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Banco de Sangre
Banco de Sangre
DE MEXICO
TRABAJO PROFESIONAL
DEDICATORIA
LE DOY LAS GRACIAS A TODA LA GENTE QUE ME APOYO EN LA REALIZACIN
DE ESTE TRABAJO POFESIONAL
A MI FAMILIA
EDWIIN MI ESPOSO, POR TODO SU AMOR, SUSTENTO Y COMPRENSIN
SEBASTIAN MI ADORADO HIJO, POR DARME LAS FUERZAS PARA CONTINUAR
A MIS PADRES
MARA GRISELDA POR SU RECUERDO
OSCAR POR SU EJEMPLO
A MIS HERMANAS
NUBIA Y PAOLA POR SU CARIO
A BENIGNO, MINERVA, IRED, IRVING Y DELFINA POR SU PREOCUPACIN
PROFESORES
QFB MARTHA PATRICIA CAMPOS PEN MI ASESORA, POR TODA LA PACIENCIA Y ENSEANZA
DR. ANDRS ROMERO, DR. VCTOR ZENDEJAS, QFB. GUADALUPE REBOLLAR Y QFB. LADISLAO
PALOMAR POR BRINDARME SU VALIOSO TIEMPO Y EJEMPLO
AL INCMNSZ
POR PERMITIRME SER PARTE DE SU GENTE
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS
PARA INMUNOHEMATOLOGA
BANCO DE SANGRE
NDICE
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Generalidades
I. Prlogo 1
I.I. Introduccin 2
III. Objetivo, Meta y Alcance 7
IV. Mensaje del Usurio 8
V. Marco Jurdico 9
VI. Seguridad de las Muestras 10
VII. Definiciones 11
VIII. Instalaciones y Procedimientos 12
1. 1 Responsabilidades 18
1. 2 Aplicacin clnica 18
1. 3 Suministros 18
1. 4 Reactivos 18
1. 5 Equipo necesario 19
1. 6 Procedimiento del ensayo 20
1. 7 Marcado y empaque 23
1. 8 Formatos, referencias y bibliografa 24
2. 1 Responsabilidades 25
2. 2 Principio 25
2. 3 Aplicacin clnica 27
2. 4 Recoleccin de la muestra 28
2. 5 Factores de rechazo 29
2. 6 Condiciones de manejo y almacenamiento 30
2. 7 Reactivos 30
2. 8 Control de calidad 31
2. 9 Procedimiento del ensayo 33
2. 10 Resultados 34
2. 11 Interferencias y limitaciones del mtodo 34
2. 12 Formatos, referencias y bibliografa 35
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3. 1 Responsabilidades 36
3. 2 Principio 36
3. 3 Recoleccin de la muestra 37
3. 4 Reactivos 39
3. 5 Control de calidad 39
3. 6 Equipo necesario 41
3. 7 Procedimiento del ensayo 41
3. 8 Resultados 42
3. 9 Formatos, referencias y bibliografa 43
4. 1 Responsabilidades 44
4. 2 Principio 44
4. 3 Recoleccin de la muestra 45
4. 4 Reactivos 47
4. 5 Equipo necesario 47
4. 6 Procedimiento del ensayo 48
4. 7 Formatos, referencias y bibliografa 50
5. 1 Panel de 10 clulas 57
5. 2 Formatos, referencias y bibliografa 58
TEMA 6. RASTREO DE ANTICUERPOS IRREGULARES
MTODO LION EN TUBO
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6. 1 Responsabilidades 59
6. 2 Principio 59
6. 3 Recoleccin de la muestra 60
6. 4 Reactivos 62
6. 5 Equipo necesario 65
6. 6 Procedimiento del ensayo 65
6. 7 Resultados 65
6. 8 Interferencias y limitaciones del mtodo 68
6. 9 Formatos, referencias y bibliografia 69
7. 1 Responsabilidades 70
7. 2 Principio 70
7. 3 Recoleccin de la muestra 72
7. 4 Reactivos 74
7. 5 Equipo necesario 75
7. 6 Resultados 76
7. 7 Interferencias y limitaciones del mtodo 76
7. 8 Formatos, referencias y bibliografia 78
TEMA 8. PRUEBA DE COOMBS
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8. 1 Responsabilidades 79
8. 2 Principio 79
8. 3 Recoleccin de la muestra 81
8. 4 Reactivos 83
8. 5 Control de calidad 84
8. 6 Equipo necesario 85
8. 7 Procedimiento del ensayo 85
8. 8 Resultados 89
8. 9 Formatos, referencias y bibliografia 90
9. 1 Propsito y alcance
9. 2 Introduccin 91
9. 3 Instrucciones y procedimiento 92
9. 4 Material y equipo requerido para criopreservar CPH 100
9. 5 Espcimen a criopreservar 101
9. 6 Procedimientos previos a la criopreservacin de CPH 103
9. 7 Procedimiento para criopreservar 105
9. 8 Procedimiento para determinar el No. De CMN de las CPH 113
9. 9 Procedimiento para determinar la viabilidad celular de las CPH 114
9.10 Limpieza y asepsia de la campana de flujo laminar 115
9.11 Verificacin de la esterilidad del proceso 116
9.12 Procedimiento para descongelar CPH criopreservadas 116
9.13 Abreviaturas 120
9.14 Formatos, referencias y bibliografia 127
NDICE DE TABLAS
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TABLA 1. Avidez 20
TABLA 2. Especificidad 21
TABLA 3. Titulo de reactivos 22
TABLA 4. Sistema de grupo sanguneo ABO 25
TABLA 5. Tipo y volumen de muestra requerida 29
TABLA 6. Identificacin del control 31
TABLA 7. Tipo y volumen de muestra requerida 37
TABLA 8. Identificacin del control 39
TABLA 9. Tipo y volumen de muestra requerida 45
TABLA 10. Tipo y volumen de muestra requerida 60
TABLA 11. Identificacin del control 63
TABLA 12. Tipo y volumen de muestra requerida 72
TABLA 13. Tipo y volumen de muestra requerida 82
TABLA 14. Identificacin del control 84
TABLA 15. Volumen mnimo y mximo al criopreservar CPH 105
TABLA 16. Valores de DMSO plasma para la medicin exacta 108
Del DMSO al 20 %
NDICE DE FIGURAS
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En la actualidad hay que estar bien preparados para enfrentar la problemtica que se
nos presenta a los que concluimos la trayectoria, pues las oportunidades son escasas, y
en gran medida de difcil acceso, es por ello que para formar parte, del rea del Banco
de Sangre de una Institucin de prestigio como es el Instituto Nacional de Ciencias
Medicas y Nutricin Salvador Zubirn, que es mi caso particular, no solo hay que
mostrar lo aprendido durante la formacin acadmica, que considero la mejor carta de
presentacin, adems es necesario agotar todas las herramientas con las que se cuenta
en la actualidad, como el conocer un segundo idioma, como el ingles, el manejo de
computadora e Internet entre otros.
II. INTRODUCCIN
Uno de los factores que influye en la atencin mdica que se otorga, es la disponibilidad
de sangre y sus derivados en las cantidades necesarias y con las caractersticas de
calidad y seguridad que garanticen, el cumplimiento de las normas de salud vigentes.
Una certificacin, en general, asegura la calidad de un producto, de un organismo o de
una persona. Pone de manifiesto que se poseen los niveles de competencia para ejercer
correctamente y dar adecuadamente las prestaciones que se le suponen. La certificacin
es el conjunto de pruebas que permiten la obtencin de un certificado que da fe de la
calificacin de un profesional en un momento dado de su carrera.
La Certificacin asegura a un profesional que posee determinados niveles de
conocimiento y de habilidades que le permiten ejercer su profesin en las mejores
condiciones.
Por lo anterior, todo el personal que trabaja en este lugar y en especial los responsables
de gestin y direccin, deben asegurarse que se cumpla con los requisitos de calidad,
normatividad que se ofrezcan productos vlidos a los enfermos, as como mejorar la
seguridad de los productos, la productividad y los costos, tras obtener la Certificacin
de la Calidad ISO 9001-2000.
La certificacin, es un logro importante y trascendental, el cual nos impulsar a
continuar con una mejora constante y ascendente del servicio que prestamos para
beneficio de los pacientes, y claro, sin olvidar a los donadores.
En la actualidad, el implementar un sistema de gestin de la calidad, resulta
indispensable, para contar con servicios de excelencia, an cuando el proceso que se
lleva a cabo en una poca especialmente difcil donde los recursos materiales son
escasos y donde no mucha gente piensa en trabajo en equipo y en superacin.
SANGRE
Su funcin es transportar el oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos del
cuerpo para que las clulas respiren, y tambin eliminan los residuos producidos por
la actividad celular (p.ej. anhdrido carbnico).
PLAQUETAS
Entre las sustancias de importancia que transporta el plasma estn las siguientes.
La Albmina. Es una protena que ayuda a mantener el agua del plasma en una
proporcin equilibrada.
Este manual tiene como objetivo principal, contener las polticas y ensayos
inmunohematolgicos, como una estandarizada de procedimientos con el fin de obtener
resultados ptimos en menor tiempo, recopilados a travs de la experiencia laboral para
dar respuesta inmediata a las necesidades de los pacientes que requieren una
transfusin segura y de calidad.
METAS
ALCANCE
Finalmente se presenta un programa para el entrenamiento del personal que realiza estas
pruebas pretransfusionales.
Decretos por el que se aprueba el Programa de Reforma del Sector Salud 1995-2000.
D.O.F. 11-III-1996
En el contexto de esta publicacin, los trminos listados abajo se definen como sigue:
(3) Rastreo de anticuerpos irregulares: Prueba que se realiza de rutina a todos los tubos
primarios que llegan al Servicio.
Aqu se describen cuales son los sitios potenciales en donde se pueden realizar las
pruebas pre - transfusionales:
Aqu se realizan todas las pruebas pretransfusionales a los pacientes, cuenten o no con
registro del Instituto, a quienes sus mdicos tratantes les hayan solicitado concentrados
eritrocitarios, plasma fresco congelado, plasma envejecido, crioprecipitados
concentrados plaquetarios y/o plaquetafresis.
No hay programacin de citas, en este mismo sitio se trabajan muestras urgentes y
ordinarias as como las cirugas electivas, inmediatamente despus de terminar las
pruebas pretransfusionales del paciente utilizamos el sistema BBS para ingresarlos.
Eventualmente, tambin acuden al laboratorio de inmunohematologa pacientes
ambulatorios que son referidos de otras Instituciones pblicas y/o por mdicos
particulares.
El acceso es por la puerta nmero 4 del INCMNSZ que da a la calle Martn de la Cruz
S/N ubicada entre Vasco de Quiroga y Viaducto Tlalpan. Tiene un horario de
funcionamiento de 7:00 hr. a 18:00 hr. por la puerta 2 despus de esta hora.
Esta Unidad fue inaugurada en enero de 1995. Cuenta con rampas de acceso e
instalaciones para discapacitados, un mostrador de registro para los pacientes as como
sala de espera y sanitarios.
A continuacin se describirn las instalaciones con que cuenta, as como algunos
procedimientos.
2) Los estos deben contener los siguientes datos: nombre completo y nmero de
predonante, fecha, nombre del estudio (ej. B-H., Historia clnica etc.)
Cada una de ellas para exmenes de laboratorio debe ser introducida en el sistema de
software para poder identificar y obtener la hoja de trabajo, etiquetas, y otros
suministros de cada paciente.
Muestras lipmicas
Muestras hemolizadas
Muestras coaguladas
Muestras insuficientes (menos de 4.5mL de volumen)
Reactivos que presentan turbidez o hemlisis
Las que presenten uno o ms de los factores arriba mencionados solo se procesaran
previa autorizacin del jefe de servicio.
A los resultados de laboratorio inesperados y no buscados se les llama frecuentemente
errores de laboratorio. An cuando los procedimientos analticos hayan sido
realizados en forma correcta y precisa, diversas variables pueden afectar los resultados.
El conocimiento de stas y la estandarizacin de los procedimientos de las pruebas de
laboratorio son esenciales para la correcta interpretacin y el uso ptimo de los datos.
Las principales causas pueden estar relacionadas a factores no analticos tales como la
toma, manejo y transporte de las muestras.
Los factores no biolgicos, como la inadecuada identificacin del paciente, y factores
biolgicos, como la postura del paciente y la hora de la toma de la muestra, contribuyen
juntos al error del laboratorio total.
PROGRAMA DE ENTRENAMIENTO
Se puede pensar, inicialmente, que cualquier individuo inteligente puede llevar a cabo
las pruebas del laboratorio de inmunohematologa. Sin embargo, aquellos que estn
familiarizados con est saben que eso no es verdad. La Medicina Transfusional es un
procedimiento complejo que requiere conocimientos y experiencia para realizarlo
correctamente. Por esta razn, una institucin debe establecer criterios para la seleccin
adecuada del personal.
El programa de entrenamiento debe contener instrucciones didcticas y entrenamiento
emprico.
Despus del entrenamiento, el entrenado debe ser capaz de realizar las siguientes
tareas:
CONTROL DE CALIDAD
1.1 RESPONSABILIDADES
Es responsabilidad del Jefe de Medicina Transfusional y del Coordinador (a) el
proporcionar ste documento al personal de nuevo ingreso y a todo aquel que lo
requiera.
Es responsabilidad de todo el personal de inmunohematologa conocer y seguir este
procedimiento.
1.3 SUMINISTROS
La siguiente lista describe los suministros que deben estar disponibles en el laboratorio
de para llevarlo a cabo manera habitual.
1.4 REACTIVOS
Antisueros hemoclasificadores tienen las siguientes caractersticas: Caducidad
mnima de un ao, con certificacin ISO 9001, FDA o mayor
Eritrocitos con fenotipo conocido al 3-5% caducidad de 3 a 4 semanas
Tarjetas con gel sephadex para pruebas cruzadas, grupos sanguneos y fenotipos
Solucin salina fisiolgica al 0.9%
Solucin I (diana sol I)
Solucin II (diana sol II)
Solucin de lavado A (diana fluid A)
Solucin de lavado B (diana fluid B)
1.5 EQUIPO NECESARIO
MATERIAL DE VIDRIO
Pipetas Pasteur
Tubos de 12x75 mm
Frascos goteros estriles
EQUIPOS
Centrifugas de mesa
Incubador de calor seco
OTROS
Guantes: Son de ltex, no estriles. Si algn trabajador es susceptible de
desarrollar dermatitis al usarlos por largos perodos de tiempo, debe intentar usar
de vinil u otro tipo de plstico.
Contenedores desechables para punzo-cortantes:
En este sitio debe haber disponibles contenedores desechables para material punzo-
cortante en el cual se coloca el material de vidrio usado que se haya roto. Estn
fabricados de plstico rgido y tienen una pestaa para desatornillar la aguja.
Adems estn claramente marcados como residi bio peligrosos, de acuerdo con la
NOM 087 SSA.
Bulbos de hule o ltex
Gogles
1.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
AVIDEZ
TABLA 1. AVIDEZ
Anti - D 30 0
ESPECIFICIDAD
TABLA 2. ESPECIFICIDAD
CLULAS CONOCIDAS
SUERO A1 A2 B 0 R1r Rr
Anti - A 4+ 4+ 0 0
Anti - B 0 0 4+ 0
Anti - AB 4+ 4+ 4+ 0
Anti - D 4+ 0
POTENCIA
TITULO
NOM-008-SCFI-1993.
FASE ANALTICA
2.1 RESPONSABILIDADES
2.2 PRINCIPIO
A A Anti - B
B B Anti - A
AB AyB Ninguno
Para realizar el grupo sanguneo de una persona se prueban directamente los eritrocitos
con reactivo Anti-A, y Anti-B ( prueba con eritrocitos o prueba directa). La
confirmacin de los resultados se hace utilizando eritrocitos de grupo A y B ( prueba
srica o prueba inversa ). Algunas pruebas adicionales facilitan la identificacin de
subgrupos por ejemplo: La distincin serolgica de las clulas A1 y A2 utilizan lectina
de las semillas de Dolichos biflorus.
En la dilucin apropiada, esta lectina reacciona como Anti-A1 y aglutina los eritrocitos
A1, pero no los A2. El 80% de los individuos del grupo A o AB posee globulos rojos
que se aglutinan en presencia de anti-A1 y, por lo tanto, se clasifica como A1 o A1 B.
El 20% restante, con eritrocitos que se aglutinan en presencia de Anti-A, pero no de
anti-A1, se clasifican como A2 o A2 B.
Tarjetas de Gel
Cmara de Reaccin
Sobrenadante
Gel de Sephadex o
Poliacrilamida
TIPO DE MUESTRA:
Suero
Eritrocitos
VOLUMEN REQUERIDO:
TIPO DE VOLUMEN
MUESTRA
ptimo Mnimo
4.0 mL 1.0 mL
Suero
3.0 mL 0.5 mL
Eritrocitos (3-5%)
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
La muestra debe ser recolectada en un tubo con tapn morado que contiene
anticoagulante (EDTA), o en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para el
Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Presencia de macro partculas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
Muestras coaguladas
Cuando una muestra es rechazada, el coordinador y/o responsable de rea (o el
responsable del turno) deber dar aviso al mdico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando una nueva muestra o cancelando el anlisis y llenar un reporte de productos
no conformes (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
2.7 REACTIVOS
MATERIALES
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIN
Previa centrifugacin de las tarjetas de reactivos dianagel donors/donantes
FORMA AUTOMATIZADA:
No requiere de preparacin
ACEPTABILIDAD
La aceptabilidad de un reactivo est determinada por los resultados obtenidos en
el control de calidad
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
PRUEBA DIRECTA
reactivo:
Anti - A I Antisueros, tarjetas
Anti - B
Anti-AB
Anti - D
PRUEBA INDIRECTA
Clulas al 3-5 % :
Clulas A1 II Eritrocitos
Clulas A2
Clulas B
Clulas O
PREPARACIN DEL CONTROL
No requiere preparacin
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los das que se procese el analito
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si despus de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: almacenamiento inadecuado del reactivo, muestras de sangres
viejas, suspensiones muy diluidas o muy concentradas, tiempo y temperatura de
incubacin inapropiada.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
el continua lo conveniente es dar aviso al servicio tcnico especializado del proveedor
del instrumento.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de eritrocitos y
de sueros de los grupos A, B, AB, Rh, O.
EQUIPO NECESARIO
Centrfuga
Guantes desechables
Gradillas
Sistema Wadiana
Solucin salina fisiolgica al 0.9%
Bulbo de hule
Pipetas Pasteur
Una vez recibida la muestra debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningn tratamiento previo y conforme
lo especificado segn el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO
REPORTE DE RESULTADOS:
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
En la validacin de los resultados se revisa que los resultados obtenidos sean
congruentes y que no queden espacios libres en la pantalla sin capturar.
CRITERIOS DE REPETICIN
VALORES CRTICOS
Entre las sustancias que causan interferencia se encuentran: muestras viejas, muestras
hemolizdas, que la dilucin de eritrocitos que hacemos para nuestro anlisis estn muy
concentradas o muy diluidas, reactivo mal almacenado, caducado, etc.
2.12 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA
3.1 RESPONSABILIDADES
3.2 PRINCIPIO
TIPO DE MUESTRA
Suero
Eritrocitos
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
ptimo Mnimo
La muestra debe ser recolectada en un tubo sin anticoagulante con datos especiales para
el Servicio de Medicina Transfusional.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Despus del anlisis se almacenan durante las primeras 72 hrs. entre 2C y 8C.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de
plstico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
3.4 REACTIVOS
FORMA AUTOMATIZADA
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIN
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparacin
Deben analizarse los 2 niveles de controles todos los das que se procese el
analito.
ALMACENAMIENTO
Almacenar los frascos goteros sin abrir entre 2oC y 4oC. Una vez abiertos, los controles
que se utilizarn en un plazo de 30 das pueden almacenarse entre 2oC y 8oC de uso de
los controles.
En caso de que una corrida sea rechazada, debe repetirse el ensayo, si despus de ello no
se corrigen los valores, deben indagarse las posibles causas de error, como pueden ser
entre otros factores: reactivo, sol.1, sol.2, mal almacenamiento del reactivo.
Si al observar estos detalles persiste, debe buscarse alguna falla sencilla en el equipo, si
continua lo conveniente es dar aviso al servicio tcnico especializado del proveedor del
instrumento.
En caso de no contar con controles comerciales debe usarse una muestra de suero de un
paciente normal y otra de un paciente patolgico alto.
3.6 EQUIPO NECESARIO
Centrfuga
Guantes desechables
Gradillas
Sistema Wadiana
Solucin salina fisiolgica al 0.9%
Bulbo de hule
Pipetas Pasteur
Una vez recibida la muestra deben ser centrifugadas durante 5 minutos a 3000 rpm.
Las muestras de suero deben ser procesadas sin ningn tratamiento previo y conforme
lo especificado segn el Manual del Sistema Wadiana.
PROCEDIMIENTO:
3.8 RESULTADOS
REPORTE DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del Paciente Ambulatorio (SIPAM) y/o en el Programa Blood Bank y son
validados y liberados por el responsable de turno.
CRITERIOS DE REPETICIN
VALORES CRTICOS
4.1 RESPONSABILIDADES
4.2 PRINCIPIO
PRUEBA MAYOR (anticuerpos en el suero del receptor, contra los eritrocitos del
donador).
APLICACIN CLNICA
Suero 2 Gotas
Eritrocitos 1 Gota
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
En un tubo con tapn morado con anticoagulante EDTA que proporciona el banco de
sangre.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestra coagulada
Muestra hemolizada
Muestra mal etiquetada
Volumen insuficiente
La muestra debe ser manipulada slo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posicin vertical, en gradillas de tamao adecuado al tubo, o en su
defecto a travs de un sistema de transporte neumtico.
Si la muestra requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de
plstico perfectamente bien cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte a la muestra.
4.4 REACTIVOS
3. Suero del paciente (obtenido en los tres das previos a la transfusin, s el paciente se
encuentra dentro de la ventana de inestabilidad serolgica).
Centrfuga
Guantes desechables
Gradillas
Solucin salina
Albmina, LISS, PEG ( polietilenglicol )
Antiglobulina humana (poli inespecfico IgG C3).
4.6 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO
Una vez recibida la muestra de sangre debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
Irregulares naturales: anti A1, anti-M, anti-N, anti-P1. anti-E, entre otros.
Por anticuerpos regulares debemos identificar a los que existen en todos los individuos
y que stos tendrn durante toda su vida. Los anticuerpos irregulares son los que no
estn de esa manera, aunque en el caso de los naturales no se conoce a ciencia cierta qu
o cmo se induce su produccin.
Los anticuerpos fros van dirigidos contra los sistemas MN, Lewis y P1, con ptima
reaccin a temperaturas entre 4C y 22C; estos son generalmente inmunoglobulinas
tipo IgM y ocasionalmente tipo IgG, y debido a esa temperatura de reaccin carecen de
importancia clnica salvo que su reaccin ocurra tambin a 37C, es decir, que acten
como anticuerpos calientes.
Entre estos slo los dirigidos contra los antgenos M y N han sido asociados con EHRN,
cuya severidad va desde leve a moderada. Los llamados anticuerpos calientes tienen una
temperatura ptima de reaccin a 37C, a veces visible pero en otras ocasiones slo
evidente hasta agregar anti gamma globulina humana (suero de Coombs). Estos tienen
una relevante importancia clnica ya que se les asocia con reacciones transfusionales de
intensidad moderada a severa, que pueden ocasionar la muerte; adems, son causantes
de hemlisis en los recin nacidos, quienes en ocasiones requieren
exsanguinotransfusin.
Para un ptimo funcionamiento de esta rea del laboratorio es importante conocer las
caractersticas ya descritas del comportamiento de los anticuerpos, as como otras ms:
La afectacin que sufren por el efecto de medios de baja fuerza inica (LISS,
polietilenglicol y otros), por el de productos qumicos o enzimas (ficina, tripsina,
quimiotripsina, ditiotreitol, papana, stalidasa, bromelasa, y otras) o de otras
sustancias. De esta manera conocemos que algunos anticuerpos de este tipo se
ven afectados o son destruidos.
Tcnica enzimtica con bromelina (bromelasa): Por el fuerte efecto que tiene
esta enzima sobre los eritrocitos, los tiempos de incubacin se reducen. El
procedimiento es de la siguiente forma: a los eritrocitos lavados se les agrega el
suero problema en la proporcin ya descrita ms una gota de la enzima
(bromelina); se incuban, centrifugan y se leen.
Se elaboran clulas de donantes con fenotipo conocido en el que se han incluido los
ms comunes de nuestra poblacin. ste consta generalmente de grupos sanguneo O,
factor RhOD positivo y de factor RhOD negativo; de cuatro donadores para
determinacin de grupo en el sistema ABO (A1, A2,B, O); de dos donadores grupo O
para diferenciacin de factor RhO D (una factor positivo y otra factor negativo); clulas
de un donador grupo O, las cuales sern sensibilizadas, es decir, se les pegar un
anticuerpo de naturaleza IgG, generalmente un anti-D, y otras del mismo grupo O sin
sensibilizar que funcionan como control negativo; stas dos ltimas servirn para
controlar el suero de Coombs.
Debe trabajarse con sumo cuidado teniendo siempre en cuenta que de nuestro trabajo
depende la vida de muchos pacientes, y que nosotros podramos ser la causa de una
pronta recuperacin o de una complicacin mayor. Nos corresponde poner nuestro
mayor empeo para obtener resultados ptimos; Por eso, cada tcnica debe ser trabajada
de acuerdo con los parmetros establecidos, por ejemplo: el sistema Duffy es sensible a
los medios de baja fuerza inica y susceptible de ser destruido por algunas enzimas, lo
que pudiera conducir a resultados errneos. La importancia de la albmina, radica en
que puede magnificar reacciones del sistema Rh-Hr, sin embargo, la tcnica ms
empleada es la salina, ya que nos permite observar adecuadamente las reacciones y nos
apoya en las otras tcnicas, sobre todo cuando se observa ms de una poblacin de
anticuerpos antieritrocitos, adems de ser altamente confiable.
6.1 RESPONSABILIDADES
6.2 PRINCIPIO
El uso de gamma LO-ION, en lugar de las soluciones de albmina bovina para los
procedimientos de anticuerpos, crea un ambiente de baja fuerza inica que incrementa
la proporcin del anticuerpo captado durante la incubacin y as es mayor la reactividad,
ya sea como hemoaglutinacin directa o en pruebas de antiglobulina indirecta. Al
mismo tiempo, la incorporacin de compuestos de alto peso molecular incrementa la
habilidad de muchos anticuerpos para dar reacciones de aglutinacin directas con las
clulas que posean el antgeno apropiado.
Aplicacin clnica
Este estudio consiste en el rastreo que permite identificar a los pacientes que presentan
en su suero anticuerpos antieritrocitarios dirigidos contra antgenos que no son del
sistema ABO.
Esta prueba est indicada como parte de las pruebas de compatibilidad sangunea
pretransfusional, en mujeres Rh negativo, como parte del estudio de la EHRN, en
estudios de la anemia hemoltica autoinmune, entre otras ms.
6.3 RECOLECCIN DE LA MUESTRA
Tipo de muestra:
Sangre total
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
ptimo Mnimo
7.0 mL 5.0 mL
Sangre total
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipmicas o hemolizadas
Presencia de macro partculas
Muestras sobre etiquetadas
Muestras con etiquetas tachadas o corregidas
Volumen insuficiente
Recipiente distinto al proporcionado
La sangre se extrae por una tcnica asptica, mediante una puncin limpia y sin
problemas de toma. Se coloca en el tubo proporcionado por el Servicio de Medicina
Transfusional, correctamente etiquetado. Debe de centrifugarse inmediatamente y ser
procesada en ese mismo da. Despus de terminar los estudios la muestra se debe de
conservar y almacenar en su tubo original debidamente tapado y en refrigeracin entre
2C y 8C por un tiempo no mayor de 72 horas.
La muestra debe ser manipulada slo por personal autorizado. Debe ser transportada
bien cerrada y en posicin vertical, en gradillas de tamao adecuado al tubo, o en su
defecto a travs de un sistema de transporte neumtico.
Si sta requiere salir del laboratorio debe ser colocada en contenedores rgidos de
plstico perfectamente cerrados, los cuales deben de proporcionarle seguridad y
facilidad de transporte.
6.4 REACTIVOS
MATERIALES
Pipetas Pasteur
Tubos de ensaye de 12 x 75 10 x 75 mm
Bulbos
Gradillas
Marcador con tinta indeleble
Pluma (tinta azul o negra)
Papel parafilm
Cronmetro
Contenedor de plstico con hipoclorito de sodio al 5 % en cantidad suficiente
Contenedor desechable de punzo cortantes
Libreta de pruebas de Banco de Sangre
Reactivo de clulas rojas para la deteccin de anticuerpos
Solucin salina fisiolgica al 0.9 %
Reactivo de anti-IgG, C3d (suero de Coombs)
Reactivo de clulas rojas sensibilizadas
Reactivo de clulas rojas no sensibilizadas
Reactivo de Gamma LO-ION
PREPARACIN
Los eritrocitos del panel se preparan cada vez que se utilicen realizando tres lavados con
solucin salina fisiolgica al 0.9 % y resuspender es sta a una concentracin
aproximada de 3% a 5%. De igual manera se preparan los eritrocitos sensibilizados y no
sensibilizados, proporcionados en el mismo.
ACEPTABILIDAD
ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
CONTROL DE CALIDAD
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparacin
FRECUENCIA DE USO DE CONTROLES
Los sueros control se analizan al inicio de cada lote de eritrocitos del panel 10 Siglo
XXI.
Para los reactivos de Inmunohematologa es diario al inicio del da.
ALMACENAMIENTO
Todos los datos obtenidos del control de calidad se registran en los formatos
correspondientes.
Centrifuga clnica
Centrifuga serolgica Clay Adams
Bao Mara
Guantes desechables
Gradillas
Lentes de seguridad
a) Preparar una serie de 10 tubos identificados con el nmero de cada clula del
Panel 10 . Incluir un autotestigo
b) Con pipeta Pasteur agregar 2 gotas de suero de la muestra en cada tubo
c) Agregar una gota de la suspensin de eritrocitos de cada clula del panel a cada
tubo correspondiente
d) Agregar una gota de la suspensin de eritrocitos del paciente en el tubo
autotestigo
e) Mezclar y centrifugar 30 segundos a 3500 rpm
f) Resuspender suavemente el botn de clulas, tubo por tubo. Leer y anotar si
existe o no aglutinacin
g) Agregar a cada tubo dos gotas de LO-ION mezclar y centrifugar 30 segundos a
3500 rpm
h) Observar tubo por tubo si existe hemlisis. Leer y registrar la presencia de
hemlisis
i) Resuspender completamente el botn de clulas mediante agitacin suave e
incubar a 37C durante 10 minutos (mximo 30 minutos)
j) Luego de la incubacin, lavar en tres ocasiones con solucin salina fisiolgica al
0.9 %, centrifugando durante 1 minutos en cada lavado
k) Eliminar el exceso de solucin salina fisiolgica al 0.9 % en el ltimo lavado y
agregar dos gotas de suero de Coombs a cada tubo, se mezcla suavemente y se
centrifuga durante 30 segundos a 3500 rpm
l) Se resuspende suavemente el botn de clulas a contraluz tubo por tubo y leer la
aglutinacin. Registrar los resultados
m) En los tubos en donde no se observ aglutinacin con el suero de Coombs,
agregar una gota de clulas rojas sensibilizadas, mezclar suavemente y
centrifugar durante 30 segundos a 3500 rpm
n) Despus de la centrifugacin resuspender el botn de clulas por agitacin suave
y leer a contraluz la aglutinacin, tubo por tubo. Registrar los resultados
o) El registro de todos los datos y observaciones realizados durante la prueba se
harn en la libreta de registro de estudios del Banco de Sangre con el formato y
organizacin establecidos.
6.7 RESULTADOS
CLCULOS Y CONVERSIONES
Con los datos obtenidos al final de la prueba se realiza la lectura mediante comparacin
con la carta de identificacin de anticuerpos correspondiente proporcionada en el Panel
10 para la identificacin de l o los anticuerpos encontrados.
REPORTE DE RESULTADOS
Una vez que los resultados son liberados en el SIPAM, son impresos durante la noche
en el departamento de archivo clnico y son archivados en el expediente del paciente.
INTERVALOS DE REFERENCIA
Burtis Carl A., 1996. Fundamentals of clinical chemistry, 4 ed. Ed. W.B.
Saunders Company, U.S.A: p. 351-359.
7.1 RESPONSABILIDADES
7.2 PRINCIPIO
Cuando el suero de pacientes contiene anticuerpos para caprilato o algunos otros con
una cadena corta de cidos grasos, la formacin de los complejos albmina -
inmunoglobulina causa aglutinacin de algunas clulas rojas sanguneas.
Esta aglutinacin es algunas veces vistas solo en la fase de antiglobulina pero es
observada ocasionalmente en la prueba despus de la incubacin a 37oC.
Esta causa puede ser sospechosa si un suero da positivo con todas las clulas
(incluyendo el control).
Mantenga a 1oC - 8oC cuando no se use. No se congele, mantenga su esterilidad, no se
use si esta marcadamente turbio.
APLICACIN CLNICA
TIPO DE MUESTRA
TIPO DE VOLUMEN
MUESTRA
ptimo Mnimo
La sangre se extrae por una tcnica asptica y el suero es separado para ser probado tan
pronto como sea posible.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipmicas
Presencia de macro partculas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
El suero es separado para ser usado tan pronto como sea posible, si la prueba se dilata,
las muestras para la identificacin de anticuerpos, deben conservarse de 2oC a 8oC por
un tiempo no mayor de 48 horas. El suero puede mantenerse por un tiempo mayor de 48
horas. El plasma de muestras anticuaguladas puede usarse si se desea, pero el operador
debe estar enterado que esto puede dar resultados falsos o detectar anticuerpos
dependientes de complementos. Si son requeridas clulas rojas para la prueba se pueden
obtener las muestras utilizando EDTA, heparina u oxalato y stas deben ser probadas
antes de 48 horas. Las clulas rojas sanguneas de muestras coaguladas pueden ser
probadas dentro de 21 das despus de su recoleccin. Las clulas rojas de donadores
unitarios deben ser probadas hasta antes de la fecha de caducidad.
7.4 REACTIVOS
MATERIALES
PREPARACIN
ACEPTABILIDAD
Centrfuga
Guantes desechables
Gradillas
Colocar dos gotas del suero del receptor en tres tubos marcados I, II y AC
(autocontrol)
Agregar una gota de las clulas I, II y AC a sus respectivos tubos
Aadir tres gotas de albmina al 22% a cada uno de los tubos
Incubar 30 minutos a 37C
Centrifugar 30 segundos a 3500 rpm
Examinar la hemlisis y reconocer si se presenta
Resuspender las clulas agitando suavemente con la mano
Lavar los tubos tres veces con solucin salina fisiolgica 0.9% llenando completamente
el tubo y decantando con cuidado la solucin salina entre lavado y lavado; y
resuspender las clulas perfectamente cuando se adicione la solucin salina fisiolgica
para el siguiente lavado.
Decantar la salina fisiolgica 0.9 % completamente en el ltimo lavado
Aadir una o dos gotas de anti globulina humana en el botn seco de clulas
Mezclar bien centrifugar
CRITERIOS DE REPETICIN
8.1 RESPONSABILIDADES
8.2 PRINCIPIO
La reaccin de Antiglobulina, fue descrita por Moreshi. En 1908, y fue aplicado por
Coombs y sus colaboradores en 1945 en la serologa de grupos sanguneos. Cuando se
utiliza el suero de animales inmunizados con protena humana en la deteccin de los
llamados anticuerpos incompletos, la capacidad del suero antiglobulina para reaccionar
con componentes del complemento humana unidos a los glbulos rojos fue reportado
en 1957 por Dacie y sus colaboradores.
La prueba de antiglobulina Coombs es un procedimiento importante para la deteccin
de inmunoglobulina y/o complemento unido a los glbulos rojos. La prueba de
antiglobulina directa se utiliza para demostrar los anticuerpos y/o complemento unido a
los glbulos rojos in vivo, y la prueba de antiglobulina indirecta despus de la
incubacin del suero y los glbulos rojos, demuestran los anticuerpos y/o complemento
unido in vitro.
Cuando los anticuerpos incompletos (usualmente IgG) entran en contacto con los
glbulos rojos que poseen los antgenos apropiados, stos se unirn a la superficie de las
clulas y permanecern unidos durante la serie de lavados con solucin salina
fisiolgica 0.9% para eliminar la protena humana unida. Se puede detectar entonces la
presencia de la protena resultante a travs de una prueba de lavado de clulas con un
reactivo hecho de suero de conejo inmunizado con la protena humana adecuada, o de
anticuerpos monoclonales secretados por hibridomas derivadas de ratn inmunizado y
de un cultivo medio fluido.
La aglutinacin de glbulos rojos por Anti-IgG en la prueba de antiglobulina directa e
indirecta, indica que las clulas estn cubiertas con anticuerpos.
Algunos reportes sugieren que el IgG puede fallar ocasionalmente en la deteccin de
anticuerpos que se demuestren por el uso de un reactivo de antiglobulina humana poli
especfica y los anticuerpos no detectados por Anti-IgG pueden ser clnicamente
significativos en algunos casos. El usuario debe ser consiente que la informacin
cientfica actual no es completamente un soporte para el uso excesivo de Anti-IgG para
pruebas de rastreo de anticuerpos y para pruebas de compatibilidad.
No se requiere una preparacin previa del paciente para obtener la muestra. La sangre
debe obtenerse por medio de una tcnica asptica, y preferentemente debe probarse
mientras est fresca. Si ocurre un retraso en la prueba, la muestra debe conservarse de
1C a 8C.
Para la prueba de antiglobulina directa se debe extraer la sangre con o sin anticoagulante
cuando se va a realizar la prueba con Anti-IgG.
TIPO DE MUESTRA
Suero, eritrocitos
TABLA 13. TIPO Y VOLUMEN REQUERIDO
VOLUMEN
TIPO DE MUESTRA
ptimo Mnimo
4.0 mL 2.0 mL
Suero
RECIPIENTE DE RECOLECCIN
La muestra debe ser tomada en un tubo vacutainer con EDTA.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA
FACTORES DE RECHAZO
Las muestras deben ser rechazadas si cumplen con por lo menos uno de los siguientes
puntos:
Muestras lipmicas
Presencia de macro partculas
Muestras mal etiquetadas
Volumen insuficiente
Cuando una muestra es rechazada, el Coordinador y/o responsable de rea (o el
responsable del turno) debe comunicar al mdico encargado del servicio (o al MIP),
solicitando nueva muestra o cancelando el anlisis y llenar un reporte de producto no
conforme (FR-AC-05) como se establece en el procedimiento general de control de
producto no conforme (PG-AC-04).
8.4 REACTIVOS
INGREDIENTES ACTIVOS
PREPARACIN
No requiere de preparacin
ACEPTABILIDAD
Los frascos goteros de reactivo deben almacenarse cerrados entre 2oC y 8C.
NOMBRE DEL
NIVEL TIPO DE MUESTRA
CONTROL
No requiere preparacin
ALMACENAMIENTO
Se almacena de 2oC - 8C
Centrfuga
Guantes desechables
Gradillas
Tubos de ensaye de 12X 75 mm
Una vez recibida la muestra de suero debe ser centrifugada durante 5 minutos a 3500
rpm.
Para la deteccin de glbulos rojos sensibilizados in vitro
Este procedimiento puede ser utilizado para la deteccin e identificacin de anticuerpos
inesperados y para pruebas de compatibilidad.
Cuando se prueban los glbulos rojos con reactivos especficos para el uso de pruebas
de antiglobulina indirecta (incluyendo Anti-D en la prueba para D dbil), realice la
prueba de acuerdo con el procedimiento explicado en el inserto para el uso del reactivo
en particular.
En el caso de las pruebas para la deteccin de anticuerpos inesperados, siga las
instrucciones dadas para los reactivos de glbulos rojos o para cualquier aditivo que se
utilice.
En cualquiera de los casos revise estas instrucciones dadas para la fase de
antiglobulina.
Note que las clulas conocidas que tengan una prueba de antiglobulina directa positiva,
no pueden usarse en la prueba de antiglobulina indirecta.
3.- Aada una gota de la suspensin de clulas a cada tubo. Las clulas deben ser
lavadas por lo menos una vez y resuspenderse en salina fisiolgica a una concentracin
de 3-5%. El reactivo de glbulos rojos se puede utilizar directamente del frasco.
Alternativamente pueden prepararse en la forma recomendada por el fabricante, o por
medio de un procedimiento que sea efectivo para el usuario. Si utiliza un procedimiento
de baja fuerza inica en el que las clulas estn resuspendidas en una solucin de baja
fuerza inica revise las instrucciones del fabricante, las cuales toman preferencia sobre
este paso.
4.- Si se utiliza un aditivo como Albmina Bovina al 22% 30% un aditivo de baja
fuerza inica, como Gamma LO-ION, Gamma PeG, adalo de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Note que este paso no es aplicable si las clulas fueron
resuspendidas en la solucin de Baja Fuerza Inica (LISS) en el paso 3.
5.- Mezcle y centrifugue el tiempo apropiado a la calibracin de la centrfuga
Nota: La fuerza centrfuga aplicada a las mezclas de suero y clulas es la mnima
requerida para producir un botn compacto de clulas y un sobrenadante claro. Una
centrifugacin excesiva dificulta la resuspensin del botn de clulas, asimismo una
centrifugacin inadecuada puede producir una aglutinacin que se dispersa fcilmente.
Cada laboratorio debe calibrar sus propias centrfugas para determinar el tiempo ptimo
y velocidades de centrifugacin para los diferentes sistemas de prueba.
Como una gua, un minuto a 1000 rpm, es usualmente adecuado tanto para pruebas con
salina rapida como con albmina. A 3500 rpm las pruebas de solucin salina fisiologica
0.9% usualmente requieren 15 segundos, mientras las pruebas de albmina requieren 30
segundos por la mayor viscosidad de la mezcla de prueba.
7.- Resuspenda las clulas por medio de una agitacin suave y registre el resultado.
8.- Incube las muestras con solucin salina fisilogica al 0.9% (si se realizaron) por 15
minutos a temperatura ambiente (23C 3C) y los otros tubos por 15 minutos (o de
acuerdo a las instrucciones del fabricante) a 37C 1C.
10.- Repita los pasos 6 y 7, registrando los resultados apropiadamente (ej 37C salina,
37C albmina, 37C LO-ION.
11.- Descarte los tubos etiquetados para las pruebas con solucin salina fisiolgica 0.9
% a temperatura ambiente si se realizaron.
12.- Lave las clulas de todos los tubos incubados a 37C por lo menos 3 veces con los
tubos llenos de salina, teniendo cuidado de decantar la solucion salina fisiologica entre
los lavados y resuspender las clulas por completo cuando se le aada la solucion salina
fisiolgica para la siguiente lavada.
16. Resuspenda las clulas mediante agitacin suave, observar la aglutinacin y registre
los resultados de la prueba.
Reporte de resultados
Los resultados obtenidos del equipo pueden ser capturados manualmente o transmitidos
al Sistema del paciente Ambulatorio (SIPAM) va electrnica (interface) y son
validados y liberados por el Coordinador de Qumico o el responsable de turno.
8.9 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA
PROPSITO
ALCANCE
ANTECEDENTES
Los transplantes de Clulas Progenitoras Hematopoyticas (CPH) se consideran, hoy
da, el tratamiento de eleccin para una gran variedad de enfermedades tanto malignas
como no malignas. El uso de estas en su forma autloga tiene como objetivo restablecer
las funciones hematopoyticas en pacientes sometidos a altas dosis de quimioterapia,
radioterapia, o ambas, y por tal motivo, la conservacin de los precursores
hematopoyticos a temperaturas bajas y en condiciones ptimas garantizan su
almacenamiento durante el tiempo que sea necesario, con la mnima prdida de sus
capacidades de autorregulacin y diferenciacin.
Por lo anterior, los bancos de sangre o el Servicio de Medicina Transfusional son los
responsables de recolectarlas y procesarlas, y debern de contar con manuales de
procedimientos actualizados para mantener un sistema de calidad, y asegurar que los
procedimientos, el almacenamiento y la distribucin de los productos se ajusten a los
requerimientos y lineamientos internacionales para satisfacer las necesidades de
atencin a los pacientes.
CHOQUE TRMICO
El choque trmico puede ocurrir cuando ciertas clulas son enfriadas repentinamente,
incluso en la ausencia de cristalizacin. El rango crtico oscila entre +15C y 0C,
aunque tambin puede ocurrir entre 0C y -80C. El choque trmico comienza en la
membrana como un resultado de:
Agentes crioprotectores
La presencia de ciertos fosfolpidos (fosfatidil serina)
Enfriamiento lento
Acondicionamiento previo en medios con alta concentracin de sales.
UMBRAL DE DESHIDRATACIN
Congelamiento ideal
Incremento en la
velocidad de enfriamiento
AGENTES CRIOPROTECTORES
Una vez terminada la mezcla, se transfiere a una bolsa de congelamiento que debe estar
constituida por un material plstico no lipoflico (poliolefina o tefln-kapton) para evitar
el dao a las membranas celulares, y adems debe de ser lo suficientemente resistente a
bajas temperaturas (-196C). La bolsa se introduce en un soporte de aluminio que
mantenga comprimidas ambas superficies, proporcionando as un espesor y forma
homognea de la muestra que facilite un correcto intercambio de calor.
El programa de congelacin puede variar, pero en trminos generales debe incluir
primero una fase de estabilizacin a una temperatura de 4C, seguida de un descenso
constante de la misma a un ritmo de 1-2C/min. En el momento previo al punto
eutctico, se debe inducir un descenso prolongado de la temperatura de la cmara para
compensar la liberacin del calor latente de fusin.
Una vez superada la fase de transicin, el ritmo de enfriamiento debe permanecer
constante entre 1-2 C/min.
Las clulas congeladas pueden almacenarse en un contenedor de N2 (l), en su fase
lquida, donde la temperatura se mantiene constante a 196C. Si la muestra se mantiene
en la fase gaseosa, la temperatura puede oscilar entre 100C y 140C.
OBSERVACIONES
1. Bata quirrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirrgico
4. Guantes estriles
5. Campos estriles
6. Tijeras inoxidables estriles
7. Pinzas inoxidables estriles (Rocher)
8. Gasas estriles
9. Torundas de algodn (jabn, alcohol, isodine)
10. Alcohol isoproplico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehdo, fenol al 5%, o formaldehdo)
12. Isodine
13. Frascos estriles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO estril (Sigma, Cat D-2650) o USP (Sigma, Cat. D-1435)
17. Jeringas desechables estriles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estriles del No. 18G
19. Bolsa criognica de 250 mL (OriGen, Cryostore, Cat. CS 250n)
20. Casete de aluminio (Canister) para bolsa criognica a 4C
21. Equipo para congelamiento controlado CrioMed Freezer
22. N2 (l) a baja presin
23. Guantes criognicos
24. Frascos para hemocultivo y de hongos/micoplasma (peditricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometra Hemtica (BH)
26. Hielo frppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio ptico
32. Sellador dielctrico
33. Bolsas para desechos
34. Etiquetas de identificacin
35. Crioviales estriles
36. Campana de Flujo Laminar
37. Depsito para almacenamiento con N2 (l)
38. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
39. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
40. Marcos metlicos (Racks) numerados N2 (l)
41. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depsito de N2 (l)
42. Pipetas automticas de 200 y 1000 L
43. Puntas para pipetas automticas de 200 y 1000 L
44 Solucin Salina Fisiolgica 0.9%
9.5 ESPCIMEN A CRIOPRESERVAR
Pesar la bolsa que contienen las CPHSP al terminar su recoleccin. Restar el peso de la
bolsa vaca (bolsa transfer de 600 mL de equipo CobeSpectra = 32g; bolsa de
recoleccin de equipo CS-3000 = 25g) y dividir el resultado entre la densidad especfica
de las CPH (d= 1.066) para obtener el volumen aproximado. Con este valor se puede
calcular la cantidad de bolsas criognicas que sern necesarias para la criopreservacin
de las clulas.
Ejemplo:
5 1 4
10 2 8
15 3 12
20 4 16
25 5 20
30 6 24
35 7 28
40 8 32
45 9 36
50 10 40
55 11 44
60 12 48
65 13 52
70 14 56
75 15 60
80 16 64
85 17 68
90 18 72
95 19 76
100 20 80
105 21 84
110 22 88
115 23 92
120 24 96
125 25 100
130 26 104
135 27 108
140 28 112
145 29 116
150 30 120
160 32 128
170 34 136
180 36 144
190 38 152
200 40 160
250 50 200
300 60 240
Anotar el volumen de la solucin crioprotectora de cada bolsa criognica en el
Formato del registro del procedimiento de criopreservacin.
Anotar el volumen total de cada bolsa en el Formato del registro.
Colocar un reloj con alarma a los 30 minutos y otro a los 20 minutos.
A la alarma de los 20 minutos preparar la solucin. Con la probeta estril medir
la cantidad del plasma autlogo fro (a 4C) y depositarlo en un frasco estril en
hielo. Con una jeringa de 20 mL tomar la cantidad necesaria de DMSO y
adicionar al plasma mezclando perfectamente para evitar desnaturalizar las
protenas del plasma debido a la reaccin exotrmica.
Iniciar el programa correspondiente del congelador programable y permitir que
se enfre a 4C.
A la alarma de los 30 minutos tomar con una jeringa de 20 mL la cantidad
necesaria de la solucin crioprotectora. Retirar la jeringa vaca de la suspensin
de CPH, con prontitud adicionarla en cada bolsa criognica, empezando con la
bolsa control y posteriormente a las bolsas con las clulas, mezclar
perfectamente. Usar el mbolo de la jeringa para retirar la mayor cantidad
posible de aire y tomar aproximadamente 2.5 mL de la mezcla.
Colocar 0.5 mL en un criovial rotulado, 1 mL en el tubo de BH, rotulado
previamente como post-DMSO, para corroborar su viabilidad. Mantener el tubo
a 4C. Inocular 1 mL de la mezcla en el frasco de hemocultivo, rotular como
post-DMSO.
Sellar la lnea de la bolsa criognica que contiene la jeringa tres veces con un
sellador dielctrico. Cortar con tijeras en medio de la lnea sellada y desechar la
lnea unida y la jeringa.
Secar rpidamente cada bolsa criognica y colocarla dentro del canister
previamente enfriado a -20C; por ejemplo, colocar la bolsa #1 canister #1.
Cuando corte la lnea sea cuidadoso en no dejar cualquier gota de CPH en el
rea de sellado. La presencia de clulas en un extremo abierto de la lnea
despus del sellado debe de ser evitada ya que puede contaminar el N2 (l) en el
tanque de depsito. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criognicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.
Colocar los canister y el criovial en la cmara de enfriamiento. Distribuir
individualmente los canister en una gradilla metlica para que se lleve a cabo el
proceso en las mismas condiciones del congelamiento.
Coloque la bolsa control dentro de un canister e inserte el sensor de la
temperatura en uno de los puertos de muestreo. Tener cuidado de no dejar aire
para evitar un registro inadecuado del proceso de congelamiento. Cerrar con
cuidado el canister para evitar maltratar el sensor de la temperatura, y colocarlo
en la gradilla metlica. Ver observaciones para otras opciones para congelar las
bolsas criognicas usando una prensa para congelamiento del equipo CryoMed
Freezer.
Cerrar la puerta de la cmara de enfriamiento y oprimir el botn de RUN del
equipo. Registrar el programa utilizado para el congelamiento controlado y el
tiempo de inicio en el Formato del registro de procedimiento (formato II).
Al final del proceso de congelamiento presionar el botn stop para silenciar la
alarma del equipo. Registrar el tiempo final. (formato I).
Abrir la puerta de la cmara de enfriamiento, remover los canister y el criovial
de las CPH y colocarlos en el depsito de almacenamiento con N2 (l) en la fase
de lquida o de vapor. Anotar el No. del marco metlico (rack), la fase de
almacenamiento de N2 (l) y el sitio dentro del depsito de N2 (l) en el Formato
del registro del procedimiento de criopreservacin , segn el siguiente diagrama:
FIGURA 10. ESQUEMA DE LA LOCALIZACIN DENTRO DEL
CONTENEDOR DE N2 (l).
La curva apropiada del calor latente de fusin deber de estar por debajo de 0C.
Cerrar la puerta de la cmara de enfriamiento y accionar el botn de calentamiento
(warm) para descongelar la cmara. Al terminar, retirar la bolsa control y almacenarla a
-20C y apagar el equipo de congelamiento.
Limpiar la campana de flujo laminar y tirar todo el material desechable en las bolsas
correspondientes.
9.8 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR EL NO. DE CMN DE LAS CPH
MATERIAL REQUERIDO:
Portaobjetos
Microscopio ptico
Pipeta automtica de 50 L
Puntas para pipeta automtica
Tubos de ensayo de 12 x 75 mm
Cmara de Neubauer
Cubreobjetos para cmara de Neubauer
REACTIVOS:
Azul de Tripano al 0.4 %
PROCEDIMIENTO:
Debido a que las CPH son recolectadas en un ambiente abierto y porque muchos de
los pasos de su procesamiento no pueden ser realizados en un sistema completamente
cerrado, hay numerosas oportunidades para la contaminacin con microorganismos. Por
esto, se debe asumir un mtodo estricto de asepsia que deber de ser realizado en el rea
de trabajo dentro de la campana de flujo laminar. Cultivos bacterianos y de hongos
debern ser realizados en las diferentes etapas del procesamiento para determinar si
cualquiera de las tcnicas y/o materiales en uso estn comprometiendo la pureza de
estas.
PROCEDIMINETO:
Las clulas criopreservadas son descongeladas en un bao mara entre 37C y 40C
inmediatamente antes de infundirlas y administrarlas a travs de un catter central.
Aunque la infusin de DMSO ha sido asociada con cierta toxicidad incluyendo nauseas,
vmitos, rubor, incremento en la frecuencia cardiaca y presin sangunea, y elevacin
de las transaminasas en suero, muchos investigadores creen que la manipulacin de las
clulas descongeladas pueden provocar prdida celular inaceptable.
MATERIAL NECESARIO:
Bao Mara
Cronmetro
Agua estril
Solucin desinfectante PRESEPT (Code Nr. SPW50, Johnson & Johnson)
Disolver una tableta de 5 g en 3 litros de agua
Alcohol al 70%
Fenol al 5 %
Refrigerantes
Tubos de vidrio de 12 x 75 mm
Frascos para Hemocultivo y Hongos
Microscopio ptico
Porta y cubre objetos
Azul de tripano al 0.4%
Campos quirrgicos
Contenedor de N2 (l) porttil
Ropa quirrgica
Gasas estriles
Tijeras estriles
Acoplador para toma de muestra
Jeringas desechables estriles de 10 mL y 20 mL
Agujas estriles del calibre 18G
Torundas de alcohol e isodine
Guantes estriles
Cubre bocas
PROCEDIMIENTOS PREVIOS PARA DESCONGELAR LAS CPH
PROCEDIMIENTO:
FORMATO I
PREPARADO
1. Bata quirrgica
2. Cubre bocas
3. Gorro quirrgico
4. Guantes estriles
5. Campos estriles
6. Tijeras inoxidables estriles
7. Pinzas inoxidables estriles (Rocher)
8. Gasas chicas estriles
9. Torundas de algodn (jabn, alcohol, isodine)
10. Alcohol isoproplico al 70%
11. Desinfectante (glutaraldehdo, fenol al 5%, o formaldehdo)
12. Isodine
13. Frascos estriles (100 mL) o matraz Elermeyer de 250 mL
14. Probeta graduada estril (100 mL)
15. Acopladores para toma de muestras (Sampling Site Couplers, Fenwal 4C-2405)
16. DMSO (Dimetilsulfxido) USP (Sigma, Cat. D-1435) o estril (Sigma, Cat
17. Jeringas desechables estriles de 5, 10, y 20 mL
18. Agujas estriles del No, 18G
19. Criobolsa de poliolefina o tefln de 250 mL o 500 mL
20. Canister para criobolsas de poliolefina a 4C
21. Equipo para congelamiento controlado Criomet
22. Nitrgeno lquido N2 (l) a baja presin (22 PSI dewars) criognicos
24. Frascos para hemocultivo (peditricos, 1-3 mL)
25. Tubos para Biometra Hemtica
26. Hielo frppe
27 Refrigerantes envueltos en papel
28. Azul Tripano al 0.4%
29. Cubre y porta objetos
30. Microscopio ptico
32. Grapas metlicas y rodillo
33. Sellador dielctrico
34. Bolsas para desechos
35. Etiquetas de identificacin
36. Crioviales estriles
37. Campana de Bioseguridad
38. Depsito para almacenamiento con Nitrgeno lquido
39. Formato del material necesario para criopreservar CPH (Formato I)
40. Formato de registro del procedimiento para criopreservar CPH (Formato II)
41. Racks numerados
42. Diagrama del sitio de almacenamiento en el depsito de N2 (l)
43. Pipetas automticas de 200 L y 1000 L
44. Puntas desechables para pipetas automticas de 200 y 1000 L
45, Solucin Salina Fisiolgica
46. Conocer la ubicacin del material y reactivos
47. Leer el manual de procedimientos
48. Leer las instrucciones sobre el uso de la bolsa criognica
49. Contenedor para desechos punzo cortantes potencialmente infecciosos
50. Recipiente y bolsas para los desechos
51. Masking tape.
FECHA: _____________________________________________________________________
REGISTRO DEL PROCEDIMIENTO DE CRIOPRESERVACION DE CPH
FORMATO II
IDENTIDAD DE LA MUESTRA
CLASE DE RECOLECCIN
CRIOPRESERVACIN
Observaciones:
_____________________________________________________________________________
Mdico Solicitante:
_____________________________________________________________________________
Realiz procedimiento:
_____________________________________________________________________________
Vo.Bo. Dr.
_____________________________________________________________________________
Fecha
_____________________________________________________________________________
REGISTRO DE LA TEMPERATURA Y NIVEL DE N2 (l) DEL CONTENDOR
FORMATO III
Nivel mnimo para cubrir los diferentes espacios de marco de aluminio (Rack) para bolsas de
500 mL:
Nivel A = 9 pulgadas; Nivel B = 16 pulgadas; Nivel C = 22 pulgadas; Nivel D = 28
pulgadas.
REGISTRO DEL NIVEL DE N2 (l) DE LOS CILINDROS INFRA
FORMATO IV
Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones Fecha Hora Nivel Cambio Observaciones
9.14 FORMATOS, REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFAS
Boletn ISO 9001; 2000. I: Nm. 1, 2002. Hospital Universitario Dr. Jos
Eleuterio Gonzlez, mayo.
Clark DA, et al. Medical schools and hospitals. Interdependence for service. J
Med Educ 1985; 60:22-38.
Freedman A., Gribben J., Neuberg D., et al 1996. High dose therapy and
autologous bone marrow transplantation in patients with follicular lymphoma
during firt remission. Blood 88: 278.
He Y, Wheatley K, Clark O, et al. 2003 Early versus deferred treatment for early
stage multiple myeloma. Cochrane Database Sits Rev (1): CD004023.
Rajkumar SV, Hayman S, Gertz MA, et al. 2002. Combination therapy with
thalidomide plus dexamethasone for newly diagnosed myeloma. J Clin Oncol 20
(21): 4319-23.