Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
y determinacin de la
incertidumbre de la medicin:
Boris Duffau
Fabiola Rojas
Isabel Guerrero
Luis Roa
Luis Rodrguez
Marcelo Soto
Marisol Aguilera
Soraya Sandoval
Coordinacin Edicin
Soraya Sandoval
Seccin Metrologa Ambiental y de Alimentos
Departamento de Salud Ambiental
Edicin
Ao 2010
GUA TCNICA N 1 1
I: INTRODUCCION
La presente gua tiene como objetivo, entregar recomendaciones a los laboratorios para realizar
la validacin de los mtodos analticos e introducir a estos en el concepto de incertidumbre de
la medicin.
GUA TCNICA N 1 2
CONTENIDO
I: INTRODUCCION 2
II: TERMINOLOGA 4
IV: VALIDACION 21
SELECTIVIDAD 27
LINEALIDAD 28
SENSIBILIDAD 33
LIMITES 34
EXACTITUD 37
ROBUSTEZ 45
APLICABILIDAD 49
V: INCERTIDUMBRE 50
VI: ANEXOS 54
VII: BIBLIOGRAFA 66
GUA TCNICA N 1 3
II: TERMINOLOGA:
Adecuacin al propsito: Es el grado en que la aplicabilidad de un mtodo se ajusta a los criterios o
requerimientos acordados entre el analista y el usuario final (cliente) que hace uso de los informes o
datos generados a travs de un mtodo de ensayo. Es decir es la adaptacin de un mtodo para un fin
previsto.
Analito: Sustancia (qumica, fsica o biolgica) buscada o determinada en una muestra, que debe ser
recuperada, detectada o cuantificada por el mtodo.
Aplicabilidad: Los analitos, matrices y concentraciones para los cuales puede utilizarse
satisfactoriamente un mtodo de anlisis con el fin de determinar su conformidad con una norma.
(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16 Ed.)
Blanco matriz: Matriz que no contiene el analito de inters u objetivo para el mtodo seleccionado.
Calibracin: Operacin que, en condiciones especificadas, establece primero una relacin entre los
valores con incertidumbres de medicin proporcionados por las normas de medicin y las indicaciones
correspondientes con las incertidumbres de medicin asociadas, y utiliza luego esta informacin para
establecer una relacin a fin de obtener un resultado de medicin a partir de una indicacin.
(Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Nota1 : La calibracin se puede expresar por medio de una declaracin, una funcin, un diagrama,
una curva o una tabla. En algunos casos puede consistir en una correccin aditiva o multiplicativa
de la indicacin con la incertidumbre de medicin asociada. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Nota 2: La calibracin no debe confundirse con el ajuste de un sistema de medicin que a menudo
se denomina errneamente autocalibracin, ni tampoco con la verificacin de la calibracin.
GUA TCNICA N 1 4
Ensayo: Operacin tcnica realizada de acuerdo a un procedimiento especifico, que consiste en la
determinacin cualitativa y/o cuantificacin de una o ms caractersticas (propiedades o analitos) en un
determinado producto, proceso o servicio.
Error aleatorio: Es aquel error inevitable que se produce por eventos nicos imposibles de controlar
durante el proceso de medicin. Se contrapone al concepto de error sistemtico. Las fuentes de los
errores aleatorios son difciles de identificar o sus efectos no pueden corregirse del todo. Son
numerosos y pequeos. Este error ocurre o esta dado por el azar. Ejemplo: Errores de apreciacin, tales
como el paralaje, que depende del observador y su capacidad en cuanto al lmite separador del ojo.
Error Sistemtico: Es aquel que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de
una magnitud. El error sistemtico esta condicionado por algn factor distinto al azar. Ejemplo: el error
de las masas patrn del laboratorio se transfiere sistemticamente al momento de calibrar la balanza.
El VIM, lo define como componente del error de medicin que al reiterar las mediciones se mantiene
constante o bien varia de manera predecible.
Idoneidad para el fin previsto: La medida en que los datos obtenidos en un proceso de medicin
permiten al usuario adoptar decisiones correctas, tanto desde el punto de vista tcnico como
administrativo, para alcanzar un fin establecido.
Incertidumbre: Parmetro asociado al resultado de una medicin que caracteriza la dispersin de los
valores que podran razonablemente ser atribuidos al mensurando.
Intervalo de trabajo: Es el intervalo entre el nivel ms bajo y ms alto de concentracin que ha sido
demostrado que puede ser determinado con la precisin y exactitud requeridas para una determinada
matriz.
Limite mximo permitido (LMP)): Nivel mximo o tolerancia establecida para un analito en una
reglamentacin.
Limite mximo Residual (LMR): Concentracin mxima de residuos de una sustancia (plaguicida o
medicamento) que se permite legalmente su uso en la superficie o parte interna de un producto
alimenticio.
Matriz: Es el tipo de sustancia compuesta (liquida, slida, gaseosa) que puede o no contener al analito
de inters, ejemplo: matriz de alimento, matriz ambiental, etc.
GUA TCNICA N 1 5
Material de Referencia Certificado (MRC): Material de referencia acompaado de documentacin,
emitida por un rgano autorizado, en la que se indican uno a ms valores de propiedades especificadas
as como la incertidumbre y rastreabilidad asociadas, con el uso de procedimientos vlidos. (Referencia:
VIM, JCGM 200:2008)
Nota: Material homogneo que tiene definidas sus propiedades, a travs de un mtodo validado
que puede usarse para fines analticas (calibracin de equipos, comprobacin de un mtodo, etc.).
Mtodo de ensayo validado: Mtodo de ensayo aceptado para el que se han llevado a cabo estudios
de validacin (desempeo) con el fin de determinar su precisin y fiabilidad para un propsito
especfico. (Referencia: ICCVAM Guidelines for the nomination and submission of new, revised and
alternative test methods, 2003).
Mtodo oficial: Es el mtodo especificado por los organismos reglamentarios de un pas, con fines de
aplicaciones de normas (ejemplo; reglamento sanitario de alimentos) o estipulados por organizaciones
comerciales (Referencia: FAO).
Mtodo normalizado: Mtodo apropiado para el ensayo dentro de su alcance, publicado por
organismos de normalizacin internacional, nacional o regional (ISO, EN, NM, ASTM, BS, DIN, IRAM,
etc.) o por organizaciones reconocidas en diferentes mbitos ( AOAC, FIL-IDF, EPA, USP etc.)
Mtodo cualitativo: Mtodo que permite determinar la presencia o ausencia de un analito en una
muestra o matriz.
Mtodo cuantitativo: Mtodo que permite determinar la concentracin de un analito presente en una
muestra o matriz.
Plan de Validacin: Documento tipo protocolo en el cual se definen las pruebas o parmetros de
validacin necesarios y el diseo experimental a desarrollar en base a los requerimientos del mtodo.
Requerimiento del mtodo: Corresponde a aquellas caractersticas del mtodos que son esenciales
para poder aplicarlo para el fin previsto. Cuando no estn establecidas por el cliente o usuario, debe
definirlas el responsable del ensayo de manera confiable y cientfica.
GUA TCNICA N 1 6
Resolucin: Parmetro cromatogrfico que permite determinar la capacidad de separacin entre 2
picos, de manera que se puedan diferenciar adecuadamente de la cromatografa los analitos de inters.
Resultado de un ensayo (X): El valor final notificado de una cantidad medida o calculada, tras aplicar un
procedimiento de medicin, incluidos todos los procedimientos secundarios y las evaluaciones.
(Referencia: Manual Codex Alimentarius 16 Ed.)
Testigo reactivo o blanco: Es la solucin que contiene todos los reactivos usados en los mismos
volmenes y concentraciones, que son utilizados en el procesamiento de la muestra. Este blanco debe
seguir todos los pasos indicados en la tcnica y ayuda a detectar trazas de contaminacin provenientes
del material o reactivos usados.
Valor verdadero: El grado de concordancia entre la media de un nmero infinito de valores reiterados
de cantidad y un valor de cantidad de referencia.
Valor de Referencia: Valor cuantitativo que se utiliza como base para la comparacin con valores
cuantitativos del mismo tipo. (Referencia: VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms in
Metrology: 2007)
Verificacin: Suministro de prueba(s) objetiva(s) de que un elemento dado satisface el (los) requisito(s)
especificado(s) . (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
Es decir, es la comprobacin experimental de que un mtodo establecido funciona de acuerdo con
las especificaciones, en las condiciones disponibles en el laboratorio usuario. Se entiende como
verificacin a las pruebas realizadas por un laboratorio en la rutina de trabajo que permiten
comprobar y documentar la aplicabilidad y uso adecuado del mtodo por parte del laboratorio.
GUA TCNICA N 1 7
II: ESTADISTICA BASICA
Para los fines de una validacin, se utilizan normalmente ciertas mediciones estadsticas, que nos
ayudan a establecer si el mtodo se encuentra dentro de un parmetro aceptable, normalmente se
determinan las siguientes:
Media: Conocida tambin como media aritmtica o promedio, es la cantidad total de la variable
(muestra o medida) distribuida a partes iguales entre cada observacin. En trminos matemticos, es
igual a la suma de todos sus valores dividida entre el nmero de sumandos
X = n xi
n
Siendo:
xi = valor de una lectura.
n = nmero de lecturas
S= n
i=1 (xi-X)2
n-1
Siendo:
xi = valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas
Coeficiente de Variacin (CV): Desviacin estndar dividida por la media. Tambin es conocida como
desviacin estndar relativa (RSD). El coeficiente de variacin puede ser expresado en porcentaje:
%CV = S x100
X
Siendo:
S = desviacin estndar de las lecturas.
X = promedio de la totalidad de lecturas.
S2 = n i=1 (xi-X)2
n-1
Siendo:
xi = valor de una lectura.
X= promedio de la totalidad de lecturas.
n = nmero de lecturas
GUA TCNICA N 1 8
Coeficiente de Variacin de Horwitz (CV h): Es el coeficiente de variacin definido por W. Horwitz, a
travs de la ecuacin obtenida de un estudio estadstico. En dicho estudio, Horwitz despus de reunir
una serie de datos (provenientes de 150 ensayos de interlaboratorios organizados por AOAC), observ
que el coeficiente de variacin de los valores medios dados por los diferentes laboratorios aumentaban
a medida que disminua la concentracin del analito. Comportndose como muestra la siguiente
grfica, conocida como la trompeta de Horwitz.
Este coeficiente de variacin (CVh) esta expresado en potencia de 2, y la concentracin media del
analito expresado como potencia de 10, de esta forma independiente del analito y el mtodo utilizado
se puede estimar el CV esperado para la precisin.
Tabla N 1:
Concentracin Razn Unidad
(Potencia de 10)
100 1 100% (100 g/100 g)
-1
> 10 10 > 10 % (10 g/100 g)
-2
>1 10 > 1 % (1 g/100g)
-3
> 0,1 10 > 0,1 % (1 mg/g 0,1 g/100 g)
-4
0,01 10 100 mg/kg
-5
0,001 10 10 mg/Kg
-6
0,0001 10 1 mg/Kg
-7
0,00001 10 100 g/Kg
-8
0,000001 10 10 g/Kg
0,0000001 10-9 1 g/Kg
GUA TCNICA N 1 9
Distribucin Normal: Distribucin continua conocida tambin como distribucin Gaussiana, la
distribucin de una variable normal est completamente determinada por dos parmetros, su media y
su desviacin estndar, denotadas generalmente por y . La distribucin normal se caracteriza por
tener una nica moda, que coincide con su media y su mediana. Su expresin grafica es una curva
normal, cuya forma es similar a los histogramas con forma de campana, es conocida como campana de
gauss que es simtrica respecto a su media y asinttica al eje de abscisas, esto hace que cualquier valor
entre y es tericamente posible. El rea total bajo la curva es, por tanto, igual a 1. Para este
tipo de variables existe una probabilidad de un 50% de observar un dato mayor que la media, y un 50%
de observar un dato menor.
- 3
- 2
-
+
+2
+3
Nivel de significancia (Alfa, ): Es el nivel de significacin utilizado para calcular el nivel de confianza. El
nivel de confianza es igual a 100% (1 - ), es decir, un alfa () de 0,05 indica un nivel de confianza de
95%.
Factor de cobertura: Nmero mayor que uno por lo que una combinacin de incertidumbre en la
medicin estndar se multiplica a obtener una incertidumbre expandida de medida. Un factor de
cobertura suele ser simbolizada k. (Referencia: VIM, JCGM 200:2008)
GUA TCNICA N 1 10
Pruebas de Significancia
Es frecuente utilizar pruebas de significancia estadsticas durante el proceso de validacin de los mtodos
analticos en este sentido, se aplican comnmente las siguientes:
Al hacer una prueba de significancia se comprueba la veracidad de una hiptesis experimental, llamada
hiptesis alternativa (H1, si hay diferencia,) con respecto a la hiptesis nula (H0, no hay diferencia).
1. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media no es igual al valor dado (H1: x0) dos-colas
2. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media es menor que el valor dado (H1: < x0) una-cola
3. La media es igual al valor dado (H0: = x0) versus la media es mayor que el valor dado (H1: > x0) una-cola
t-Test
1. Son las medias iguales? Dos-colas
2. Son las medias diferentes (puede una media ser mayor o menor a la otra)? Una-cola
F-Test
1. Son las varianzas diferentes? Dos-colas
2. Es la varianza 1 mayor que la varianza 2? Una-cola
GUA TCNICA N 1 11
Prueba t-Student
Esta prueba permite comparar las medias de dos grupo de datos y determinar si entre estos parmetros
las diferencias son estadsticamente significativas.
El siguiente ejemplo, trata de explicar la afirmacin realizada anteriormente: Un atleta desea realizar un
salto con garrocha, para lo cual, l realiza un calculo de con que velocidad y con que fuerza (t calculado)
debe realizar la prueba de atletismo, a fin de saltar correctamente la altura establecida para la
competencia (t critico).
Si el t calculado es inferior al t crtico, entonces, no existir una diferencias significativa que permita
superar al t critico, y el atleta no podr realizar el salto.
GUA TCNICA N 1 12
Si el valor t calculado es superior al t crtico, entonces, existir una diferencia significativa que
permitir superar al t crtico, y el atleta podr realizar el salto.
Para explicar de mejor manera la prueba de t-Student, hemos incluido los siguientes ejemplos:
Se realiza el anlisis de una muestra de flor en agua bajo el mtodo de cromatografa inica en
Laboratorio 1 y por EIS en Laboratorio 2. Los resultados obtenidos en mg/L de F- , fueron:
Nivel Grupo/Experiencia
Observaciones 1 2
1 4,5 5,3
2 5,2 6,8
3 5,0 6,9
4 6,4 7,1
5 6,0 7,7
6 7,1 ---
Experiencia 1: n1=6 Media X1=5,70 Desviacin estndar S1= 0,9716 grados de libertad gl1= 5
Experiencia 2: n2=5 Media X2= 6,76 Desviacin estndar S2 = 0,8877 grados de libertad gl2= 4
t calc = X1 - X2 .
S1 2 (n1-1) + S2 2 (n2-1) . 1 + 1
n1+ n2-2 n1 n2
GUA TCNICA N 1 13
t calc = 5,70 - 6,76 .
t calc = -1,06 .
Se desea determinar si son iguales las medias de la experiencia 1 y 2. Para esto se procede luego a
determinar el t critico en la tabla t-student para =0,05.
Se observa. t calc >t crit .Concluimos que existen diferencias significativas. Por lo cual el resultado se
acepta.
GUA TCNICA N 1 14
EJEMPLO 2: Prueba t-student para 2 variables correlacionadas o pareadas
Nivel Grupo/Experiencia x
Observaciones A B
1 4 3 1
2 5 2 3
3 6 1 5
4 6 2 4
5 4 3 1
X = ( xA xB) t calc = X .
n (S/n)
Se procede a comparar el t crtico y el t calculado, t calc= 3,48. Se observa que t calc > t crit. Concluimos que
existen diferencias significativas. Por lo cual no es aceptable.
GUA TCNICA N 1 15
EJEMPLO 3: Prueba t-student para comparacin de muestreal versus un valor de referencia
Experiencia :
t calc = X- .
(S/n)
Se observa que: t calc < t crit . Concluimos que no existen diferencias significativas. Por lo cual el
resultado se acepta.
GUA TCNICA N 1 16
Prueba F (de Fisher)
Prueba en la que el estadstico utilizado sigue una distribucin F si la hiptesis nula no puede ser
rechazada. En estadstica aplicada se prueban muchas hiptesis mediante el test F, entre ellas: La
hiptesis nula=Ho de que las medias de mltiples poblaciones normalmente distribuidas y con la misma
desviacin estndar son iguales. Esta es, quizs, la ms conocida de las hiptesis verificada mediante el
test F y el problema ms simple del anlisis de varianza. Y la hiptesis de que las desviaciones estndar de
dos poblaciones normalmente distribuidas son iguales.
Para explicar de mejor manera la prueba de Fischer, hemos incluido el siguiente ejemplo:
Nivel Grupo/Experiencia
Observaciones 1 2
1 C1,1 C2,1
2 C1,2 C2,2
3 C1,3 C2,3
4 C1,4 C2,4
5 C1,5 C2,5
6 C1,6 C2,6
7 C1,7 C2,7
8 C1,8 C2,8
9 C1,9 C2,9
10 C1,10 C2,10
11 -- C2,11
12 -- C2,12
13 -- C2,13
14 -- C2,14
Si se intenta un test de t-student con estos valores hay que verificar si las 2 varianzas no son
significativamente diferentes; por que si son diferentes, el test de t-student no podr ser utilizado. Que
se hace?
GUA TCNICA N 1 17
3) Dividir la varianza ms grande por la ms pequea:
4) Para saber si 2,079 indica que la varianza obtenida en la experiencia 2 es menor que la obtenida en la
experiencia 1, uno va a la Tabla F (Ver Anexo n 4) y coloca los grados de libertad (gl) del numerador (9)
en la fila horizontal, y del denominador (13) en la columna, para un valor de = 0,05, 1 cola:
gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316
2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474
3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232
4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880
5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246
6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901
7 5,59 4,74 4,35 4.12031 3.97152 3.86598 3.78705 3.72572 3.67667
8 5,32 4,46 4,07 3.83785 3.68750 3.58058 3.50046 3.43810 3.38812
9 5,12 4,26 4,07 3.63309 3.48166 3.37376 3.29274 3.22959 3.17890
10 4,96 4,10 3,86 3.47805 3.32584 3.21718 3.13547 3.07166 3.02038
11 4,84 3,98 3,71 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622
12 4,75 3,89 3,59 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638
13 4,67 3,81 3,49 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436
Concluimos que las dos varianzas no son significativamente diferentes. Por lo tanto, hacer el test de t
es una decisin legtima.
GUA TCNICA N 1 18
Anlisis de Varianza
El anlisis de varianza, tambin conocido como ANOVA, es el anlisis estadstico en el cual se compara
ms de dos medias entre s.
Para ese fin, se debe proceder a comparar las diferencias entre cada grupo y las observaciones
realizadas.
Ejemplo:
Experiencia n
n= Observaciones Mtodo A Mtodo B Mtodo C
1 8,5 9,9 7,4
2 9,2 10,0 8,0
3 7,8 11,1 8,6
SCB = ( xA)2 + ( xB)2 + ( xC)2 - ( x)2 = (25,5)2 + (31,0)2 + (24,0)2 (80,5)2 = 9,0553
nA nB nC N 3 3 3 9
GUA TCNICA N 1 19
Suma cuadrados residuales o dentro del grupo, es decir , dentro de los mtodos:
Resumiendo obtuvimos:
Origen de la Varianza Grados de libertad (gl) Sumas cuadrticas (SC) Cuadrados medios (CM)
Se determina el valor F crtico de Tabla F (Ver Anexo n 4) y coloca los grados de libertad (gl) del
numerador (2) en la fila horizontal, y del denominador (6) en la columna, para un valor de = 0,05, 1
cola:
gl 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 161.44622 199.49948 215.70668 224.58335 230.16037 233.98752 236.76694 238.88424 240.54316
2 18,51 19,00 19,16 19.24673 19.29629 19.32949 19.35314 19.37087 19.38474
3 10,13 9,55 9,28 9.11717 9.01343 8.94067 8.88673 8.84523 8.81232
4 7,71 6,94 6,59 6.38823 6.25607 6.16313 6.09421 6.04103 5.99880
5 6,61 5,79 5,41 5.19216 5.05034 4.95029 4.87586 4.81833 4.77246
6 5,99 5,14 4,76 4.53369 4.38737 4.28386 4.20667 4.14681 4.09901
Se observa que F calc > F crit . Se concluye que hay diferencias significativas entre los 3 mtodos.
GUA TCNICA N 1 20
IV: VALIDACION
La validacin de un mtodo analtico es un paso fundamental para asegurar que los resultados
entregado por dicho mtodo son confiable. Cuando se realiza la validacin de un mtodo por parte del
laboratorio, lo que se busca es poder determinar con fundamento estadstico que el mtodo es
adecuado para los fines previstos.
En este sentido, es importante que para el proceso de validacin se asigne a un responsable de realizar
dicha tarea. De manera que, la validacin se efecte en forma metdica, ordenada, trazable y
confiable.
Es importante que el laboratorio tenga claridad antes de iniciar la validacin de cuales son los
requerimientos del mtodo para establecer el alcance de la validacin.
Cuando se trata de un mtodo empleado tradicionalmente por el laboratorio que no este normalizado,
se puede realizar una Validacin Retrospectiva, es decir, en base a los datos experimentales que el
laboratorio dispone, para la cual se realizar la recopilacin de la mayor cantidad de datos histricos
disponibles, para luego realizar un proceso de ordenamiento y seleccin de los datos recopilados, estos
datos pueden ser: curvas de calibracin, resultados de ensayos, cartas de control, ensayos de aptitud,
etc. A travs de estos, se debern determinar los parmetros de validacin, y evaluar si los resultados
obtenidos para los fines de la son aceptable.
En caso de ser un mtodo nuevo (o uno antiguo del que no se dispongan de datos suficientes) se debe
realizar una Validacin Prospectiva, generando a travs de anlisis datos experimentales.
En algunos casos se puede realizar lo que se conoce como validacin menor o verificacin cuando se
trate de:
1. Mtodos normalizados.
2. Mtodos normalizados usados fuera de su alcance propuesto. Ejemplo: uso en otra matriz.
3. Ampliaciones y modificaciones menores de mtodos normalizados. Ejemplo: uso en otros
analitos.
4. Cuando se trate de mtodos previamente validados, que haya sufrido alguna alteracin
significativa por lo cual deben volver a evaluarse. Estas variaciones pueden ser; cambio de
equipo, cambio de componentes de equipo como columnas, detectores, cambio analista,
cambio de la matriz que contiene la muestra o de nivel de concentracin del analito de
inters, entre otros.
GUA TCNICA N 1 21
La verificacin, tiene generalmente como objetivo, el comprobar que el laboratorio domina el mtodo
de ensayo normalizado y lo utiliza correctamente, en caso de tratarse de un mtodo normalizado
modificado para la verificacin se requiere solo realizar aquellas pruebas que indiquen que la variacin
realizada no afecta el ensayo.
En ocasiones, lo que se busca a travs de una validacin es demostrar que un mtodo es equivalente a
otro.
GUA TCNICA N 1 22
Definicin del mtodo a Validar:
Cuali o Cuantitativo-Analito-matriz-Concentracin-Principio
Tipo de Mtodo
S No
Se trata de un mtodo normalizado?
Validacin
Verificacin Validacin Prospectiva Retrospectiva
Evaluar resultados
INFORME DE VALIDACIN
REVISIN DE INFORME
GUA TCNICA N 1 23
En relacin a los parmetros de validacin o verificacin estos debern determinarse de acuerdo al tipo
de mtodo. Para este fin la siguiente tabla puede ser utilizada como gua:
Tabla N 2
Diseo experimental:
Establecer la(s) muestra(s) a ser analizada(s): testigos reactivos, blanco matriz, material
certificados, material control, material(es) de referencia certificado, matrices de las muestras,
muestras sin fortificar, muestras fortificadas, etc.
El (los) parmetro(s) y pruebas a desarrollar, en caso, de que la prueba no sea una
convencional, sino diseada por el responsable, tambin deber indicarse en el documento.
Nmero de anlisis requeridos para cada prueba y/o parmetro.
Criterios de aceptabilidad para cada parmetro de validacin.
Analista(s) responsable de realizar la(s) prueba(s) analtica(s).
GUA TCNICA N 1 24
Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validacin.
Cualquier modificacin realizada al plan de validacin, durante el proceso, debe quedar debidamente
documentada.
Para el desarrollo de las pruebas de validacin, los analistas a cargo debern conocer el procedimiento
de mtodo de ensayo y el nmero de ensayos o mediciones a realizar de acuerdo a lo establecido en el
plan de validacin.
Los resultados obtenidos en cada prueba deben ser debidamente registrados y almacenados.
Los ensayos o mediciones realizadas sern con el fin de poder realizar las siguientes pruebas de
parmetros de validacin:
Selectividad
Linealidad
Sensibilidad
Limites
Exactitud
Precisin
Robustez
Aplicabilidad
El analista o responsable de la validacin deber con los resultados obtenidos de cada prueba realizar
los clculos matemticos, comparativos y/o estadsticos correspondientes a cada ensayo para lo cual
podr utilizar para ese fin un software estadstico, calculadora o una planilla de clculo (ejemplo: Excel).
Se deber evaluar para cada parmetro de validacin, si los resultados de las pruebas son
satisfactorios, es decir, si cumplen con los criterios de aceptabilidad establecidos en el plan, se
considera que el mtodo es aceptable.
GUA TCNICA N 1 25
D) INFORME DE VALIDACIN
El laboratorio debe tener disponible el procedimiento usado para la validacin, y una declaracin
acerca de que el mtodo se ajusta para el uso propuesto.
Este informe deber ser revisado por una tercera persona que tenga conocimiento en el rea, y que no
haya formado parte del proceso de validacin. En dicha revisin se deber establecer si los criterios de
aceptabilidad establecidos en el plan son aceptables, y si el mtodo es idneo para el fin previsto.
GUA TCNICA N 1 26
SELECTIVIDAD
La selectividad es el grado en que un mtodo puede cuantificar o cualificar al analito en presencia de
interferentes. Estos interferentes normal o frecuentemente se encuentran en la matriz de inters.
Una prueba de Selectividad comnmente utilizada, consiste en analizar un mnimo de tres testigo
reactivos, tres blancos de matriz y tres muestras o estndares de concentracin conocida del analito de
inters.
Se deben comparar las lecturas (seales de medicin) obtenidas para cada caso, y observar si existen
variaciones entre los testigos reactivos, blancos de matrices y estndares o muestras con analito. Si se
encuentran diferencias significativas debern ser identificadas y en lo posible eliminadas.
GUA TCNICA N 1 27
LINEALIDAD
Con el fin de determinar el rango lineal se puede realizar mediante un grfico de concentracin versus
respuesta, que se conoce como Funcin Respuesta (normalmente llamada recta de calibrado). sta se
establece cada da con una cierta cantidad de valores formados por un blanco y los patrones de
trabajos limpios de valor terico conocido, que cubran el intervalo de trabajo. En este sentido se
recomienda abarcar valores desde cercano al cero y valores superiores al LMP o al valor de inters. El
nmero de puntos a analizar deber ser establecido por el analista (en general, se utiliza un mnimo de
4 valores).
Fig. 1 Fig.2
Evaluar los estimadores de regresin lineal del grfico: la pendiente (m), el coeficiente de correlacin (r
) y el punto de corte (intercepto) con el eje de las Y (L0).
Y= X x m + Lo
GUA TCNICA N 1 28
En general el criterio de aceptacin cualitativo que se usa para determinar la linealidad es el coeficiente
de correlacin:
El coeficiente de correlacin indica el grado de relacin entre la variable concentracin (X) y la variable
respuesta (Y) de la curva de calibracin. Los valores mximos que puede alcanzar son 1 y 1. El valor
mximo de 1 indica una correlacin positiva perfecta (entre X e Y) con una pendiente positiva. Cuando
r=0, no existe correlacin alguna, independencia total de los valores X e Y
En la prctica si r tiene un valor cercano a uno (1), esto significa que existe correlacin con una
probabilidad elevada. Para una curva de calibracin o trabajo, es recomendable que el coeficiente de
correlacin obtenido sea mayor o igual a 0.999, aunque para el caso de trazas se admite un valor igual
o mayor que 0.99.
r = _Sxy
Sx Sy
Se puede realizar una evaluacin de curva de calibracin global (construida con ms de una curva de
calibracin de las mismas caractersticas) en la cual se puede realizar una evaluacin estadstica de
prueba t-Student, como un mejor indicador del modelo lineal.
Se calcula un valor de t con n-2 grados de libertad y se compara con el valor tabulado de t para el nivel
de confianza requerido ( = 0.05), dos-colas, en este caso para un n que depende de los niveles de
calibracin.
Se desea probar si existe entonces una correlacin significativa: La hiptesis nula H0 es que no existe
correlacin entre X e Y. Si el valor observado de tr es mayor que tcri, se rechaza la hiptesis nula H0,
siendo la correlacin lineal significativa con la probabilidad calculada.
tr = | r | (n-2)
(1- r2)
Donde:
tr = Valor del estimador t Student obtenido para el coeficiente de correlacin
| r | = Valor absoluto del coeficiente de correlacin
n 2 = Nmero de grados de libertad
r2 = Valor del coeficiente de determinacin
GUA TCNICA N 1 29
Ejemplo:
Desviacin
Nivel Conc rea rea rea A Estndar CV % Varianza
mg/L 1 2 3 Promedio S
1 13,4 43,8 44,2 44,1 44,0 0,2 0,4 0,0
2 26,6 86,2 86,1 87,6 86,7 0,8 1,0 0,7
3 40,8 131,2 132,7 133,6 132,5 1,2 0,9 1,4
4 54,7 181,7 180,7 178,6 180,3 1,6 0,9 2,5
5 68,6 221,6 224,2 221,8 222,5 1,4 0,6 2,0
n= N de niveles= 5
r= coeficiente de correlacin= 0,99985
r= coeficiente de determinacin= 0,9997
GUA TCNICA N 1 30
El valor t critico obtenido de la tabla para: 3 grados de libertad, un = 0.05 y 2 colas es:
t crit = 3,182
Se observa que el valor observado de tr (es decir el t calculado) es mayor que tcrit (99,85 > 3,182),
por lo cual se rechaza la hiptesis nula Ho, siendo la correlacin lineal significativa con la
probabilidad calculada.
Ejemplo:
El LMP para mercurio en sal es de 0,1 mg/Kg, por lo cual se aplicara la ecuacin de Horwitz para
determinar la SR prevista a este nivel que es igual a 10-7
SR = c 2 C0,1505
100
GUA TCNICA N 1 31
Sustituyendo obtendramos:
Entonces:
Entonces el rango que se requera del mtodo para que fuera aceptable debera estar a lo menos entre
0,03 y 0,17 mg/Kg.
Para coeficientes de concentracin < 10-7, se aplica la teora de Thompson, esto es, CVR% = 22 %
por lo tanto, SR = 0,22 LMP
Ejemplo:
El Codex Alimentarius seala que para un LMP = 0,01 mg/kg , es decir, para una concentracin de 10-8,
es decir < 10-7:
LMP + 2 SR= 0,01 2 SR = 0,01 2 (0,22 LMP) = 0,01 0,44 0,01 = 0,01 0,0044 mg/kg
El rango mnimo aplicable para un LM de 0,01 mg/kg es, por lo tanto, 0,006-0,014 mg/kg.
GUA TCNICA N 1 32
SENSIBILIDAD
La sensibilidad es el cociente entre el cambio en la indicacin de un sistema de medicin y el cambio
correspondiente en el valor de la cantidad objeto de la medicin.
Se calcula como:
m = Xi Yi - ( Xi Yi/ n)
X2 i - ((Xi)2 /n)
El valor de sensibilidad obtenido [m] debe permitir una adecuada discriminacin de los valores de
concentracin en base a la lectura.
En figura N 3, se puede observar que mientras ms prxima al eje de las Y est la recta, significa que a
ligeros cambios en las concentraciones esperadas habr grandes variaciones en los resultados de las
lecturas observadas [m2] En el caso de [m3] grandes cambios en la concentracin no son significativos
para la lectura.
Fig. 3
Se dice, que un mtodo es sensible cuando una pequea variacin de concentracin determina una
gran variacin de respuesta. La sensibilidad permite observar la capacidad de respuesta instrumental
frente a una determinada cantidad de analito. En el tiempo, visualiza como se comporta el
instrumento.
GUA TCNICA N 1 33
LIMITES
Se debe tener en consideracin los siguientes parmetros: Valor critico, limite deteccin (LOD) y limite
de cuantificacin (LOQ).
Valor critico (LC): El valor de la concentracin o cantidad neta que en caso de superarse da lugar, para
una probabilidad de error dada , a la decisin de que la concentracin o cantidad del analito presente
en el material analizado es superior a la contenida en el material testigo (Referencia: Codex
Alimentarius).
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz o testigo reactivo.
Donde:
t = t-Student
1-= probabilidad b
v= Grados de libertad
So = Desviacin estndar de las lecturas del blanco matriz o testigo reactivo.
Lmite de deteccin (LOD): Concentracin o cantidad real del analito presente en el material objeto de
anlisis que llevar, con una probabilidad (1-), a la conclusin de que la concentracin o cantidad del
analito es mayor en el material analizado que en el material testigo (Referencia del Manual del Codex
Alimentarius ).
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.
LOD = 3,29So, cuando la incertidumbre del valor medio (esperado) del material testigo es insignificante,
= = 0,05 y el valor estimado tiene una distribucin normal con una varianza constante conocida.
Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD < LMP. En general tambin se sugiere, para un LMP >
0,1 ppm un LOD < 1/10 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOD < 1/5 LMP.
Lmite de cuantificacin (LOQ): Una caracterstica del funcionamiento del mtodo que suele expresarse
como seal del valor (verdadero) de la medicin que producir estimaciones con una desviacin
estndar relativa (RSD) generalmente de 10 % (o 6 %). El LOQ se calcula mediante la siguiente frmula:
LOQ = 10 So
GUA TCNICA N 1 34
Se recomienda para su clculo a lo menos seis mediciones de blanco matriz , testigo reactivo o
concentracin estimada cercana al blanco.
En este caso, el LOQ es exactamente 3,04 veces el lmite de deteccin, dada la normalidad y = =
0,05. En el LOQ es posible lograr una identificacin positiva con un nivel de confianza razonable.
Un criterio de aceptacin adecuado es LC < LOD<< LOQ <LMP. En general tambin se sugiere, para un
LMP > 0,1 ppm un LOQ < 1/5 LMP y para un LMP <0,1 ppm un LOQ < 2/5 LMP.
Para el analito mercurio en marisco fresco el limite mximo permisible es 0,5 mg/Kg. Se realiza la
experiencia de medir 10 veces el blanco matriz:
Resultado
Medicin mg/Kg
1 0,05
2 0,05
3 0,03
4 0,04
5 0,05
6 0,03
7 0,01
8 0,05
9 0,05
10 0,04
Se puede observar que se cumple que el LC es inferior al LOD, ya que 0,022 < 0,044.
El LMP establecido por el analito es de 0,5 ppm es decir es > 0,1 ppm, por lo cual el LOD debe ser <
1/10 del LMP, es decir, debe ser inferior o igual a una dcima parte de 0,5.
0,044 mg/L es inferior a 0,05 mgKgL , por lo cual se estara aceptando el LOD calculado de acuerdo al
criterio de aceptacin establecido.
GUA TCNICA N 1 35
Para un LMP de 0,5 ppm un LOQ < 1/5 LMP , es decir , se debe determinar el (LMP/5) , que es : 0,5/5
de 0,1 mg/Kg.
Por lo cual no se estara cumpliendo el criterio pues 0,13mg/Kg es mayor 0,1 mg/Kg. El LOQ no sera
aceptable para el campo de aplicabilidad que le quiere dar al mtodo.
En este sentido se pude tomar la decisin de buscar otro mtodo que cumpla con estos requisitos para
este fin previsto o aceptar su aplicabilidad, considerando en la declaracin de la aplicabilidad estas
reservas u observaciones en cuanto a su LOQ.
GUA TCNICA N 1 36
EXACTITUD
El manual del Codex Alimentarius define la exactitud como el grado de concordancia entre el resultado
de un ensayo y el valor de referencia.
Como se puede observar entre ms veraz y preciso sea un resultado analtico, es ms exacto.
GUA TCNICA N 1 37
VERACIDAD: Determina el grado de coincidencia existente entre el valor medio obtenido de una serie
de resultados y un valor de referencia aceptado.
a) Sesgo (s): La diferencia entre la expectativa relativa a los resultados de un ensayo o una
medicin y el valor verdadero. En la prctica el valor convencional de cantidad puede sustituir el valor
verdadero. El sesgo es el error sistemtico total en contraposicin al error aleatorio.
Para determinar el sesgo puede utilizarse material de referencia, material fortificado, material control,
material ensayo de aptitud: Para este fin, se debe medir un analito de concentracin conocido y se
determina la diferencia en valor absoluto entre el valor conocido y la media del valor obtenido. Una
diferencia sistemtica importante en relacin al valor de referencia aceptado se refleja en un mayor
valor del sesgo, cuanto ms pequeo es el sesgo, mayor veracidad indica el mtodo.
s= X -Xa
Donde:
s= sesgo
X = lectura obtenida o valor promedio de las lecturas obtenidas.
Xa = valor asignado, valor certificado del material de referencia o valor esperado.
Para evaluar el sesgo, se debe realizar la prueba t, en la cual el tobs < t crit:
t calc = [ Xa X]
S x n
Donde :
t calc= t observado o calculado
Xa = Valor esperado o valor certificado en concentracin
X= Promedio de valores ledos u observados en concentracin
S= Desviacin estndar
n= Nmero de lecturas o valores observados.
Buscar t- Student terico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad
deseado ( 1-) para un error . Usualmente se trabaja con un valor de 0,05.
GUA TCNICA N 1 38
Ejemplo ejercicio de sesgo:
Para un valor asignado de un material de referencia certificado de 20,1 mg/L de N-NO2, los
valores obtenidos son:
Se desea establecer si existe una diferencia significativa entre el valor obtenido de la experiencia
analtica y el valor de referencia. Entonces, para determinar el t terico o critico para grados de libertad
de n-1 ( es decir de 10-1=9) , un valor =0,05 y 2 colas, se extrae de tabla el t critico que es de 2,262,
cumplindose que tcalc < t crit , ya que 0,32 < 2,262. Es decir; no hay diferencias significativas.
A travs del ejercicio se puede observar que para la medicin de Nitritos en agua el sesgo obtenido
para el mtodo utilizado es aceptable, y por lo tanto su veracidad es aceptable.
GUA TCNICA N 1 39
b) Recuperacin (R): Es la fraccin de la sustancia agregada a la muestra (muestra fortificada) antes del
anlisis, al ser analizadas muestras fortificadas y sin fortificar.
Se recomienda realizar a lo menos 6 mediciones de cada uno en lo posible en tres niveles. Se debe
considerar al elegir estos niveles el rango de la curva de calibracin del mtodo, el LOD y el LMP
establecido. De manera que los niveles seleccionados permitan entregar la mejor informacin posible
respecto a la capacidad de recuperacin del mtodo, en cuanto a estos valores criticos.
R= Ce Co
Ca
Siendo:
R= Recuperacin
Ce = es la concentracin de analito de la muestra enriquecida.
C0 = es la concentracin de analito medida en la muestra sin adicionar.
Ca = es la concentracin de analito adicionado a la muestra enriquecida.
%R = [ R ] x 100
Donde :
t calc= t observado o calculado
R= Recuperacin
S= Desviacin estndar de las lecturas del porcentaje de recuperacin
n= N de lecturas o valores observados
Buscar t-Student terico en tabla ( Anexo II) para grados de libertad (v) y el porcentaje de seguridad
deseado ( 1-) para un error de 0,05, es decir con un 95% de confianza.
Si el tcalc> tcrit (hay diferencia estadsticamente significativa), los resultados reportados debern ser
corregidos.
GUA TCNICA N 1 40
Si el tcalc tcrit (no hay diferencia estadsticamente significativa), no es necesario ninguna correccin.
El Criterio de aceptacin en base al valor obtenido para el porcentaje de recuperacin puede utilizarse
los criterios de AOAC. En caso de utilizar criterio de AOAC ( Ver Anexo III), se debe buscar en tabla de
acuerdo a la concentracin esperada del analito y si el % R obtenido de la experiencia analtica, se
encuentra dentro del rango de %R tericos esperados.
En caso que se cuente con un MRC utilizar el rango de aceptabilidad sealado en el certificado como
criterio de aceptabilidad. Es decir, el valor determinado analticamente deber encontrase dentro del
rango de tolerancia establecido a travs de certificado, es decir, del limite superior (LS) o limite inferior
(LI).
Cabe sealar que el Codex Alimentarius seala que existen directrices relativas a los intervalos previstos
de recuperacin en reas especficas de anlisis, como por ejemplo: Residuos de plaguicidas (RP) o
residuos de medicamentos veterinarios (RMV). En casos en los que se haya demostrado que la
recuperacin es una funcin de la matriz, podrn aplicarse otros requisitos especificados.
Se utilizo fortific una muestra de carne de marisco a una concentracin 15 mg/100g de Cadmio y se
analizo por fotometra de absorcin atmica.
Lectura Co Ca Ce R %R
1 0,1 15,0 15,0 0,993 99,3
2 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3
3 0,1 15,0 13,0 0,860 86,0
4 0,1 15,0 16,0 1,060 106,0
5 0,0 15,0 14,0 0,933 93,3
6 0,2 15,0 13,0 0,853 85,3
i) De acuerdo a tabla de AOAC al nivel de 10 ppm el valor aceptable es de 80 a 110 %R por lo cual el
valor obtenido en la experiencia seria aceptable para el nivel medido en la matriz analizada.
ii) En caso de utilizar como criterio de aceptabilidad la prueba t, entonces, la determinacin del valor
de t calculado, sera:
Mediciones, n=6
t calc = [ 100 93,9] =0,315
7,90 x6
GUA TCNICA N 1 41
Se desea determinar si existe diferencia significativa entre el valor de % recuperacin determinado y el
10% de Recuperacin. Para determinar el t critico para grados de libertad de = n-1 ( es decir de 6-
1=5), 2 colas y un valor =0,05 , se extrae de tabla t-student:
El t terico o critico es de 2,015, cumplindose que tcalc < t crit , ya que 0,315 < 2,571. Es decir no existen
diferencias significativas.
Se puede determinar registrando a lo menos 6 mediciones bajo las mismas condiciones (mismo
operador, mismo aparato, mismo laboratorio y en corto intervalo de tiempo) de un analito en un
Material de Referencia. Calcular la Desviacin Estndar (Sr) y el porcentaje de coeficiente de
variacin (CVr%).
GUA TCNICA N 1 42
Cuando se desea determinar la reproducibilidad interlaboratorios para fines de validacin de un
mtodo, deben participar diferentes laboratorios, se debe tener en consideracin que estos
utilicen el mismo mtodo y misma muestra, en un intervalo de tiempo preferentemente
establecido, se determina de este modo la desviacin estndar de los resultados obtenidos por
los diferentes laboratorios (SR).
Donde:
C= valor nominal del analito expresado en potencia de 10, ejemplo 1ppm = 1mg/L =10-6
En este sentido se establece para la repetibilidad, el CVr% obtenido debe ser < (CVh%/2).
C obtenida
Lectura mg/kg
1 1,08
2 1,07
3 0,84
4 0,83
5 0,94
6 0,87
7 1,02
8 1,06
9 0,95
10 0,88
GUA TCNICA N 1 43
Si el valor asignado es de 1 mg/Kg , para el calculo de Coeficiente de variacin porcentual de horwitz ,
el valor nominal del analito es equivalente a 0,00000120, es decir a 1,2 x 10-6. y el CV%hr para
repetibilidad es la mitad del valor calculado del CV%h .
De acuerdo a Horwitz el CV% para repetibilidad es de 7,78%. Por lo cual se cumple el criterio de
aceptabilidad establecido.
GUA TCNICA N 1 44
ROBUSTEZ
La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analtico de no ser afectado por
variaciones pequeas pero deliberadas de los parmetros del mtodo; proporciona una indicacin de la
fiabilidad del procedimiento en un uso normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es
optimizar el mtodo analtico desarrollado o implementado por el laboratorio, y describir bajo que
condiciones analticas ( incluidas sus tolerancias), se pueden obtener a travs de este resultados
confiables.
Un mtodo de ensayo es ms robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una
modificacin de las condiciones analticas.
Para esta determinacin se aplica el Test de Youden y Steiner para la evaluacin de la robustez de un
mtodo qumico analtico. Este procedimiento permite evaluar el efecto de siete variables con slo
ocho anlisis de una muestra.
Para proceder a realizar el estudio de robustez se deben identificar aquellos factores del mtodo que
posiblemente afectaran los resultados finales obtenidos a travs de este.
Los factores a estudiar no deben ser necesariamente siete; puede considerarse un nmero menor de
variables. Esto no afectar el balance del diseo del experimento, pero es importante considerar que
siempre se den llevar a cabo los ocho pruebas de ensayo indicado.
Los resultados de la experiencia analtica obtenidos con las variaciones realizadas en estas 8 pruebas se
representan con las letras s hasta la z.
GUA TCNICA N 1 45
A partir de los resultados puede calcularse el efecto de cada una de las variables haciendo la media de
los cuatro anlisis que contienen la variable en su valor ms alto (mayscula) y aquellas que
corresponden al valor ms bajo (minscula). As, para evaluar el efecto de la primera variable obsrvese
que:
(s + t +u +v) = 4A = A y (w + x + y +z) = 4a = a
4 4 4 4
Es decir, la media de los resultados (s + t + u + v) equivalen a A porque las seis restantes variables
presentes en estos cuatro resultados se anulan entre s como consecuencia de que existen siempre dos
maysculas y dos minsculas de cada variable. Anlogamente, la media de los resultados (w + x + y + z)
equivalen a a.
Para cualquier otra variable se puede proceder de manera similar, tal como muestra la tabla siguiente:
Se deben establecer las siete comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de mayor
valor versus la de menor valor:
De este modo se puede conocer el efecto de cada variable. En este sentido, cuanto mayor sea la
diferencia de los resultados entre el valor mayor y el valor menor ( = X-x), mayor influencia tendr
dicha variable en el mtodo analtico.
Como criterio de aceptacin para la robustez del mtodo se considera que la diferencia entre el valor
alto y el valor bajo sea superior a 2 de la desviacin estndar de la precisin del mtodo (S), es decir:
( X-x ) < 2 S.
GUA TCNICA N 1 46
Una informacin adicional de este test de Youden es que la desviacin estndar de los resultados s a z
constituye una medida excelente de la imprecisin previsible del mtodo cuando se utiliza para el
anlisis de rutina, ya que este procedimiento introduce deliberadamente el tipo de variacin en las
variables que puede esperarse que ocurra durante el empleo normal del mtodo.
GUA TCNICA N 1 47
S: 0,813 2 S: 1,150
Por lo tanto las variables sensibles, no debern modificarse las variables que se establecieron como
sensibles en el estudio de robustez, y se deber mantener el valor nominal establecido en el mtodo,
para dicha condicin.
GUA TCNICA N 1 48
APLICABILIDAD
Es decir, la aplicabilidad consiste en una declaracin de las especificaciones del rendimiento del
mtodo, que se entrega en el informe de validacin y que normalmente incluye la siguiente
informacin:
Una especificacin de la gama de las matrices del material de prueba cubierto por la validacin (por
ejemplo,"marisco", productos lcteos, etc.).
En este sentido, la prueba de aplicabilidad, consiste en el mbito de aplicacin del mtodo declarado
por el responsable de la validacin, una vez concluida esta.
En aquellos casos que se trate de un mtodo normalizado u oficializado, esta declaracin se realiza de
acuerdo a los antecedentes bibliogrficos o normativos del mtodo.
GUA TCNICA N 1 49
V: INCERTIDUMBRE
La incertidumbre de una medicin es el parmetro asociado al resultado, es decir, caracteriza la
dispersin de los valores que razonablemente pueden ser atribuidos al mesurando.
En este sentido, es importante que para un mtodo validado o verificado por el laboratorio, se realice
la determinacin de las diferentes fuentes o componentes de la incertidumbre de la medicin
presentes:
a) Muestreo
b) Efectos de la muestra: tipo de matriz, almacenamiento, etc.
c) Sesgos Instrumentales: Las debidas a las caractersticas de los equipos utilizados para realizar las
medidas tales como: deriva, resolucin, magnitudes de influencia. Ejemplo: temperatura
d) Pureza de Reactivos: materiales de referencia, preparacin de estndares.
e) Analista: Las debidas a la serie de mediciones: variaciones en observaciones repetidas bajo
condiciones aparentemente iguales. Ejemplo: paralelaje
f) Condiciones de medicin: Las debidas al certificado de calibracin: en l se establecen las
correcciones y las incertidumbres asociadas a ellas, para un valor de k determinado, en las condiciones
de calibracin. Ejemplo: material volumtrico, etc.
g) Condiciones de medicin: temperatura, humedad, etc.
h) Otras: Mtodo (por ejemplo al interpolar en una recta), tablas (por ejemplo las constantes), pesada,
alcuota, efectos computacionales, etc.
GUA TCNICA N 1 50
La incertidumbre de la medicin comprende, en general, muchos componentes. Algunos de estos
pueden ser evaluados por tipo.
Para este fin el laboratorio deber realizar una evaluacin de las incertidumbres tipo A y B que
estn presentes en el mtodo:
En general, la incertidumbre esta dada por los errores sistemticos y aleatorios presentes en el ensayo
analtico.
GUA TCNICA N 1 51
La determinacin de la incertidumbre incluye generalmente 4 pasos, el primero como se ha dicho
anteriormente corresponde a la determinacin de las fuentes, el segundo en expresar los
componentes en una incertidumbre estndar , el tercero combinar las diferentes incertidumbres y el
cuarto paso es la determinacin de la incertidumbre expandida es decir, multiplicar la incertidumbre
combinada por un factor de cobertura de k = 2, a fin de entregar un 95% de confianza, y as establecer
el intervalo entorno al resultado de la medicin en el cual se puede esperar que se incluya la mayor
fraccin de la distribucin de los valores que se pueden atribuir razonablemente al mesurando.
Los resultados obtenido se expresaran como por ejemplo: 178 g/L + 14 g/L , que corresponde a 178
g/L + ( 2x7 g/L), es decir, el resultado entregado, corresponde a un intervalo de a 2u que
representa un nivel de confianza del 95 % dentro del cual se encontrara el valor real.
En algunos casos pueden existir mayores exigencias en cuanto al valor del factor de cobertura utilizado
para obtener la incertidumbre expandida, pudindose solicitar o requerir un k = 3, a fin de entregar un
99,7 % de confianza, esto generalmente se puede solicitar frente a determinados contaminantes o
residuos.
Para demostrar que un mtodo analtico es adecuado para el fin previsto, el laboratorio deber
demostrar a travs de una evidencia objetiva que el mtodo analtico ha sido adecuadamente validado
o verificado.
En este sentido, el laboratorio debe demostrar que las caractersticas de desempeo del mtodo
analtico utilizado, son adecuadas para el uso destinado:
GUA TCNICA N 1 52
Fuente: National Food Administration of Sweden.
GUA TCNICA N 1 53
VI: ANEXOS
ANEXO N 1: FORMATO TIPO DE PLAN DE VALIDACION
PLAN DE VALIDACION
N:_____
1) Alcance de la validacin:
Mtodo:
Analito:
Matrices:
Procedimiento de validacin:
2) Diseo experimental:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 54
3) Materiales, insumos y equipos necesarios para desarrollar la validacin:
Pgina x de y
GUA TCNICA N 1 55
ANEXO N 2: FORMATO TIPO DE INFORME DE VALIDACION
N Validacin:__________
Equipos involucrados: (Nombre, marca, modelo, nmero de identificacin, tipo de columnas, tipo de detectores, etc.)
Soluciones estndares y/o patrones involucrados: (Nombre, marca, modelo, nmero de identificacin,
concentraciones, etc.)
Material de Referencia: (Nombre, marca, cdigo de identificacin, valores asignadas, unidades, etc.)
Material de Referencia Certificado: (Nombre, marca, Cd. identificacin, N certificado, valores asignadas, unidades,
trazabilidad , etc.)
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 56
PARMETROS DE VALIDACIN
Pruebas realizadas:
Selectividad
Linealidad Sensibilidad Lmites
Exactitud: Veracidad Precisin
Robustez
Otros:
Linealidad
Descripcin : (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Tipo de calibracin:
Calibracin externa Calibracin en matriz
Calibracin externa estndar interno (SI) Calibracin en matriz estndar interno (SI)
Ecuacin recta: Intervalos de confianza :
ICm mx.: min.:
ICLo mx.: min.:
Valor obtenido Criterio de Aceptabilidad
Rango Lineal:
Coeficiente de Correlacin ():
Comentarios:
Sensibilidad
Descripcin : (Breve descripcin de la experiencia analtica).
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 57
Limites:
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
SELECTIVIDAD
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Comentarios:
EXACTITUD
Precisin
Comentarios:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 58
Precisin en Condiciones de Reproducibilidad
Nivel/concentracin (unidades) SD Ri % CV Ri Criterio de Aceptabilidad
Comentarios:
Veracidad
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Reproducibilidad
Nivel/concentracin (unidades) R %R tobs Criterio(s) de Aceptabilidad
Comentarios:
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 59
ROBUSTEZ
Descripcin (Breve descripcin de la experiencia analtica).
Variables
A,a B,b C,c D.d E,e F,f G,g
Resultados
s t u v w x y z S sz
APLICABILIDAD
(Declaracin del campo de aplicacin del mtodo: analito, rango de trabajo, unidades, matrices y advertencias acerca de la interferencia
conocida en las cuales se ha demostrado la validacin).
ANEXOS
(Anexar al presente informe los documentos necesarios para respaldar la informacin, los registros o reportes entregados por el equipo y copia
de la planillas de clculos generadas en el proceso analtico):
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
Revisado por: Validacin: Firma Fecha
Nombre: Aceptada
Cargo: Rechazada
OBSERVACIONES
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------
pgina x de y
GUA TCNICA N 1 60
ANEXO N 3: TABLA DE LA DISTRIBUCIN t-Student
GUA TCNICA N 1 61
ANEXO N 4: TABLA F
F DISTRIBUCIN (= 0,05)
11 4.84434 3.98231 3.58743 3.35669 3.20388 3.09461 3.01233 2.94798 2.89622 2.85362
12 4.74722 3.88529 3.49030 3.25916 3.10587 2.99612 2.91335 2.84857 2.79638 2.75339
13 4.66719 3.80557 3.41053 3.17912 3.02543 2.91527 2.83210 2.76691 2.71436 2.67102
14 4.60011 3.73889 3.34389 3.11225 2.95825 2.84773 2.76420 2.69867 2.64579 2.60216
15 4.54307 3.68232 3.28738 3.05557 2.90130 2.79046 2.70663 2.64080 2.58763 2.54371
16 4.49400 3.63372 3.23887 3.00692 2.85241 2.74131 2.65720 2.59109 2.53767 2.49351
17 4.45132 3.59154 3.19677 2.96471 2.81000 2.69866 2.61430 2.54796 2.49429 2.44992
18 4.41386 3.55456 3.15991 2.92775 2.77285 2.66130 2.57672 2.51016 2.45628 2.41170
19 4.38075 3.52189 3.12735 2.89511 2.74006 2.62832 2.54354 2.47677 2.42270 2.37793
20 4.35125 3.49283 3.09839 2.86608 2.71089 2.59898 2.51401 2.44707 2.39282 2.34787
21 4.32479 3.46679 3.07247 2.84010 2.68478 2.57271 2.48758 2.42046 2.36605 2.32095
22 4.30094 3.44336 3.04912 2.81671 2.66127 2.54906 2.46377 2.39650 2.34193 2.29669
23 4.27934 3.42213 3.02800 2.79554 2.64 2.52766 2.44223 2.37481 2.32011 2.27472
24 4.25968 3.40283 3.00879 2.77629 2.62065 2.50819 2.42263 2.35508 2.30024 2.25474
25 4.24170 3.38520 2.99124 2.75871 2.60299 2.49041 2.40473 2.33706 2.28210 2.23648
26 4.22520 3.36901 2.97516 2.74260 2.58679 2.47411 2.38831 2.32053 2.26545 2.21972
27 4.21001 3.35413 2.96035 2.72777 2.57189 2.45911 2.37321 2.30531 2.25013 2.20430
28 4.19598 3.34039 2.94668 2.71407 2.55812 2.44526 2.35926 2.29127 2.23598 2.19004
29 4.18297 3.32766 2.93403 2.70140 2.54538 2.43244 2.34634 2.27825 2.22288 2.17685
30 4.17089 3.31583 2.92228 2.68963 2.53355 2.42052 2.33435 2.26616 2.21070 2.16458
GUA TCNICA N 1 62
ANEXO N 4: TABLA DE % DE RECUPERACION
10 10% 98 102
1 1% 97 - 103
GUA TCNICA N 1 63
ANEXO N 5: TABLA DE HORWITZ
GUA TCNICA N 1 64
ANEXO N 6: EJEMPLO DE ESQUEMA GENERAL PARA EL DESARROLLO DE UN PLAN DE
VALIDACION DE UN MTODO NORMALIZADO
El siguiente es un esquema que muestra un ejemplo de cmo se desarrollo el plan de validacin de un
mtodo y como se establecieron los correspondientes criterios de aceptabilidad.
Linealidad: Realizar 3 curvas de calibracin con 4 estndares incluido el blanco, determinar el valor de
coeficiente de correlacin promedio de las 3 curvas.
Criterio de aceptabilidad: r > 0,99
Precisin:
a) Repetibilidad: Realizar en un mismo da 10 ensayos de medicin de una matriz de muestra en un
nivel de concentracin, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las
concentraciones obtenidas (X) y la desviacin estndar de las concentraciones obtenidas (Sr).
Determinar el CVr%.
Criterio de aceptabilidad: CVh = (2(1-0.5.log c))/2 , en el cual c es el valor de la concentracin del analito
expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).
b) Reproducibilidad: Realizar en un total de 10 das 10 ensayos de medicin de una matriz de muestra
en un nivel de concentracin, en lo posible en el nivel medio de la curva, determinar el promedio de las
concentraciones obtenidas (X) y la desviacin estndar de las concentraciones obtenidas (SRi).
Determinar el CVRi%.
Criterio de aceptabilidad: CVRi = 2x(2(1-0.5.log c))/3, en el cual c es el valor de la concentracin del analito
expresado en potencia de 10 (Ver tabla N 1).
Veracidad:
Dependiendo a las caractersticas del mtodo y acceso a material de referencia determinar el sesgo o
la recuperacin.
a) Sesgo: Determinar en un mismo da a lo menos 6 mediciones (n) de un material de referencia o
material de referencia certificado, determinar el promedio (X) y desviacin estndar (S)de las
concentraciones obtenidas de las 6 mediciones, luego calcular el valor del sesgo del valor promedio (X)
respecto del valor asignado (Xa), como s= X -Xa, determinar el valor de t calculado para el sesgo,
comparar con el t critico (5,95%) que es 2,571.
Criterio de aceptabilidad: Si t calc < t crit , el sesgo es aceptable.
b) Recuperacin: Medir una matriz de muestra blanco, determinar el promedio de las concentraciones
obtenidas para Co. Posteriormente realizar un fortificado en dicha matriz blanco en un nivel de
concentracin (Ca) cercano al LMP o punto medio de la curva de calibracin. Tomar 6 sub-muestras del
material fortificado y realizar el ensayo analtico, determinar el promedio de la concentracin del
analito en la muestra fortificada (Ce). Calcular el % de recuperacin obtenido.
Criterio de aceptabilidad: Si el %R se encuentra dentro del rango de %R segn AOAC para el
nivel de fortificacin realizado (Ca), es aceptable.
GUA TCNICA N 1 65
VI: BIBLIOGRAFA
1. Aguirre L, et al. Validacin de mtodos analticos, Asociacin Espaola de Farmacuticos de
Industria, Barcelona, 2001, parte II
12. Validacin de Mtodos de anlisis qumicos Procedimiento NMKL No. 4 (1996). Versin
Espaol 1 , febrero 1997
GUA TCNICA N 1 66
_____________________________________________________________________
GUA TCNICA N 1 67
Comit Editor: Boris Duffau, Fabiola Rojas, Isabel Guerrero, Luis Roa, Luis Rodrguez, Marcelo Soto, Marisol Aguilera,
Soraya Sandoval.