QUE

QUE ES
ES LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Mtodo analtico por el que se mide la emisin de mltiples

fluorescencias y la dispersin de luz (light scatter) de clulas o
partculas microscpicas, alineadas secuencialmente mediante una
corriente lquida laminar, cuando son presentadas de una en una y a
gran velocidad (hasta miles de clulas/segundo) frente a un haz de luz
lser de longitud de onda adecuada

INTRODUCCION
INTRODUCCION AA LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO

QUE
QUE SE
SE PUEDE
PUEDE ANALIZAR
ANALIZAR POR
POR CITOMETRIA
CITOMETRIA
DE
FLUJO?
DE FLUJO?
Protenas extracelulares
Secuencias de ADN o ARN libres
Complejos inmunes circulantes
Viriones individuales
Liposomas
Cromosomas aislados
Orgnulos aislados
Ncleos aislados
Bacterias
Hongos unicelulares
Clulas humanas y animales
Protoplastos vegetales
Hibridomas y fusiones celulares
Esferoides
Organismos pluricelulares

QUE
QUE PARAMETROS
PARAMETROS SE
SE PUEDEN
PUEDEN ANALIZAR
ANALIZAR
POR
CITOMETRIA
DE
FLUJO?
POR CITOMETRIA DE FLUJO?
Parmetros Nucleares
Enzimas

Pared celular

Proteinas

Molculas de superficie
Proteinas

Molculas de superficie

Enzimas

Enzimas

Parmetros
Citoplasmticos

Parmetros de Superficie

Proteinas secretadas

Extracellular Parameters

PARAMETROS
PARAMETROSCITOPLASMATICOS
CITOPLASMATICOSQUE
QUESE
SE
PUEDEN
ANALIZAR
POR
CITOMETRIA
DE
PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
FLUJO

PARAMETROS
PARAMETROSNUCLEARES
NUCLEARESQUE
QUESE
SE PUEDEN
PUEDEN
ANALIZAR
POR
CITOMETRIA
DE
FLUJO
ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
Parmetros nucleares

1.1.Parmetros
Parmetrosbasados
basadosen
enADN:
ADN:
- -Contenido
Contenidode
deADN
ADN
- -Contenido
Contenidoen
enpares
paresGC/AT
GC/AT
- -Superenrrollamiento
Superenrrollamientode
deADN
ADN
- -Estructura
Estructurade
delalacromatina
cromatina
- -Roturas
Roturasde
dehebras
hebrasde
deADN
ADN

Nucleus
2.2.ADN+otros
ADN+otrosparmetros:
parmetros:
- -ADN/ARN
ADN/ARN
- -ADN/Proteinas
ADN/Proteinastotales
totales
- -ADN/Proteinas
ADN/Proteinastotales
totales
- -ADN/Antgenos
ADN/AntgenosNucleares
Nucleares
- -ADN/Antigenos
ADN/Antigenoscelulares
celulares

Ploida de ADN
Cariotipo en flujo

3.3.Parmetros
Parmetrosno
no
basados
basadosen
enADN:
ADN:
- -Receptores
Receptoresnucleares
nucleares
- -Expresin
Expresinde
degenes
genes
indicadores
indicadores(Reporters)
(Reporters)
- -Morfologa
Morfologanuclear
nuclear
- -Componentes
Componentesnucleares
nucleares

Regulacin
del ciclo
celular
Compartimentos
del ciclo
Ciclo celular de
Cariocinesis
poblaciones especficas
Intercalado de frmacos

Expresin
gnica

Ciclo celular

Apoptosis/Necrosis

Accin de
hormonas

PARAMETROS
PARAMETROSDE
DESUPERFICIE
SUPERFICIEQUE
QUE SE
SEPUEDEN
PUEDEN
ANALIZAR
POR
CITOMETRIA
DE
FLUJO
ANALIZAR POR CITOMETRIA DE FLUJO
1.1.Estructuras
Estructurasde
delala
superficie
superficiecelular:
celular:
- -Antgenos
Antgenos
- -Glicoconjugados
Glicoconjugados
- -Carga
Cargade
desuperficie
superficie
- -Pared
Paredcelular
celular

Diferenciacin
celular

Adhesin
celular

Interacciones
clula-clula
Accin de frmacos

1.1.Componentes
Componentesintracelulares:
intracelulares:
- -Contenido
Contenidoen
enprotenas
protenastotales
totales
- -Protenas
estructurales
Protenas estructurales
- -Protenas
Protenasfuncionales
funcionales
- -Glicoconjugados
Glicoconjugadosintracelulares
intracelulares
- -Lpidos
intracelulares
Lpidos intracelulares
- -GSH
GSHyytioles
tioleslibres
libres

2.2.Funciones
Funcionesintracelulares:
intracelulares:
- -Enzyme
Enzymeactivities
activities
- -Protein
Proteinsynthesis
synthesis
- -Membrane
Membranepotentials
potentials

Metabolismo celular y
Energtica
Procesos de
Biosntesis
Procesos
degradativos

Parmetros
citoplasmticos

Transduccin Estrs celular

de seal

3.3.Entorno
Entornointracelular:
intracelular:
- -Concentratin
Concentratinde
deiones
iones
- -Movimientos
Movimientosinicos
inicos
- -Generacin
Generacinde
deROS
ROS
- -Lpidos
Lpidosyyprotenas
protenasoxidados
oxidados

Adaptacin
celular

Lesin y Muerte celular

PARAMETROS
PARAMETROSEXTRACELULARES
EXTRACELULARESQUE
QUESE
SE
PUEDEN
PUEDENANALIZAR
ANALIZARPOR
PORCITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO

Parmetros de Superficie

Parmetros
Extracelulares
Receptors

2.2.Dinmica
Dinmicade
delalasuperficie
superficiecelular:
celular:
- -Unin
Uninde
deligandos
ligandos
- -Transporte/internalizacin
Transporte/internalizacinde
deligandos
ligandos
- -Eflujo
Eflujode
desolutos
solutos
- -Exposicin
Exposicinde
dereceptores
receptores
- -Potencial
Potencialde
demembrana
membrana

Resistencia a frmacos

Dinmica
Dinmicade
delalasecrecin
secrecincelular:
celular:
- -Captura
Capturade
deprotenas
protenassecretadas
secretadas
- -Ensayos
multiplexados
en
Ensayos multiplexados ensuero
suero

Interaccin con otras clulas

Activacin celular
Diferenciacin celular

Activacin
celular

Reciclaje de
membrana

Lesin celular
y muerte celular

Surface molecules

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Inyeccin de la muestra y cmara de flujo

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Emisin de fluorescencia y bancada ptica

Amplificacin de las seales de fluorescencia

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Eliminacin de seales no deseadas: Discriminador

Cuantificacin de las seales: Convertidor analgico-digital

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Clasificacin de las seales: Histograma de frecuencias

Presentacin de datos: Dot-plots y proyecciones

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN CITMETRO
CITMETRO DE
DE FLUJO?
FLUJO?

Acotamiento de subpoblaciones de inters: gating

Generacin de resultados: Dot-plots mltiples

INSTRUMENT
INSTRUMENT
CONTROL
CONTROL

ESQUEMA
ESQUEMA DE
DE UN
UN SISTEMA
SISTEMA DE
DE CITOMETRIA
CITOMETRIA

CYTOSETTINGS
SORT SETTINGS

PARAMETER SELECTION
PARAMETER SELECTION
GATE DEFINITION
GATE DEFINITION
DATA DISPLAY AND STORING
DATA DISPLAY AND STORING

REAL-TIME
REAL-TIME
DATA ACQUISITION
DATA ACQUISITION

DIGITALIZED SIGNALS
INTENSITY-CLASSIFIED DATA

SIGNAL COLLECTION
SIGNAL COLLECTION
SIGNAL AMPLIFICATION
SIGNAL AMPLIFICATION
PULSE PROCESSING
PULSE PROCESSING

INTERFACED COMPUTER
WITH CYTOMETER SOFTWARE

PHOTOMULTIPLIERS

FCS 2.0 FORMAT FILES

FILTER ASSEMBLY

LIST MODE FILES:

NON-CORRELATED
DATA MATRIX

LASER
FLUORESCENCE
COLLECTING LENS

DOTPLOTS
HISTOGRAMS

SAMPLE IN

FLOW CHAMBER

OFF-LINE ANALYSIS
OFF-LINE ANALYSIS

KINETIC PLOTS
AUTOMATED
DATA STATISTICS
AND REPORTS

FORWARD SCATTER
DETECTOR
NON-INTERFACED COMPUTER
WITH STAND ALONE OR
THIRD-PARTY SOFTWARE

SORTING
SORTING

EJEMPLOS
EJEMPLOS DE
DE CITOMETROS
CITOMETROS DE
DE FLUJO
FLUJO
AA LO
LO LARGO
LARGO DE
DE LA
LA HISTORIA
HISTORIA
EPICS PROFILE

FACSCalibur

PAS

FLUOROCROMOS
FLUOROCROMOS YY MARCADORES
MARCADORES
FLUORESCENTES
FLUORESCENTES

EPICS XL

FACSCan

Cytoron

LSR

Bryte

CyFlow

QU
QU ES
ES FLUORESCENCIA?
FLUORESCENCIA?
11

Un
es absorbido
Unfotn
fotnde
deenerga
energah
hEX
EX es absorbido
por
porlalamolcula
molculafluorescente,
fluorescente,creando
creandoun
un
estado
estadoexcitado
excitadocon
conun
unelectrn
electrnen
en
singlete
singlete(S1').
(S1').

22

El
Elestado
estadoexcitado
excitadotiene
tieneuna
unaduracin
duracin
-9
de
de110
11010
10-9segundos
segundos

33

Un
es emitido,
Unfotn
fotnde
deenerga
energah
hEM
EM es emitido,
para
paradevolver
devolverlalamolcula
molculafluorescente
fluorescente
aasu
suestado
estadobasal
basalS0.
S0.

 Fluorocromo: Molcula capaz de absorber fotones y emitir fotones de menor

energa (mayor longitud de onda).
Fluorforo: Parte del fluorocromo responsable de la emisin de fluorescencia.
Marcador fluorescente o sonda fluorescente: Fluorocromo diseado para unirse
a una regin especfica de una muestra biolgica o responder a un determinado
estmulo.
Longitud de onda de excitacin: Longitud de onda a la que un fluorocromo
puede absorber fotones.
Longitud de onda de emisin: Longitud de onda a la que un fluorocromo
emite fotones de fluorescencia.
Desplazamiento de Stokes: Separacin entre las longitudes de onda de absorcin
y de emisin en un fluorocromo.
Rendimiento cuntico: cociente entre el nmero de fotones de fluorescencia
emitidos y el nmero de fotones absorbidos

EJEMPLOS
EJEMPLOS DE
DE ESPECTROS
ESPECTROS DE
DE ABSORCION
ABSORCION
YY EMISION
DE
FLUOROCROMOS
EMISION DE FLUOROCROMOS COMUNES
COMUNES
Argn 488nm

He-Ne 630nm

PE-Cy5 Conjugado
ECD
Propidio
Etidio
PE = RD1
FITC
Indo 1; DAPI

RELACION
RELACION ESTRUCTURA/FLUORESCENCIA
ESTRUCTURA/FLUORESCENCIA

COMPLEJIDAD

CONCEPTOS
CONCEPTOS ESENCIALES
ESENCIALES EN
EN
FLUORESCENCIA
FLUORESCENCIA

LONGITUD DE ONDA DE EXCITACIN

FLUORESCENCE
FLUORESCENCEENERGY
ENERGY TRANSFER
TRANSFER

PROPIEDADES
PROPIEDADES BIOLOGICAS
BIOLOGICAS DE
DE LOS
LOS
MARCADORES
FLUORESCENTES
MARCADORES FLUORESCENTES

CLASIFICACION
CLASIFICACION FUNCIONAL
FUNCIONAL DE
DE LOS
LOS
MARCADORES
MARCADORES FLUORESCENTES
FLUORESCENTES

REACTIVIDAD CON GRUPOS QUIMICOS

MOLECULAS CON REACTIVIDAD QUIMICA

UNION NO COVALENTE A ESTRUCTURAS

MOLECULAS CON ESPECIFICIDAD ESTRUCTURAL

INTERACCION CON IONES O RADICALES

INDICADORES Y QUELANTES DE IONES

SUSCEPTIBILIDAD A REACCIONES ENZIMATICAS

SUSTRATOS DE ENZIMAS Y TRANSPORTADORES

PERMEABILIDAD Y RETENCION A TRAVES DE MEMBRANA

MACROMOLECULAS Y POLIMEROS SINTETICOS

FLUOROCROMOS INTRACELULARES NATURALES

MOLECULAS
MOLECULAS CON
CON REACTIVIDAD
REACTIVIDAD QUIMICA
QUIMICA

MOLECULAS
MOLECULAS CON
CON ESPECIFICIDAD
ESPECIFICIDAD
ESTRUCTURAL
ESTRUCTURAL

ANTICUERPOS CONJUGADOS CON FLUOROCROMOS

REACTIVOS DE GRUPOS TIOL (SH-)

LECTINAS CONGUJADAS CON FLUOROCROMOS

REACTIVOS DE GRUPOS AMINO (NH2-)

MARCADORES DE ACIDOS NUCLEICOS

REACTIVOS DE BASES NITROGENADAS

MARCADORES DE LIPIDOS
LIGANDOS FLUORESCENTES DE RECEPTORES

INDICADORES
INDICADORES YY QUELANTES
QUELANTES

SUSTRATOS
SUSTRATOS DE
DE ENZIMAS
ENZIMAS YY
TRANSPORTADORES
TRANSPORTADORES
SUSTRATOS DE ENZIMAS HIDROLITICOS

INDICADORES DE pH
QUELANTES DE CATIONES
SENSORES DE POTENCIAL DE MEMBRANA
SENSORES DE ESTRS OXIDATIVO

SUSTRATOS DE ENZIMAS OXIDATIVOS

SUSTRATOS DE ENZIMAS REDUCTIVOS
SUSTRATOS DE ENZIMAS DE TRANSFERENCIA
SUSTRATOS DE P-GLICOPROTEINA
ANALOGOS FLUORESCENTES DE BIOMOLECULAS

MACROMOLECULAS
MACROMOLECULAS YY POLIMEROS
POLIMEROS
SINTETICOS
SINTETICOS

FLUOROCROMOS
FLUOROCROMOS INTRACELULARES
INTRACELULARES
NATURALES
NATURALES

PROTEINAS CONJUGADAS CON FLUORESCENCIA

NUCLEOTIDOS DE NICOTINA REDUCIDOS (NADH, NADPH)

DEXTRANOS CONJUGADOS CON FLUORESCENCIA

NUCLEOTIDOS DE FLAVINA OXIDADOS (FMN; FAD)

ESFERAS DE EMISION AMPLIA DE FLUORESCENCIA

CLOROFILAS

ESFERAS CON FLUORESCENCIA ESPECIFICA

ESFERAS FLUORESCENTES CALIBRADAS
ESFERAS RECUBIERTAS DE ANTICUERPO

FICOBILIPROTEINAS
PROTEINAS FLUORESCENTES (GFP)

APLICACIONES
APLICACIONES CLINICAS
CLINICAS GENERALES
GENERALES

DIAGNOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR

PRONOSTICO BASADO EN EL ANALISIS CELULAR
EVALUACION Y MONITORIZACION DE TRATAMIENTO

APLICACIONES
APLICACIONES CLINICAS
CLINICAS DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA
DE
DE FLUJO
FLUJO

APLICACIONES
APLICACIONES DIAGNOSTICAS
DIAGNOSTICAS DE
DE LA
LA
CITOMETRIA
DE
FLUJO
CITOMETRIA DE FLUJO

CARACTERIZACION DE LAS CELULAS NORMALES

IDENTIFICACION Y DETECCION DE CELULAS ANORMALES

ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR

IDENTIFICACION
IDENTIFICACION YY CARACTERIZACION
CARACTERIZACION DE
DE
CELULAS
NORMALES
CELULAS NORMALES
PARAMETROS ESTRUCTURALES:
Tamao
Complejidad
ANTIGENOS DE SUPERFICIE:
Identidad
Linaje
Funcin
Activacin
ADN, ARN Y PARAMETROS RELACIONADOS:
Ploida
Estado proliferativo
Estado de maduracin
Expresin gnica
BIOQUIMICA INTRACELULAR:
Condiciones basales
Respuesta bioqumica a estmulos controlados

IDENTIFICACION
IDENTIFICACION YY CARACTERIZACION
CARACTERIZACION DE
DE
CELULAS
ANORMALES
CELULAS ANORMALES
ALTERACIONES EN LA MORFOLOGIA CELULAR:
Cambios en tamao
Cambios en granularidad
ALTERACIONES EN EL INMUNOFENOTIPO:
Inmunoproliferacin/ Inmunodeficiencia
Inmunodisfuncin
ALTERACIONES EN EL GENOTIPO:
Cambios en el contenido de ADN (ploida)
Cambios en la expresin de genes
ALTERACIONES EN LA BIOQUIMICA INTRACELULAR:
Cambios en la sntesis y concentracin de molculas
Cambios en la actividad de enzimas y en el flujo a travs de rutas
Alteraciones en el nmero y la funcin de orgnulos subcelulares
Cambios en la respuesta bioqumica a estmulos controlados
DETECCION DE CELULAS INFRECUENTES (CELULAS RARAS)
Deteccin de clulas tumorales circulantes
Deteccin de clulas fetales en sangre materna
Deteccin de clulas activadas o antgeno-especficas circulantes

APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO
EN
LA
TERAPEUTICA
EN LA TERAPEUTICA
SELECCION DE CELULAS EN LA TERAPIA CELULAR:
Anlisis de progenitores en el transplante autlogo
Pruebas cruzadas (cross-match) en transplantes heterlogos
Deteccin y cuantificacin de leucocitos residuales en hemopreparados
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL CELULAR:
Cambios en parmetros estructurales
Cambios en parmetros funcionales
ANALISIS DE LA ACCION TERAPEUTICA A NIVEL DEL PACIENTE :
Deteccin de recidivas y enfermedad mnima residual
Establecimiento de patrones pronsticos de xito teraputico
DETECCION Y ANALISIS DE RESISTENCIA A LA TERAPIA:
Anlisis de la captacin y retencin de frmacos (fenotipo MDR)
Anlisis del metabolismo de frmacos

APLICACIONES
APLICACIONES PRONOSTICAS
PRONOSTICAS DE
DE LA
LA
CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO
CORRELACION DE PARAMETROS CITOMETRICOS CON OTROS
PARAMETROS CLINICOS BIEN ESTABLECIDO:
Estudios retrospectivos con material de archivo
Estudios prospectivos
PARAMETROS IMPLICADOS DIRECTAMENTE EN EL PROCESO
PATOLOGICO:
Anlisis de muestras especficas de la patologa
Anlisis de parmetros especficos de la patologa
PARAMETROS IMPLICADOS INDIRECTAMENTE EN EL PROCESO
PATOLOGICO :
Anlisis de muestras indicadoras (reporter)
Anlisis de parmetros indicadores de la patologa (pathology-reporter)
Anlisis de parmetros predictivos de riesgo

APLICACION
APLICACION DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO EN
EN
EL
ANALISIS
DE
LA
LESION
Y
MUERTE
CELULAR
EL ANALISIS DE LA LESION Y MUERTE CELULAR
DETECCION DE LESION CELULAR SUBLETAL:
Cambios en parmetros estructurales
Changes in functional parameters
CUANTIFICACION DE LA VIABILIDAD CELULAR:
Determinacin de efectos citotxicos globales
Control de calidad de las preparaciones celulares
CARACTERIZACION DE LOS MECANISMOS DE MUERTE CELULAR:
Identificacin y anlisis de clulas apoptticas
Identificacin de clulas necrticas

APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA EN
EN INMUNOINMUNOHEMATOLOGIA
HEMATOLOGIA

APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA EN
EN INMUNOINMUNOHEMATOLOGIA
HEMATOLOGIA
ANALISIS DE ANTIGENOS:
Inmunofenotipo de superficie
Deteccin de antgenos intracelulares
Deteccin de antgenos circulantes
ANALISIS DE ANTICUERPOS:
Deteccin de anticuerpos circulantes
Deteccin de anticuerpos unidos a clulas
ANALISIS DE LA FUNCION CELULAR:
Anlisis de la proliferacin celular
Anlisis de la bioqumica intracelular
Anlisis de la muerte celular

INMUNOFENOTIPO
INMUNOFENOTIPO DE
DE SUPERFICIE
SUPERFICIE

INMUNOFENOTIPO
INMUNOFENOTIPO DE
DE SUPERFICIE
SUPERFICIE

Identificacin de subpoblaciones celulares mediante anticuerpos

monoclonales de especificidad conocida
Sistema CD: Clasificacin de grupos de anticuerpos
(Clusters of Differentiation) que reconocen los mismos
antgenos en los mismos tipos celulares
Proporciona informacin sobre:
Linaje celular
Estado de maduracin hematopoytica
Implicacin en la respuesta inmunitaria
Grado de activacin celular

Identificacin de subpoblaciones celulares en la hematopoyesis

Diagnstico y clasificacin de enfermedades hematolgicas:
Leucemias agudas y crnicas
Linfomas
Inmunodeficiencias
Hemoglobinuria paroxstica nocturna
Deteccin de enfermedad mnima residual
Enumeracin de precursores hematopoyticos CD34+
Diagnstico de enfermedades congnitas plaquetarias:
Tromboastenia de Glanzmann
Sndrome de Bernard-Soulier

ANTIGENOS
ANTIGENOS INTRACELULARES
INTRACELULARES
Deteccin de protenas intracelulares con anticuerpos
fluorescentes
Requiere el ajuste de procedimientos metodolgicos clave:
Suspensin de clulas individuales e intactas
Preservacin de los epitopos a determinar
Fijacin
Permeabilizacin
Marcaje con los anticuerpos
Anlisis multiparamtrico

ANTICUERPOS
ANTICUERPOS CIRCULANTES
CIRCULANTES
Deteccin de autoanticuerpos circulantes:
Anticuerpos antiplaquetarios
Anticuerpos antineutrfilos
Deteccin de aloanticuerpos circulantes :
Pruebas cruzadas pre-transplante
Uso de esferas recubiertas con HLA especficos
Deteccin de anticuerpos unidos a clulas de la sangre

ANTIGENOS
ANTIGENOS INTRACELULARES
INTRACELULARES
Deteccin de citokeratinas en muestras heterogneas:
Identificacin especfica de las clulas tumorales
Deteccin de clulas metastticas en ndulos linfticos
Deteccin de clulas tumorales circulantes
Fenotipo intracelular de leucemias y linphomas:
Cadenas ligeras de Ig intracelulares: y
Antgenos de superficie an no expresados: CD3, CD22
Enzimas intracelulares: TdT, MPO
Expresin de reguladores del ciclo celular: Ciclina D1
Expresin de protenas antiapoptticas: Bcl-2, Rb
Expresin de protenas supresoras de tumores: p53
Anlisis de citokinas intracelulares: Fenotipo Th0, Th1 y Th2

ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA INMUNOPROLIFERACION
INMUNOPROLIFERACION
Anlisis monoparamtrico del ciclo celular: Contenido de ADN
Anlisis multiparamtrico del ciclo celular:
Fenotipo de superficie y contenido de ADN
Contenido de ADN y antgenos relacionados con el ciclo
Anlisis de la historia de divisin celular:
Trazadores celulares (Cell-tracking dyes:PKH-1, CFSE)
Trazadores celulares y fenotipo de superficie

ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA BIOQUIMICA
BIOQUIMICA INTRACELULAR
INTRACELULAR
Funciones bioqumicas de la inmunidad especfica:
Sntesis y secrecin de citokinas
Expresin de molculas de adhesin
Movimientos inicos tras la activacin celular
Funciones bioqumicas de la inmunidad innata:
Fagocitosis y destruccin de microorganismos
Generacin intracelular de especies reactivas de oxgeno
Actividad proteoltica intracelular
Respuestas quimiotcticas:
Expresin de molculas de adhesin
Explosin oxidativa (Oxidative burst)
Funciones bioqumicas de las plaquetas:
Activacin y agregacin plaquetarias

APLICACIONES
APLICACIONES GENERALES
GENERALES DE
DE LA
LA
CITOMETRIA
DE
FLUJO
EN
INVESTIGACION
CITOMETRIA DE FLUJO EN INVESTIGACION
BASICA
BASICA

ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA MUERTE
MUERTE CELULAR
CELULAR EN
EN EL
EL
SISTEMA
INMUNITARIO
SISTEMA INMUNITARIO
Anlisis de clulas efectoras citolticas:
Identificacin fenotpica de subpoblaciones CD8 y NK
Anlisis de la citotoxicidad mediada por clulas:
Anlisis de la interaccin entre clulas efectoras y dianas
Anlisis de la citotoxicidad dependiente de anticuerpos:
Monitorizacin de la terapia con anticuerpos monoclonales
Anlisis del proceso y mecanismo de muerte celular:
Identificacin y cuantificacin de clulas apoptticas
Identificacin y cuantificacin de clulas necrticas
Anlisis de parmetros celulares durante la apoptosis

VENTAJAS DE LA CITOMETRIA EN
APLICACIONES FUNCIONALES
Acceso no invasivo
a parmetros celulares

Mltiples procesos
funcionales analizables

Integracin de respuestas
y mecanismos
Anlisis multiparamtrico
Resolucin de
heterogeneidad celular
Anlisis de gran
nmero de clulas

Seleccin fenotpica
de subpoblaciones

ENSAYOS CINETICOS POR CITOMETRIA DE

FLUJO

Anlisis
Cintico
in situ

Anlisis
secuencial

APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA EN
EN
CIENCIAS
MEDIOAMBIENTALES
CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES

Deteccin de
efectos
tempranos o
transitorios

Evaluacin de
procesos
dinmicos

APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA EN
EN
CIENCIAS
MEDIOAMBIENTALES
CIENCIAS MEDIOAMBIENTALES
Anlisis de poblaciones unicelulares en su entorno:
Identificacin y taxonoma
Estimacin de biomasa
Deteccin de contaminaciones
Deteccin de toxicidad in situ:
Marcadores de exposicin
Marcadores de efecto bioqumico
Uso de microorganismos naturales o de laboratorio como
indicadores de toxicidad
Anlisis genmico en clulas procedentes de organismos
superiores

SISTEMAS
SISTEMAS ESPECIALES
ESPECIALES DE
DE CITOMETRIA
CITOMETRIA PARA
PARA
EL
ANALISIS
MEDIOAMBIENTAL
EL ANALISIS MEDIOAMBIENTAL

CITOMETRO DE FLUJO IN SITU

EPICS V A BORDO DE
UN BARCO OCEANOGRAFICO

CMO
CMO FUNCIONA
FUNCIONA UN
UN SEPARADOR
SEPARADOR CELULAR?
CELULAR?
488 nm laser

Detector de FS
Detector de
fluorescencia

Placas cargadas

Clulas separadas

EJEMPLOS
EJEMPLOS DE
DE CELL
CELL SORTERS
SORTERS
AA LO
LARGO
DE
LA
HISTORIA
LO LARGO DE LA HISTORIA
EPICS V

EPICS CS

EPICS ELITE

MoFlo

EPICS ALTRA
FACStar

FACS Vantage

EJEMPLOS
EJEMPLOS DE
DE OBTENCION
OBTENCION YY ANALISIS
ANALISIS DE
DE
DATOS
EN
CITOMETRIA
DE
FLUJO
DATOS EN CITOMETRIA DE FLUJO

RECUENTO
RECUENTO ABSOLUTO
ABSOLUTO DE
DE LINFOCITOS
LINFOCITOS CD4
CD4
CON
ESFERAS
DE
CONCENTRACION
CALIBRADA
CON ESFERAS DE CONCENTRACION CALIBRADA

INMUNOFENOTIPO
INMUNOFENOTIPO DE
DE POBLACIONES
POBLACIONES
LINFOCITARIAS
LINFOCITARIAS

DETECCION
DETECCION YY CUANTIFICACION
CUANTIFICACION ABSOLUTA
ABSOLUTA
DE
PRECURSORES
HEMATOPOYETICOS
DE PRECURSORES HEMATOPOYETICOS CD34
CD34++

CD69

ANALISIS
ANALISIS DE
DE MARCADORES
MARCADORES DE
DE ACTIVACION
ACTIVACION EN
EN
LINFOCITOS
LINFOCITOS

CD69

ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA FUNCION
FUNCION PLAQUETARIA
PLAQUETARIA

+ CD3/CD28

BASAL

ANALISIS
ANALISIS DE
DE PARAMETROS
PARAMETROS DE
DE
ACTIVACION
EN
PLAQUETAS
ACTIVACION EN PLAQUETAS

RECUENTO
RECUENTO DE
DE RETICULOCITOS
RETICULOCITOS

ADP
ADP

ADP
ADP

RBC

Plaquetas

ADP
ADP

A23187
A23187

A23187
A23187

Basal
Basal

Basal
Basal

Basal
Basal

ADP
ADP

ANALISIS
ANALISIS DE
DE CITOKINAS
CITOKINAS INTRACELULARES
INTRACELULARES
EN
EN LINFOCITOS
LINFOCITOS

ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA ACTIVIDAD
ACTIVIDAD DEL
DEL
+
+
+
+
TRANSPORTADOR
TRANSPORTADOR Na
Na /H
/H EN
EN LEUCOCITOS
LEUCOCITOS

WBC

WBC

WBC

Granulocitos

Granulocitos
Granulocitos

Monocitos

RBC

Monocitos

Linfocitos

Monocitos

Linfocitos
Morfologa leucocitaria
y seleccin de linfocitos

Seleccin de poblaciones:
clulas T (CD3)

Seleccin de clulas T:
TC (CD8+)/TH (CD8-)

IgG2bPE

Sntesis de IFN: Baja

Lymphocytes

Control de activacin:
CD69

Control isotpico:
IgG2d-PE

Sntesis de IFN : Alta

AVANCES
AVANCES EN
EN LAS
LAS APLICACIONES
APLICACIONES
CLINICAS
CLINICAS DE
DE LA
LA CITOMETRIA
CITOMETRIA DE
DE FLUJO
FLUJO

Leucocitos
Leucocitos

Linfocitos
Linfocitos

Monocitos
Monocitos

Granulocitos
Granulocitos

Leucocitos
Leucocitos
+ EIPA
+ EIPA

AVANCES
AVANCES EN
EN LA
LA IDENTIFICACION
IDENTIFICACION YY
CARACTERIZACION
CARACTERIZACION DE
DE CELULAS
CELULAS
1. ANTIGENOS DE SUPERFICIE:
Caracterizacin de nuevas molculas de superficie (CD)
Marcaje con 4-5 colores de fluorescencia
Implementacin de software de autoajuste y autocompensacin
Preparacin automtica de muestras para inmunofluorescencia
2. ANTIGENOS INTRACELULARES:
Desarrollo de tcnicas reproducibles de permeabilizacin
Desarrollo de anticuerpos contra citokinas y enzimas
Desarrollo de sistemas para detectar protenas secretadas
3. ACIDOS NUCLEICOS:
Anlisis multiparamtrico del DNA y componentes celulares
Desarrollo de anticuerpos contra productos gnicos especficos
Desarrollo de anticuerpos contra protenas reguladoras del ciclo
Implementacin de software para ajuste del ciclo celular

AVANCES
AVANCES EN
EN EL
EL ESTUDIO
ESTUDIO FUNCIONAL
FUNCIONAL
DE
CELULAS
DE CELULAS

AVANCES
AVANCES EN
EN LAS
LAS APLICACIONES
APLICACIONES
AA LA
TERAPEUTICA
LA TERAPEUTICA

1. ASPECTOS FUNCIONALES DE LA INMUNIDAD:

Desarrollo de reactivos (tetrmeros) para detectar linfocitos antgenoespecficos
Desarrollo de mtodos para el anlisis de la activacin leucocitaria
Desarrollo de anticuerpos contra molculas de adhesin leucocitarias
Desarrollo de fluorocromos sensibles al burst oxidativo
Desarrollo de mtodos para el anlisis de fagocitosis
Desarrollo de mtodos para el anlisis de citotoxicidad
2. FUNCIONALIDAD DE LA HEMOSTASIA:
Desarrollo de anticuerpos contra antgenos estructurales
y dependientes de activacin en superficie de plaquetas
Desarrollo de tcnicas en sangre entera para el estudio
de la activacin de plaquetas
3. ANALISIS DEL METABOLISMO CELULAR:
Desarrollo de sustratos fluorognicos para enzimas intracelulares
Desarrollo de mtodos para Citoenzimologa de Flujo
Desarrollo de fluorocromos con especificidad subcelular

1. MECANISMO DE RESISTENCIA A FARMACOS:

Desarrollo de anticuerpos contra glicoprotena P
Desarrollo de tcnicas cinticas para el estudio de la captacin/eflujo de
frmacos o anlogos
Desarrollo de tcnicas para la cuantificacin de glutatin intracelular y de
glutatin-S-transferasa
2. DETECCION DE ENFERMEDAD MINIMA RESIDUAL:
Desarrollo de mtodos de inmunofluorescencia mltiple
Implementacin del anlisis de eventos infrecuentes
3. INMUNOLOGIA DEL TRANSPLANTE/TRANSFUSION:
Desarrollo de tcnicas para el estudio de histocompatibilidad
Implementacin de la deteccin de anticuerpos circulantes
Implementacin de la cuantificacin de clulas CD34+
Desarrollo de mtodos para detectar clulas contaminantes infrecuentes

AVANCES
AVANCES EN
EN LAS
LAS APLICACIONES
APLICACIONES DE
DE VALOR
VALOR
PRONOSTICO
PRONOSTICO O
O PREDICTIVO
PREDICTIVO
1. ESTABLECIMIENTO DE CONSENSOS METODOLOGICOS :
Inmunofenotipo de leucemias y linfomas
Ploida de DNA e ndice de proliferacin en tumores slidos
Deteccin y cuantificacin de activacin de plaquetas
Anlisis del fenotipo MDR
2. ESTABLECIMIENTO DE CONTROLES DE CALIDAD:
Inmunofenotipo de superficie
Ploida de DNA e indice de proliferacin en tumores slidos
Cuantificacin de clulas CD34+
3. VALOR PRONOSTICO/PREDICTIVO DE LA CITOMETRIA:
Inmunofenotipo en leucemias y linfomas
Ploida de DNA e ndice de proliferacin en algunos tumores
Expresin de genes relacionados con apoptosis en neoplasias
Expresin de protenas reguladoras del ciclo celular en neoplasias
Indice de madurez reticulocitaria en hematopoyesis

AVANCES
AVANCES EN
EN EL
EL ANALISIS
ANALISIS DE
DE LA
LA LESION
LESION YY
MUERTE
MUERTE CELULAR
CELULAR
1. AVANCES EN EL ESTUDIO FUNCIONAL CELULAR:
Desarrollo de tcnicas para la cuantificacin de sustratos
Desarrollo de tcnicas de citoenzimologa de flujo
Desarrollo de mtodos de activacin celular in vitro
2. AVANCES EN EL ESTUDIO DE LA MUERTE CELULAR:
Desarrollo de tcnicas de deteccin y cuantificacin de apoptosis
Desarrollo de mtodos para el estudio de los mecanismos
moleculares de la apoptosis
Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis
en neoplasias e inmunodeficiencias
Establecimiento del valor predictivo/pronstico de la apoptosis
en la respuesta a la teraputica