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  • Cap 01 - Introducción A La Histología y Técnicas Histológicas Básicas PDF

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    Histologia es la rama de la anatomta que estudia ls tefdos de aniresy plantas Sin emburgs et Ibm de to ‘élo describe los tejidos animales, de manera espectfica los ]humanos. En su aspecto mas amplio, la palabra histologéa se emplea como sinénimo de anatomnta mierosedpica, ya que su materia no sélo incluye la estructura microsedpica dle Tos tefidos sino también la de la célula, drganos y sistemas. Es necesario comprender que el cuerpo esti compuesto de célls, mates itercllat una sstencie Hulda, el liguido extracelular (iquido tisular), que impregna estos ‘componentes, El iquido extracelular, que deriva del plasma sanguineo, transporta nutrientes, oxigeno y moléculas de sefialamiento a la eélulas del cuerpo. Por él contearo, las moléeulas de sefialamiento, los productos de desecho y el didxido de carbono que liberan las eélulas del organismo Tegan a la sangre y fos vasos linfticos a través del liquide extracelular. Este itimo y también gran parte de la matriz intercelularno se observan en preparaciones histol6yieas de ratina; empero, es necesario que el estudiante de histologia reeanozea su presencia invisible. El objeto de la histologia ya no aborda simplemente la estructura del cuerpo, sino también su funcionamiento. En realidad, la histologta guarda una relacién directa con ‘otras diseiplinas y es esencial para comprenderlas. Por esta razén, este libro de texto entrelaza la biologta celular, bioguiiica,fisiologiay, segtin sea apropiado, la patologia Los estudiantes reconocerdn la importancia de este objetivo fen cuanto se remitan al texto mas adelante en su carrera Un excelente ejemplo de esta relacion se advertira cuando el lector conozca la histologia del rindn y observe st intrincada estructura (hasta el nivel molecular), en la que reside la capacidad de este 6rgano para realizar su funci6n. {La ateracones de la estrctra renal dan gu an gran niimero de trastornos que ponen en peligro lt vida. Elresto de este capitulo analiza los métodos que aplican los histélogos para estudiar la anatomia microscépica del cuerpo. Introduccién a la histologta y técnicas histoldgicas bdsicas MICROSCOPIA DE LUZ Preparacién de los tejidos Los pasos necesarios para la preparacién de tejdos para rmierescopia de luz incluyen a) fijacisn, b) deshidratacion ¥y aclaramiento, ¢) inclusion, corte y e) mantaje y tincion de lor cortes Se han desartollado diversas téenias para prepara los teldos conel in de estdiarlos, de tl mariera que semejen cuanto mas su estado natural en vivo. Las etapas ineluidas son fijacién, deshidratacién y aclaramiento, inclusion, en uit medio estable, seeeién en cortes delgados para poderlos observar mediante transiluminacién, montaje en una superficie para fallitar su manipulacfon y tnein ra diferenciar los diversos componentes tisulares y celu- Fijacién La fijacién se refiere al tratamiento del tejido con sustaneias guimicas que no sélo retardan las alteraciones tutes subsecventes ala muerte (o despues de su remo. in del orgasm) sno que tnbin conserva su cont guracién normal. Los agentes para fijacién usados mas a Ienado en ricroscopiade uz son formalina amortigusda y fijador de Bouin. Estas dos sustaneias permiten el entrecruzamiento de las proteinas y por tanto conservan tuna imagen del tejido similar al vivo. Deshidratacién y aclaramiento Debido a que una gran parte del tejido esté constituida por agua, se aplica una serie gradual de bafos de aleohol Tniciando con aohol al 50% y aleanzando de manera 1 2 ene Introduccion a 1a histologia y técnicas histoligicasbisicas ppaulatina el alcohol al 100% para eliminar el agua (deshi- Aratacién). A continuacién, el tejido se trata con xileno, tana ststanciaqnimice que es miscible con parafna funda Este proceso se conoce como aclaramiento, ya que el tejido se torna transparente en sileno, Inclusion Gon objeto de distinguir entre silas céulas superpuestas en un tejdo y la matrz extracelulr, el histdogo debe ineluir los tejidos en un medio apropindo ya continnacién seccionarlos en cortes delgados, Para la microscopia de ln ‘el medio habitual de inelusién es la parafina. Se coloca el tejido en um recipiente adeenado con parafina field hasta gue se inflta por completo, Una vez que se impregna. el tejido con parafina, se coloca en un recepticulo pequerto, recubierto con parafina fundida y se deja endurecer para formar un bloque de parafina que incluya al tejido. Seccién Una vez que se rebajan los bloques de tejido para climinar ef material de inelusién redundante, se montan para seccionarlos. Esta labor se lleva a cabo mediante ‘un micrétomo, un’ aparato equipado con una hoje yun brazo que desciencle en el bloque de tejido en incrementos espectficos iguales. Para la microscopia de Iuz, el grosor de cada corte luctia entre 5 y 10 pm. ‘Tambien es posible efectuar los corles en especimenes congeladios, sea en nitrbgeno liquide o en un portamuestras para congelaciOn rapida en un eriéstato, Estos cortes se montan con un medio para montaje de congelacién réipida y se secelonan a temperaturasinferores a cero mediante ima hoja de acero enfriada con anterioridad. Los eortes se coloean en portaobjetos de vidrio previamente entriados, se permite que alcancen la temperatura ambiente y se tiften después con colorantes especificos (o se tratan para studios histoquimicos 0 inmunoctioguimicos). Montaje y tincién os cortes de parafina se montan (colocan) en portaobjetos de vidrio y 2 continuacién se tinen mediante colorantes hidrosolubles que permiten diferenctar los diversos componentes celulares. Los cortes para mieroscopia de luz. convencional, see- cionados mediante hojas de acero inoxidable, se montan en portaobjetos de vidrio recubiertos con un adhesivo. Debido a que muchos constituyentes de los teidos tienen ‘asi las mismas densidades dptimas, deben tefirse para la mieroseopia de luz. La tineién para microscopia de luz se lleva cabo principaimente cot coloranteshidrosolables En consecuencia, primero es necesario eliminar la parafing del corte, despues de lo cul se rehidraa y tite el tej. Una vez teitido, se deshidrata el corte de nueva cuenta de tal manera que pueda fjarse de modo permanente el cubreobjetos con iin medio adeeuado para, montaje. El eubreobjetos no sélo protege el tejido de algiin dano sino que también se requiere para observar el corte con el microscopio. “Aunque exsten varios tips de colorantes para cbservar los miitiples componentes de eélulas y tejidos, pueden sageuparse en tres clases: # Colorantes que diferencian los componentes éeidos y brisieas de la eelula # Golorantes especializados que distinguen los compo- bentes lrosos de Ia mati extracel lar 1 Sales metilicas que se preeipitan en los tejidos y forman depéstes de metals en ellos ai Los colorantes empleados con mis frecuencia en his- tologia son hematoxilina y eosina (Hy E). La hema- toxilina es una base que tite de manera preferencial los componentes cides de la célula de un color azuloso Puesto que casi todos los componentes dcidos son fcido desoxirribonueleico (DNA) y écido ribonucleico (RNA), el nicleo y las regiones del citaplasma ricas en ribosoma se tien de color azul oscuro; estos elementos se denominan basofilicos. La eosina es um deido que tie los componentes Inisicos de la celula de eolor rosado. Debido a que muchos constituyentes del citoplasma tienen un plT basico, las regiones del citoplasma se tifien dle color rosa; se dice que estos elementos son aeidéfilos. También se usan muchos ‘otros colorantes en la preparacién de especimenes para estudio histolégico (cuadro 1-1) Las moléeulas de algunos colorantes, como el azul de toluidina, se polimerizan entre si cuando se exponen a concentraciones altas de polianiones en el tefido. Estos agregudos son de un color diferente al de sus moléculas individuales. Por ejemplo, el azul de toluidina tite de azul los tejidos, excepto los que son ricos en polianiones (p. j., matriz de cartilago y grinulos de células cebadas), que se tien de color prirpnra. Se dice que un tejido ‘0 un componente celular que se tite de color pairpura ‘es metaeromiitico y que el azul de tolvidina muestra ‘metacromasia. Microscopia de luz Los microscopios compuestos estén constituidos por una dlisposicion especifca de lentes que permiten una gran amplificacién y una buena resolucién de los tejidos observados Enel microscopio de luz actual se utiliza una disposieién espectfica de grupos de lentes que amplifican wna imagen (fi 1-1). Como resultado del uso de mds de una lente simple, este instrumento se conoce como un mieroseopio sompverio: Ux fuesio ds lu os um Poubile lécricn con tn filamento de tungsteno cuya luz se retine en un hhaz enfocado por la lente eondensadora. El haz. de luz se localiza abajo y se enfoca en el espéci- nen. Lat luz que pasa a través de este timo penetra en una de las Tentes def objetivo; estas lentes estén asentadas en Cuadro 1-1. Colorantes y reacciones histolégicas comunes. Reactivo Resultado Hematonilina ‘Azul: mileo; regiones| fcidas del citoplasmna; smatriz de eartlago osina ons: regones basics del ‘ttoplam bas de cli fem “etna de Mason Aslan neo jon ‘mine, questing to plasma Aci lar: ming, colagena Colorante de orcetna para Pardo: fas Cis sate Colorante Weiger pars Azul Ans listens ora lists Ticlones argéntiow Negro bras revere ernatnlin ferca ‘gn eaactones de tidal, sels, ert toe ‘eid penidico de Schill Mogens moles vss th glicdgeno y extol tan Colornies de Wrigity Se ulza para lncones ‘Giemsa itorendales do las hema Aout ertractos, grinulos de eosinéfilos a Prgura cles de leueo- hos, gitlor bos ‘cul ctplasma de mono- tory hnitow So _ tuna torreta movible localizada justo arriba del espécimen. Por lo general se dispone de cuatro lentes objetivos en ‘una torreta, que proporcionan amplifcaciones baja, media, alta y con aceite. En la mayor parte de los microscopios las tres primeras lentes suclen amplificar, cuatro. 10 $40, ‘ees, pectvamente,y se utlizmn sin aceite; It lente nara aceite amplifica la imagen 100 veces PLA imagen de les lentes del objet se rene y las lentes del ocular la amplifcan de manera adicional. Es- tas lentes aumentan la imagen en un factor de 10 —para amplificaciones totales de 40, 100, 400 y 1 00—y enfocan Ja imagen resultante en la retina del oj. FV enfcamionto de lt imagen 6 realiza medante perilasindentadas que mmieven ks lentes del objetivo hacia Erba y abajo sobre el espécimen. La perl de enoque aamplio las mueve en inerementos mayores que Ia perilla Introducién a la histologla y técnicasbistol6gicas biscas wx 3 de enfoque fino. Resulta de interés que la imagen que se Droveca en aretin esta invert de derecha' izqlerda yal reves a calidad de una imagen no sélo depende de la capa- cidad de una lente para amplifear sino tambien de®sa resolucién —la capacidad de la lente para mostrar que tlos objetos distintos estan separados por una distancia. La calidad de una lente depende de que tan cerca se aproxima su resolucisn al limite te6rico de 0.25 pm, una restriceién determinada por la longitud de onda de la luz visible. Existen varios tipos de microscopios de hz, que se diferencian por el tipo de luz que utilizan como fuente Tumminosa y la forma en que la emplean. Sin embargo, la tayorfa de los estudiantes de histologia deben reconocer sélo las imagenes obtenidas de los mieroscopios de luz compuesto, clectrénico de transmisién y electrdnico de harrida: en consecuencta, no se comentan uqut los otros tipos de microscopios. Técnicas de imagenes digitales En fas técicas de imagenes digitales ¢ emplea ‘una computadora para capturar y manipular imagenes histologicas. EL advenimiento de lx computadora proporcioné un medio para caper migenes en forma digit, an tna peiclAengue este metodo de eaptura de mgencs atin no puede competr con le teenologa Hmiea, ene imgchas entajas que la constituyen en una herramnienta valota, por ejemplo 4 Observacin inmediata de la imagen adquirida © Modificacin digital de la imagen * Capacidad para realzar la imagen mediante el uso de programas de computadora disponibles en el comer Ademés, debido a que estas imagenes se guardan en ‘un formato digital, es posible archivar cientos de ellasen un solo disco CD-ROM y su reeuperacién es casi instantinea. Por altima, su forma digital hace posible la transmisién lectrénica de estas imégenes mediante correo electrénico ‘osu distribucion a través de Internet Interpretacion de cortes microscépicos Una de las habilidades mas difieiles, frustrantes y demoradas en histologia es la de aprender a interpretar sun corte bidimensional como si fuera tridimensional. Si se imagina una manguera para el jardin, como en la figura 1-2, ya continnacién se practican cortes delgados, se torna obvio que el objeto tridimensional no necesariamente se distingue de cualquiera otra de las representaciones bidimensic embargo, observando todos los cortes, {dos de la manguera arrollada, es posible reconstruit mentalmente la imagen tridimensional: Introdccién a la hstologia y técnica histolégicas basicas Imagen on oto objewvo Lens ceondensador Lente de proyeccicn Lampara Imager la pantaa de cbservacion Iieroscopioelectré ‘de traneimision Microscopie de luz cto Anode condensador Serpentin de exporecen, Haz de expiorecion Detector de betones, ‘imagen en lapartaa de cbsorvacin Panta de ‘eiesion nico Microscopioelectrénico ‘de barido. Fig. 1-1. Comparicién de los micrscopis deh, electinice de transmsn yelcténico de bari, Procedimientos avanzados de observacién Histoquimic {a Pistoquimica es un métado de tincin de teidos ‘que proparciona informacion sobre la presencia ¥Y localizacién de macromoléculas intracelulares y extracelulares Es posible localizar los constituyentes quimicos expect= ficos de tejidos y eclulas por los métodos de histoq. y eitoguimica. Estos métodos aprovechan la actividad ‘enzimatica, renctividad quimica y otros fenémenos fisico- quimicos relacionados con el elemento en cuestién. Las reacciones de interés se tornan evidentes mediante la formacién de un precipitado insoluble que toma cierto color. Con frecuencia, Ie histoquimica se electiia en tejdos congelados y puede aplicarse tanto en la microscopia de luz como en la electrénica, En una reaccién histoqutiica se utiliza el reactivo fcido peryddico de Schiff (PAS), que forma un precipitado de color magenta con moléeulas rieas en glucégeno y ‘earbohidratos. Para asewrar que la reaccién sea especitfica del ghicégeno, los cortes consecutivos se tratan eon ami- asa. Por consiguiente, los cortes no tratados con amilasa Imuestran un depsito magenta, en tanto que en fs cotes ‘ratados no se observa tincién en la misma regién, Aunque es posible localizar enzimas mediante proce- dimientos histogusmicos, se observa el producto de la reaccién enzimética yno la enzima en si misma. El reactivo std disefiado de tal manera que el producto se precipita en el sitio de la reaceién y se reeonoee como un depésito etilico o de color Inmunocitoquimica Eo a inmunocitoquimica se utilizan anticuerpos marcados on fluoresceina y antiantieverpos para identificar una localizacién intracelular y extracelular de las ‘macromoléculas més precisa de la que es posible con la bistoguimice. Aunque los procedimientos histoquimicos permiten ubicarrelativamente bien ciertas enzimas y maeromoléculas cen células y tejidos, es posible obtener una localizacién mas, exacta con la inmunoeitoquimiea. Este procedimiento exige desarrollar un antieuerpo contra la macromoléeula particular a localizar y marear el anticuerpo con un colo- rante fluorescente (Buoresceina o rodamina: Existen dos métodos de marcado con anticuerpo: direeto ¢ indirecto. En el método directo (fig, 1-3) se marca el anticuerpo contra la macromolécula con un colorante fluorescente, A contimiacién se permite que reaccione el anticuerpo con la maeromolécula y puede Fig. 4-2. La histologi ee a zeconstre- ih mow de ages menses tin sla tdmensonal a partir de la eal x comaron En ste dara e sein tbo curve on verte plnos par fstar la relacion entre una see de eortes biimen Sales ylaestrtoeatiinenstona ‘observarse el complejo resultante con un microscopio de Auorescencia (fig. 1-4). En el método indireeto (fig, 1-3) se prepara un anti- cuerpo mareado con fluorescencia contra el anticuerpo primario espeeffico para la macromolécula de interés, Una ‘ez que reaciona el antcuerpo primaro con el antigen, se lava la preparacién para eliminar el antieuerpo primario no unido; en seguida se afiade el anticuerpo marcado y reaeciona con el complejo antigeno-anticuerpo origi nal, con lo cual se forma un complejo secundario visi- ble'con mieroseopia de fiorescencia (fig, 1-5). Elmétodo Fig. 1-3. Metodos de iamunohisogsinica toe indreto,Izulerda Se tases in “ntcnesp contr el atgeno com wn calorie Shorscenteyse obser un lroscpio de Sworescenia La uoresenca se det lo ‘endonde se loan el anticnerpe, Derech. Se prearanantcuerpos marcos com wr reson conta th acuepo que reac om'in antigen poricar van se bse ‘on mate mcroscopla de Buorescenca irene Suorescefepresets el sade aioe Anticuerpo tet Introduccién a la histologia y técnica bistolégicas bascas wa 5 cone Tongtucial Diagrama que muestalos dferentos aspoctos do cris a raves do un bo ‘Sano en dlerentesniveles indirecto es mis sensible que el directo porque se unen iniltiples antiantieuerpos marcados con ef antieuerpo pri- mario, cuya observacién es més facil. Ademés, el método indirecto no requiere marcar el anticuerpo primario, que muchas veces sblo se enctentradsponiBleen cant Timitadas. Ta inmunocitoquimiea puede utilizarse con especime- nes para microscopia electrénica si se marca el anticuerpo con ferritina, una moléeula densa en eleetrones, en lugar de un eolorante fluorescente. El marcado con ferritina puede aplicarse en los métodos directo e indirecto, Anantioverpo Roorescemnade adcionago Anticuerpo Incirecto * Introduccién ala histologia y ténicas histologicas basicas tejido con un cubreobjetos, se aplica sobre él una capa in fotogrifiea, Se coloca el tejido en wna delgada de emu caja oseura durante tunos cuantos dias o semanas, durante Tos cuales las particulas emitidas del isétopo radiaetivo se loalza el isdtopo, Se revelay fj la emaliGn meciante téenloas fotografeas y se dejan pequeos granulos de plata sobre las porciones expuestas de la emulsign, A -objetos rdnnlos y se observa con un microscapio de luz, Los ie plata se hallan sobre las regiones del espécimen que incorporé el compuesto radiaetivo. Se usa una autorradiografia para vigilar el tiempo de incorporacién de probina tritiada en la membrana basal subyacente a células endodérmicas del saco vitelino (fig, 1.6). Se ha empleado una adaptacién del método de aul radiografia de In microseopia electrénica para demostrar que la prolina tritiada aparece primero en el citosol de Tas eélulas endodérmicas, se desplaza a continuacién al reticulo endoplismica rugoso, después al uparato de Golgi Fig. 7 leg fon antenerpo. jemplo de iomunoctoquinica directa. Se titeron inn te neurones entiadas de tn ode on fuoresconela espectcn part el recepta responden alo aoe en los que se fein. El patrn de nck = ext Ta N. Thomas F, Baonstock CI Teepe cae depen fafore. J Anat 1825-100, 19 Autorradiografia La avtorradiografia es un método en el que se Incorporan isétopos radiactvos en macromoléculas, que 2 continuacién se abservan con el uso de una pelicula de ‘emulsion superpuesta, La autorradiografia (radioautografia) es un método particularmente itil para loca Gia temporal especttica de fenémenos. El método exige incorporar un isétopo radiactivo —casi siempre tritio (OH)— en el compuesto estudiado (fig, 1-6). Un ejemplo es el empleo de un aminoicido tritiada para observar la Figs 4-5. Inmunoc sintesis y agrupamiento de protefnas. Después de inyectar _fvorescent tl compuesto radiomarcado en un animal se oblienen Pt especimenes de tejido a intervalos de tiempo scleceionados. SE asl Se procesa el tejido en la forma usual y se coloca en un guinica indirects, Se prepararon antiouerpos weeps pitarios oligena de tip TV tefidoconectivo cheundante staat: Dist ‘vl ie Cell Tse Res 27205-4085, portaobjetos de vidrio; sin embargo, en lugar de sellar el 993. Capynght Springe Ver ‘eontinuaeién hacia vesfeulas y por altima a ka matriz extracelular (fig. 1-7], De esta forma se demostré visual- mente la seeueneia de fendmenos que tiene lugar en la sintesis de coligena de tipo IV —la proteina principal en la Kamina densa de la kimina basal MICROSCOPIA ELECTRONICA Fuso de electrones como fuente de luz en la microscopia ‘electrénica permite lograr una amplifccién y resolucion ‘mucho mayores que las obtenidas con a microscopio de luz. En los microscopios de lz, las lentes épticas enfocan luz visible (un haz de fotones). En los microseopios elec- trdnicos, os electromagnetos tienen la fancin de enfocar un rayo de electrones. Debido a que la longitud de onda de un rayo de electrones es mucho mis corta que la de ia hz visible, los mieroscopios electrénicos son en teorfa capaces de obtener la resolueisn de dos objetos separados por 0.005 nm. Sin embargo, en la préctica Ia resolucién ‘el mieroscopio eleetrénieo de transmisign (MET) es alrededor de 0.2 nm, atin mas de 1.000 veces mayor ‘que la resolucién del microscopio de Iz compuesto. Lal sesolueién del microscopio eleetrénico de barrido (MEB) se aproxima a 10 nm, considerablemente menor respecto de los instrumentos de transmisién. Mis atin, los mi¢roseopios electrénicos modernos pueden amplifear un objeto hasta 150 000 veces; esta ampliicacién es lo bastante potente para observar macromoléculas individuales como DNA y miosina Microscopia electronica de transmision nla microscopla electronica de transmis se wtilean

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