrano 6-15/%
Agarosa 0,05-1,20%
Figura 24. Principio de la EF de zona.
El mecanismo que rige la separacin en electroforesis capilar
en gel (ECG) es similar al principio en gel, tubo o placa, a diferencia
de la CGE, que incluyen campos elctricos 10 a 100 veces ms
elevados, sin efecto de calentamiento Joule, la deteccin sobre el
capilar y automatizacin de la instrumentacin. Adems, no se
necesita usar un gel anticonvectivo, pues las caractersticas del capilar
proporcionan esta capacidad.
Las separaciones preparativas, que constituyen la mayor ventaja
de la electroforesis clsica, se pueden lograr en cierto grado,
empleando capilares de dimetro interno mayor de 100 a 200 m
y bajos campos elctricos.
Los polmeros de la ECGel pueden ser entrecruzados en
forma covalente (como un BIS-Poliacrilamida) por unin
hidrgeno como la agarosa o soluciones de polmero lineal como
poliacril amida o metil celulosa.
Las macromolculas pueden ser separadas usando cada tipo
de gel (tabla IX).
Una matriz muy usada, la piliacrilamida entrecruzada, se
polimeriza in situ y no se saca del capilar; es muy importante
emplear soluciones sin gases (degasadas al someterlas al vaco) y
emplear sustancias puras para evitar burbujas, pues si no pueden
producirse geles inestables.
Capilares
Una mencin especial merecen los capilares y su tratamiento. Se
pueden emplear capilares de slica fundida sin cubrir y es conveninte
no emplear ambientes coated. Generalmente, una buena prctica
es lavar el capilar con hidrxido de sodio (0,1 M) seguido de
buffer y agua destilada filtrada, para eliminar los contaminantes.
La preparacin de estos geles requiere mucho cuidado, pues
son de polimerizacin muy rpida. Su inconveniente radica en
que los geles tienen naturaleza rgida, y las muestras pueden tapar
el capilar o pueden formarse burbujas que lo inutilizan. Con el
uso apropiado, pueden hacerse mltiples inyecciones: la rigidez
impide el empleo por inyeccin hidrodinmica.
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
Aplicacin
Oligonucletidos. Secuencia DNA
Fragmentos de restriccin
Oligonucletidos. Secuencia DNA, Protenas
Fragmentos de restriccin. Protenas
27
 Los polmeros lineales ofrecen una alternativa ms flexible,
pues son soluciones de polmero; no es imprescindible la
polimerizacin in situ. El polmero puede disolverse en el
buffer y se lo pude introducir hidrodinmicamente al capilar.
La concentracin del polmero necesaria es inversamente
proporcional al tamao del analito. Cuando tiene baja viscosidad,
pueden ser introducidos a presin, y son menos susceptibles a la
formacin de burbujas y otros problemas.
La eficiencia de la EGZ y ECGel son muy similares pues son
tcnicas electroforticas zonales.
Aplicaciones
Ha sido muy aplicada esta tcnica a la resolucin de protenas y
productos de biologa molecular (anlisis de pureza de
oligonucletidos, terapia gnica, secuenciado de DNA y anlisis
de productos de PCR y de qumica forense) (fig. 25).
Figura 25. 1. colorante de corrida; 2. Lizosima; -lactoglobulina; 4.
tripsingeno; 5. pepsina; 6. albmina de huevo; 7albmina bovina.
Electroforegrama
Isoelectroenfoque capilar 19
En esta tcnica los recipientes electrdicos se llenan uno con una
solucin bsica y otro con una solucin cida. El capilar se llena
con un anfolito que est constituido por una mezcla de agregados
moleculares obtenidos por la reaccin de cido acrlico polietilen
tetra o penta aminas que al paso de la corriente se ordena de
acuerdo a la atmsfera protnica que se obtiene.
Esta atmsfera inica de protones, reacciona con los grupos
amino y carboxilos generando zwitteriones, que delimitan un
gradiente de pH estable y continuo. Los pptidos y protenas se
desplazan y separan acorde el mbito qumico que permite su
desplazamiento hasta el valor del pH igual a su pI. Los mbitos
extremos del pH del sistema anfolito puden ser 3 a 9,
subordinados a las caractersticas del anfolito empleado.
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
Al aplicar el campo en el capilar que contiene los solutos y el
anfolito, las protenas cargadas migran hasta enfocarse, por lo
que encuentran el mbito de pH igual a su punto isoelctrico
(pI); estas bandas proticas son muy angostas porque la difusin
a una zona de pH diferente resulta en generacin de cargas, y la
subsecuente migracin de vuelta a la zona apropiada.
La corriente es la que produce la migracin de los iones, y
cuando el sistema alcanza el estado estacionario, no fluye ms
corriente, una vez enfocadas las protenas en el rea de los anfolitos,
las soluciones son movilizadas y pasan a travs del detector.
La FEO necesita ser reducida o eliminada, en la electroforesis
capilar por isoelectroenfoque, porque el flujo podra barrer los
28
anfolitos del capilar, antes que se complete el enfoque.
La reduccin de FEO puede ser obtenida usando un
cubrimiento dinmico o covalente; el primero es simple, pero es
difcil obtener reproductibilidad, pero son tiles para limitar la
adsorcin de las protenas a la pared del capilar.
Aplicaciones de la electroforesis capilar por isoelectroenfoque,
se han empleado exitosamente para la medicin del pI de
protenas y para lograr la separacin de isomorfos. Es muy til
para la separacin de hemoglobinas e inmunoglobulinas.
Isotacoforesis 20
En los compartimientos electrdicos se une una combinacin de
dos sistemas buffers, para generar un estado en el cual todas las
zonas separadas se muevan a igual velocidad, por eso se llama iso
(igual) y tachos (velocidad).
En general se deben elegir los buffers que tengan uno de ellos
como ion rpido y el otro un ion lento, y que el contrain sea el
mismo para los componentes de ambos buffers.
Cuando se aplica el campo elctrico en la separacin de aniones,
se busca un buffer con un electrolito delantero que contenga un
anin con una movilidad efectiva mayor que la del soluto.
Similarmente, el buffer usado como electrolito terminal debe
tener un anin cuya movilidad sea menor que la de los solutos.
Cuando est actuando, el anin rpido o delantero se desplaza
primero.
El estado estacionario se logra porque el campo elctrico vara
en cada zona, y es autoajustado para mantener la velocidad
constante con el mnimo de campo en la zona de mxima
movilidad.
Lo expuesto genera un fenmeno muy particular entre las
zonas, y las fronteras inicas son muy agudas entre ellas. Si un
ion difunde en una zona vecina, cambia su velocidad y retorna
rpidamente a su zona.
Si las zonas inicas son menos o ms concentradas que el
electrolito delantero, stas se hacen ms angostas o ms anchas,
para su adaptacin a la concentracin apropiada. Esta propiedad
entre soluciones que tienen un anin (o catin) comn y un ion
rpido (o lento) y permite su concentracin, pues el ion a separar
debe encontrarse entre las movilidades del ion ms rpido y del
ms lento.
Este efecto de concentracin puede ser aplicado a electroforesis
capilar de zona (CZE), a la electroforesis capilar electrocintica
(MEKC) y a la electroforesis en gel.
Este fenmeno de concentracin y afinado de las bandas se
observa en las separaciones de protenas o aminocidos. Cuando
no existe una adecuada refrigeracin y se evapora el agua del buffer,
la concentracin del solvente aumenta y las bandas se hacen cada
vez ms ntidas. Un angostamiento de la zona puede ocurrir si se
agrega electrolito en alta concentracin.
Aplicaciones de la isotacoforesis 21, 25, 26, 27, 28
La bibliografa es extensa en esta rea, pero no tanto como las
separaciones en electroforesis capilar zonal y los que emplean
medios soportes como los geles lineales o entrecruzados.
 Los primeros trabajos fueron realizados para separar aniones
como oxalato urinario; tambin se ha aplicado a separacin de
purinas y primimidinas en suero. Se ha extendido a la identificacin
y separacin de pequeas molculas de pptidos en fluido de
pacientes urmicos o pueden ser aplicados en electroforesis capilar
de zona, pero con una etapa de isotacoforesis, los cidos orgnicos
como aniones piruvato, citrato, malato, acetoacetato, en
electroforesis con capilares cubiertos con poliacrilamida lineal 15.
Tambin se ha aplicado isotacoforesis para separar aminocidos
urinarios, previamente derivatizados con opthaldialdiodo (OPA)
y nalfatalina 2, 3 dicarboxaldehdo. Los productos derivatizados
por CZE son detectados empleando por fluorescencia estimulada
con lser (fig. 26).
Aplicaciones de la electroforesis capilar 22
ELECTROFORESIS CAPILAR EN ZONAS (CZE)
Ha sido empleada en Qumica Clnica para la separacin de las
protenas del suero humano normal y patolgico, pptidos
como insulina, hemoglobinas normales y patologas en un
lapso de 3 a 5 minutos. Separa pequeas molculas ionizadas,
como nuclesidos, nucletidos, aminocidos, vitaminas y
drogas inicas 29-33, 36-42.
Puede proveer la CZE la separacin de estereoismeros y
puede esta tcnica permitir la caracterizacin de drogas quirales y
de sus metabolitos; se emplean ciclodextrinas en los buffers como
aditivos. Los oligosacridos cclicos poseen cavidades hidrofbicas
en las cuales el anfolito puede estar en forma de complejo husped.
La cavidad y la dimensin del grupo funcional, es la que permite
la enantioselectividad a la separacin.
Con esta tcnica se pueden separar iones inorgnicos,
incorporando un ion que absorbe en UV y los iones se detectan
por la produccin de una absorbancia negativa, y producir picos
negativos, se separan as iones como S2O3=, Br -, CI-, SO4=, NO2-,
N3-, SCN-, ClO3-, BrO3-, PO4-3.
ECIF (O CIEF) 23
El sistema contiene en los recipientes electrdicos cido fosfrico
en el ctodo e hidrxido de sodio en el nodo, el mbito del
capilar y la muestra contienen anfolito que al pasar la corriente
genera un mbito de pH en forma de gradiente estable y continuo
en donde la protena se desplaza hasta que su pI idntico al pH
del medio produzca su inmovilizacin.
Figura 26. Separacin por electroforesis capilar por isatocoforesis.
Este gradiente se mantiene estable al paso de la corriente y
para desplazarlo se emplea simultneamente leve presin y
corriente o se desplaza hidrodinmicamente por presin o
combinado el electrolito por un zwitterion. Se emplean capilares
recubiertos para reducir a cero la FEO.
TAMIZADO MOLECULAR 24
Muchos compuestos y cidos nucleicos forman complejos SDS
protenicos, que no se pueden separar empleando electroforesis
de zona; esto se obtiene formando un gel con poliacrilamida
como se usa tradicionalmente, o si no, colocando los polmeros
en solucin sin polimerizar dentro del capilar; as se han separado
oligonucletidos y sus secuencias de bases, y para la determinacin
de peso molecular.
MEEC
Contiene el sistema surfactante SDS, que en determinada
concentracin produce micelas a las que se agregan ciclodextrinas.
Se ha separado uriacimida, piridoxina, riboflavina, cido ascrbico,
cianocobalamina, cido nicotnico y tiamina.
Electrocromatografa micelar. Cromatografa micelar
electrocintica. MEEC 34, 35, 36
DEFINICION
La cromatografa micelar electrocintica o electroforesis capilar
con cromatografa micelar, llamada tambin electrocroma-
tografa, est basada en un principio cromatogrfico empleando
soluciones homogneas que contienen carriers inicos o
transportadores inicos en el mismo aparato que se utiliza en la
electroforesis capilar.
Las caractersticas fundamentales residen en que en la
Electrocromatografa (MEEC) los analitos cargados o neutros
pueden ser separados elctricamente.
La aplicacin de soluciones micelares con surfactantes inicos,
la ha transformado en una de las tcnicas de ms amplia aplicacin
para la separacin de pequeas molculas.
La caracterstica ms importante es que la solucin buffer
contiene surfactante a una elevada concentracin, que corresponde
a una concentracin micelar crtica. Estas micelas constituyen una
pseudo fase en la cual la molcula del analito es particionada por
las interacciones hidrofbicas en el interior de la micela (fig. 27)
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
La Fuerza Electroendosmtica es empleada como una bomba
transportadora de las micelas y del volumen del electrolito hacia
el punto de deteccin.
Entre las tcnicas de mayor uso el dodecilsulfato de sodio
(SDS) es el surfactante ms utilizado. Como las micelas estn
cargadas negativamente, son aninicas. La migracin
electrofortica est en direccin opuesta a la FEO, aumentando el
rango de separacin.
De acuerdo con la importancia y magnitud de la FEO, la
velocidad electrofortica de migracin es muy grande cuando se
desplaza hacia el detector. Comparando con la HPLC con fase
29

Figura 27. Micela y molcula del analito.
Figura 28. Esquema de una separacin MEEC (S=muestra, por ej.,
drogas, vitaminas, compuestos quirales).
reversa, la MEEC (fig. 28) exhibe una elevada eficiencia,
fundamentalmente vinculada con dos caractersticas del fenmeno
de la electroforesis.
a. El perfil planar del frente de la fuerza electroendosmtica,
elimina el efecto de borde curvo por el roce con la pared que se
produce en la columna de HPLC.
b. El intercambio entre el surfactante monmero y los campos
altamente mviles de la fase micelar es rpido. Se produce un
intercambio cintico muy rpido de la masa del analito entre la
fase micelar mvil y la fase no micelar.
RESUMIENDO
El tiempo de migracin del analito (tr ) es limitado entre el
tiempo de migracin de la solucin de fondo (t0 ) y el tiempo de
migracin tmc.
Al modificar el pH por debajo de 5, la corriente electrosmtica
se hace menor que la velocidad electrofortica de la micela en SDS
y entonces la micela migra hacia el electrodo positivo.
Cuando se emplea bromuro de dodecil trimetil amonio en
lugar de SDS, se produce una reversin de la corriente
electrosmtica pues migra hacia el electrodo positivo, debido a la
absorcin de molculas de surfactante, sobre la pared del capilar.
BIOQUIMIA VOL. 25 NO. 1 - 98 - 2000
EFECTOS DE ADITIVOS EN LA FASE ACUOSA
Los aditivos ms empleados se encuentran vinculados a los
surfactantes y son similares en sus efectos a los logrados con la
HPLC.
Existen cuatro categoras de aditivos:
1. Ciclodextrinas (CDs)
2. Pares inicos
30
3. Urea
4. Modificadores orgnicos
PRINCIPIO DE SEPARACION CON LA
CICLODEXTRINA (fig. 29)
En este tipo de procedimientos el capilar de silica fundida se llena
con solucin buffer que contiene un surfactante de elevada
concentracin, para que se formen micelas.
Esta concentracin micelar crtica (CMC) es una constante de
gran importancia que influye decididamente en la separacin.
Cuando se emplea SDS como surfactante aninico, la micela
cargada negativamente se desplaza hacia el electrodo positivo por
electroforesis, contrariamente la corriente electrosmtica migra
hacia el electrodo negativo, debido fundamentalmente, a la carga
negativa del capilar.
La corriente electroendosmtica (FEO) es mayor que la
migracin electroendosmtica de la micela bajo condiciones
neutras o bsicas, sin embargo, las micelas aninicas del SDS
migran hacia el electrodo negativo con una velocidad retardada.
Cuando un analito neutro se inyecta en la solucin micelar,
ste se distribuye entre la micela y la solucin de fondo (fig. 31).
1. La velocidad de migracin del analito depende del coeficiente
de distribucin y de la solubilizacin micelar.
Si el analito es neutro migra a una velocidad entre dos
extremos: la velocidad de la corriente electroendosmtica Vest y la
velocidad de la micela. Se encuentra explicado en el grfico que se
detalla.
En el sistema MEEC-CD electrocromatografa micelar con
ciclodextrina, stas migran a la misma velocidad que la corriente
electrosmtica, si la molcula de analito es neutra se incluye en
CD en la fase acuosa y se desplaza a la velocidad electroendos-
mtica (figs. 30 y 32)
Es decir que el analito migra a diferente velocidad ya sea que se
encuentra dentro de sta y a otra velocidad distinta si se encuentra
en la solucin.
Las CD retardan el coeficiente de distribucin entre el lquido
y la micela, lo que se traduce en una mejora en la separacin.
Las estructuras tridimensionales cnicas de las CD permiten
la incorporacin en el interior de la misma, de sustancias
hidrofbicas (fig. 30).
Figura 29. Ilustracin esquemtica del principio de separacin MEEC.
PARES IONICOS EJEMPLO DE MECC
Electrocromatografa micelar MEEC
Se emplean sales de tetra alquil aluminio que se producen la
repulsin entre las micelas de SDS reduciendo la capacidad
aninica del analito.

UREA

La urea incrementa la solubilidad de compuestos hidrofbicos

en agua.

MODIFICADORES ORGANICOS

Suministran un aumento de la resolucin y un cambio en la

selectividad. Los ms usados son el metanol, el 2-propanol y
el acetonitrilo.
Figura 31. Principio esquemtico de separacin con ciclodextrina y micela.

Figura 32.

pico 1: xido meta-

bolito
pico 2: clozapina

Buffer: 10% MeOH

90% SDS 150 M-
fosfato de sodio 2,8
mM - borato de
sodio 3,6 mM - pH9

Figura 30. El gran momento dipolar calculado para la -ciclodextrina capilar" slica fun-
tiene como consecuencia que el p-nitrofenol se inserte con su vector dida 27 cm x 50 mm
momento dipolar en sentido opuesto al de la molcula anfitriona. 20 C
20 KV
La revisin que antecede permite tener un panorama de 5 seg inj (x presin
0,6 nL/seg)
las mltiples variantes de la electroforesis capilar y las 0,2 mg/mL de cada
aplicaciones a las reas analticas ya comentadas. componente
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