Aplicaciones de la

Biotecnologa
Vegetal en la
Fitopatologa
 Qu es la Biotecnologa ?
La Biotecnologa es toda aplicacin tecnolgica que
utilice sistemas biolgicos u organismos vivos o sus
derivados para la creacin o modificacin de
productos o procesos para usos especficos.
Convenio sobre Diversidad Biolgica,1992
 Biotecnologa Vegetal
Conjunto de tcnicas de cualquier tipo,
empleadas sobre vegetales como organismos
enteros o sobre alguna de sus partes (tallos,
hojas, orgnulos etc.)
 Virologa

Biologa
Fisiologa Molecular
Vegetal

Biotecnologa
Vegetal
Botnica

Bioqumica

Biologa
Agricultura
Celular
Historia de la Biotecnologa Vegetal
Biotecnologa tradicional
Descubrimiento de la agricultura (8000-7000 ac)
Fabricacin de cerveza de los sumerios (6000 ac)
Elaboracin del vino en Mesopotamia (5000-4000 ac)
Produccin del pan en Egipto (4000-3000 ac)
 Biotecnologa Clsica (siglo XIX)
La finalidad principal es la mejora de
distintas plantas para obtener variedades
con las caractersticas seleccionadas
Introduccin consciente de la diversidad
gentica en las poblaciones cruzando
progenitores con caractersticas notables
Es ptima para el manejo de
caractersticas que depende de la
interaccin de muchos genes
 Biotecnologa moderna (a
partir 1970)
Se apoya en la puesta en
prctica de la ingeniera
gentica, consiste en introducir
informacin gentica nueva en
un organismo para dotarlo de
capacidades que antes no
posea
Ofrece mejoras para caracteres
que dependen de un nmero
de genes reducido
 Ventajas y desventajas de la
Biotecnologa
1) Ventajas

Rendimiento superior

Reduccin de pesticidas

Aumento de resistencia frente a patgenos

y deficiencias nutricionales
2) Desventajas

Riesgos para el medio ambiente

- Polinizacin cruzada

- Cultivos modificados con genes que producen toxinas

insecticidas (B. anthracis)

- Perdida de biodiversidad

- Mayor inestabilidad frente a variables ambientales

Riesgos para la salud:

-Transferir toxinas o compuestos alergnicos de unas especies a
otras

- Problemas ticos
 Plantas transgnicas

Organismos en los que se

han introducido genes
que proceden de otras
especies o en los que se
ha modificado la
expresin de sus propios
genes, incorporndosele
o no DNA de otras
especies
 Propagacin clonal rpida

El callo y el cultivo de clulas individuales

Produccin
plantas
transgnicas
Protoplastos vegetales

Haploides
 Propagacin clonal rpida

Cultivo in vitro de un meristemo o yema apical aislado de un vstago

A veces se utilizan para obtener plantas sanas libres de patgenos a
partir de plantas madre cuya sanidad se desconoce

La frecuencia con la que se obtienen plantas sanas aumenta:

- Cultivos con sustancias que inhiben patgenos
- Cultivos expuestos a elevadas temperaturas

Aplicaciones en Fitopatologa:
- Aporta estabilidad gentica o ausencia de mutaciones

- Plantas libres de patgenos (saneamiento)

 El callo y cultivos de clulas
individuales
Callo:
Tejido desorganizado formado por una masa de
clulas tumorales debido a que stas crecen de
manera descontrolada. La mayora de estas
clulas estn en estado diferenciado salvo algunas
que revierten al estado indiferenciado.
Consiste en regenerar plantas a partir de clulas
desorganizadas y diferenciadas pero siempre
que estas reviertan al estado de meristimoide y/o
embrioide

Cultivo del callo:

- Agar
- Macronutrientes y micronutrientes
- Agua
Aplicaciones del callo y cultivos de clulas
individuales en Fitopatologa:

Estudiar los efectos que presentan ciertas sustancias

secretadas por patgenos

Estudiar el comportamiento del patgeno (parsitos obligados)

Estudiar barreras estructurales y sustancias bioquimicas que

producen las clulas y tejidos de las variedades vegetales
resistentes

Probar in vitro sustancias qumicas

 Protoplastos vegetales
Protoplasto: es una clula vegetal, bacteriana
o fngica que ha perdido su pared celular para
lo cual se usan mtodos mecnicos o
enzimticos

Los virus se introducen en las plantas mediante

el empleo de protoplastos utilizando:
- Fusgeno
- Liposomas

Una vez introducido el virus con la variable de

estudio, los protoplastos se introducen en medios
nutritivos con :
- Toxina
- Patgenos
A continuacin se observa la resistencia de cada
protoplasto
 Plantas Haploides

Anteras Clulas Plantas

Haploides haploides

Dado que las microsporas son los productos de la meiosis, la

constitucin gentica de cada microspora y de cada una de las
plantas haploides que derivan de ellas difieren de la
constitucin gentica de las dems microsporas y plantas
haploides.
Dotacin gentica 1N Fcil aislamiento de genes
menores que confieren
resistencia
Aplicaciones de las plantas haploides en
Fitopatologa

Inoculacin del material con virus y otros patgenos y

su posterior seleccin para obtener resistencia a las
enfermedades

Diploidizacin o inoculacin del tejido dihapolide

seguida de una seleccin del material vegetal para
obtener resistencia contra los patgenos

Inoculacin y seleccin del tejido vegetal para obtener

resistencia contra las enfermedades
 TCNICAS DE INGENIERA GENTICA
QUE SON IMPORTANTES PARA LA
FITOPATOLOGA

1. Biologa Molecular Vegetal

2. Biologa Molecular de los Fitopatgenos
3. Vectores que se utilizan para Clonacin
Gentica en plantas
1. Biologa Molecular Vegetal
 Clulas Vegetales
Tienen tres genomas de DNA de doble
banda separados pero intercalados:
Genoma Nuclear:
Est dividido en cromosomas y es el
ms grande.
Tpico de los organismos eucariticos
Genoma Mitocondrial:
Molcula de DNA circular pero que a
veces es lineal
Puede consistir tambin en varias
molculas e incluso puede contener
pequeas molculas de DNA parecidas a
plsmidos
De naturaleza tanto eucaritica como
procaritica
Los ribosomas presentan un tamao
intermedio
Utilizan un cdigo gentico que varia un
poco del universal
 Genoma de los Cloroplasto:
Consta de una molcula de DNA circular
Su sistema gentico es esencialmente de naturaleza procaritica
Los ribosomas son mas pequeos que los del genoma nuclear y del
mismo tamaos que los de las bacterias.
 Funciones Bsicas del DNA de cada Genoma

Se Replica:
Produce copias exactas de ciertas partes de cada molcula de DNA o del
todo el genoma.
Las copias:
Permanecen en la misma clula.
Son distribuidas en cada una de las clulas hijas
Es Transcrito en RNA: este puede ser:
RNA ribosomal (RNAr).
RNA de transferencia (RNAt).
RNA mensajero (RNAm) Son los nicos que pueden traducirse a
protenas
Casi todos los RNAs son Procesados son modificados por la
clula antes de que maduren.
 Gen
Definicin Cada segmento de DNA que es transcrito
en un RNA funcional.
Cuando se expresa? Cuando se transcribe a RNAm.
Proceso:
RNAm
Traduce
Protena
Transloca
Locus adecuado

Realiza su funcin normal

 Regulacin de la expresin Por numerosos
mecanismos de control:
Otros genes reguladores.
Regiones promotoras.
Seales de iniciacin y de terminacin .
Reguladores del crecimiento.
Condiciones ambientales.
Otros ms
2. Biologa molecular de los
Fitopatgenos
 Organismos Fitopatgenos:
Eucariontes.
Procariontes.
Virus
Inters en este estudio:
Comenz aproximadamente 10 aos.
Se debe: Los sistemas genticos de algunos patgenos pueden
utilizarse como vehculos de introduccin de material gentico extrao
en el genoma de plantas Se pueden modificar genticamente.
Aument al observar que los sistemas genticos de estos y de sus
organismos antagonistas se podan modificar Se podan controlar
biolgicamente a los organismos patgenos
 Clonacin Gentica
Qu es?: El aislamiento y multiplicacin de un gen individual o de una
secuencia de genes cuando se inserta en una bacteria o levadura, donde
puede replicarse.

Qu permite?: Obtener cantidades lo suficientemente grandes de un gen

o su RNAm.
Para estudiar la estructura del gen y las secuencias que regulan su
expresin.
Para resintetizar o modificar al gen
Para insertar al gen en otros organismo Producto codificado por el
gen en estudio

Etapas del procedimiento:

Clonacin de DNA complementario a partir del RNAm.
Genes de clonacin obtenidos a partir del DNA del genoma.
Expresin de los genes Clonados
 I. Clonacin de DNA complementario a partir del RNAm

RNAm de las clulas: Se extrae en un etapa celular cuando

cierto gen muestra una mayor actividad Ej: gen de una
enzima o toxina que causa un patgeno al producir la
enfermedad.
RNAm
T.I

DNAc
Plsmido bacteriano
DNA pol

DNAc (doble cadena)

 Ampr 1. El gen de ADNc se inserta
dentro del Gen Ampr ( )
2. Se inhibe la resistencia a Ampr
Tetrar
3. Son Plsmidos
Recombinantes

1. Se mezclan con bacterias de

E.Coli que incorporan al
plsmido
E.Coli 2. Las bacterias son
Transformadas.
6. Se colocan en medios nutritivos que tienen tetraciclina

E.Coli con Plsmido E.Coli sin Plsmido

Sobreviven Mueren
7. Se aslan las bacterias resistentes

1. Cada una forma colonias

separadas
2. Cada bacteria se multiplica
con rapidez
3. Produce mltiples copias de:
Ella misma
Del plsmido
Del gen que incorpor su
genoma
 8. Detectar qu colonia de la bacteria contiene el
gen

Se requiere de etapas complicadas que engloban:

Deteccin de la protena especfica codificada por el gen.
Deteccin del DNA del gen cuando se hibrida con un marcador radiactivo.

Despus se utiliza la bacteria para otros estudios:

Aislamiento.
Manipulacin.
Transferencia del gen de inters
II. Genes de clonacin obtenidos a partir del DNA del genoma

Clones Genmicos: Son clones de las diferentes partes del

genoma.

Permiten estudiar:
La estructura y disposicin de los genes en el genoma.
Las secuencias de DNA que delimitan a los genes.

Cmo se obtienen?
 Se aslan por separado

DNA se purifica y se
DNA degrada parcialmente por
E.R Enzimas de Restriccin

Los fragmentos se mezclan:

Fragmentos de DNA
Plsmidos bacterianos
Genoma modificado del
bacterifagos
Con ellos se inserta el DNA
E.COli en E.coli
 III. Expresin de los genes clonados

La expresin de los genes de las plantas en los genomas

bacterianos no es siempre posible.

Pero al utilizar genes derivados del DNAc se han logrado clonar

y expresar en bacterias:
Genes del ncleo.
Genes de los cloroplastos.
Incluso genes de las mitocondrias

Actualmente se ha logrado:
Transferir.
Incorporar. Ciertos genes clonados de
Expresar
3. Vectores que se utilizan
para clonacin gentica en
plantas
 Vectores:
Son aquellos organismos capaces de transferir material gentico de un
organismo a otro

- El material gentico
persiste.
Donador Receptor
- Se expresa en la clula
receptora
Los ms utilizados:
Plsmido de la bacteria fitopatgena Agrobacterium tumefaciens.
El virus del mosaico de la coliflor
Otros en estudio:
Geminivirus Con DNA de una sola banda.
Virus del mosaico del tabaco Con un RNA de una sola banda.
Otros virus.
Transposones
 I. Plsmidos bacterianos como vectores

Se utiliza Plsmido Ti de Agrobacterium tumefaciens.

Cepas virulentas de
A.tumefaciens
Formacin de tumores

Induce
Infectan

AGALLAS DE LA CORONA
 Si entra en contacto con una planta ya lesionada

Planta lesionada

Plsmido Ti se transfiere de la bacteria a la clula

DNA T Regin especfica del plsmido Ti
Se transfiere al ncleo de la clula vegetal.
Se integra al genoma nuclear de la planta y se
transcribe.
 Regin del DNA T

Contiene varios genes:

Gen para la opina sintetasa: Enzima que sintetiza las opinas.
Sustancias que solo producen las clulas vegetales
transformadas.
Se utilizan como fuente de C y N solo por las bacterias que
contienen
Plsmido Ti .
Gen especfico para el catabolismo de las opinas.
Gen o genes que controlan la biosntesis de citocininas: Su
inactivacin produce tumores en la races.
Genes que controlan la biosntesis de auxinas: su inactviacin
produce tumores en los vstagos.
25 pares de bases terminales: Se necesitan para que ocurra la
transferencia del DNA T hacia el genoma de la planta.
 Otros genes del plsmido Ti

Van a influir a los que controlan:

La transferencia conjugada del plsmido Ti.
El catabolismo de las opinas.
Las propiedades de incompatibilidad del plsmido hacia
algunas cepas.
El origen de la replicacin del plsmido.
 Problemas y Ventajas del plsmido Ti

Problemas:
Demasiado grandes.
Difciles de manipular desde el punto de vista gentico.
Las clulas infectadas se transforman en clulas tumorosas Es
difcil regenerarlas como plantas completas

Clulas Tumorosas
Clula infectada

Difcil regenerar
 Ventajas:
Ninguno de los genes incluidos dentro del DNA T son necesarios para
que ocurran la transferencia e integracin de ese DNA.
El material gentico de las clulas animales, bacterianas y vegetales
no emparentadas que se insertan en el DNA T:
Se transfieren al genoma nuclear de la planta.
Los genes solo se expresan cuando la regin promotora del gen
de la opina sintetasa se incorpora al gen extrao Gen
Quimrico.

P P

Opina Sintetasa Gen Extrao Gen Quimrico

 Solucin a los Problemas

Problemas de transformacin en clulas tumorales:

Aislar la regin oncognica o inductora de tumores Son los genes
que controlan la biosntesis de las auxinas y citocininas del DNA T.
Las clulas vegetales son transformadas con el nuevo material
gentico:
Ya no son clulas tumorales.
Se pueden regenerar en plantas transformadas ntegras.
Las regiones del DNA T son ocupadas por genes quimricos.

DNA T Gen quimrico

Kanamicina r
 Problema del gran tamao:
a) Se utiliza un plsmido Ti no tumoroso:
Se conservan las secuencias terminales del DNA T.
Los genes entre las regiones terminales de DNA T se sustituyen
por un pequeo plsmido de E.coli..
El DNA del gen extrao tambin se clona en otro plsmido pBR32

Gen extrao
Regin pBR32
Secuencias terminales
del DNA T Gen extrao

+ +
Recombinacin en
la regin pBR32 Regin
Plsmido Ti Regin pBR32 pBR32
 a) Clonar regiones:
Se van a clonar:
Regiones terminales del DNA T (junto con los genes extraos
que comprende) en un plsmido pequeo.
Regin de virulencia en otro plsmido similar.
Por si solos ningn plsmido causa infeccin.
Pero si:
Miniplsmido Ti es virulento
Virulencia
DNA T y el gen o genes
extraos que contienen Se
integran a los cromosomas de
DNA T
la planta.

Agrobacterium Cl. Vegetal

 Conclusiones sobre el plsmido Ti

El conocimiento sobre l:
Conocimiento relacionado a la patologa de este agente
fitopatgeno.
Capacidad para transferir selectivamente de un planta a otra los
genes que confieran resistencia.

Obstculos a los que se enfrenta:

Dnde se encuentra el gen de resistencia en el genoma de las
clulas de las plantas resistentes?
Cmo se expresa en las nuevas plantas?
 II. Los virus fitopatgenos como vectores

Son muy buenos en estudios en bacterias y animales, pero no

en plantas.
No es posible que sean vectores de incorporacin como el
plsmido Ti.
Es probable que transfieran algn gen en una clula vegetal,
donde este gen:
Se replicar casi un milln de veces con el virus.
Se propagara sistemticamente por toda la planta.
Se piensa que los se utilicen sern seleccionados o tratados
con tcnicas de ingeniera gentica:
Podrn infectar a las clulas vegetales y autoduplicarse.
Duplicar al gen o genes extraos que contienen.
Sin causar sntomas y prdidas en la produccin de plantas.
 Cules se va a utilizar?
Caulimovirus Geminivirus

Virus RNA Viroides

 Caulimovirus
Son virus isomtricos.
Tienen un DNA circular de doble banda.
Cada cadena de DNA tiene una o dos zonas discontinuas.
Virus del mosaico de la coliflor (VMCa):
Se transmite:
Inoculacin mecnica de las hojas.
Por fidos en plantas de la familia de las crucferas.
El virus y su DNA aislado son infecciosos:
Causan infecciones sistmicas en los hospedantes.
Producen casi medio milln de partculas virales por clula.
An no se ha podido utilizar como vector gentico.
 Problemas del VMCa

Limitacin del tamao:

Se utiliza un virus auxiliar.
Alguna porcin importante del genoma viral en algunos virus se pierde
y se sustituye con un DNA extrao.
Prdida de funcin:
Infeccin simultnea de las mismas clulas vegetales con:
Un DNA viral normal.
Algn DNA viral A perdido su DNA que codifica para varias
funciones distintas.
Pero an falta para que estas tcnicas se desarrollen con
xito Utilizarse los Caulimovirus.
 Geminivirus
Son virus isomtricos que estn en pareja.
Cada par viral tiene una sola molcula de DNA circular de una
sola banda.
Varios tienen un genoma dividido: Son un par de molculas de
DNA de igual tamao pero que codifican para diferentes
funciones.

Protenas de la cpside
Geminivirus
idnticas
DNAs con diferente
secuencia de nucletidos

Partculas en pares Se replican

en su ncleo
Cl. Vegetal
 En la naturaleza se transmiten:
Por medio de chicharritas o mosquitas blancas en forma persistente.
Por va mecnica Con dificultad.
Infectan:
A planta monocotiledneas y dicotiledneas.
El DNA de doble cadena Formado en el ncleo de la clula vegetal
de forma intermedia:
A protoplastos vegetales.
Utilizarse en estudios de manipulacin in vivo en plsmidos
bacterianos.
Problemas:
Pequeo tamao de su genoma.
Dificultad de transmitirse a travs de la savia.
Se estn realizando esfuerzos para utilizarse en el futuro.
 Virus del RNA

Es posible que el futuro adquieran importancia.

Virus multiparticulados:
Virus del mosaico del bromo.
La ms pequea de las tres partculas contiene el RNA de la cpside
proteica.
Ese RNA puede sustituirse por completo con material gentico
extrao No afecta a la capacidad del virus para producir infeccin.
RNAs y Virus satlite:
Los RNAs no son requeridos por los virus.
Se sustituyen total o parcialmente por material gentico extrao Sera
introducido en la planta al ser infectada por el virus.
No se han logrado la sntesis y su uso como vectores.
 Viroides

Son pequeas molculas de RNA.

Desnudo.
Circular.
De una sola banda
Se transmiten por va mecnica.
Se replican en el ncleo de las clulas hospedantes.
Infectan sistmicamente a las plantas.
Se les considera posibles vectores pero actualmente no se
aplican.
 III. Componentes genmicos de las plantas como
vectores

Elementos transponibles o transferibles.

Elementos extracromosmicos.

Elementos cromosmicos.
 Elementos transponibles o transferibles

Son segmentos de DNA que existen en el genoma de todo tipo de

organismos.
Pueden transferirse al genoma de las clulas e integrarse en diferentes
sitios Incluso cuando pasan la mayor parte del tiempo incorporados
en ese genoma.
Se piensa que:
1. Se asla el elemento
transponible
2. El elemento extrao de alguna
planta se inserta en l.
Elemento 3. El elemento hbrido puede
Gen
transponible introducirse en clulas o
extrao
aislado protoplastos vegetales.
4. Puede incorporarse al genoma
celular.

Elemento hbrido
 Elementos extracromosmicos
Son segmentos de DNA lineales o
circulares.
Se replican de manera independiente.
Se localizan en el citoplasma.
Parece que:
Algunos tienen repeticiones terminales invertidas.
Son capaces de transponerse dentro del genoma
mitocondrial.
Estas propiedades:
Permiten considerarlos como posibles medios de
estudio y utilizacin como vectores genticos.
Pero se desconoce su potencial como vector.
 Elementos cromosmicos

Permiten incorporar algn otro material gentico distinto al

genoma del hospedante Con o sin remplazo de sus
genes homlogos.
Se ha logrado realizar en levaduras No en plantas.
Se espera aplicar levaduras que:
Sean buenos vectores genticos.
Para estudiar los genes que determinan las propiedades de
virulencia y no virulencia de:
Hongos fitopatgenos.
Hongos antagonistas de las especies de hongos patgenos.
 IV. Sistemas de transferencia qumica y mecnica del DNA
dentro de las clulas

1. Incorporacin:
De DNA en fragmentos cromosmicos o plsmidos.
De cromosomas completos en protoplastos vegetales.
Cmo se hace?:
Mezclar c. nucleico + Protoplastos.
En presencia de cationes Polietilenglicol.

Medio con
Polietilenglicol
cationes

c. nucleico Protoplasto
1. Electroporacin o
electrotransformacin:

Tratamiento de un mezcla
de protoplastos vegetales y
de DNA extrao Pulso elctrico
Con breves pulsos
elctricos:
Rompe temporalmente la
membrana celular
Permite que el DNA extrao Mezcla
penetre en la clula.
El DNA extrao puede
expresarse despus y los
protoplastos convertirse en Expresin
plantas.
del DNA
Para plantas
monocotiledneas y
dicotiledneas.
1. Microinyeccin directa del cido nucleico en
clulas vegetales:
Es una tecnologa que permite la introduccin mecnica
de soluciones en el interior de la clula mediante una
micropipeta.
Es una tcnica muy sensible.
1. Inclusin del DNA o RNA en liposomas y fusin
de estos con los protoplastos.

1. Fusin directa de protoplastos vegetales con:

Bacterias transformadas.
Esferoplastos bacterianos.
Conclusin de bacterias que tienen plsmidos
formados por el DNA extrao.
Alguna pregunta?