IBP. MSc. BV. Pérez Pérez Jorge L PDF

INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA DE LAS PLANTAS
TESIS EN OPCIN AL TTULO ACADMICO DE
MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGA VEGETAL
EMBRIOGNESIS SOMTICA EN FRIJOL TEPARI
(Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1).
ASPIRANTE: Ing. Jorge Liusvert Prez Prez.
TUTOR (A): DrC. Lourdes Garca Rodrguez.
Santa Clara, CUBA

2006
PENSAMIENTO
Es preciso fomentar el estudio de las ciencias como va nica para el
conocimiento de las verdades.
Jos Mart
DEDICATORIA
Dedicatoria
DEDICATORIA
A mi familia, en especial a mis padres y hermanas.

AGRADECIMIENTOS
Agradecimientos
AGRADECIMIENTOS
Realizar una investigacin requiere del apoyo firme y decidido de muchas personas, sin las
cuales sera prcticamente imposible alcanzar la meta propuesta.
En este momento, escribir estas lneas resulta muy difcil por el temor constante de dejar de
mencionar inconscientemente nombre alguno, de las tantas personas a las que debo agradecer
por su apoyo incondicional.
Agradezco, al colectivo de trabajadores del Instituto de Biotecnologa de las Plantas de Santa
Clara, la posibilidad que me dieron de formarme junto a ellos en el campo de la investigacin,
en especial a la DrC. Lourdes Garca Rodrguez y dems compaeros del Laboratorio de
Mejoramiento Gentico, a los cuales estar eternamente agradecido.
Tambin, agradezco al colectivo de trabajadores de la Facultad de Ciencias Agrcolas de la
Universidad de Granma y en especial a mis colegas del Centro de Estudios de Biotecnologa
Vegetal y Medio Ambiente, por la confianza que tuvieron en m.
A mis compaeros y amigos, con los cuales compartimos durante tanto tiempo y sin los cuales
no hubiera sido posible cumplir la meta trazada.
A todos, muchas gracias!.

SNTESIS
Sntesis
SNTESIS
Las leguminosas en general y los Phaseolus en particular han presentado dificultades con la
regeneracin in vitro, no existiendo en la actualidad una metodologa de regeneracin va
embriognesis somtica eficiente y reproducible. Esta investigacin se desarroll en el
Instituto de Biotecnologa de las Plantas de la Universidad Central Marta Abreu de Las
Villas con el objetivo de lograr la regeneracin de plantas de Phaseolus acutifolius a partir de
la embriognesis somtica con miras a utilizar dicho procedimiento en el mejoramiento
gentico del cultivo. Durante la fase de formacin de callo se logr un 87.50 92.86 % de los
explantes secciones cotiledonales con formacin de callos, en un medio de cultivo compuesto
por las sales MS, vitaminas Heinz y Mee (1969), 2 % sacarosa, 0.05 mg.L-1 de AIA y 0.2 a
0.5 mg.L-1 TDZ respectivamente. Los explantes brotes apicales de embriones cigticos
germinados mostraron la mayor capacidad para la formacin de embriones somticos (20 %)
cuando fueron colocados en un medio de cultivo compuesto por las sales MS, vitaminas Heinz
y Mee (1969), 0.2 mg.L-1 de TDZ, 2 % sacarosa y 3 5 mg.L-1 de AIA. La luz solar con la
intensidad y duracin del fotoperodo evaluado, result ser la ms favorable para el desarrollo
de las plantas in vitro alcanzndose un 14 % de embriones somticos con germinacin
completa en medio de cultivo con las sales MS, vitaminas Heinz y Mee (1969), 0.01 mg.L-1 de
AG3, 0.09 mg.L-1 de AIA, 100 mg.L-1 de Myo-inositol y 2 mg.L-1 de Zeatina. Se logr por
primera vez evidencias de embriognesis somtica y regeneracin in vitro de embriones
somticos en la especie Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1.

NDICE
ndice
NDICE
Pginas
I. INTRODUCCIN ------------------------------------------------------------------------------------ 1
II. REVISIN BIBLIOGRFICA -------------------------------------------------------------------- 4
2.1 Generalidades del cultivo -------------------------------------------------------------------------- 4
2.1.1 Ubicacin filogentica del cultivo -------------------------------------------------------------- 4
2.1.2 Caractersticas botnicas ------------------------------------------------------------------------- 5
2.1.3 Contenido nutricional ----------------------------------------------------------------------------- 6
2.2 Cultivo de tejido y regeneracin in vitro de plantas -------------------------------------------- 7
2.2.1 Regeneracin de plantas va organognesis en el gnero Phaseolus ----------------------- 8
2.2.2 Embriognesis somtica -------------------------------------------------------------------------- 9
2.2.2.1 Embriognesis somtica en leguminosas --------------------------------------------------- 11
2.3 Etapas para la regeneracin de plantas va embriognesis somtica ------------------------ 12
2.3.1 Induccin de los embriones somticos -------------------------------------------------------- 12
2.3.2 Desarrollo y proliferacin de los embriones somticos ------------------------------------- 13
2.3.3 Maduracin de los embriones somticos ----------------------------------------------------- 14
2.3.4 Germinacin y conversin de los embriones somticos ------------------------------------ 15
2.4 Factores que influyen en la embriognesis somtica ----------------------------------------- 16
2.4.1 Composicin del medio de cultivo ----------------------------------------------------------- 16
2.4.2 Condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo --------------------------------- 19
2.4.3 El tipo y estado fisiolgico del explante ------------------------------------------------------ 20
2.4.4 Genotipo ------------------------------------------------------------------------------------------ 21
2.5 Mejoramiento gentico ---------------------------------------------------------------------------- 22

ndice
III. MATERIALES Y MTODOS ------------------------------------------------------------------ 23
3.1 Efecto del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y del tipo de explante en la formacin de
callos de Phaseolus acutifolius cv. TB1--------------------------------------------------------------- 25
3.2 Efecto del thidiazurn (TDZ) en la formacin de callos en explante secciones cotiledonales
de Phaseolus acutifolius cv. TB1 --------------------------------------------------------------------- 26
3.3 Efecto del tipo y grado de desarrollo del explante en la formacin de callos en Phaseolus
acutifolius cv. TB1 ------------------------------------------------------------------------------------- 27
3.4 Estudio del AIA en la formacin de los embriones somticos en Phaseolus acutifolius cv.
TB1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 28
3.5 Efecto de intensidad y duracin del fotoperiodo en la germinacin de los embriones

somticos en Phaseolus acutifolius cv. TB1 ------------------------------------------------------- 29
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN ---------------------------------------------------------------- 30
4.1 Efecto del 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y del tipo de explante en la formacin de

callos de Phaseolus acutifolius cv. TB1 ------------------------------------------------------------- 30
4.2 Efecto del thidiazurn (TDZ) en la formacin de callos en explante secciones cotiledonales
de Phaseolus acutifolius cv. TB1 --------------------------------------------------------------------- 34
4.3 Efecto del tipo y grado de desarrollo del explante en la formacin de callos en Phaseolus
acutifolius cv. TB1 ------------------------------------------------------------------------------------- 38
4.4 Estudio del AIA en la induccin de los embriones somticos en Phaseolus acutifolius cv.
TB1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- 41

somticos en Phaseolus acutifolius cv. TB1 ------------------------------------------------------- 46
CONCLUSIONES ------------------------------------------------------------------------------------- 51
RECOMENDACIONES ------------------------------------------------------------------------------ 52
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS -------------------------------------------------------------- 53

ABREVIATURAS
Abreviaturas empleadas en el texto
ABREVIATURAS EMPLEADAS EN EL TEXTO
FAO Food and Agricultura Organization
AIA cido indol-3-actico
ANA cido naftalenactico
6-BAP 6-benzilaminopurina
NaClO Hipoclorito de sodio
NaOH Hidrxido de sodio
CO2 Dixido de carbono
mg.L-1 Miligramo por litro
HCl cido clorhdrico
GA3 Giberlico-3
AgNO3 Nitrato de plata
g.L-1 Gramo por litro
C Grados Celsius
ABA cido abscsico
TDZ Thidiazurn
% Porcentaje
ml Mililitros
mm Milmetros
INTRODUCCIN
Introduccin
I. INTRODUCCIN
Los frijoles (Phaseolus spp.) son uno de los cultivos ms ancestros del nuevo mundo,
cultivados hace ms de 7 000 aos en dos centros de origen: uno Mesoamericano (Mxico-
Amrica Central) y otro en la regin Andina (Guidolin, 2003).
Durante milenios los agricultores cultivaron diversos tipos de frijol como barrera viva contra
la seca, el ataque de plagas y enfermedades. Este proceso produjo una alta variabilidad
gentica, casi ilimitada con una gran variedad de colores, textura y tamao del grano, viniendo
a encontrar las condiciones de plantacin y preferencias de sabor de diferentes regiones del
mundo (Popelka et al., 2004).
Los Phaseolus, representan el segundo cultivo con ms rea plantada en todo el mundo, solo
superado por el millo (Pennisetum spp.). La produccin total excede los 23 millones de
toneladas mtricas de la cual, siete millones de toneladas mtricas son producidas en Amrica
Latina y frica (Broughton et al., 2003).
En los pases de Asia, frica y Amrica Latina, los frijoles constituyen una de las principales
fuentes calrico-proteica para cerca de 500 millones de personas. En la mayor parte de estos
pases la protena de origen vegetal, ocupa ms del 80 % del total de protenas de la dieta
humana (Araujo et al., 1996).
En Cuba se cultivan aproximadamente 52 000 hectreas de frijol sin incluir las reas dedicadas
al autoabastecimiento. La produccin estatal cubre el 5.0 % de la demanda, lo que exige la
importacin de 120 000 toneladas anuales del grano, equivalente a 40 millones de dlares
(Echemenda, 2003).
-1-
Introduccin
Los factores climticos que prevalecen en Cuba, durante una u otra poca del ao y los
microclimas existentes en cada regin donde se cultiva, provoca que el cultivo del frijol se vea
afectado por diferentes enfermedades que limitan los rendimientos, destacndose las
producidas por hongos fitopatgenos del suelo, entre los que se encuentran los gneros,
Rhizoctonia solani Khn, Fusarium solani f. sp. phaseoli y Sclerotium rolfsii Sacc.
Los daos causados por estos hongos, producen en sus hospederos una amplia variedad de
sntomas como, manchas clorticas y necrticas, podredumbres, y marchitamientos, los cuales
causan un pobre establecimiento de las plantas, muerte prematura y finalmente merma en el
rendimiento (Torres et al., 1997). Por ello, la introduccin de genes que mejoren las
caractersticas agronmicas, como resistencia a plagas y enfermedades mediante Ingeniera
Gentica, permite en corto tiempo la introduccin de genes de inters sin la necesidad de
cruzamientos que en programas de mejoramiento gentico convencional pueden durar aos
(Azurdia et al., 1999 y Guidolin, 2003).
Las denominadas biotecnologas, basadas en el uso de la Ingeniera Gentica, han posibilitado
importantes avances en el mejoramiento gentico; pero para que ello ocurra es necesario
contar con sistemas de regeneracin in vitro a partir de clulas indiferenciadas que brinden
como producto final la formacin de plantas (Medina et al., 2003).
En leguminosas, familia de gran inters comercial, se ha intentado establecer un
procedimiento eficiente de regeneracin in vitro y transformacin gentica en algunas
variedades. Sin embargo, los procesos de regeneracin in vitro empleados en otras especies
vegetales no se han podido aplicar a estas plantas (Nagl et al, 1997 y Dillen et al., 2000).
-2-
Introduccin
En la actualidad el P. acutifolius, una de las cinco especies cultivadas de este gnero, es la
nica especie en la cual se ha logrado la transformacin gentica y la regeneracin de plantas
va organognesis, basado en la regeneracin de callos y transferencia de genes mediante
Agrobacterium tumefaciens (Zambre et al., 2005) y luego mediante cruzamiento de estos
individuos con la especie P. vulgaris se han obtenido plantas de frijol comn con los genes de
inters incorporados (Meja-Jimnez et al., 1994).
Teniendo en cuenta la importancia que tiene este cultivo para nuestro pas y las
potencialidades de la embriognesis somtica para la transformacin de plantas, as como que
en la actualidad tanto en Cuba como a nivel internacional no se ha logrado la regeneracin in
vitro va embriognesis somtica, que permita utilizarla en los programas de mejoramiento
gentico por biotecnologa, nos propusimos la siguiente hiptesis de trabajo: Es posible
establecer la embriognesis somtica en plantas de Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1,
combinando diferentes tipos de explantes y reguladores del crecimiento en los medios de
cultivo.
Para cumplimentar esta afirmacin nos trazamos los siguientes objetivos.
Objetivos:
1. Determinar la influencia del tipo de explante y diferentes reguladores del crecimiento en
los medios de cultivo durante la callognesis y formacin de la embriognesis somtica en
Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1.
2. Estudiar diferentes condiciones de iluminacin durante la fase de germinacin de los
embriones somticos.
-3-
REVISIN BIBLIOGRFICA
Revisin bibliogrfica
II. REVISIN BIBLIOGRFICA
2.1. Generalidades del cultivo
El gnero Phaseolus sensus stricto, comprende alrededor de 180 especies, de las cuales
solamente cinco son cultivadas: Phaseolus acutifolius A Gray (frijol tepari), Phaseolus
coccineus L (frijol botil), Phaseolus lunatus L (frijol lima), Phaseolus polyanthus G (frijol
piloy) y Phaseolus vulgaris L (frijol comn) (Debouck, 2000).
2.1.1 Ubicacin filogentica del cultivo
Reino: Plantae
Subreino: Tracheobionta
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Magnoliopsida
Subclase: Rosidae
Orden: Fabales
Familia: Fabaceae
Gnero: Phaseolus
Especie: acutifolius
Nombre cientfico: Phaseolus acutifolius Asa Gray
Nombres vulgares: frijol tepari, escomite o escumite, frijol piuelero, tepari bean, texas bean,
yori mui, pavi, entre otros (Carlyle, 2000).
Dentro del gnero Phaseolus existen diferentes grupos naturales o acervos genticos. El
acervo gentico primario, incluye las variedades silvestres y cultivadas de P. vulgaris, entre
ellas se cruzan y se recombinan genes sin ninguna barrera gentica. El acervo secundario
-4-
incluye, P. coccineus, P. costaricensis y P. polyanthus. En el acervo gentico terciario se
encuentran, P. acutifolius, P. parvifolius, P. filiformis y P. angustissimus, que podran ser
ancestros en la evolucin del frijol comn; en todos los cruzamientos realizados con estas
especies es necesario el rescate de embriones y los hbridos iniciales son estriles (Rodrigo,
2000; De la Rosa, 2003).
El Phaseolus acutifolius, tiene dos parientes silvestres que corresponden a P. acutifolius var.
acutifolius y P. acutifolius var. tenuifolius. La primera de ellas distribuida en el sur de los
Estados Unidos de Amrica y norte de Mxico, y la segunda desde Nuevo Mxico, Estados
Unidos de Amrica hasta Chiapas, Mxico (Azurdia et al., 1999).
El frijol tepari (P. acutifolius), ha sido cultivado desde hace mucho tiempo en Mesoamrica, y
principalmente como legumbre en las zonas desrticas o con una larga temporada seca.
Primero se describi una de sus formas silvestres, y la relacin con la forma cultivada fue
reconocida ms tarde, al contrario de lo que ha ocurrido con las dems especies cultivadas del
gnero Phaseolus (Debouck, 1999).
Los hallazgos arqueolgicos han mostrado una gran antigedad del cultivo de esta especie en
el suroeste de Estados Unidos de Amrica (donde habra penetrado a partir de Mxico hace
1 200 aos) y en la regin mexicana de Puebla, donde existe hace 5 000 aos. Su distribucin
geogrfica se extiende desde Arizona y Nuevo Mxico hasta Costa Rica (Debouck, 1999).
2.1.2 Caractersticas botnicas
El P. acutifolius, es una planta tolerante a la sequa, que se desarrolla en regiones ridas o
semiridas, conocido como frijol del desierto. La planta es anual, trepadora, de tallos delgados
y pilosos, con hojas delgadas y lineales. Las variedades trepadoras llegan alcanzar dos a tres
-5-
metros de altura. Su sistema radicular es muy ligero y poco profundo, constituido por una raz
principal que puede alcanzar una profundidad de uno a dos metros y gran nmero de races
secundarias con elevado grado de ramificacin. Las semillas son aplanadas o reniformes, casi
redondas, de seis a nueve milmetros de largo y tres a seis milmetros de ancho, de testa
blanca, castaa o azul oscuro, uniforme o con manchas o puntos. Su inflorescencia es en forma
de racimo axilar con dos a cinco flores (FAO, 2005).
El P. acutifolius, se distingue fcilmente por su germinacin epigea, hojas primarias ssiles,
fololos romboidales agudos, pseudoracimos con dos a cuatro ramillas fructferas, flores
pequeas de coloracin rosada o blancas, con bractolas muy pequeas y triangulares, vainas
con suturas marcadas con cinco a diez vulos. Presenta autogamia dominante. Cultivo de ciclo
corto con floracin a los 27 - 40 das despus de la germinacin y maduracin a los 60 - 80
das, con un hbito de crecimiento indeterminado (Stephens, 2000).
2.1.3 Contenido nutricional
Los nutricionista caracterizan el frijol, como un alimento casi perfecto debido al alto contenido
de protenas 15 - 27 % (principalmente Phaseolin), fibras, carbohidratos complejos y otros
complementos de la dieta como cido flico, hierro, zin, magnesio y potasio (Guidolin, 2003).
Las semillas del frijol tepari, son ricas en lectinas que a diferentes concentraciones inhiben el
crecimiento de clulas cancergenas e inducen apoptosis, el grano seco es rico en hidratos de
carbono con un alto contenido de lisina y rico en protenas entre un 23 - 25 %, sin embargo,
como en el caso de otras leguminosas, la protena es deficiente en metionina. Se ha indicado
que tiene potencial como donador de genes para obtener mejores variedades de frijol desde el
punto de vista culinario, nutricional y toxicolgico (Hernndez y Len, 1994; FAO, 2005).
-6-
2.2 Cultivo de tejido y regeneracin in vitro de plantas
El cultivo de tejidos vegetales, es un conjunto de tcnicas que permiten el cultivo en
condiciones aspticas de rganos, tejidos, clulas y protoplastos empleando medios nutritivos
artificiales (Jimnez, 1998).
La habilidad de hacer que clulas de plantas formen rganos y hasta plantas enteras es una
importante herramienta en el mejoramiento de cualquier especie, permitiendo el acceso a
tcnicas como mutagnesis in vitro, seleccin in vitro, utilizacin de variantes somaclonales,
rpida micropropagacin y en especial la transformacin gentica (Gamborg y Phillips, 1995).
El cultivo de tejidos y la regeneracin in vitro de plantas en Phaseolus spp., a tenido serias
dificultades desde los primeros intentos realizados en P. vulgaris por Hildebrandt desde 1963
hasta 1975 y Crocomo en 1976 (Nagl et al., 1997). Desde entonces un protocolo eficiente
para la embriognesis somtica y la organognesis ha estado careciendo. Un poco
prometiendo aparecen los resultados para el Phaseolus coccineus y el P. acutifolius (Dillen et
al., 1997 y Santangelo, 2000).
Desde entonces, aunque diversas combinaciones de reguladores del crecimiento, explantes y
condiciones de cultivo han sido estudiadas, no se ha podido regenerar plantas de Phaseolus
eficientemente a partir de embriones somticos (Zambre et al., 2001).
Segn los resultados de varios autores dos tipos de tejidos jvenes mantienen la totipotencia
celular: los meristemas apicales o axilares y tejidos inmaduros o tejidos de semillas recin
germinadas (Santangelo, 2000).
Existen dos va fundamentales empleadas en la regeneracin in vitro de plantas: organognesis
y embriognesis somtica.
-7-
2.2.1 Regeneracin de plantas va organognesis en el gnero Phaseolus
La organognesis, generalmente ocurre por la optimizacin de la relacin citoquinina - auxina
en el medio de cultivo, y ocurre por la diferencia de rganos y brotes directamente del
explante o del callo pudiendo organizarse de una nica clula o de un conjunto de clulas, la
cual se caracteriza por ser una estructura unipolar con una amplia conexin vascular de los
rganos formados con el explante (Thorpe, 1995).
La regeneracin in vitro va organognesis en el gnero Phaseolus ha sido intentada a partir de
explantes como segmentos de hojas (Kumar et al., 1988), yemas axilares (Brinks, 2000),
cotiledones (Hernndez et al., 2002), brotes caulinares (Eissa et al., 2002), embriones
cigticos (Popelka et al., 2004) y pecolos (Radeva y Lilota, 2005).
Algunos investigadores han obtenido organognesis directa a partir de brotes apicales de los
embriones cigticos en P. vulgaris, P. coccineus y P. acutifolius (Malik y Saxena, 1992 b), as
como cultivo de meristemos apicales y axilares con altas concentraciones de citoquininas, en
P. vulgaris y P. acutifolius (Mohamed et al., 1992 a; Malik y Saxena, 1992 a).
Sin embargo, los resultados de regeneracin va organognesis indirecta son limitados en
especies Phaseolus. Lo cual ha sido descrito en P. acutifolius (Kumar et al., 1988 y Dillen et
al., 1997), P. coccineus (Genga y Allavena, 1991), P. polyanthus (Zambre et al., 2001) y
Vigna angulkaris (El-Shemy et al., 2002).
De Carvalho et al. (2000) usaron la tecnologa de la capa de clula delgada, a partir de
brotes apicales de embriones cigticos germinados in vitro para regenerar brotes de Phaseolus
vulgaris va indirecta donde un tratamiento inicial con 2.75 mg.L-1 TDZ increment la
frecuencia de regeneracin de las yemas.
-8-
2.2.2 Embriognesis somtica
La primera descripcin de embriognesis somtica in vitro fue obtenida de forma
independiente por Steward en 1958 y Reinert en 1959, trabajando con zanahoria (Daucus
carota L.), confirmando la prediccin de Haberlandts, de que los embriones somticos
pueden formarse de simples clulas en cultivo in vitro (Jimnez, 2001).
La embriognesis somtica, es en el cultivo de tejidos vegetales el proceso de iniciacin de un
embrin somtico y su desarrollo a partir de clulas vegetativas o no gamticas (Bhojwari y
Razdan, 1996).
La diferencia principal con la embriognesis cigtica radica, en que las clulas que dan origen
al embrin somtico no son el resultado de la fecundacin sexual (Carlota et al., 1997),
adems de mantener la misma combinacin gentica que el de la planta fuente del explante
(Parrott, 1993).
El uso de la embriognesis somtica para la propagacin seguir aumentando segn hayan
protocolos ms avanzados y refinados capaces de producir embriones somticos
morfolgicamente normales, sin variacin somaclonal y con capacidad para germinar y
convertirse en plantas rpida y eficazmente (Parrott, 2002).
Entre las ventajas que ofrece la embriognesis somtica est, la posibilidad de obtener
volmenes de produccin superiores en un menor tiempo, lo cual convierte a este sistema en
una va de regeneracin potencialmente ms eficiente que la regeneracin va organognesis
(Villalobos y Thorpe, 1991). Adems, la disponibilidad de protocolos para la obtencin de
embriones somticos es clave para la automatizacin de la micropropagacin y la consecuente
reduccin de los costos para su implementacin a escala comercial (Olmos et al., 2004).
-9-
La caracterstica sobresaliente de los embriones somticos es que se desarrollan de clulas
somticas y por lo tanto, presentan la potencialidad de producir duplicados de un genotipo
especfico; esta caracterstica permite la multiplicacin de clulas somticas a las cuales se les
han introducido genes especficos por ingeniera gentica y as, los individuos genticamente
modificados pueden ser multiplicados en forma segura y eficiente, evitando los riesgos de
incorporacin de genes extraos meiticamente inestables en el resto del germoplasma
(Artola, 2004).
Sus desventajas radican en el desconocimiento que existe sobre los parmetros que regulan
este proceso y el limitado nmero de especies en las cuales se describe una embriognesis
somtica eficiente que permita la aplicacin del mtodo (Jain, 2000).
Existen dos vas para desarrollar el proceso de embriognesis somtica que son:
La va indirecta, que requiere una fase intermedia de callo formado por un conjunto de
diferentes tipos de clulas no organizadas y que conservan la capacidad de dividirse. Una vez
organizado el callo este prolifera, se inicia la formacin de pro-embriones, usualmente en este
medio de cultivo con altas concentraciones de auxinas y luego se transfieren los callos a un
medio de cultivo con menores concentraciones de reguladores del crecimiento para inducir la
formacin de los embriones somticos a partir de los pro-embriones iniciales. Este fenmeno
se conoce como Clulas Embriognicas Determinadas Inducidas (Tisserat, 1991).
La va directa, involucra la formacin de los embriones somticos en una parte del tejido
del explante sin la formacin de callos, ya que las clulas dentro de un embrin cigtico son
de por si embriognicas, es posible inducirlas para que estas se dividan para formar un
embrin somtico. En este caso, las clulas pre-existentes se dividen directamente para formar
- 10 -
un embrin somtico. stas se conocen como Clulas Embriognicas Pre-Determinadas
(Parrott, 2002).
Existen dos tipos de embriognesis somtica indirecta, una conocida como embriognesis
somtica de baja frecuencia y otra denominada embriognesis somtica de alta frecuencia. En
la primera, el nmero de callos con embriones somticos es mayor, aunque se forman pocos
embriones somticos por callo; estos embriones aparecen entre las 12 - 14 semanas de cultivo,
aislados o en pequeos grupos y se desarrollan completamente pasando por los diferentes
estadios de desarrollo, mientras que en la segunda, aparecen entre las 16 - 20 semanas de
cultivo, no se desarrollan completamente y se mantienen en estado globular, agrupados en un
nmero mucho mayor, en un nmero menor de callos (Gmez, 1998).
2.2.2.1 Embriognesis somtica en leguminosas
La regeneracin de plantas va embriognesis somtica ha sido descrita en otras especies de
leguminosas como soya (Glicine max (L.) Merrill), man (Arachis hipogea) y chcharo (Pisum
sativum) (Droste et al., 2001; Chandra y Pental, 2003).
En Glicine max y Arachis hipogea, han sido establecidos cultivos de callos con estructuras
embriognicas y la embriognesis somtica directa ha sido observada en Pisum sativum,
Arachis hipogea y garbanzo (Cicer arietinum). La induccin de embriones somticos va
suspensiones celulares se ha obtenido en especies de Vigna (Chandra y Pental, 2003). Por otra
parte, la embriognesis somtica y el subsiguiente desarrollo de plantas ha sido desarrollado
en P. coccineus (Genga y Allavena, 1991) y Phaseolus vulgaris (Mohamed et al., 1993).
Anand et al. (2000) regeneraron plantas de frijol caup (Vigna unguiculata (L.) Walp.), va
embriognesis somtica a partir de hojas primarias inmaduras. Devi et al. (2004) indujeron
- 11 -
embriognesis somtica en explantes cotiledones maduros, hipoctilos, segmentos nodales y
hojas de dos cultivares de Vigna radiata (L.) Wilczek, en un medio de cultivo compuesto por
sales MS suplementadas con diferentes concentraciones de reguladores del crecimiento.
2.3 Etapas para la regeneracin de plantas va embriognesis somtica
2.3.1 Induccin de los embriones somticos
Todas las clulas somticas dentro de la planta contienen la informacin gentica necesaria
para crear una planta completa y funcional. La expresin temporal y espacial de los genes es
fuertemente regulada para permitir la diferenciacin de varios sistemas de rganos, as como
el desarrollo de una planta (Jimnez, 2001).
Para aprovechar las potencialidades que el embrin somtico ofrece, es vital entender los
mecanismos involucrados en la transicin de una clula somtica o del gametofito en una
clula embriognica (Mordhorst et al., 1997).
El tejido embriognico se caracteriza por clulas pequeas, ricas en citoplasma, y asimtricas.
Las clulas dentro de los tejidos embriognicos pueden dividirse y mantener su estado
embriognico mientras estn expuestas a suficiente auxina. Estos tejidos van creciendo y
forman masas conocidas como: masas embriognicas, centros embriognicos, complejos
proembrionales, o masas pro-embriognicas (Parrott, 2002).
An para aquellas especies en las cuales es posible la embriognesis somtica, los embriones
generalmente slo se pueden obtener de ciertos tejidos en ciertas etapas de desarrollo, o de
ciertos genotipos dentro de la especie. La relativa habilidad de un tejido y genotipo dado para
formar embriones somticos se conoce como competencia embriognica (Parrott, 2002).
- 12 -
En el caso de un tejido no embriognico se puede inducir las clulas a un estado embriognico
mediante la exposicin a reguladores de crecimiento, cambios en el pH, tratamientos con
sustancias qumicas o calor (Mordhorst et al., 1997).
2.3.2 Desarrollo y proliferacin de los embriones somticos
En el caso de las plantas monocotiledneas, los embriones somticos pasan por diferentes
etapas de desarrollo embrionario: globular, escutelar y coleoptilar (Noceda, 1999).
En dicotiledneas, la etapa globular es seguida por la etapa corazn que se corresponde con la
adquisicin de la simetra bilateral: desarrollo de la epidermis, de los estratos procambiales y,
de manera sucesiva, el desarrollo del pice radical. El pice de tallo se desarrolla ms tarde en
la etapa cotiledonal. En los embriones somticos de algunas especies, existe una etapa
intermedia entre globular y corazn llamada oblonga, que corresponde a la individualizacin
del pice de la raz y al procambium en respuesta a la elongacin axial del embrin somtico
debido al transporte de auxinas (Radice, 2004).
Otro tipo de desarrollo del embrin tiene lugar en las conferas que incluye tres fases
embrionarias, la cotiledonal y globular tempranos, y los embriones cotiledonales tardo (Dong
y Dunstan, 2000).
Cuando el nivel de auxinas en el medio de cultivo baja ms de cierto umbral, las clulas
embriognicas empiezan un proceso de histodiferenciacin. Los embriones que se van
histodiferenciando crecen debido a la divisin celular, y pasan por las mismas etapas de
desarrollo que los embriones cigticos (Parrott, 2002).
Aunque la forma corazn y torpedo han definido los embriones tradicionalmente como fases
separadas del desarrollo del embrin, la distincin entre ellos est aparentemente basado en la
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diferencia del tamao. Estas diferencias tienen su causa de origen en que los embriones de
plantas monocotiledneas comienzan por un solo cotiledn y por consiguiente no proceden a
travs de una fase de corazn (Kaplan y Cooke, 1997).
Uno de los ms poderosos aspectos de la embriognesis somtica que permite su aplicacin en
la propagacin masiva y la transferencia de genes, es la habilidad de los cultivos
embriognicos de muchas especies de plantas a proliferar o multiplicarse indefinidamente
(Merkle et al., 1995).
La proliferacin de clulas embriognicas es aparentemente influenciada por un nmero de
factores, algunos de los cuales pueden ser controlados durante el proceso, y otros que todava
no han sido definidos, siendo muchos de stos los mismos que afectan el proceso de induccin
de la embriognesis somtica (Barranco, 2001).
Los procesos de multiplicacin, han recibido varios trminos como embriognesis secundaria,
recurrente, accesoria o repetitiva. La embriognesis repetitiva ocurre cuando al aumentar el
nivel de auxinas exgenas, se llega a un punto en que la histodiferenciacin no pasa ms all
de la etapa globular. En este caso, los embriones nuevos se forman en el embrin original, y
estos a su vez llegan a la etapa globular, donde cesa su desarrollo y forman nuevos embriones.
Este proceso se repite indefinidamente mientras el nivel de auxina exgena sea lo
suficientemente alto (Parrott, 2002).
2.3.3 Maduracin de los embriones somticos
La fase de maduracin es un complejo perodo de desarrollo del embrin somtico en el cual
ocurre la expansin de la clula y la acumulacin de sustancias de reserva y se adquiere
tolerancia a la desecacin (Parrott, 1993).
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En esta etapa juega un papel fundamental la presencia de nitrgeno en el medio de cultivo,
siendo necesaria la adicin de nitratos, amonios, aminocidos y casena hidrolizada. Los
carbohidratos entre ellos la sacarosa en concentraciones de tres a seis porciento son esenciales,
junto a bajas concentraciones de oxgeno en el medio de cultivo, lo cual permite una total
maduracin de los embriones somticos y evita la germinacin precoz (Merkle et al., 1995).
Diferentes patrones en la acumulacin de sustancias de reserva en el embrin somtico pueden
dirigir las modificaciones de diferentes protocolos que pudieran elevar el desarrollo y posterior
rendimiento de la planta. Varios estudios han usando como marcadores de la calidad del
desarrollo del embrin somtico, sustancias de reserva como la acumulacin de protenas,
lpidos y almidn (Merkle et al., 1995).
McKersie y Bowley (1996) encontraron que la adicin de prolina como suplemento del medio
de cultivo favorece el nmero de embriones somticos en estados avanzados y el tamao de
los embriones de alfalfa (Medicago sativa L.).
2.3.4 Germinacin y conversin de los embriones somticos
El trmino germinacin, se refiere al desarrollo de la raz o el brote, o ambos a partir de
embriones somticos (Merkle et al., 1995), mientras que la conversin, se emplea para indicar
la supervivencia y desarrollo de los propgulos obtenidos como resultado de la germinacin
bajo las condiciones de en un ambiente ex vitro (Noceda, 1999).
Las plantas in vitro se desarrollan en condiciones de alta humedad y baja intensidad luminosa
por lo que al pasar a la fase de aclimatizacin se producen cambios bruscos en los niveles de
CO2, iluminacin y humedad relativa lo que provoca una excesiva prdida de agua a travs de
las hojas (Aguilar et al., 2000).
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En muchos casos durante la maduracin se induce la dormancia, por lo que son necesarios
tratamientos con fro o aplicaciones de AG3 que aceleran la germinacin y crecimiento del
embrin, tambin tratamientos con citoquininas contrarrestan el efecto provocado por la
auxina durante la induccin y proliferacin (Gmez, 1998). Tratamientos de secado parcial del
embrin somtico aumentan, normalizan y sincronizan la germinacin, adems aplicaciones
de ABA, prolina y tratamientos con calor inducen la tolerancia a la desecacin (Merkle et al.,
1995).
2.4 Factores que influyen en la embriognesis somtica
2.4.1 Composicin del medio de cultivo
Generalmente se han empleado los medios de cultivo compuestos por las sales MS (Murashige
y Skoog, 1962) o alguna otra modificacin de esta formulacin ya que parece que la alta
concentracin de sales es beneficiosa para el crecimiento de los embriones somticos. Se
requieren altas concentraciones de potasio, magnesio, fosfato y sulfato para un adecuado
crecimiento celular, adems de hierro, el cual es imprescindible para que los embriones
somticos alcancen la madurez (Gmez, 1992).
La composicin y concentracin de los reguladores de crecimiento en el medio de cultivo son
factores determinantes para el crecimiento y normal desarrollo de la mayora de las plantas en
los sistemas de cultivo in vitro (Guidolin, 2003).
Se considera que las auxinas juegan un doble rol, donde el nivel endgeno de la auxina
provoca la polaridad de las masas embriognicas indispensable para la induccin de
embriognesis somtica, mientras que las auxinas aadidas exgenamente pueden difundirse
dentro de las masas embriognicas y cancelar la polaridad (Nomura y Komamine, 1995).
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El 2,4-D auxina muy utilizada en la formacin de embriones somticos puede producir
variabilidad gentica y aunque los mecanismos de dicha variabilidad no se han determinado
an, parecen estar expresados por un afectacin de la divisin celular que provoca mutaciones
cromosomales (Merkle et al., 1995).
En algunas investigaciones donde se han estudiado varias auxinas se ha observado que el AIA
y el ANA promueven la formacin de estructuras embriognicas, mientras que el 2,4-D
estimula la formacin de callos de menor tamao, poco compactos y con menor capacidad de
regeneracin (Trejo et al., 2002).
En las angiospermas, el AIA regula ambas fases de desarrollo embrionario a travs de diversos
mecanismos tales como vas alternativas para la biosntesis de auxinas, control de los niveles
de auxinas y gradientes de concentracin (Ljung et al., 2002). El alto nivel de auxina libre
surge para mediar la rpida proliferacin de crecimiento celular durante el estado inicial de la
embriognesis cigtica en Daucus carota L (Ribnicky et al., 2002).
Las citoquininas juegan un importante papel en la regulacin de la divisin celular e
intervienen como las auxinas en el control de muchos aspectos del crecimiento y del desarrollo
de las plantas. La formacin de races, parte area y callo en el cultivo de tejido son reguladas
por la disponibilidad e interaccin de estas dos clases de reguladores de crecimiento (Frank y
Schmlling, 1999).
El papel de las citoquininas es menos claro en el medio de induccin de embriones, aunque
normalmente el medio de cultivo incluye una de ellas, mientras que su presencia en el medio
de proliferacin podra promover la divisin celular. Su incorporacin al medio de cultivo
durante la histodiferenciacin compensa el efecto negativo inducido por las auxinas sobre el
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desarrollo del meristemo y suelen ser esenciales para la maduracin y germinacin de los
embriones somticos (Bhojwari y Razdan, 1996). Adems, estn envueltas en la
diferenciacin de cloroplastos, metabolismo de nutrientes, prdida de dominancia apical y
retardo de la senescencia de las hojas (Gonneau et al., 1998).
El thidiazurn, fue desarrollado originalmente para su utilizacin como defoliante del algodn
(Gossypium spp) (Huetteman y Preece, 1993), adems ha sido muy empleado en la induccin
de procesos morfognicos (Murthy et al., 1998).
La propiedad biolgica del TDZ como regulador del crecimiento en cultivo de tejidos de
Phaseolus spp., fue demostrada primeramente en callos de Phaseolus lunatus cv. Kingston.
Tambin ha presentado buenos resultados en diferentes protocolos de regeneracin en otras
especies del gnero Phaseolus entre las que se encuentra P. acutifolius (Zambre et al., 1998;
De Carvalho et al., 2000; Zambre et al., 2001).
A bajas concentraciones, el TDZ induce la formacin de brotes en el frijol comn, demostrado
ser una citoquinina muy activa a bajas concentraciones (Huetteman y Preece, 1993). Tambin
se ha utilizado para estimular la embriognesis somtica en varias especies como Arachis
hipogea, Pisum sativum y Cicer arietinum, sin embargo, todava no se ha podido emplear para
desarrollar protocolos de transformacin reproducibles (Chandra y Pental, 2003).
Mohamed et al. (1993) y Zambre et al. (1998) emplearon combinaciones de TDZ y AIA en la
obtencin de plantas a partir de callos en P. vulgaris L. cv. Xan 159 y GN Tara, lo cual puede
estar influenciado, por un factor gentico heredado de P. acutifolius que favorezca la
regeneracin de plantas a partir de callos, ya que ambos genotipos provienen de cruzamientos
interespecficos con P. acutifolius.
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En algunas especies vegetales, han sido relatadas algunas desventajas asociadas con el uso del
TDZ como hiperhidricidad, morfologa anormal de las hojas, yemas cortas y no elongadas,
disminucin o eliminacin del enraizamiento (De Lima et al., 1998).
El AG3 ayuda a la normal maduracin y a la germinacin de los embriones somticos y el
ABA, el cual reprime la embriognesis somtica, reduce la formacin secundaria de
embriones a partir de embriones somticos y la germinacin precoz (Chee, 1996).
2.4.2 Condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo
Es muy frecuente que una gran cantidad de trabajos de micropropagacin estn relacionados
con la composicin de los reguladores del crecimiento del medio de cultivo, como elemento
decisivo en la respuesta in vitro del material vegetal, sin embargo, muchos autores han
investigado acerca de la influencia del ambiente fsico, demostrando su importancia
frecuentemente subestimada en las investigaciones (Licea, 2001).
Un aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo que depende,
adems, de la especie empleada. Las diferentes tipos y calidades de gelificantes existentes en
el mercado modifican la expresin morfognica debido a que pueden contener sustancias
inhibitorias o promotoras del crecimiento (Radice, 2004).
La atmsfera gaseosa, es un factor determinante en los procesos morfognicos condicionada
por el tipo y tamao de envase seleccionado as como por el sistema de cobertura del mismo.
En cultivos in vitro se han registrado, etileno y otros compuestos hidrocarbonatos (Radice,
2004).
Villalobos y Thorpe (1991), sealan que la luz y la temperatura han sido los factores fsicos
considerados ms importante en la micropropagacin.
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La luz es uno de los factores que determina el desarrollo de los organismos auttrofos, en ello
radica la importancia de controlar la luz en los cultivos in vitro (Pelacho et al., 2002).
El fotoperodo, puede afectar los niveles internos de los reguladores del crecimiento, donde
cambios en la intensidad luminosa pueden causar organognesis y cambios morfolgicos
especficos debido a la longitud de onda de la iluminacin (Lizt y Jarret, 1993).
Determinadas longitudes de onda son las que mejor aprovechan las plantas para realizar sus
funciones vitales de fotosntesis, fototropismo o fotomorfognesis y son concretamente las del
azul y rojo (Escobar, 2000).
2.4.3 El tipo y estado fisiolgico del explante
La seleccin del explante podra ser el factor clave que determina el xito o no de un protocolo
de embriognesis somtica (Brown et al., 1995).
Es muy importante para lograr el xito de la embriognesis somtica que el explante sea
obtenido de plantas altamente vigorosas, en especial de los rganos y tejidos inmaduros que
son los que generalmente permiten obtener mejores resultados (Bidot, 2001).
Comnmente se han utilizado como explantes, cotiledones, hipoctilo, embriones cigticos,
pices caulinares, segmentos de tallos, hojas, races e inflorescencias inmaduras (Lizt y Jarret,
1993).
Eissa et al. (2002), obtuvieron en P. vulgaris que clulas jvenes procedentes de yemas
axilares tuvieron una mejor respuesta que los cotiledones a las aplicaciones exgenas de los
reguladores del crecimiento 6-BAP y ANA. Dillen et al. (1996) y Zambre et al. (1998),
observaron que solamente los explantes que contenan meristemos (yemas axilares y apicales
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de plantas que crecieron en casas de cultivo y los segmentos nodales de las plantas germinadas
in vitro) indujeron la formacin de callos morfolgicos.
Las dificultades en la regeneracin de P. vulgaris probablemente es producto de variaciones
fisiolgicas adquiridas por los explantes obtenidos de plantas que crecen bajo condiciones de
casa de cultivo. Adems, los explantes derivados de semillas, habitualmente forman una
mayor cantidad de callo que los explantes tomados de yemas de las plantas en P. polyanthus
as como P. vulgaris y P. acutifolius (Zambre et al., 2001).
Se plantea, que la morfologa de los explantes utilizados durante el proceso de transformacin
gentica mediante biobalstica puede influir en la recuperacin de las plantas transgnicas de
Phaseolus vulgaris (Arago y Rech 1997).
2.4.4 Genotipo
El genotipo es un factor determinante en todos los procesos morfognicos desde la capacidad
del explante para su establecimiento en condiciones in vitro as como para la proliferacin de
callo, o la diferenciacin y crecimiento de nuevos rganos (Radice, 2004).
La capacidad embriognica de un explante depende en gran medida del genotipo, incluso
dentro de la misma especie lo que refleja diferencias en el poder de activacin de las rutas
embriognicas (Parrott, 1993).
Segn Yamada et al. (2001) la eficiencia en la regeneracin in vitro de plantas de frijol
depende de las concentraciones ptimas de los reguladores del crecimiento y el genotipo.
Recientes avances en el cultivo de tejidos de especies ha ofrecido la oportunidad de producir
cultivares que no pueden ser obtenidos por mtodos de mejoramiento convencional, pero los
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protocolos de regeneracin han estado influenciados por el genotipo, por ello, no es posible
generalizar metodologas de trabajo (Santalla et al., 1998).
Un procedimiento de regeneracin aplicado en plantas lites de P. vulgaris y P. coccineus
empleando como explantes brotes apicales de los embriones cigticos germinados, se obtuvo
que la respuesta al cultivo in vitro y su capacidad de regeneracin vari significativamente
entre las especies y genotipos, produciendo P. coccineus ms brotes por explantes con una
mayor eficiencia de enraizamiento que P. vulgaris. Este efecto significativo del genotipo,
sugiere que los factores genticos son importantes en la respuesta en el cultivo de tejido in
vitro (Santalla et al., 1998).
2.5 Mejoramiento gentico
Las plantas poseen factores intrnsecos capaces de protegerlas del ataque de insectos, los
cuales pueden ser no proteicos (antibiticos y alcaloides) o proteicos (quitinas y lectinas),
estos factores pueden ser incorporados a nuevos cultivares a travs de procesos de
mejoramiento gentico y de tcnicas de biologa molecular (Ventura et al., 2003).
En P. acutifolius y P. vulgaris, diferentes tipos de tejidos han sido empleados en varios
procesos de transformacin, siendo los tejidos meristemticos los ms usados. Tambin
diferentes mtodos para insertar la informacin gentica en el genoma de la planta han sido
desarrollados, tales como biobalstica y Agrobacterium tumesfaciens (Karakaya y zcan,
2001; Zambre et al., 2002; Arago, 2002 y Arago et al., 2002).
La aplicabilidad de la biobalstica para introducir y expresar genes en clulas meristemticas
en la regin apical del frijol comn fue demostrada por Arago y Rech (1997) y Arago et al.
(2000) para lograr plantas transgnicas con una baja frecuencia de transformacin (0.9 %).
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MATERIALES Y MTODOS
Materiales y Mtodos
III. MATERIALES Y MTODOS
La presente investigacin se desarroll en el Laboratorio de Mejoramiento Gentico del
Instituto de Biotecnologa de las Plantas, centro adscripto a la Universidad Central "Marta
Abreu" de Las Villas, en el perodo comprendido entre Enero de 2004 y Febrero de 2006.
Tcnicas y procedimientos generales
Material vegetal
Como material vegetal se emple semillas maduras de la especie, Phaseolus acutifolius cv.
TB1, (procedentes de la Universidad de Ghent, Blgica).
Procedimientos de desinfeccin
Los trabajos de laboratorio se desarrollaron bajo condiciones aspticas, en cabina de flujo
laminar horizontal (IKEM).
Las semillas fueron desinfectadas segn el protocolo propuesto por Dillen et al. (1997) para su
introduccin in vitro. Las mismas se sumergieron en etanol al 70.0 % (v/v) durante 20
segundos y se realizaron dos lavados con agua destilada estril; luego se efectu una
inmersin de las semillas en 300 ml de NaClO al 3.0 % (v/v) con seis gotas de Tween-20
durante diez minutos, para reducir la tensin superficial y eliminar las burbujas que se forman
en la superficie y cavidades del explante. Finalmente, se realizaron cuatro enjuagues con agua
destilada estril para eliminar los residuos de NaClO y Tween-20.
El pH de los medios de cultivo se ajust a 5.7 previo a la esterilizacin en autoclave vertical
con NaOH 1.0 N y HCl 1.0 N.
Se emplearon frascos de vidrio de 250 ml de capacidad con 30 ml de medio de cultivo
gelificado con Gelrite (SIGMA).
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Materiales y Mtodos
Los medios de cultivos se esterilizaron en autoclave vertical (BK-75) a 121C de temperatura
y 1.2 Kg.cm-2 de presin durante 20 minutos.
El instrumental empleado en la diseccin del material vegetal como pinzas y bisturies, se
desinfect mediante inmersin en NaClO al 1.0 % (v/v) durante 15 minutos.
Germinacin in vitro de las semillas
Con el objetivo de facilitar la separacin de los cotiledones y tomar el brote inducido con la
germinacin de las semillas, se emple el medio de cultivo propuesto por Dillen et al. (1997).
En cada frasco de vidrio (frasco de cultivo) se colocaron diez semillas maduras, sumergiendo
las partes de las mismas en el medio de cultivo y colocadas con el hilium hacia la parte
superior.
Anlisis estadstico
El procesamiento de los datos se realiz mediante los programas computacionales Statistix
versin 1.2 y Statgraphics Plus versin 2.1, todos para ambiente del sistema operativo
Windows de Microsoft.
El diseo experimental empleado fue completamente aleatorizado, dadas las condiciones de
homogeneidad en las que se desarroll la investigacin en las cmaras de crecimiento y se
aplic un anlisis de varianza de clasificacin simple. Las pruebas estadsticas se describen en
el acpite correspondiente y se realizaron para un nivel de significacin del 5.0 %.
En los tratamientos con segmentos cotiledonales se colocaron cuatro secciones de cotiledones
por frasco de cultivo y en los tratamientos con brotes apicales se colocaron tres explantes por
frasco de cultivo. En todos los casos se evaluaron diez frascos de cultivo, representando cada
frasco una repeticin del experimento.
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Materiales y Mtodos
3.1 Efecto del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y del tipo de explante en la
formacin de callos de Phaseolus acutifolius cv. TB1
Este experimento se desarroll con el objetivo de evaluar el efecto del regulador del
crecimiento 2,4-D durante la fase de formacin de callo.
Se emple el medio de cultivo de Murashige y Skoog (1962) (sales MS) suplementado con las
vitaminas Heinz y Mee (1969), 2 % sacarosa y diferentes concentraciones del regulador del
crecimiento 2,4-D (5.0; 10.0; 15.0; 20.0 mg.L-1) y un control sin regulador del crecimiento.
Para realizar este experimento se tomaron dos explantes diferentes: Los cotiledones, los cuales
fueron cortados en los bordes y se seccionaron en pequeos segmentos de aproximadamente
0.25 cm2, colocados con la superficie axial en contacto con el medio de cultivo (Figura 1 a), y
los brotes apicales de embriones cigticos germinados (Figura 1 b).
(a) (b)
Figura 1. (a) Secciones cotiledonales y (b) brotes apicales de embriones cigticos germinados,
de P. acutifolius cv. TB1 en medio de cultivo de formacin de callo.
Las evaluaciones se realizaron a las cuatro semanas de cultivo momento en el cual se evalu:
a) coloracin de los callos, b) zona del explante con formacin de callo, c) consistencia de los
callos, d) porcentaje de explantes con formacin de callo, y e) nivel de formacin del callo en
el explante, segn la escala elaborada para la investigacin (Tabla 1).
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Materiales y Mtodos
Tabla 1. Escala del nivel de formacin de los callo en explantes de P. acutifolius cv. TB1.
Escala Formacin de callo
Nivel - 1 Explante muerto
Nivel - 2 Explante vivo pero sin formacin de callo
Nivel - 3 Explante vivo con pequeas reas de formacin de callo
Nivel - 4 Explante con 50% de formacin de callo
Nivel - 5 Explante con 100% de formacin de callo
El porcentaje de explantes con formacin de callo por tratamiento se determin mediante la
frmula: %FC = NEC x 100 / TE
Leyenda: (%FC) porcentaje de explantes que formaron callo (%), (NEC) nmero de explantes
con callo y (TE) total de explantes por tratamiento
Para el anlisis estadstico del nivel de formacin de callo en el explante, se emple la prueba
no paramtrica Kruskall-Wallis complementndose con una comparacin mltiple no
paramtrica de rango de medias del programa estadstico Statistix versin 1.0.
3.2 Efecto del thidiazurn (TDZ) en la formacin de callos en explante secciones
cotiledonales de Phaseolus acutifolius cv. TB1
Este experimento se desarroll con el objetivo de evaluar el efecto de diferentes
concentraciones de TDZ durante la fase de formacin de callo a partir de secciones
cotiledonales como explante inicial.
Los cotiledones fueron colocados en un medio de cultivo con las sales MS suplementado con
vitaminas Heinz y Mee (1969), 0.05 mg.L-1 AIA, 2.0 % sacarosa, diferentes concentraciones
de TDZ (0.05; 0.10; 0.20 y 0.50 mg.L-1) y un control sin regulador del crecimiento.
Las evaluaciones se realizaron a las cuatro semanas de cultivo y los indicadores evaluados
fueron: a) coloracin de los callo, b) consistencia de los callo, c) zona del explante con
formacin de callo, d) nivel de formacin del callo en el explante, segn la escala descrita en
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Materiales y Mtodos
el acpite 3.1, e) porcentaje de explantes con formacin de callo y f) composicin celular de
los callo.
El porcentaje de explantes con formacin de callos y el nivel de formacin del callo en el
explante se determin segn descripcin en acpite 3.1. La observacin de la composicin
celular de los callo se realiz con el microscopio ptico AXISKOP. El porcentaje de explantes
con formacin de callo, se determin mediante una prueba de hiptesis de comparacin de
proporciones del software analtico Statgraphics Plus versin 2.1.
3.3 Efecto del tipo y grado de desarrollo del explante en la formacin de callos en
Phaseolus acutifolius cv. TB1
Tomando en consideracin los resultados obtenidos en el experimento anterior se desarroll
este experimento con el objetivo de seleccionar el tipo de explante y su grado de desarrollo a
emplear en la formacin de callos en P. acutifolius cv. TB1.
En este experimento se emple un medio de cultivo con las sales MS suplementado con las
vitaminas Heinz y Mee (1969), 0.05 mg.L-1 AIA, 0.20 mg.L-1 TDZ y 2.0 % sacarosa.
Se estudiaron cuatro tratamientos, constituidos por secciones cotiledonales y brotes apicales de
embriones cigticos germinados, obtenidos a partir de semillas maduras segn el
procedimiento descrito en el acpite 3.1, as como, secciones cotiledonales y embriones
cigticos de semillas inmaduras.
Las evaluaciones se realizaron a las cuatro semanas de cultivo, momento en el cual se evalu
los indicadores: a) porcentaje de explantes con formacin de callo, b) coloracin de los callo,
c) nivel de formacin del callo en el explante, segn la escala descrita en el acpite 3.1 y d)
porcentaje de callos con estructuras embriognicas.
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Materiales y Mtodos
El porcentaje de explantes con formacin de callos se determin segn lo descrito en el
acpite 3.1y la prueba de hiptesis de comparacin de proporciones del software analtico
Statgraphics Plus versin 2.1. El porcentaje de callo con estructuras embriognicas se
determin mediante la formula descrita en el acpite 3.1.
La determinacin del nivel de formacin del callo en el explante se efectu segn se describe
en del acpite 3.1 y las diferencias estadsticas se determinaron mediante la prueba no
paramtrica de Kruskal-Wallis del programa Statgraphics Plus versin 2.1.
3.4 Estudio del AIA en la formacin y diferenciacin de embriones somticos en
Este experimento se desarroll con el objetivo de inducir la formacin de embriones somticos
en explantes brotes apicales de embriones cigticos germinados.
Se emple un medio de cultivo con las sales MS, suplementado con vitaminas Heinz y Mee
(1969), 2 % sacarosa, 0.2 mg.L-1 TDZ, diferentes concentraciones del regulador del
crecimiento AIA (0.05; 0.20; 0.50; 1.00; 3.00; 5.00; 7.00 mg.L-1) y un control sin regulador
del crecimiento.
A las cuatro semanas de cultivo se evalu las siguientes variables: a) porcentaje de explantes
con formacin de embriones somticos o grupos de embriones somticos, b) caracterizacin
de los grupos de embriones somticos, y c) zona del explante con formacin de grupos de
embriones somticos.
Para la determinacin de las variables significativamente diferentes del porcentaje de
formacin de embriones somticos se aplic la prueba de hiptesis de comparacin de
proporciones del programa estadstico computacional Statgraphics Plus versin 2.1.
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Materiales y Mtodos
3.5 Efecto de la intensidad y duracin del fotoperodo en la germinacin de los embriones
somticos de Phaseolus acutifolius cv. TB1
Para el desarrollo de este experimento se tomaron grupos de embriones somticos obtenidos
en el experimento anterior, con el objetivo de estudiar el efecto de la intensidad y duracin del
fotoperodo en la germinacin de los embriones somticos, evalundose en el periodo de
Mayo a Septiembre de 2005 bajo las siguientes condiciones:
1) Luz solar, a temperatura de 282 C con una duracin mxima y mnima del perodo
luminoso de 13 horas 34 minutos y 10 horas 41 minutos respectivamente, con una intensidad
de 48.0 - 62.5 mol.m-2.s-1
2) Luz artificial, a temperatura de 242 C con fotoperodo de 16 horas luz y 8 horas de
oscuridad y una densidad de flujo fotosinttico de 62 - 68 mol.m-2.s-1.
El medio de cultivo empleado estuvo compuesto por las sales MS, vitaminas Heinz y Mee
(1969), 0.09 mg.L-1 AIA, 2.0 mg.L-1 Zeatina, 0.01 mg. L-1 AG3, 100 mg.L-1 Myo-inositol y
Sacarosa 3.0 %.
Las evaluaciones se realizaron a las cuatro semanas de cultivo, momento en el cual se evalu:
a) nmero de embriones somticos con germinacin parcial o completa, b) coloracin de las
hojas, c) nmero de hojas, d) altura de las plantas (cm) y e) longitud del sistema radical (cm).
Para la comparacin mltiple de medias se aplic la prueba de Tukey del programa
computacional Statgraphics Plus versin 2.1 para Windows. La determinacin de las variables
porcentuales se realiz similar a lo descrito en el acpite 3.1.
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RESULTADOS Y DISCUSIN
Resultados y Discusin
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 Efecto del cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y del tipo de explante en la

formacin de callos de Phaseolus acutifolius cv. TB1
Con las diferentes concentraciones de 2,4-D incorporadas en los medio de cultivo se obtuvo
un 100 % de los explantes con formacin de callos. No obstante, se observaron diferencias
significativas en dependencia del tipo de explante y las concentraciones de 2,4-D utilizadas
para el resto de las variables evaluadas.
El nivel de formacin de los callo segn la escala utilizada (Tabla 1), fue superior en la
medida que se incrementaron las concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo,
encontrndose en el explante secciones cotiledonales, diferencias significativas entre los
tratamientos superando en todos los casos al control, alcanzndose los mejores resultados en
los tratamientos con 10.0, 15.0 y 20.0 mg.L-1, mientras que en el explante brote apical de
embriones cigticos germinados, no se obtuvieron diferencias significativas entre los
tratamientos con 2,4-D superando en todos los casos al tratamiento sin regulador del
crecimiento, donde no ocurri la formacin de callo (Tabla 2).
Tabla 2. Influencia del 2,4-D y el tipo de explante en el nivel de formacin de callos en P.

acutifolius cv. TB1 a las cuatro semanas de cultivo, segn la escala propuesta en (Tabla 1).
Nivel de formacin Nivel de formacin
Concentracin
de los callo de los callo
2,4-D Explante Explante
Media de Media de
(mg.L-1) Media Media
rango rango
0.0 1.85 14.90 c Brote 1.88 10.50 b
5.0 Cotiledn 3.00 37.60 bc apical 4.67 59.50 a
10.0 maduro 3.75 51.60 ab de 4.70 58.60 a
15.0 4.44 64.90 a embriones 4.78 61.83 a
20.0 4.50 65.63 a cigticos 5.00 66.50 a
Medias con letras no comunes en una misma columna difieren significativamente por Kruskal-Wallis
(p<0.05).
- 30 -
Segn Gmez (1998), en los tejidos u rganos diferenciados y en presencia de una auxina y/o
citoquinina en el medio de cultivo, se logra un proceso de desdiferenciacin, mediante lo cual
las clulas proliferan continuamente y de forma desorganizada en el explante pareciendo una
masa amorfa de clulas.
En general, los callos presentaron un mayor crecimiento en la medida que se incrementaron
las concentraciones de 2,4-D demostrndose la fuerte actividad auxnica de este regulador del
crecimiento as como su capacidad de producir crecimiento desordenado en las clulas del
explante, lo cual se incrementa al interactuar las concentraciones endgenas de auxinas del
tejido vegetal con las exgenas presentes en el medio de cultivo.
Tambin se observaron desigualdades en el nivel de crecimiento de los callo, lo cual pudo
estar influenciado por los reguladores del crecimiento, tanto endgenos del explante como
exgenos en el medio de cultivo.
Jimnez (2001), observ que el abundante crecimiento de los callos puede deberse a que en
condiciones de oscuridad no ocurre el efecto degradativo que provoca la luz sobre las auxinas,
principalmente 2,4-D y el AIA por un proceso oxidativo.
La zona de formacin de callo en el explante vari en dependencia del tipo de explante
utilizado, los obtenidos a partir de brotes apicales de embriones cigticos germinados se
formaron en todo el tejido del explante (Figura 2 a); mientras que en el explante obtenido de
secciones cotiledonales, el callo se desarroll en los bordes y zonas del explante en contacto
con el medio de cultivo (Figura 2 b).
- 31 -
(a) (b)
Figura 2. Callos de Phaseolus acutifolius a partir de brote apical de embriones cigticos (a) y
secciones cotiledonales (b) en medio de cultivo compuesto por las sales MS, vitaminas Heinz
y Mee (1969), 2.0 % sacarosa, 5.0 mg.L-1 de 2,4-D a las cuatro semanas de cultivo.
En todos los tratamientos se obtuvieron callos de coloracin amarillenta, traslucidos y de
consistencia acuosa (Figura 3), lo cual son caractersticas desfavorables a la morfognesis por
embriognesis somtica, lo cual sugiere que las caractersticas de los callos son las que
determinan su capacidad morfognica (Cantliffe, 1993).
Figura 3. Callos de Phaseolus acutifolius, formados a partir de secciones cotiledonales a las

cuatro semanas en medio de cultivo compuesto por las sales MS, vitaminas Heinz y Mee
(1969), 2.0 % sacarosa y 10.0 mg.L-1 de 2,4-D.
La fase de formacin de callos no es la ms difcil, sino obtener plantas finalmente (Gmez,
1998). Sin embargo, aunque diversas combinaciones de reguladores del crecimiento han sido
estudiadas, los trabajos publicados de regeneracin va indirecta en especies Phaseolus son
limitados a determinados genotipos (Zambre et al., 2001).
Algunos investigadores han obtenido la formacin de callos empleando diferentes
concentraciones de 2,4-D como Allavena y Rossetti (1983) quienes indujeron estas estructuras
- 32 -
en explantes hojas y embriones cigticos inmaduros de P. vulgaris; Saunders et al. (1987)
observ la formacin de callo con estructuras globulares formados a partir de hojas
cotiledonales y regin distal en cotiledones de Phaseolus vulgaris L. cv. UI 114, en medio de
cultivo MS con 2,4-D (0.01 a 80.0 mg.L-1) y kinetina (0.0 a 1.0 mg.L -1); Venketeswaran et al.
(1990) y Anton (1994) establecieron diferentes cultivares de frijol alado (Psophocarpus
tetragonolobus) para formar callo a partir de explantes hipoctilos, cotiledones, hojas,
epictilos y yemas, obteniendo los mejores resultados en medio de cultivo MS suplementado
con 1.0 mg.L-1 de 2,4-D; Genga y Allavena (1991), lograron callos nodulares y la
embriognesis somtica en P. coccineus cv. Streamline 770, a partir de cotiledones inmaduros
en un medio de cultivo MS con 2iP, ANA y glucosa; Santangelo (2000) a partir de meristemos
apicales de semillas maduras en P. coccineus formaron brotes adventicios va indirecta en
medios de cultivo que contenan diferentes combinaciones de TDZ y 2,4-D, confirmando una
mayor competencia del P. coccineus con respecto al P. vulgaris; Eissa et al. (2001) en
explante hipoctilo de P. vulgaris con 2.0 mg.L-1 de 2,4-D y 1.0 mg.L-1 de kinetina obtuvieron
un rpido crecimiento de los callos.
Segn Yamada et al. (2001) el elevado nivel endgeno de auxinas en los frijoles, podra
explicar la formacin exagerada de callos hiperhidratados. Tambin Jimnez (2001), plante
que el 2,4-D en el medio de cultivo incrementa los niveles endgenos de AIA.
Se ha observado una reduccin en la capacidad embriognica de los explante sometidos a
condiciones de cultivo prolongadas con 2,4-D en trigo (Triticum aestivum) (Jimnez y
Bangerth, 2001 a) caracterizada por una reduccin del AIA libre endgeno prcticamente a los
niveles presentes en las lneas no embriognicas.
- 33 -
Tambin se ha encontrado que altas concentraciones de 2,4-D en el medio de cultivo inhibe el
proceso de embriognesis somtica en Arachis spp. y Cydonia oblonga (Canhoto et al., 1999).
De los resultados obtenidos en este experimento se concluye, que aunque en todas las
concentraciones de 2,4-D y para los dos tipos de explantes estudiados se logr un 100 % de
formacin de callo superando en todos los casos al tratamiento sin regulador del crecimiento,
los cuales se mostraron hiperhidratados, traslucidos y no compactos, caractersticas no
deseables para el cultivo de tejidos, lo cual estuvo influenciado por la posible interaccin de
los reguladores del crecimiento 2,4-D y AIA adicionadas al medio de cultivo con las
concentraciones endgenas principalmente AIA y citoquininas presentes en las leguminosas.
4.2 Efecto del thidiazurn (TDZ) en la formacin de callos en explante secciones
cotiledonales de Phaseolus acutifolius cv. TB1
Los explantes secciones cotiledonales durante las dos primeras semanas de cultivo
incrementaron su tamao normal, debido al inicio de la desdiferenciacin y comienzo de la
formacin de callo causado por la interaccin de los reguladores del crecimiento endgenos
del explante con los adicionados en el medio de cultivo.
Florencia y Rossi (2000) emplearon como citoquinina 6-BAP en explantes epictilo y
cotiledones, durante la formacin de callos para la regeneracin in vitro del man, describieron
incrementos en su tamao para todas las concentraciones evaluadas.
Durante las dos primeras semanas de cultivo los explantes de secciones cotiledonales en todos
los tratamientos mantuvieron una coloracin verdosa sin formacin de callo; mientras que, a
partir de la tercera semana se observ la formacin de callo de color pardo con pequeas zonas
de color blanco de apariencia seca y consistencia compacta (Figura 4), lo cual difiere
- 34 -
totalmente de los resultados alcanzados en el acpite 4.1 con presencia del 2,4-D, donde se
obtuvieron callos de coloracin amarillenta, consistencia no compacta y traslucidos.
Resultados similares fueron descritos por Zambre et al. (1998) trabajando con cotiledones
maduros de P. acutifolius y P. vulgaris, quienes evidenciaron la formacin de callo de color
pardo y compacto con 0.1 mg.L-1 de TDZ.
Figura 4. Callo de coloracin parda, formado a partir de secciones cotiledonales en Phaseolus

acutifolius cv. TB1, a las cuatro semanas en medio de cultivo de formacin de callo con las
sales MS, 0.20 mg.L-1 de TDZ, vitaminas Heinz y Mee (1969), 0.05 mg.L-1 de AIA y 2.0 %
sacarosa.
Las secciones cotiledonales formaron callos en los bordes y regiones en contacto con el medio
de cultivo. El bajo crecimiento de los callos pudiera estar ocasionado, segn Klerk (2002), a
que el TDZ se conjuga a muy bajas concentraciones despus de 12 - 33 das en el medio de
cultivo de formacin de callo en Phaseolus spp., lo cual fue demostrado con TDZ
radiomarcado, donde el 60.0 % del TDZ se encontraba libre en el medio de cultivo.
Murch y Saxena (2001), plantearon que la molcula de TDZ permanece intacta, tanto en la
forma libre como en la forma conjugada dentro de los tejidos vegetales, evidencindose que
una exposicin de TDZ aumenta y trasloca las auxinas dentro de los tejidos vegetales. Varios
autores como Smith y Krikorian (1990) y Van Harten et al. (2004) observaron que los cortes
- 35 -
realizados a los tejidos de los explantes facilita la liberacin de reguladores del crecimiento
endgenos del explante, estimulando la formacin de callo en esta zona.
En cuanto al nivel de formacin de los callo en el explante secciones cotiledonales, se
encontraron diferencias significativas entre los tratamientos con TDZ superando en todos al
tratamiento control sin regulador del crecimiento alcanzndose los mayores nivel de
crecimiento a concentraciones de 0.50 y 0.20 mg.L-1 de TDZ (Tabla 3).
Tabla 3. Influencia del TDZ en el nivel de formacin de los callos en explante secciones
cotiledonales de P. acutifolius cv. TB1.
Concentracin
Nivel de formacin de los callos en el explante
TDZ (mg.L-1) Media Media rango
0.00 1.75 20.00 d
0.05 2.42 47.92 cd
0.10 2.97 68.84 bc
0.20 3.44 88.44 ab
0.50 3.64 97.61 a
Medias con letras no comunes difieren significativamente por Kruskal-Wallis (p<0.05).
Segn Phillips et al. (1995) de manera general los callo al ser cultivados en un medio de
cultivo gelificado presentan un estndar de crecimiento con un comportamiento sigmoidal.
El TDZ a bajas concentraciones induce diversas formas de respuestas de los cultivos in vitro
que van desde la induccin de callos hasta la formacin de embriones somticos (Hutteman y
Preece 1993; Murthy et al., 1998).
En la Figura 5, se apreci un incremento proporcional en el porcentaje de explantes con
formacin de callo, respecto a las concentraciones estudiadas, logrndose a concentraciones
0.20 y 0.50 mg.L-1 de TDZ las mejores respuestas para esta variable.
- 36 -
secciones cotiledonales
100 a
Porcentaje de formacin de a
80
callos (%)
b
60
b
40
20
c
0
0 0,05 0,1 0,2 0,5
Concentraciones TDZ (mg.L-1)
Letras no comunes difieren estadsticamente por la prueba de proporcin binomial (p<0.05).
Figura 5. Influencia del TDZ en el porcentaje de explantes secciones cotiledonales con

formacin de callos en P. acutifolius cv. TB1.
Existe relativamente poca informacin disponible concerniente al tipo de callo inducido por el
TDZ. Segn Murthy y Saxena (1998), generalmente esta citoquinina tiende a formar callos
nodulares y compactos.
La identificacin entre callos con estructuras embriognicas y no embriognicas no suele ser
dificultosa, de forma general en todas las especies los callo suelen presentar una coloracin
amarillo plido, compactos y de apariencia nodular (Aftab et al., 1996).
Por el contrario Zambre et al. (2001), trabajando con TDZ y AIA en P. polyanthus observaron
que los callos proliferaron y ocasionalmente murieron en los subsiguientes subcultivos a
medio de cultivo, pero nunca llegaron a ser morfognicos. Sin embargo, en P. vulgaris se
obtuvieron callos nodulares y compactos, caractersticas favorables al cultivo de tejido.
- 37 -
Con la observacin bajo microscopio ptico de los callos a las cuatro semanas, se observaron
cambios en su composicin, aprecindose la formacin de agregados celulares constituidos
por clulas meristemticas pequeas y disminucin de clulas parenquimatosas (Figura 6).
Figura 6. Agregados celulares en explante secciones cotiledonales de P. acutifolius cv. TB1, a

las cuatro semanas en medio de cultivo compuesto por las sales MS, 0.20 mg.L-1 de TDZ,
vitaminas Heinz y Mee (1969), 0.05 mg.L-1 de AIA y 2.0 % sacarosa.
Con una combinacin de TDZ y AIA se puede inducir la formacin de callos nodulares, lo
cual ha sido observado en diferentes trabajos de especies Phaseolus (Zambre et al., 1998;
Dillen et al., 2000; Zambre et al., 2001).
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos y que con la concentracin 0.20 mg.L-1 de TDZ
no hubo diferencias altamente significativa con respecto la mxima concentracin evaluada
(0.50 mg.L-1), alcanzndose entre un 87.50 - 92.86 % de explantes con formacin de callo, se
seleccion la misma para su empleo en los siguientes experimentos.
4.3 Efecto del tipo y grado de desarrollo del explante en la formacin de callos en
En este experimento, se observ en el indicador porcentaje de explantes con formacin de
callo que los explantes obtenidos a partir de secciones cotiledonales maduras alcanzaron un
87.5 % de los explantes con formacin de callo, difiriendo significativamente de los explantes
secciones cotiledonales inmaduras, brote apical de embriones cigticos germinados y embrin
- 38 -
cigtico inmaduro, donde se alcanz un 100 % de explantes con formacin de callo (Tabla 4).
Adems solo so obtuvo la formacin de estructuras embriognicas en callos provenientes del
brote apical. Esto indica que la interaccin de los reguladores del crecimiento con los tejidos
inmaduros, donde se encuentran clulas meristemticas en continua divisin y con capacidad
para desdiferenciarse, pueden formar callo con mayor facilidad que los tejidos maduros.
Tabla 4. Efecto del tipo y estado de desarrollo embrionario de los explantes en el porcentaje de
formacin de callos en P. acutifolius cv. TB1.
Tipo de explantes Porcentaje de formacin (%)
Callos Callos con estructuras embriognicas
Seccin cotiledonal madura 87.5 b -
Seccin cotiledonal inmadura 100 a -
Brote apical de embrin cigtico 100 a 7.14
Embrin cigtico inmaduro 100 a -
Medias con letras no comunes difieren significativamente por proporcin binomial (p<0.05).
En cuanto al nivel de formacin de los callos en el explante se observ que los explantes
obtenido a partir de brote apical de embriones cigticos germinados y el embrin cigtico
inmaduro se alcanzaron los mayores niveles de crecimiento seguido de las secciones
cotiledonales inmaduras y finalmente de la seccin cotiledonal madura (Tabla 5). Lo cual
reafirma que los explantes de tejidos jvenes tienen la capacidad de formar callo ms
fcilmente que los tejidos maduros y a su vez con mayor nivel de crecimiento.
Tabla 5. Influencia del tipo y estado de desarrollo del explante, en el nivel de formacin de
callo en P. acutifolius cv. TB1.
Nivel de formacin de los callos

Tipo de explantes
Media Media rango
Seccin cotiledonal madura 3.00 31.00 b
Seccin cotiledonal inmadura 3.07 34.54 b
Brote apical de embriones cigticos germinados 3.50 55.75 a
Embrionario cigtico inmaduro 3.75 68.13 a
Medias con letras no comunes difieren significativamente por Kruskal-Wallis (p<0.05).
- 39 -
Diferentes partes de la planta pueden responder de maneras distintas e incluso en un tejido de
una misma especie, los cambios durante el desarrollo del mismo se acompaan de un cambio
no slo en la concentracin del regulador del crecimiento sino en la sensibilidad tisular a estos
compuestos (Jimnez, 2001).
En cuanto a la coloracin de los callos se observ a las cuatro semanas en los callos formados
a partir de brote apical de embriones cigticos germinados y los embriones cigticos
germinados una coloracin parda-amarillenta, mientras que los formados de secciones
cotiledonales mantuvieron una coloracin que vari entre blanco y pardo.
Gran parte del xito del cultivo de tejidos depende de la edad del explante, donde muchas
veces la edad de la planta y el grado de diferenciacin del tejido estn interrelacionados y
pueden producir efectos interactivos cuando se cultiva in vitro (Chau, 1999).
Explantes con diferentes grados de desarrollo embrionario han sido empleados en especies de
frijol, utilizndose cotiledones y embriones cigticos inmaduros de P. coccineus (Angelini y
Allavena, 1989); embriones cigticos inmaduros en P. acutifolius (Mohamed et al., 1992 b) y
explantes cotiledones y embriones cigticos maduros de P. vulgaris (Zambre et al., 1998;
Eissa et al., 2002).
Segn Lizt y Jarret (1993), todos los tejidos vegetales pueden formar callos bajo determinadas
condiciones pero en pocos se logra la formacin de callos con estructuras embriognicos.
Merkle et al. (1995) refieren que secciones de callos embriognicos competentes o
incompetentes son producidos en el mismo explante, indicando que clulas genticamente
idnticas responden de forma diferente a un estimulo particular.
- 40 -
La formacin de callos tambin va a estar influenciado, por el efecto de las concentraciones de
los reguladores del crecimiento o de su estabilidad en el medio de cultivo, el tejido del
explante y la sensibilidad del tejido, de aqu que clulas de ciertos tejidos pueden no reconocer
el efecto de los reguladores del crecimiento (Jimnez, 2001).
Segn Castillo y Smith (1997) el factor ms importante de la embriognesis somtica es el
estado de desarrollo del explante. En varias especies de plantas, los tejidos inmaduros son los
que generalmente se emplean en los trabajos de cultivo de tejido por ser estos ms activos
morfolgicamente que los tejidos maduros (Tisserat, 1991).
En este experimento se concluye con la seleccin del explante brote apical de los embriones
cigticos germinados para su empleo en los siguientes experimentos. Teniendo en cuenta, que
los resultados alcanzados concuerdan con los obtenidos por Dillen et al. (1996); Zambre et al.
(1998) y Eissa et al. (2002), donde los explantes con tejidos meristemticos como los brotes
apicales de embriones cigticos germinados, fueron capaces de inducir la formacin de callos
y se evidenciaron pequeos puntos de estructuras embriognicas en las yemas axilares,
adems de estar ampliamente documentado su efectividad en numerosos trabajos de especies
Phaseolus, por su alta respuesta en el cultivo in vitro, demostrndose que la embriognesis
somtica ocurre ms fcilmente en aquellos tejidos que en s son ms embriognicos o
juveniles que los tejidos maduros, donde intervienen grupos completos de clulas para formar
un meristemo nuevo.
4.4 Estudio del AIA en la induccin de los embriones somticos en P. acutifolius cv. TB1
En los tratamientos de explante brote apical de embriones cigticos germinados, la formacin
de grupos de embriones somticos de coloracin amarillenta en todos los tratamientos que
- 41 -
contenan AIA, formadas en las yemas axilares (68.75 %) y en el hipoctilo (31.25 %),
durante la tercera y cuarta semanas de cultivo (Figura 7), lo cual esta dado por la presencia en
estas zonas de clulas meristemticas indiferenciadas en constante divisin celular.
Estos resultados tambin se relacionan con los descritos por Malik y Saxena (1992 b), Dillen
et al. (1996) y Zambre et al. (1998) quienes demostraron que los tejidos jvenes como los
meristemos apicales y/o axilares y los tejidos de semillas inmaduras o brotes apicales de los
embriones cigticos germinados, retienen la totipotencia celular e inducen la formacin de
embriognesis somtica.
Quintana (1995), observ la formacin de grupos de clulas embriognicas en callos de Vigna
luteola SC-123 provenientes de tratamientos con AIA y ANA.
Segn, Toonen y De Vries (1996), un nmero muy limitado de clulas en cualquier tipo de
explante responden para alcanzar un estado embriognico.
0.30 mg.L-1 1.00 mg.L-1

(a) (b)
Figura 7. Grupos de embriones somticos en la zona del hipoctilo (a) y yemas axilares (b)
de P. acutifolius cv. TB1 en la cuarta semana de cultivo en medio de cultivo compuesto por
las sales MS, vitaminas Heinz y Mee (1969), 2.0 % sacarosa, AIA (0.30 mg.L-1 y 1.00 mg.L-1)
y 0.20 mg.L-1 de TDZ.
En estos tejidos, las clulas estaban determinadas para el desarrollo embrionario, necesitando
de condiciones permisivas para su expresin, o que se indujera la capacidad embriognica del
explante por la exposicin del mismo a reguladores del crecimiento como el AIA. Esta
- 42 -
capacidad del tejido de formar embriones somticos fue definida por Parrott, (2002) como
competencia embriognica del tejido, la cual es mantenida mientras el explante este
expuesto a suficiente auxina, permitiendo de esta forma su crecimiento hasta llegar a formar
las masas pro-embriognicas, donde embriones nuevos se forman a partir del embrin original.
La Figura 8 muestra el porcentaje de formacin de estructuras embriognicas de forma
proporcional a las concentraciones de AIA evaluadas, demostrndose el papel de este
regulador del crecimiento en la induccin de la embriognesis somtica en esta especie. En la
misma, se aprecia que los mejores resultados se obtuvieron en los tratamientos cinco y seis a
concentraciones de 3.0 mg.L-1 y 5.0 mg.L-1 respectivamente de AIA, logrndose un 20.0 % de
formacin de masas embriognicas. Todos los tratamientos con AIA, fueron superiores al
control, excepto a concentracin de 0.05 mg.L-1 de AIA.
Tambin se observ una ligera disminucin en el porcentaje de grupos de embriones
somticos formadas en la concentracin de 7.0 mg.L-1 de AIA, lo cual pudo estar influenciado
segn Nomura y Komamine (1995), por una estrecha relacin entre el nivel endgeno de
auxinas y la polaridad de las masas embriognicas.
En este caso el balance endgeno de las auxinas y citoquininas puede ser alterado o destruido,
por las auxinas aadidas exgenamente al medio de cultivo, las cuales aun, a un nivel por
debajo del umbral que permite la histodiferenciacin, pueden cancelar la polaridad al
difundirse dentro de las masas embriognicas. Con esto se provoca la inhibicin del proceso
iniciado por las auxinas endgenas, impidindose de esta forma la adquisicin de simetra
bilateral y el desarrollo del meristemo apical (Parrott, 2002).
- 43 -
22 a a
Porcentaje de formacin de
20
embriones somticos (%) 18 b b
16
14 c
12
10
8 d
6
4
2 e e
0
0,00 0,05 0,20 0,50 1,00 3,00 5,00 7,00
-1
Concentraciones AIA (mg.L )
Medias con letras no comunes difieren significativamente por la prueba de proporcin binomial para
(p < 0,05).
Figura 8. Influencia del AIA en la formacin de masas embriognicas en el explantes brote de

semillas germinadas in vitro en P. acutifolius cv. TB1 a las cuatro semanas de cultivo.
Picciarelli et al. (2005) estudiaron el contenido de auxinas endgenas y la embriognesis
somtica en semillas de P. coccineus, obtuvieron diferentes concentraciones de AIA libre en
diferentes partes de las semillas, encontrndose las mayores concentraciones en embriones
somticos en etapa corazn. Concerniente al porcentaje de AIA libre, obtuvieron en los
embriones entre un 26.0 a 28.0 % de AIA libre en las primeras dos etapas de desarrollo
llegando a un 44.0 % en la etapa cotiledonal. Mientras que en cultivos en suspensin, el
porcentaje de AIA libre es mucho mayor (90.0 %) en todas las etapas de desarrollo, por ello,
se planteaba la idea de que los diferentes niveles de auxinas entre embriones somticos y
- 44 -
suspensiones celulares pueden jugar un importante rol en el establecimiento de la polaridad de
los embriones.
Comparando los pocos resultados obtenidos en diferentes cultivos sobre el efecto de los
niveles de reguladores del crecimiento endgenos en el cultivo de tejidos embriognicos y no
embriognicos, se concluye, que los niveles endgenos de AIA libre es la caracterstica
distintiva de las lneas de callos competentes embriognicamente, como fue observado en
Triticum aestivum y Zea mays (Jimnez y Bangerth, 2001 a, b). En estos trabajos no se
encontraron coincidencia entre los bajos niveles de AIA libre y los altos niveles de
citoquininas en los callos con estructuras embriognicas y no embriognicas de estas tres
especies.
Un aspecto interesante observado fue la ocurrencia simultnea de formaciones embriognicas
y organognicas en algunos de los explantes utilizados con 0.50 mg.L-1 de AIA. Lo cual
concuerda con resultados similares anteriormente descritos en P. coccineus por Malik y
Saxena (1992 a), Angelini y Allavena (1989) en medio de cultivo MS, suplementado con
ANA. Tambin Van Harten et al. (2004), observaron similares resultados en explantes
cotiledones maduros de frijol alado (Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC) en medio de
cultivo MS suplementado con 2.50 mg.L-1 de 6-BAP despus de cuatro semanas de cultivo.
De lo resultados obtenidos se deduce la importancia del AIA en la induccin de embriones
somticos con respecto al control, resultando las mejores concentraciones de 3.0 y 5.0 mg.L-1
respectivamente entre las estudiadas, para el explante brote de semillas germinadas in vitro en
la especie P. acutifolius cv. TB1.
- 45 -
somticos en Phaseolus acutifolius cv. TB1
En este experimento se evidenci durante la primera semana posterior al establecimiento en
medio de cultivo de germinacin en ambas condiciones de iluminacin, que los embriones
somticos se tornaron de color blanco-amarillento a verde e iniciaron el proceso de
germinacin (Figura 9).
Figura 9. Color de los embriones somticos de P. acutifolius cv. TB1 en el explante brote
apical de embriones cigticos germinados, durante la germinacin en condiciones de luz
artificial.
Segn Vzquez y Torres (1995), a pesar de que la luz inhibe la elongacin y la divisin celular
de los tejidos, lo cual se le atribuye a la oxidacin parcial de las auxinas, en condiciones de
iluminacin se acelera el desarrollo de los primordios foliares.
Durante el cultivo en medio de cultivo de germinacin, se observ en ambas condiciones de
iluminacin un 100 % de germinacin de los embriones somticos con desarrollo de los brotes
(germinacin parcial) o brotes y raz (germinacin completa).
Adems, se observ un 96.67 % de formacin de plantas hiperhdricas en condiciones de luz
artificial y 100 % en condiciones de luz solar (Figura 10), lo que le confiri una consistencia
- 46 -
coricea y coloracin brillosa a los mismos, causado por el desarrollo de clulas rgidas y
gruesas en la pared celular de los tejidos.
Figura 10. Germinacin completa de los embriones somticos de P. acutifolius cv. TB1 con
presencia de hiperhidricidad en a las tres semanas de cultivo en condiciones de luz artificial.
Esta alteracin morfofisiolgica, producida por el cultivo in vitro es el resultado de varias
alteraciones en determinadas rutas metablicas, lo cual pudo estar influenciado por diferentes
factores, tales como: elevadas concentraciones de los reguladores del crecimiento que causan
un efecto subtxico global, baja intensidad luminosa, humedad relativa y del potencial hdrico
del medio de cultivo durante la incubacin.
Ziv y Ariel (1994), refieren que los procesos fotosintticos, transpiracin, intercambio de CO2
y oxgeno, son afectados por la hiperhidricidad, al mismo tiempo, este fenmeno se estimula
con el incremento de las concentraciones de citoquininas en el medio de cultivo.
De Carvalho et al. (2000) utilizando TDZ en la regeneracin in vitro de plantas de P. vulgaris,
va organognesis directa, observaron efectos inhibitorios en el desarrollo de brotes y
enraizamiento de los explantes sometidos a exposiciones prolongadas en altas concentraciones
durante cuatro semanas, teniendo buenos resultados en el enraizamiento en presencia de ANA
y AgNO3.
- 47 -
Tambin, Khalafalla et al. (2000) emplearon el AgNO3 en el enraizamiento de brotes de frijol
regenerados va organognesis en presencia de TDZ, aumentando la tasa de crecimiento y el
nmero de races formadas, mejorando as los protocolos que utilizan TDZ y presentan
inhibicin del enraizamiento.
La fuente de iluminacin influy notablemente en la germinacin de los embriones somticos,
obtenindose altos porcentajes de germinacin (Tabla 6). Los resultados obtenidos demuestran
un incremento en la germinacin completa de embriones somticos favorable a la luz solar.
Segn Gmez (1998), desde el punto de vista del desarrollo in vitro se ha demostrado las
ventajas que presenta la luz solar sobre la luz artificial, influenciado por la calidad espectral,
las fluctuaciones de luz y temperatura a las cuales estn adaptados los cultivos que estimulan
su desarrollo in vitro, siendo adems ventajoso desde el punto de vista econmico.
Tabla 6. Efecto del tipo de iluminacin en la germinacin de los embriones somticos de

Phaseolus acutifolius cv. TB1.
Fuente de Nmero de embriones Porcentaje de germinacin (%)
iluminacin G. completa G. parcial G. completa G. parcial
Luz natural 16.00 a 34.0 32.0 68.0
Luz artificial 7.00 b 43.0 14.0 86.0
EE 0.45
Medias con letras no comunes en una misma columna difieren significativamente por la prueba de
Tukey (p < 0,05).
Dentro de los embriones germinados completamente se observ una marcada influencia de las
condiciones de iluminacin, lo cual tambin pudo estar influido por otros factores tales como
la temperatura, las concentraciones de CO2, etileno, entre otros factores.
Bajo condiciones de luz solar, se observ una mayor elongacin de los entrenudos con
respecto a las plantas desarrolladas en condiciones de luz artificial (Tabla 7).
- 48 -
Tabla 7. Caractersticas de los brotes con germinacin completa de P. acutifolius en ambas

fuentes de iluminacin.
Fuente de Total Nmero promedio de Altura
iluminacin hojas por brote (cm)
Luz solar 16.00 7.00 6.75 a
Luz artificial 7.00 3.00 4.10 b
EE 0.25
Medias con letras no comunes en una misma columna difieren significativamente por la prueba de
Tukey para (p < 0,05).
Vzquez y Torres (1995), plantean que cuando un lado de una planta es iluminado, las clulas
del lado oscuro se alargan ms que las del lado iluminado, provocando que la planta se incline
hacia la fuente de iluminacin. Lo cual se sustenta, en que la concentracin de AIA disminuye
en la zona iluminada ya sea por transporte lateral o por disminucin de la concentracin a
causa de la fotoinactivacin que ocurre al producirse una oxidacin de la flavoprotena en
presencia de la luz. Esto origina la oxidacin e inactivacin del AIA por efecto de la radiacin
ionizante y por destruccin del sistema enzimtico que convierte al triptfano en AIA.
En la Figura 11 se evidenciaron las caractersticas de las plantas observadas en ambas
condiciones de iluminacin, demostrndose un marcado efecto a favor de la luz solar.
Luz solar Luz artificial
Figura 11. Influencia de las condiciones de iluminacin en el crecimiento y desarrollo de las

plantas de P. acutifolius cv. TB1 con germinacin completa.
- 49 -
La Figura 11 muestra un mayor crecimiento en el sistema radicular de las plantas obtenidas en
condiciones de luz solar, donde se alcanz un crecimiento promedio de 3.40 cm de longitud;
mientras que bajo condiciones de luz artificial el crecimiento promedio del sistema radical de
los brotes fue de 1.98 cm.
Vzquez y Torres (1995), plantean que las races son mucho ms sensibles a la aplicacin de
auxina que las yemas y los tallos, por ello, es posible obtener una estimulacin de
alargamiento de la raz con el empleo de bajas concentraciones de AIA. Tambin, es conocido
que la aplicacin de AG3 y Zeatina, produce incrementos del contenido auxnico y actan de
forma sinrgica en la induccin de alargamiento celular.
De los resultados obtenidos en este experimento se deduce, que la luz solar produjo una mejor
respuesta en cuanto a la germinacin de los embriones somticos y desarrollo de las plantas
formadas con respecto a las obtenidas bajo condiciones de luz artificial, dado por la calidad
espectral de la misma.
Los resultados alcanzados en este trabajo, constituyen en el caso particular de Cuba, la primera
evidencia sobre embriognesis somtica en especies del gnero Phaseolus, especficamente en
P. acutifolius, logrndose la formacin y germinacin completa de los embriones somticos en
medio de cultivo semislido. A nivel internacional, pocos trabajos hacen referencia a la
embriognesis somtica en especies Phaseolus siendo especficos a determinados genotipos
como es el Phaseolus coccineus.
- 50 -
CONCLUSIONES
Conclusiones
CONCLUSIONES
De acuerdo a los objetivos trazados para la realizacin de este trabajo y luego de la obtencin
de los resultados discutidos anteriormente, se arriban a las siguientes conclusiones:
1. Fue posible lograr la regeneracin de plantas va embriognesis somtica en la especie
Phaseolus acutifolius cv. TB1.
2. Con la utilizacin del TDZ en los medio de cultivo a concentracin de 0.20 y 0.50 mg.L-1,
se alcanz entre 87.50 92.86 % de explantes secciones cotiledonales con formacin de
callos.
3. Los brotes apicales de los embriones cigticos germinados mostraron la mayor capacidad
para la embriognesis somtica en la especie P. acutifolius cv. TB1.
4. El empleo del AIA en los medios de cultivo, indujo el proceso de la embriognesis
somtica en todas las concentraciones evaluadas, logrndose un 20.00 % de formacin a
concentraciones de 3.00 y 5.00 mg.L-1.
5. La luz solar result ser la ms favorable para la germinacin y desarrollo de las plantas
regeneradas obtenindose un 14.00 % de germinacin completa de los embriones
somticos.
- 51 -
RECOMENDACIONES
Recomendaciones
RECOMENDACIONES
Extender los resultados de este estudio a otras especies de Phaseolus, de inters para el
mejoramiento gentico, fundamentalmente el Phaseolus vulgaris L.
Establecer la embriognesis somtica en medios de cultivo lquidos.
Estudiar diferentes concentraciones de ABA para lograr una ptima maduracin de los
embriones somticos.
Estudiar el efecto de los reguladores del crecimiento y otras sustancias como el AgNO3
en los medios de cultivo para la germinacin de los embriones somticos con vista a
disminuir la hiperhidricidad y aumentar los porcentajes de germinacin.
- 52 -
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INSTITUTO DE BIOTECNOLOGA DE LAS PLANTAS

TESIS EN OPCIN AL TTULO ACADMICO DE

MAGISTER SCIENTIAE EN BIOTECNOLOGA VEGETAL

EMBRIOGNESIS SOMTICA EN FRIJOL TEPARI

(Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1).

ASPIRANTE: Ing. Jorge Liusvert Prez Prez.

TUTOR (A): DrC. Lourdes Garca Rodrguez.

Santa Clara, CUBA

conocimiento de las verdades.

A mi familia, en especial a mis padres y hermanas.

cuales sera prcticamente imposible alcanzar la meta propuesta.

por su apoyo incondicional.

Agradezco, al colectivo de trabajadores del Instituto de Biotecnologa de las Plantas de Santa

Clara, la posibilidad que me dieron de formarme junto a ellos en el campo de la investigacin,

en especial a la DrC. Lourdes Garca Rodrguez y dems compaeros del Laboratorio de

Mejoramiento Gentico, a los cuales estar eternamente agradecido.

Tambin, agradezco al colectivo de trabajadores de la Facultad de Ciencias Agrcolas de la

Universidad de Granma y en especial a mis colegas del Centro de Estudios de Biotecnologa

Vegetal y Medio Ambiente, por la confianza que tuvieron en m.

no hubiera sido posible cumplir la meta trazada.

A todos, muchas gracias!.

regeneracin in vitro, no existiendo en la actualidad una metodologa de regeneracin va

embriognesis somtica eficiente y reproducible. Esta investigacin se desarroll en el

Instituto de Biotecnologa de las Plantas de la Universidad Central Marta Abreu de Las

Villas con el objetivo de lograr la regeneracin de plantas de Phaseolus acutifolius a partir de

la embriognesis somtica con miras a utilizar dicho procedimiento en el mejoramiento

explantes secciones cotiledonales con formacin de callos, en un medio de cultivo compuesto

germinados mostraron la mayor capacidad para la formacin de embriones somticos (20 %)

de las plantas in vitro alcanzndose un 14 % de embriones somticos con germinacin

primera vez evidencias de embriognesis somtica y regeneracin in vitro de embriones

somticos en la especie Phaseolus acutifolius A. Gray cv. TB1.

II. REVISIN BIBLIOGRFICA -------------------------------------------------------------------- 4

2.1 Generalidades del cultivo -------------------------------------------------------------------------- 4

2.1.1 Ubicacin filogentica del cultivo -------------------------------------------------------------- 4

2.1.2 Caractersticas botnicas ------------------------------------------------------------------------- 5

2.1.3 Contenido nutricional ----------------------------------------------------------------------------- 6

2.2 Cultivo de tejido y regeneracin in vitro de plantas -------------------------------------------- 7

2.2.1 Regeneracin de plantas va organognesis en el gnero Phaseolus ----------------------- 8

2.2.2 Embriognesis somtica -------------------------------------------------------------------------- 9

2.2.2.1 Embriognesis somtica en leguminosas --------------------------------------------------- 11

2.3 Etapas para la regeneracin de plantas va embriognesis somtica ------------------------ 12

2.3.1 Induccin de los embriones somticos -------------------------------------------------------- 12

2.3.2 Desarrollo y proliferacin de los embriones somticos ------------------------------------- 13

2.3.3 Maduracin de los embriones somticos ----------------------------------------------------- 14

2.3.4 Germinacin y conversin de los embriones somticos ------------------------------------ 15

2.4 Factores que influyen en la embriognesis somtica ----------------------------------------- 16

2.4.1 Composicin del medio de cultivo ----------------------------------------------------------- 16

2.4.2 Condiciones fsicas seleccionadas para realizar el cultivo --------------------------------- 19

2.4.3 El tipo y estado fisiolgico del explante ------------------------------------------------------ 20

2.4.4 Genotipo ------------------------------------------------------------------------------------------ 21

2.5 Mejoramiento gentico ---------------------------------------------------------------------------- 22

III. MATERIALES Y MTODOS ------------------------------------------------------------------ 23

3.5 Efecto de intensidad y duracin del fotoperiodo en la germinacin de los embriones

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN ---------------------------------------------------------------- 30

4.1 Efecto del 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D) y del tipo de explante en la formacin de

4.5 Efecto de intensidad y duracin del fotoperiodo en la germinacin de los embriones

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS -------------------------------------------------------------- 53

ABREVIATURAS EMPLEADAS EN EL TEXTO

FAO Food and Agricultura Organization

AIA cido indol-3-actico

ANA cido naftalenactico

NaClO Hipoclorito de sodio

NaOH Hidrxido de sodio