INTRODUCCIN

Durante muchos aos, el anlisis de cidos grasos de cadena corta (voltil

cidos grasos, AGV) se ha utilizado de forma rutinaria en la identificacin de
bacterias anaerobias. En numerosos trabajos cientficos, la grasa
cidos de entre 9 y 20 carbonos de longitud tambin han sido
utilizado para caracterizar los gneros y especies de bacterias, especialmente
organismos Gram negativos no fermentadores. Con el advenimiento
de las columnas capilares de slice fundida (que permite la recuperacin de
hidroxicidos y resolucin de muchos ismeros), tiene
convertido prctico utilizar la cromatografa de gases de clulas enteras
grasos steres metlicos de cidos para identificar una amplia gama de
organismos.
CIDOS GRASOS encuentran en las bacterias
Ms de 300 cidos grasos y compuestos relacionados tienen
han encontrado en bacterias analizadas en la investigacin y MIDI
Laboratorio de desarrollo. La gran cantidad de informacin contenida
en estos compuestos puede ser estimado al no considerar
slo la presencia o ausencia de cada cido, sino tambin mediante el uso de
los datos de forma cuantitativa. Mientras que la capacidad terica de
diferenciar entre las 2300 combinaciones diferentes no es prctico
debido a la distribucin no aleatoria dentro de los grupos de bacterias,
la enorme cantidad de cidos grasos crea una gran "nombrar" poder
para el Sherlock MIS.
Sherlock MIS utiliza cidos grasos de 9-20 tomos de carbono de longitud. los
picos se nombran y se cuantificaron por el sistema de forma automtica.
cidos de cadena ramificada que predominan en algunos Gram positiva
bacterias, mientras que los hidroxicidos de cadena corta a menudo
caracterizan
los lipopolisacridos de las bacterias Gram negativas. los
estructuras de algunos de estos compuestos se muestran en la figura
1. En esta nota, todos los compuestos se conocen como cidos grasos,
a pesar de que los compuestos reales pueden ser aldehdos, hidrocarburos,
o dimetil acetales, y se analizan tpicamente como la
steres metlicos. El sistema de asignacin de nombres utilizadas en la
presente nota es
contar carbonos desde el extremo "omega" (es decir, frente a la carboxilo
final) y para indicar las otras estructuras que sean conocidas. los
varias combinaciones de caractersticas pueden resultar en muy grande
nmero de cidos grasos. Aunque la mayora de las identificaciones de cidos
grasos
han sido confirmados por espectrometra de masas, algunos son todava
"desconocido" o con una letra que indica que la doble
posicin de enlace y / o la configuracin no ha sido confirmado.
Cultivo de las BACTERIAS
El perfil de cidos grasos celular ms estable y reproducible es
logrado mediante la regulacin cuidadosamente las condiciones de
crecimiento.
Varios trabajos cientficos han informado de los efectos del crecimiento
temperatura y de diferentes medios de cultivo bacteriano en grasa
composicin de cidos. Para reducir al mnimo estas variables, una especfica
temperatura y medio de crecimiento han sido elegidos para cada
biblioteca. Por ejemplo, la mayora de las bacterias aerobias se desarrolla bien
con
Trypticase Soy Broth Agar (TSBA), que consiste en 30 g
El caldo tripticasa de soja y 15 g de agar (BBL). aquellos aerbico
bacterias, que no se desarrolla bien con TSBA, se cultivan en el
medio que se utiliza ms comnmente para su
crecimiento en el laboratorio (por ejemplo, Legionella sobre carbn tamponada
extracto de levadura, y Haemophilus en agar chocolate). La temperatura
elegido para la base de datos TSBA era 28 C para permitir
crecimiento de una amplia gama de organismos. Una base de datos
independiente,
CLIN, utiliza 35 C y agar sangre (base de soja Trypticase) como el
normas, con medios especializados de organismos especficos. Para las
bacterias anaerobias, los usos de conjuntos de datos basados en la placa
culturas cultivadas a 35 C en infusin de cerebro y corazn con suplementos.
Una base de datos que contiene ms de 800 entradas era
desarrollado (por el Laboratorio de anaerobios VPI), utilizando toda la noche
culturas de caldo de extracto de glucosa-peptona-levadura.
El efecto de la edad se reduce al mnimo en los caldos de cultivo de
la cosecha en una turbidez dado. Al utilizar cultivos en placa,
el perodo de crecimiento es de 24 horas para aerobios y 48 horas para
anaerobios. La estandarizacin de la edad fisiolgica de la cultura es
obtenido mediante la eleccin del sector de un cuadrante consecutivas en el
placa (Figura 2). organismos de crecimiento lento pueden incubarse
durante el periodo de tiempo necesario para obtener un crecimiento adecuado.
REACTIVOS
Se requieren cuatro reactivos para escindir los cidos grasos de los lpidos:
Reactivo 1, hidrxido de sodio saponificacin-45g,
metanol 150 ml, y 150 ml de agua destilada. dispensar
a travs del uso de un autopipet asegura la reproducibilidad y
permite un gran nmero de ensayos en un da.
Reactivo 2, 6.0N certificado metilacin-325ml
cido clorhdrico y 275 ml de alcohol metlico. Esto deja caer el
pH de la solucin por debajo de 1,5 y provoca la metilacin (para el
aumento de la volatilidad en una columna parcialmente polar) de la grasa
cido. El ster metlico de cido graso es poco soluble en el
fase acuosa en este punto.
Reactivo 3, hexano extraccin en 200 ml y 200 ml de metilo
terc-butil ter. Esto va a extraer los steres metlicos de cidos grasos
en la fase orgnica para su uso con el cromatgrafo de gases.
Reactivo 4, hidrxido de sodio Muestra Cleanup-10,8 g
disuelto en agua destilada 900 ml. Este procedimiento reduce
la contaminacin del revestimiento puerto de inyeccin, la columna, y el
detector. Ms de 10.000 anlisis se pueden realizar en una
la columna antes de necesitar ningn tipo de mantenimiento.
Procesamiento de la muestra
Los cinco pasos para preparar extractos GC listas se ilustran
en la Figura 3.
Cosechar-Un bucle de 4 mm se utiliza para cosechar acerca
40 mg de clulas bacterianas de la tercera cuadrante (segunda
o si primer cuadrante de crecimiento lento) del cuadrante
placa rayada. Las clulas se colocan en un 13x100 limpio
tubo de cultivo.
La saponificacin-1,0 ml de Reactivo 1 se aade a cada
tubo que contiene las clulas. Los tubos estn sellados de forma segura con
con tubo de tefln tapas, se agitan brevemente y se calienta en un punto de
ebullicin
bao de agua durante ca. 5 minutos, momento en el que los tubos estn
vigorosamente agitan con vrtex durante 5-10 segundos y devuelto a la
bao de agua para completar el calentamiento de 30 minutos.
El metilacin enfri tubos son destapado, 2 ml
de Reactivo 2, se aade. Los tubos se taparon y brevemente
vortex. Despus de agitacin, los tubos se calentaron durante 10 1
minutos a 80 1 C. (Este paso es crtico en el tiempo y
temperatura.)
La adicin de 1,25 ml extraccin- de Reactivo 3 a
los tubos enfriados va seguido de volver a tapar y gentil
de volteo en un rotador clnica durante aproximadamente 10 minutos.
Los tubos son sin lmite y la fase acuosa (inferior)
fase se pipetea a cabo y se desecha.
Base Washing- Acerca de 3 ml de Reactivo 4 se aade a
la fase orgnica restante en los tubos, los tubos
se vuelven a tapar y se volte durante 5 minutos. Siguiendo
uncapping, alrededor de 2/3 de la fase orgnica se pipetean
en un vial de GC que tiene un tope y lista para el anlisis.
FACTORES DE HARDWARE
El Software Sherlock MIS slo se puede utilizar con el Agilent
Tecnologas 5890, 6890 o 6850 cromatgrafos de gases.
La configuracin nica del Sistema de Sherlock est diseado
para un anlisis ptimo de los steres metlicos de cidos grasos por el gas
cromatografa.
Ultra 2 Columna-A de silicona de 25 m x 0,2 mm de fenil metil
columna capilar de slice fundida tiene tanto la cromatogrfico
el rendimiento y la duracin de la columna deseada para la rutina
anlisis de extractos bacterianos. Se requiere que el la columna de tener
ms de 4.000 platos tericos por metro de picos con
k = 7 a 9. Dado que la fase estacionaria es transversal ligada a la
tubo de slice, hay menos ruido y la deriva durante temperatura
carreras programadas. rampas-El cromatgrafo de programa de temperatura
de gas
de 170 C a 270 C a 5 C por minuto. Siguiendo el
anlisis, un aumento balstico a 300 C permite la limpieza de la
columna durante una bodega de 2 minutos. La ionizacin de llama
detector permite un gran rango dinmico y proporciona una buena
sensibilidad. El hidrgeno es el gas portador, el nitrgeno es el
gas "maquillaje", y el aire son utilizados para mantener la llama.
Automuestreador-El uso de un muestreador automtico permite que el sistema
ser operado sin supervisin durante un mximo de 2 das a la vez. Las
muestras
se registran en la tabla de ejemplo computarizado y todos
de muestreo (incluyendo muestras STAT) se realiza automticamente.
Computer-La seal electrnica del detector GC es
se pasa al equipo en el que la integracin de los picos es
realizado. La electrnica de datos se almacena en el disco duro y
la composicin de ster metlico de cido graso de la muestra es
en comparacin con una base de datos almacenada con el patrn de Sherlock
software de reconocimiento.
Figura 3 Preparacin de la muestra
CALIBRACIN Y PICO DE NOMBRE
El Sherlock MIS utiliza un estndar de calibracin externa
desarrollado y fabricado por Microbial ID, Inc. El
estndar es una mezcla de la grasos saturados de cadena lineal
cidos de 9 a 20 carbonos de longitud (9: 0 a 20: 0) y cinco
los hidroxicidos. Todos los compuestos se aadieron cuantitativamente por lo
que el rendimiento de cromatografa de gases se puede evaluar
por el software cada vez que se analiza la mezcla de calibracin.
Los compuestos hidroxi son especialmente sensibles a los cambios
en las relaciones de presin / temperatura y la contaminacin
del revestimiento puerto de inyeccin. Como resultado, las tesis de los
compuestos
funcionan como controles de calidad para el sistema
los datos de tiempo de retencin obtenidos con la inyeccin de la calibracin
la mezcla se convierte en la cadena de longitud equivalente (ECL)
datos para la denominacin de cido graso bacteriano. El valor de ECL
cada cido graso puede ser derivada como una funcin de su elucin
tiempo en relacin con los tiempos de elucin de una serie conocida de
cidos grasos de cadena lineal.
Cuando Rtx es el tiempo de retencin de x; Rtn es el tiempo de retencin
de la metlico de cido graso saturado anterior ster x; Rt (n + 1)
es el tiempo de retencin del ster metlico de cido graso saturado
elucin despus de x.
Por lo tanto, es posible, en comparacin con el estndar externo,
para calcular el valor ECL para cada compuesto despus de una
anlisis. La GC y la columna permiten ventanas que se establecern a
0.010 unidad de ECL amplia dando una gran precisin en la resolucin de
ismeros. Despus de nombrar los picos en una muestra desconocida,
Sherlock compara los valores de ECL para la ms estable
serie (por ejemplo, de cadena lineal saturado o cidos de cadena ramificada)
a los valores tericamente perfectos de la tabla de nombres y pico
puede volver a calibrar internamente si se detectan diferencias suficientes.
Esta caracterstica permite que el sistema se ejecute durante un mximo de
dos das
sin atencin y sin tener que preocuparse por la deriva entre las corridas.
BIBLIOTECAS
Las bibliotecas Sherlock consisten en ms de 100.000 anlisis
de cepas obtenidas de expertos y de las colecciones de cultivos.
Los cultivos se recogieron de todo el mundo para evitar
potencial de sesgo geogrfico. Siempre que sea posible, 20 o ms cepas
de una especie o subespecie se analizaron para hacer la entrada.
Cuando se encontraron los subgrupos dentro de un cromatogrficas
taxn, se obtuvieron ms cepas de delinear cada grupo.
El mtodo de la cultura y la biblioteca correspondiente es
se indica en el campo de nombre de la muestra, ya que se registra en
el ordenador. Anlisis de un desconocido resultados de la muestra en una
comparacin automtica de la composicin de lo desconocido
cepa a una base de datos almacenada utilizando una matriz de covarianza, el
director
El anlisis de componentes y el software de reconocimiento de patrones.
La matriz de covarianza tiene en cuenta el topo-para-mole
relacin de la conversin de un cido graso a otro
(Por ejemplo, 16: 0 a 16: 1 debido a la accin de una desaturasa), que
que podra ocurrir en relacin con un cambio de temperatura o la diferencia de
edad.
El software de reconocimiento de patrones utiliza clculos de cruz
Los trminos (por ejemplo, relaciones entre las cantidades de cidos grasos),
adems de
la base principal componente. Las diferencias sutiles
entre biotipos o subespecies depende del poder de
el software de reconocimiento de patrones para discriminar a este nivel.
Las bibliotecas estn abiertas (es decir, no limitados por un conjunto finito
de ensayos bioqumicos) y el nmero de especies en ellas
es grande y creciente. Las bibliotecas son limitadas solamente por MIDI
capacidad para obtener un nmero suficiente de cepas para que la
las entradas. Por supuesto, algunos grupos de bacterias son ms susceptibles
para el anlisis de la composicin de cidos grasos para la identificacin de
otros.
Esto se refiere a si las cepas bien caracterizadas estn disponibles
y si las "especies" puede justificarse sobre la base de
parentesco de ADN (por ejemplo Escherichia coli est relacionada en el
a nivel de especie Shigella dysenteriae [vase Brenner, Int. J.
Syst. Bacteriol. 23: 298-307).