BLOQUE: TCNICAS EXPERIMENTALES ENSAYO DE INMUNOABSORCIN LIGADO A ENZIMA (ELISA)
Ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA) Claire Horlock, Imperial College London, Reino Unido Traduccin: Jess Gil, Wrzburg, DE (SEI)
El ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzima (ELISA)
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es una tcnica muy usada en inmunologa para medir anticuerpos, antgenos, protenas y glicoprotenas en muestras biolgicas. Algunos ejemplos incluyen: diagnstico de infeccin por VIH, test de embarazo, y medicin de citocinas o receptores solubles en sobrenadantes celulares o suero. Generalmente se llevan a cabo en placas de 96 pocillos, lo que permite medir mltiples muestras en un nico experimento. Estas placas deben tener propiedades especiales (ser absorbentes, como las NUNC) para asegurar que el anticuerpo o el antgeno se pegan a su superficie. Cada prueba mide un antgeno especfico, existiendo una gran variedad de kits disponibles para distintos antgenos. En la Figura 1 se puede observar un tipo de ELISA, llamado ELISA sandwich, donde se utilizan dos juegos de anticuerpos para detectar productos, como citocinas. El mtodo se lleva a cabo en el orden mostrado. El primer paso es recubrir la placa ELISA con el anticuerpo de captura; Figura 1. Ensayo ELISA. Lo que se cualquier anticuerpo en exceso o que no se haya unido se muestra es un ELISA tipo sandwich, con elimina despus mediante lavado. Este anticuerpo est los pasos de la prueba numerados del 1 diseado para reconocer el antgeno de inters. al 4. Despus la muestra (ej. orina, suero o sobrenadante celular) es aadida. Cualquier antgeno que se encuentre en ella se unir al anticuerpo de captura que recubre la placa. Las muestras suelen aadirse en duplicado o triplicado (para permitir anlisis estadstico) y en distintas concentraciones para garantizar que puedan ser medidos con los niveles de deteccin de la prueba. De nuevo, cualquier excedente es eliminado de la placa usando un paso de lavado. En el ltimo paso, se aade el anticuerpo de deteccin, que suele estar marcado con una enzima, generalmente peroxidasa de rbano picante o fosfatasa alcalina. Este Figura 2. Curva standar tpica. Se anticuerpo se unir a los antgenos que estarn a su vez muestra una curva estandar para un ELISA que detecta IFN. Para unidos al anticuerpo de captura. Para terminar, se aade determinar la concentracin del una solucin substrato. Las pruebas ELISA suelen ser antgeno en la muestra, la curva cromgenas, es decir, se basan en una reaccin que estandar se basa en usar una solucin convierte el sustrato (ej. TMB o ABTS) en un producto que contiene una concentracin coloreado que puede medirse utilizando un lector de placas. conocida del antgeno. Para determinar la concentracin de antgeno en la muestra se requiere producir una curva estandar, utilizando antgenos en concentracin conocida (mostrado en la Figura 2). La concentracin del antgeno en la muestra se puede calcular utilizando la densidad ptica (OD).