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Ministerio de Salud
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
Jr. Cpac Yupanqui 1400,
Jess Mara Telf. 471-3254,
Fax: 471-7443
Lima, Per, 1995
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MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS EN BACTERIOLOGIA DE
TUBERCULOSIS
COMITE RESPONSABLE:
Blgo. Luis Asencios Sols
Blgo. Neyda Quispe Torres
Dr. Hemn Sanabria Rojas.
Dr. Augusto Yi Chu.
REVISION:
Dra. Isabel N. de Kantor
Asesora OPSIOMS
COMITE EDITOR:
Dr. Alfonso Zavaleta Martnez- Vargas
Dr. Jaime Chang Neira
Lic. Liliana Vigil Romero
COLABORACION:
PROGRAMA NACIONAL DE ENFERMEDADES
TRANSMISIBLES: CONTROL DE TUBERCULOSIS
Dr. Pedro Guillermo Surez Aguilar
Director
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INDICE
PRESENTACIN ........................................................................................................7
INTRODUCCIN .......................................................................................................8
RESOLUCIN JEFATURA .......................................................................................9
CAPITULO I
LAS MUESTRAS
CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA (Examen microscpio)
CAPITULO III
EL CULTIVO
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3.8 Envo de cultivos al Laboratorio de Referencia
de tuberculosis (Anexo 7).........................................................................................32
3.9 Requerimientos para la preparacin del medio
a base de huevo.........................................................................................................33
CAPITULO IV
REFERENCIAS BIBLIOGAFICAS ..........................................................................36
ANEXOS .......................................................................................................................37
Anexo 1:
Solicitud para la investigacin bacteriolgica en TBC ............................................38
Anexo 2:
Registro de muestras para investigacin
bacteriolgica en TBC ..............................................................................................40
Anexo 3:
Preparacin de reactivos para baciloscopa ..............................................................42
Anexo 4:
Cantidad de reactivos y clculos de mdulo individual
para baciloscopa ......................................................................................................43
Anexo 5:
Parmetros para programacin del mdulo individual ............................................44
Anexo 6:
Preparacin del material para Cultivo de Microbacterias ........................................ 46
Anexo 7:
Informe mensual de baciloscopa y cultivo .............................................................. 48
Anexo 8:
Directiva N 001-95: Prueba de sensibilidad de Micobacterium tuberculosis
a los medicamentos antituberculosos ....................................................................... 49
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PRESENTACION
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INTRODUCCION
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CAPITULO I
LAS MUESTRAS
1.0. ASPECTOS GENERALES
1.1.1.a. Calidad:
1. 1. 1.b. Calidad:
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mientras dure la terapia antituberculosa.
1. 1.1.d. El Envase:
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1.1.1.e.2.Muestra matinal:
Las etapas son en esencia las mismas que las descritas para la
obtencin de las muestras en el momento de la consulta. Debe darse
al paciente otro recipiente numerado, el que llevar a su domicilio,
con instrucciones para que escupa en su interior al levantarse por la
maana y siempre antes del desayuno. El paciente debe colocar el
envase con la tapa bien cerrada en una bolsa plstica y llevarlo al
laboratorio inmediatamente.
1.1.2.2 Nebu/izaciones .
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recolector. El personal que recoge la muestra debe adoptar las medidas
de bioseguridad y las precauciones correspondientes.
1.2.1 Orina
La muestra ms recomendada es la muestra de orina obtenida en la
primera miccin de la maana, previa higiene externa con agua y jabn.
Es preferible recolectar entre 300-500 mI. en un envase limpio y estril
de boca ancha, que facilite la recoleccin directa. La muestra debe ser
procesada inmediatamente siempre por cultivo. Se sugiere cultivar por lo
menos tres muestras seriadas.
Debe recordarse que la prueba de baciloscopa efectuada al sedimento
urinario no necesariamente es diagnstico concluyente de
tuberculosis, por cuanto existen mycobacterias saprofitas en orina,
que pueden producir resultados falsos positivos en el examen de
baciloscopa.
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1.2.5 Biopsias y material resecado
Se utiliza un envase estril. La muestra se divide en dos partes: una
parte se enva de inmediato al laboratorio para el cultivo y la otra se
conserva o enva para el estudio histopatolgico en un frasco con
formol al 10%.
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1.3.3. Recepcin de la muestra:
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CAPITULO II
LA BACILOSCOPIA
(EXAMEN MICROSCOPICO)
La baciloscopa es un examen bsico para el diagnstico de la tuberculosis, til
para el control de la evolucin del tratamiento administrado al paciente, por lo que su
conocimiento debe alcanzar a los servicios de salud del pas de todos los ni veles. En
el Anexo l se muestra la ficha utilizada para efectuar las solicitudes de investigacin
bacteriolgica de Micobacterias en tuberculosis.
- Recepcin de muestras.
- Preparacin y fijacin de los extendidos.
- Coloracin de los extendidos.
- Para microscopa y registro de resultados.
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- Bandeja de acero inoxidable o fierro enlozado para recepcin de
muestras.
- Tres frascos tipo cuentagotas para los colorantes y decolorantes; de
preferencia 2 juegos.
- Papel carbn (opcional).
- Papel de filtro.
- Un recipiente de latn con tapa para incineracin del material
contaminado.
- Aceite de inmersin.
- Tolueno o bencina.
- Reactivos: fucsina bsica, azul de metileno, fenol en cristales, cido
clorhdrico, alcohol de 95 comercial yagua destilada. Libro de
Registro.
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2.2.2. Identificacin de muestras y lminas.
- Numerar los envases. Numerar las lminas portaobjetos empleando un
lpiz graso, en forma correlativa. Deber trazarse una lnea en cada
lmina portaobjeto empleando el lpiz graso, la que dividir la
superficie en una tercera parte destinada a la numeracin y dos terceras
partes para hacer el extendido. Esta lnea debe trazarse en la cara
inferior de la lmina a fin de evitar que se borre la numeracin al
momento de efectuar la coloracin.
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- Colocar la partcula til sobre el portaobjeto y extenderla, haciendo
movimientos de vaivn, hasta lograr que el extendido sea homogneo (ni
muy fino ni muy grueso), que no llegue a los bordes de la lmina, para
evitar que el operador se contamine al manipularla. Por ningn motivo
debe calentarse la lmina mientras se haga el extendido, debido a que
por el calor se forman crculos concntricos y precipitados granulosos.
- Pasar por la llama del mechero los bordes de la lmina extendida,
colocar sobre el soporte de madera y dejar secar a temperatura ambiente.
- Terminado el extendido, descartar los aplicadores en el receptculo de
incineracin, cerrar el envase y proseguir en igual forma para las dems
muestras.
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2.3.1. Primer Paso: Coloracin de bacilos
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- Eliminar la fucsina tomando la lmina por el extremo numerado, entre el
dedo pulgar y el ndice o con una pinza, inclinndola hacia adelante y
dejando caer agua corriente a baja presin sobre la parte que no tiene el
extendido.
- Una vez eliminado el alcohol cido lavar nuevamente la lmina con agua a
baja presin, cuidando de no desprender la pelcula que form el
extendido.
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2.3.3. Tercer Paso: Coloracin de fondo
- Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de metileno,
previamente filtrado, durante 30 segundos a un minuto.
- Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con agua a baja presin,
por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).
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2.4. OBSERVACION MICROSCOPICA DE LA MUESTRA COLOREADA
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tiles, lo que un laboratorista capacitado hace en aproximadamente 5 minutos. Se
considera campo microscpico til aquel en el cual se observa elementos
celulares de origen bronquial (leucocitos, fibras mucosas y clulas ciliadas). Los
campos en que no aparezcan dichos elementos no deben contabilizarse en la
lectura.
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Al trmino de la lectura retirar la lmina de la platina del microscopio, limpiar el
aceite de inmersin de la lmina con tolueno y guardar la lmina. Limpiar el exceso
de aceite del objetivo de inmersin del microscopio con papel lente humedecido con
tolueno.
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2.9. REGISTRO DIARIO DE BACILOSCOPIAS
Los registros son medios prcticos para obtener informacin que ayudan en las
actividades de vigilancia, supervisin y evaluacin del Programa. Adems
ofrecen la informacin necesaria para preparar los informes mensuales y
trimestrales sobre deteccin y control de casos.
Una vez terminadas las lecturas, debe hacerse el registro diario de las
baciloscopas para su informe al Programa Nacional de Control de
Tuberculosis. Utilizar una numeracin correlativa anual (se empezar
anualmente el 2 de enero y terminar el 31 de diciembre del mismo ao, desde
el nmero 1 hasta el ltimo correspondiente).
2.11.3. Las partes pticas y las lentes deben limpiarse cuidadosamente con un
trapo de lino fino o piel de gamuza que no desprenda pelusa. Nunca
debe friccionarse el papel o gamuza sobre la lente.
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acumulacin de polvo y pelusas. El microscopio debe guardarse en su
estuche de proteccin (con una bolsa conteniendo no menos de 0,5 kg.
de Silicagel seco de color azul) lejos de la humedad y polvo.
2.11.8. Utilizar alcohol etlico 95 para la limpieza de lentes de los oculares, filtro
y todos los elementos y lentes de condensador.
2.11.9. Para la limpieza diaria del microscopio se requiere disponer del siguiente
material:
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CAPITULO III
EL CULTIVO
3.1. ASPECTOS GENERALES E INDICACIONES DEL METODO DE
CULTIVO PARA MYCOBACTERlUM TUBERCUWSlS.
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3.2.1. Procedimiento para muestras obtenidas asepticamente:
Las muestras obtenidas aspticamente, que recolectadas en un recipiente
estril pueden cultivarse prescindiendo del proceso de descontaminacin
incluyen a:
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3.3. CONSERVACION DE LA MUESTRA
3.5.1. PROCEDIMIENTOS
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las tapas).Agregar4 mI. de solucin estril de hidrxido de sodio (
NaOH) al 4 %.
3.5.l.c. Dejar a 37C por 20 minutos en estufa (o bao mara).
3.6. LECTURA
El desarrollo de M. tuberculosis generalmente aparece luego de 2 a 3 semanas.
Las colonias tpicas son de color crema, secas, rugosas de aspecto de coliflor.y de
borde irregular. (Fotos 2, 3 Y 4).
- No se observan colonias.
N... Nmero total de colonias, si hay menos de 20.
+ De 20 a 100 colonias.
++ Colonias separadas ms de 100.
+++ Colonias confluentes (se observa desarrollo en toda la superficie del
medio).
c Cultivo contaminado.
Se debe realizar frotis y coloracin Ziehl-Neelsen de las colonias que no
tienen morfologa tpica. De observarse B.A.A.R.*, se enviar el cultivo
para su tipificacin al I.N.S.
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3.8. l. Objetivos del envo de cultivos al laboratorio referencial:
Las cepas se enviaran al Laboratorio de Referencia para:
- Balanza analtica.
- Esptula.
- Papel glacine.
- Erlenmeyer (500 mI), para preparar la solucin.
- Probeta (100 mi), para medir agua destilada, para la solucin de sales.
- Bao mara, para disolver la solucin de sales.
- Fosfato monopotsico (KH2PO4).
- Glutamato de sodio.
- Agua destilada.
- Huevos frescos
- Algodn, para la limpieza de los huevos
- Baguetas o palillos, para homogenizar los huevos
- Gasa, para filtrar el huevo homogenizado (4 capas de gasa estril)
- Probeta (250 mi), para medir el huevo homogenizado
- Beaker (500 mI), para homogenizar los huevos
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- Embudo, para filtrar el huevo homogenizado
- Beaker (100 mI), para verificar la calidad de los huevos
- Pipetas (10 mi), para adicionar glicerol y verde de malaquita al 2%
- Glicerol
- Verde de malaquita al 2%
- Coagulador
- Bolsas de plstico para guardar los medios
- Refrigeradora
3.10.1. INGREDIENTES:
3.10.2 PROCEDIMIENTOS
Lavar los huevos con detergente y enjuagar con agua de cao, dejar secar
en una canastilla de alambre.
Limpiar los huevos con algodn embebido en alcohol al 70% y dejar secar.
Romper los huevos uno por uno y vertir en un vaso pequeo, para
comprobar si estn en buenas condiciones, de 10 contrario descartar y
cambiar de vaso.
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Vaciar los huevos en un beaker y homogenizar con una bagueta o palillos
estriles, filtrar utilizando cuatro capas de gasa estril.
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CAPITULO IV
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. CASAL, M. (1990). Microbiologa Clnica de las enfermedades por
Micobacterias: Facultad de Medicina, Universidad de Crdoba, Espaa: 19-42.
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ANEXOS
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 1
INSTRUCTIVO SOLICITUD PARA INVESTIGACION
BACTERIOLOGICA EN TUBERCULOSIS
2. Filiacin del paciente: Anotar apellidos y nombres, edad, sexo, historia clnica o fichafamiliar.
3. Marcar con aspa (x) el tipo de muestra. Si es otra diferente a Esputo, mencionar en la lnea
punteada.
l. Nunca Tratado: Marca con aspa (x) si no recibi tratamiento en una anterior oportunidad
(virgen al tratamiento).
2. Antes Tratado: Marca con aspa (x) en la categora RECAIDA si el sintomtico respiratorio
identificado recibi un tratamiento completo exitoso (curado) y existe la
sospecha de recada, al solicitar la baciloscopa o en la categora
ABANDONO si el paciente no concurri a recibir tratamiento previo por
ms de 30 das consecutivos.
6. Para control de.- Marcar con aspa (x) el mes de tratamiento actual. En caso de retratamiento,
anotar en la lnea punteada el mes correspondiente.
RESULTADOS:
- Se marcar en los casilleros correspondientes el resultado: si es Positivo marcar el nmero
de cruces (+) (++) (+++) con tinta roja y Negativa (-) con tinta azul o negra, anotando el
N de Registro que es el mismo N de Orden del Libro de Registro de Muestras para
Investigacin Bacteriolgica enTuberculosis y la fecha correspondiente, tanto para el caso
de baciloscopa como para Cultivo.
- Escribir el nombre del laboratorio y la fecha en que se procesa la muestra.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 3
4. Cada vez que las soluciones colorantes sean trasvasadas a los pequeos frascos
cuentagotas que se emplean para la tincin, deben filtrarse; esto es
especialmente necesario para la fucsina fenicada, porque con el tiempo se
forman pequeos cristales que son causas de error al hacer la lectura de las
lminas. Los frascos cuentagotas y sus tapas deben ser lavados con todo cuidado
cada vez que se renueve su contenido.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
INSTRUCTIVO ANEXO 5
La Programacin por Mdulo Individual para el PeT, debe realizarse todos los
aos en el mes de Julio, en la primera quincena e inmediatamente despus remitir al
nivel correspondiente para su consolidacin.
I. ATENDIDOS:
Enfermos con Tuberculosis (E), programar segn la prevalencia local por 100
habitantes y con el too% de la poblacin.
II. ATENCIONES:
Baciloscopas de Diagnstico, 15 por enfermo y 3 de control.
III. INSTRUMENTOS:
Horas Baciloscopista. Rendimiento 5 baciloscopas por hora.
4. Aceite de inmersin, se requiere 0.36 cc. por enfermo o por cada 10 S.R.
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 6
REACTIVOS:
Hidrxido de sodio (NaOH) al 4% : : 0.16g para 4ml.de NaOH al 4%
Glutamato Monosdico : 0.02 g
Fosfato Monopotsico (KHlO.) : 0.06 g
Glicerina : 0.12 ml
Verde Malaquita : 0.0024g
Agua destilada : 2 ml
Huevos de gallina : 4 ml (01 huevo para 10 cultivo
Fenolal5% : 05 ml (01 litros de fenol
Cristalizados da 20 litros
de fenol 5%)
INSTRUMENTAL:
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INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
RED NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD
ANEXO 8
DIRECTIVA N 001-95
_________________________________________
* Las indicaciones han sido tomadas y adaptadas de las Directivas 001-94-INS y 014-94
PCT.
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5) El medio no deber estar alcalinizado (color amarillo), acidificado (color
azulino) ni contaminado con hongos.
7) Los tubos de cultivo debern estar sellados con cinta adhesiva para asegurar
el cierre hermtico.
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PUBLICACIONES DEL INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
ZAVALETA, A.; VERGARA, R.; VADILLO, B.; BARRIENTOS, A.; VENTO, C (1991).
Control de Calidad de Especialidades Far-macuticas y Productos Galnicos.
Manual de Procedimientos Administrativos. Carrillo, C.; Aguilar O., J.;
EspinozaA, A; Galvn, H.; Higuchi O., E. y Zavaleta, A (Eds). Ministerio de
Salud, Instituto Nacional de Salud, Centro de Control de Calidad. Red de
Laboratorios de Control de Calidad de Medicamentos. Serie de Normas Tcnicas
N 4. Lima, Empresa Grfica Cosmos. 44 pgs.
CARRILLO, C; BURSTEIN, M; AGUILAR, J.; BRAVO, N; MURGUIA, M
(1991). Normas de Calificacin de Laboratorios para Emisin de Certificados
Oficiales de Clera. Carrillo, C.; Aguilar O., J.; Burstein P., M.; Espinoza A, A;
Galvn, H.; Higuchi O., E. Y Zavaleta, A (Eds). Minis terio de Salud, Instituto
Nacional de Salud. Red de Laboratorios de Clera. Serie de Normas Tcnicas N
5. Lima, Art. Lautrec, 14 pgs.
51
QUlSPE T.N. Y DIAZ DE SILVA, S. (1995). Manual de normas de control de calidad
de las baciloscopas. Zavaleta, A; Vigil, L.; Cabezas, C. (Eds). Ministerio de
Salud, Instituto Nacional de Salud. Centro Nacional de Laboratorios de Salud
Pblica. Red Nacional de Laboratorios de Salud. Laboratorio de Referencia
Nacional de Mycobacterias. Serie de Normas Tcnicas N 7. Lima, Art. Lautrec,
20 pgs.
OTRAS PUBLICACIONES
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ANOTACIONES
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Esta publicacin se termin de imprimir
en mayo de 1995 en los
Talleres Grficos de Art. Lautrec S:R:Ltda..
Av. Paseo de la Repblica 731 Lima 13
Tel/fax: 423-7616
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