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Biologa

MICROSCOPIA
INTRODUCCIN
Existen diversos mtodos de estudio de la clula y de los tejidos, el principal instrumento para
investigar estas estructuras es el microscopio; existen as diferentes tipos, dependiendo de la
estructura y tamao de las muestras.
Los microscopios ms importantes son el ptico y el electrnico, cada uno de estos tienen sus
extensiones correspondientes como por ejemplo:
Microscopia ptica - de contraste
- de fase
- de interferencia
- entre otros.
Microscopia electrnica - de transmisin
- de alta aceleracin
- de barrido
Ambos instrumentos tienen que utilizar diversas tcnicas preparatorias, cada una
dependiendo del microscopio, estas tcnicas son:
a) fijacin
b) inclusin
c) corte
d) tincin
cada tcnica la conoceremos en profundidad en el proceso de observacin de tejido de este
informe, donde veras gracias a estas tcnicas preparatorias cada estructura muy bien
definida, gracias al tipo de tincin.

Gracias a este tipo de instrumentos y sus diversas especialidades podremos ver y estudiar
con mayor facilidad las clulas y tejidos.
UNIDADES MICROSCOPICAS

Prefijo

Abreviatura

Valor

yotta

10

24

zetta

10

21

exa

10

18

peta

10

15

tera

10

12

giga

10

mega

10

kilo

10

hecto

10

deca

da

10

Sin prefijo

Sin abreviatura

deci

10

-1

centi

10

-2

mili

10

-3

micro

10

-6

nano

10

-9

pico

10

-12

femto

10

-15

atto

10

-18

zepto

10

-21

yocto

10

-24

Las unidades micromtricas utilizan los prefijos micro, nano, pico, femto, atto, zepto,
yocto.

Para las unidades de longitud, se utilizan: micrmetro, nanmetro, picmetro, femtmetro,


attmetro, zeptmetro, yoctmetro, que son submltiplos con una medida equivalente a la
potencia o valor expresado en la anterior tabla, es decir para el micrmetro 10-6 metros y
as sucesivamente.

La unidad Angstrom (A) equivale a una diezmillonsima parte del metro, es decir 10
10
metros

MEJOR RESPUESTA
El sistema internacional de medidas incluye muchas unidades posibles para medir enormes y
minsculas magnitudes. stas pueden expresar valores desde el la distancia o la masa hasta la
frecuencia o la luminancia.
Para las distancias:
- La unidades macroscpicas se utilizan para medir grandes distancias como las astronmicas y se
suelen emplear los kilmetros, aunque se expresen en millones, o hablar directamente de
"aos/luz", que es la distancia que recorrera la luz en un ao (9.460.800.000.000 Km)
- Para medir pequeas distancias se usan las medidas microscpicas, pueden servir los
micrometros (0.000001 metros), nanmetros (0.001 micrometros) o los picometros (0.001
nanmetros). Las medidas inferiores a esto son muy poco frecuentes en el mundo cientfico, ya que
con esos rdenes pueden tratarse los comportamientos de las partculas ms pequeas que
existen.
TIPOS DE MICROSCOPIA

Microscopa ptica ( longitud de onda: 400-700nm)


Espectro de luz visible
+ Imagen 2D (Microscopios 1,2,3)
1-

Microscopio de fondo claro

Se ve todo claro menos la preparacin


Usa como fuente de luz directa una bombilla o la luz solar
La muestra a observar debe ser fina para que pueda ser atravesada por
la luz
Los microorganismos se suelen teir (por contraste).

2-

Microscopio de fondo oscuro

Se ve todo oscuro menos el objeto observar que se ve claro


Se usa para ver microorganismos vivos sin teir como espiroquetas
(Efecto Tindall)
Tiene la lente objetivo y un dispositivo que hace que el condensador y el
foco de rayo luminoso No entre un cono de luz, sino que tiene un
dispositivo que slo deja pasar los rayos ms divergentes.
Este rayo de luz pasa por la muestra, y si hay objeto, entonces lo difracta,
vindose el objeto blanco ya que desva estos rayos

3-

Microscopio de contraste de fases o de fondo claro

con dispositivo de Zernicke


Transforma las variaciones del ndice de refraccin luminosa en distintas
intensidades luminosas.
Se pueden observar microorganismos vivos.
Es un microscopio ptico modificado que permite contrastar sustancias
de diferente grosor o densidad.
El resultado es una imagen con distintos grados de brillo y oscuridad.

Con ste mtodo, el material denso aparece brillante, mientras que las
partes de la clula que tienen una densidad parecida a la del agua (casi
nula) aparecen oscuras.
Se utiliza para visualizar microorganismos y estructuras celulares sin
necesidad de usar colorantes o matarlos.

+ Imagen 3D (Microscopios 4,5,6)


4-

Microscopio de contraste diferencial inteferencial o

de Nomarsky
Utiliza luz polarizada
La luz pasa por un prisma dividindolo en 2 rayos que pasan por la
muestra

5-

Microscopio de fuerza atmica

Tiene un sensor que coge fuerzas atmicas repulsivas, basndose en


dispositivos electromagnticos.
Se construye un modelo digitalizado de la imagen.

6-

Microscopio Confocal

Se basa en mejorar la relacin entre la seal y el ruido de la imagen


Acopla una fuente de luz lser a un microscopio ptico
Un rayo lser se refleja en un espejo que lo dirige a un punto de la
muestra muy preciso. Mediante la iluminacin concreta de un solo plano
de la muestra, la intensidad de iluminacin disminuye rpidamente por
encima y por debajo de ese plano, y como consecuencia la luz perdida
en los otros planos es mnima.

Las imgenes obtenidas de las diferentes capas se pueden almacenar y


luego superponer digitalmente para reconstruir la imagen tridimensional
de la muestra completa, a esto se le llama microscopa de barrido
confocal.

Microscopa ultravioleta
1-

Microscopio de Luz ultravioleta

Mayor claridad y nitidez que el microscopio ptico


Usa lentes de cuarzo, no de vidrio
La emisin de luz es a longitud de onda ms corta (200-300nm)

Necesitamos mecanismos accesorios de visin para ver la imagen


2-

Microscopio de Fluorescencia

La emisin de luz es a 300-400 nm


A la luz se le da un colorante fluorescente ( Rodamina o aureoamina)
Usa lentes de cristal (vidrio)
Emite luz ultravioleta, pero lo que llega arriba es luz visible

Microscopa electrnica
Usa chorros de electrones
Disminuye el poder de resolucin, por lo que aumenta la calidad
o nitidez de la muestra a observar.
La longitud de onda se rebaja a 0.04nm

El microscopio electrnico es como un microscopio de fondo claro


invertido. Se trata de un filamento de tungsteno que suelta electrones,
que pasan a travs de un solenoide de campo magntico (imn) que abre
el chorro de luz, y as puede amplificar el chorro de electrones, sto

equivale a la lente objetivo, ya que el chorro de electrones se recoge en


una pantalla fotorreceptora o fotoconvertidora.

1-

Microscopio de transmisin (MET)

Las lentes son electromagnticas, operndose en todo momento a alto


vaco, en este estado la muestra se deshidrata muy rpido, lo cual nos
deforma las estructuras, por lo que no nos permite el anlisis de
muestras vivas.
Adems los electrones NO tienen gran poder de penetracin, por eso
requiere de cortes muy finos.

2-

Micoscopio de Barrido (MEB)

Usa campos electromagnticos


El ctodo o foco emisor tambin se encuentra arriba, pero existe otra
lente magntica que nos dirige un chorro especfico de electrones.
La muestra se cubre de sales de metales pesados (como oro o platino)
Los electrones pasan por el generador de barrido, es una zona que
continuamente cambia de polaridad, y ste chorro de electrones es como
una cortina que se abre y cierra continuamente.

Este choque de electrones genera una imagen de la superficie de la


muestra, y esto se recoge en una pantalla fotoconvertidora.
CELULA ANIMAL Y VEGETAL
Mejor respuesta: Animal:
1-Son celulas desnudas desprovistas de una pared Celular
2- Son Hetertrofas o Consumidoras, ya que al no poseer organelos membranosos, los Plastidios y
carecer de pigmentos Fotorreceptores( clorofila y carotemoides) son incapaces de sintetizar sus
propios alimentos, incorporan los nutrientes de los alimentos que poseen otros seres vivos.
3- Presentan Lisosmas funcionales para la Digestin intra y extracelular( endocitosis y exocitosis).
4- Poseen un organelo no membranoso el ster formado por un par de centrolos, llamado tambien
Centrosoma o centro celular encargado de formar las Fibras del Aparato del Huso Mittico,
Acrosmico o Acromtico mediante las cuales los cromosomas quedan adheridos a las fibras por
sus correspondientes Centrmeros, la denominacin de ster es porque cuando la clula animal
entra en Mitosis adquiere el aspecto estrellado parecido a un Sol o estrellas por las irradiaciones
de
5- Presentan Cilios, centrolos y Flagelos, este ltimo para la locomocin formado por fibrillas de
tubulina mltiples.
Celula Vegetal:
1- Presentan una pared celular de naturaleza celulsica ( pared celular primaria y secundaria) que
acta como elemento de proteccin a la membrana plasmtica y le da el aspecto de Cluloas
geomtricas( polidricas, isodiamtricas, etc).
2- Presentan organelos membransos de suma importancia los Plastidios( leucoplastos,
cromoplastos, cloroplastos activos en la Fotosntesis), encargados de transformar los Fotones de
luz solar en energa qumica( ATP/ NAPDH2), que sern utilizadas para la sntesis de molculas
orgnicas de mayor complejidad( azcares, lpidos, protenas).
3- Poseen Vacuolas muy desarrolladas, pueden ser numerosas como en las clulas meristemticas
o bien ser 1 sola y ocupar el 90% de la cavidad o lmen celular desplazando al sistemas de
emdomembranas y el ncleo hacia la periferia.
4- Son Auttrofas, Fottrofas o Productoras, ya que por Fotosntesis transforman sustancias de
baja energa potencial como el CO2, sales minerales y el H2O mediante la intervencin de la
clorofila y otros pigmentos auxiliares o accesorios los Carotenoides en sustancias orgnicas de alta
energa potencial.
5- No presnetan Cilios, flagelos ni centrolos.
Las 2 clulas en comn poseen la particularidad de presentar todos los organelos membransos y

no membransos, salvo los Plastidos propio de las vegetales y el centrosoma propio de las
animales, el sistemas de endomembranas y la divisin celular por Mitosis o Cariocinesis en clulas
Somticas o formadoras del cuerpo y por Meiosis las clulas germinales o gametas( vulo y
espermatozoide).

4.3.-Sistema mecnico del microscopio


La parte mecnica del microscopio tambin se denomina montura y es
de forma y dimensiones muy variables, dependiendo del fabricante y el
precio del instrumento.
De manera general se describen modelos grandes, medianos y
pequeos o porttiles. Los modelos grandes poseen todos los
aditamentos que garantizan un trabajo profesional y permiten el
intercambio de piezas y accesorios para realizar los trabajos ms
variados y su costo es el ms elevado. Los modelos medianos no
convienen a todo tipo de investigacin pero son ms prcticos puesto
que su precio es menor gracias a su construccin ms simple. Los

microscopios porttiles responden a necesidades ms restringidas y


producen aumentos menores, conviniendo para observaciones someras.

Toda montura, por complicada que sea posee los siguientes elementos:
pie o base, mecanismo de enfoque, la platina, el revlver y el tubo del
ocular.

4.3.1- Pie o base


Generalmente en herradura o en Y, aunque tambin puede ser
rectangular, con un peso considerable que garantiza la estabilidad del
instrumento. La base aloja la fuente de iluminacin y puede contener un
mecanismo para regular la intensidad luminosa.
Sirve de soporte a una columna o brazo sobre el cual reposa el resto del
aparato. La columna puede ser inclinada; en su parte ms inferior se
dispone el condensador y la parte superior posee una cremallera que
permite desplazar en sentido vertical el condensador, la platina o el
revlver y el tubo. Las ventajas que procura el microscopio inclinado son
mltiples y la posicin es ms confortable para el observador (actividad
que es muy incmoda cuando el tubo del microscopio es vertical).

4.3.2.-Mecanismo de enfoque
Se logra desplazando en sentido vertical ya sea la platina donde se
coloca el espcimen o ya sea el revlver donde estn colocados los
objetivos, de modo que se pueda centrar el punto focal del objetivo que
se est utilizando es ese momento. Se logra mediante dos mecanismos,
primero uno rpido del tornillo macromtrico y segundo, otro lento del
tornillo micromtrico.
La cremallera que permite el movimiento rpido del tornillo macromtrico
posee dientes que se engranan y producen un movimiento tosco para

lograr un enfoque aproximado. Se utiliza para enfocar con los objetivos


de poco aumento y para subirlos rpidamente con la finalidad de colocar
o retirar de la platina el preparado histolgico.
El tornillo micromtrico por el contrario posee una graduacin tal que
cada divisin de la rosca permite un movimiento vertical imperceptible en
el orden de 0,001 mm. Esta disposicin permite evaluar de manera
aproximada el espesor de los objetos, considerando el nmero de vueltas
que realiza el tornillo al enfocar su parte ms superficial y luego la ms
profunda.
El movimiento del tornillo micromtrico tiene una extensin de 5mm
aproximadamente y est limitado. Permite un enfoque fino y se utiliza con
los objetivos de mayor aumento (11).

4.3.3.-La platina
Es el soporte horizontal donde se colocan las preparaciones histolgicas.
Presenta en el centro un orificio circular por donde pasa el rayo de luz
producido por la fuente luminosa y proveniente del condensador.
Generalmente es de forma cuadrada y posee un sistema de fijacin e
inmovilizacin de la lmina porta-objeto compuesto por pinzas o una
pieza articulada que esta fija a otro dispositivo, el carro.
Este dispositivo permite el examen metdico y completo de la
preparacin al proporcionar un desplazamiento hacia adelante o hacia
atrs y de derecha a izquierda y viceversa.
Otra pieza, el vernier (denominado as gracias al nombre de su inventor
en 1631), tambin llamado nonius, consiste en dos pequeas reglas
graduadas en milmetros cuya finalidad es la de obtener coordenadas
aproximadas que sirven de referencia para localizar una estructura
determinada en la preparacin. En la prctica, el uso del vernier no es
frecuente, se hace un poco complicado anotar las cifras y ms difcil an
colocarlas en las reglas y localizar la estructura en cuestin. Adems,

estas cifras solo son vlidas para el microscopio en el cual se obtuvieron.


Hay otros procedimientos ms simples para tal fin (11, 64).

4.3.4.-El revlver
Considerado como un accesorio del tubo. Es un implemento muy
importante que permite el intercambio rpido de objetivos mediante un
movimiento de rotacin. El revlver est constituido por una semi-esfera
que posee una serie de anillos en los cuales van atornillados los
objetivos. Esta pieza gira alrededor de un eje que est colocado en la
parte inferior del tubo. Puede ser de diversas formas y de igual manera,
alojar un nmero variable de objetivos (dos, tres, cuatro o ms).

4.3.5.-El tubo
Soporta la porcin ptica del microscopio. Es un cilindro hueco de
longitud variable, cuyo interior est pintado de negro mate y posee un
diafragma para impedir la formacin de reflejos y facilitar la observacin.
El tubo puede ser doble y alojar dos lentes oculares (microscopio
binocular). En los modelos de microscopios grandes destinados a la
microfotografa, hay un tercer tubo accesorio, generalmente ms largo y
vertical que sirve para conectar una cmara fotogrfica sin necesidad de
lente ocular.
4.4.-Sistema ptico del microscopio
Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar
imgenes aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan.
Los componentes pticos estn colocados en una base estable que
permite un intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema
ptico est constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.

4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su
principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y
proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo
del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales
deben estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir
exactamente para formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn
hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto
grado de calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de
aumento, resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos
fabricantes elaboran objetivos que pueden ser intercambiados y
empleados en microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos
categoras de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y
los objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an dos
grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul
y roja. Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados
con filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografa blanco y
negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee
ninguna denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de
fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La
correccin de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan
buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la
microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de
aberraciones y por ello, son ms costosos. Presentan correccin
cromtica para cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin
de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para
microfotografa y video a color. Debido a su alto grado de correccin,
estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los
acromticos y las fluoritas. Esto puede ser un inconveniente puesto que
el campo de observacin se presenta un poco curvo.

Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que
se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se
denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto
entre el cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del
objetivo. En los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo
ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del ndice del vidrio porta y
cubre-objeto (n=1,5). Por el contrario, en los objetivos denominados de
inmersin el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del
objetivo es un lquido cuyo ndice de refraccin es lo ms prximo al del
vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite
de cedro, que posee un ndice de refraccin (n=1,515) casi idntico al del
vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o
eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el
objetivo, en consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada,
mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la
inmersin aumenta el ngulo de apertura del objetivo y permite mayor
resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos
luminosos refractados (11, 64) (ver fig. 3-5) y solo puede utilizarse con
objetivos de mayor aumento.
ptica finita y ptica infinita:
La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en
sus sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el
revlver por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con
una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que
funcionaban para esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a
160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de
microscopios modernos el tubo no es rectilneo y los rayos de luz
transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas,
especialmente en los microscopios trinoculares para fotografa. Emplear
objetivos diseados para una determinada longitud de tubo en otro
microscopio que no corresponda produce incremento en las aberraciones
de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes,
espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y

actualmente casi todos los fabricantes estn elaborando microscopios


que puedan aceptar objetivos diseados para realizar una correccin
infinita. Tales objetivos proyectan una imagen al infinito la cual es captada
por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al
punto focal del ocular. Los objetivos con esta correccin poseen el
smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al
infinito son significativos porque corrigen la aparicin de imgenes
fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no
obstante estos nuevos modelos son de mayor tamao (66) (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con


correccin al infinito. Modificado de Microscope objetives. Olympus Microscopy
Resource Center (66).

Estructura de los objetivos:


Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un
revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y

alineadas (fig. 4-5). En la parte externa posee grabadas las


especificaciones y caractersticas.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una


lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o
fluorita, con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que
contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esfrica
frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy (15).
ir arriba
Nomenclatura de los objetivos:
La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es
posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene
todas las especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La
minuciosa informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener
(fig. 4-6):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar
(semi- apocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige
curvatura de campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal
infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free,

chrome free infinity) y muchas otras especificaciones cuya nomenclatura


depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del
cono luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular,
usualmente en milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para
objetivos con correccin infinita.
Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm
pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos
objetivos poseen un collar de correccin en las lentes internas para
realizar la correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener
una escala graduada mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del
objetivo, expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas
condiciones tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de
fase, entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de
acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una
compatibilidad universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo,
algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro general
es de 20mm, pero los objetivos Leica y Nikon son de rosca ms amplia y
slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y
32 mm respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de
inmersin y para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones
Oil, Oel (aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua)
y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos
de colores para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas


especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en
Interferencia de contraste diferencial (DIC differential interference
contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con
platina caliente (heating stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Cdigo de color
de inmersin

Medio de inmersin

Negro

Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o multiuso

Cdigo de color
de aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos. Modificado de Davison


M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

ir arriba
4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que
generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las
extremidades de un cilindro que va introducido en la parte superior del
tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce
el objetivo, ejerciendo dos funciones:
Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con
respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al
objeto. Posteriormente el ojo endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el
objeto.
La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el
aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se
denomina colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).

Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y
formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida
hacia el objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. Tambin
denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos
lentes. Muy comn en modelos de microscopios antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por

varias lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma.


Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con
los objetivos corregidos al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de
aumento para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que
se aprecia en los objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento
con objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de
la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal
para dibujar o para exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo
perfectamente plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro
como en la periferia del campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se
produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares
de tipo Huygens pero con una doble lente ocular (11).

Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular


compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b)
poseen el diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los
oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes
(c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38)


(fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones
cromticas, la curvatura de campo y su empleo ptimo es en
combinacin con objetivos de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular


negativo.Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (monooculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos
ms modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los
binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45
para realizar la observacin cmodamente.
Campo del microscopio:
Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en
el ocular. Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible
observado a travs de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo
disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente
proporcional al aumento del microscopio. La forma del campo est
determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de
forma circular, no obstante el campo puede ser cuadrado y esta forma es
muy til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se
requiere reconstruir la totalidad del campo de observacin de la
preparacin, lo cual se dificulta con un campo circular clsico al quedar
zonas superpuestas (11).

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el


objetivo. El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular
y generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero
de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija
del diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan
sus caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la
observacin microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos
planos.
Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o
medicin de estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es
relevante conocer el nmero, tamao o dimensiones de las clulas y
dems elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una
pieza circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece
enfocada y superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el
plano de formacin de la misma. Los oculares para la medicin poseen
un mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala
de medicin del ocular con cada objetivo que se use (15). En la
actualidad se puede emplear algn software de computacin para
realizar mediciones sobre las imgenes digitales y obtener datos muy
precisos, no obstante, el mtodo ms econmico y de uso ms
generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura
filamentosa (alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la
finalidad de indicar de manera especfica alguna estructura en particular
en el campo de observacin. El sealador se aprecia como una lnea
oscura que parte del borde del campo hacia el centro del mismo.

Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es,
por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por
otra, impedir la formacin de reflejos luminosos que dificulten la
visualizacin. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo
de enfoque del ocular que ajusta las dioptras en caso que el observador
posea una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por
separado tanto para el ojo derecho como para el izquierdo; de igual
manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente
entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se


observa un campo rectangular con una escala de divisiones precisas,
que en este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el
tamao de una clula se cuenta el nmero de divisiones que ocupa y la
cifra se divide entre el aumento del objetivo empleado, dando como
resultado un valor que corresponde al tamao de la misma. Si la clula
mide 7 divisiones, corresponde a 7/10mm; si el aumento del objetivo es
100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy
from the very begining. 2 ed. (13).

4.8.-Tipos de microscopios
Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la
naturaleza de los sistemas de luz y otros elementos utilizados para
obtener las imgenes.

El microscopio ptico puede ser monocular, binocular, trinocular (para


microfotografa). En los microscopios binoculares la observacin se hace
con los dos ojos y esto permite una observacin ms cmoda y se
percibe una mayor nitidez de los detalles en la imagen. Se fabrican en
diferentes tamaos incluyendo microscopios pequeos porttiles o de
viaje. Dentro de los tipos de microscopios se describen:
Microscopio vertical: Es el microscopio convencional, perfeccionado a
partir de los modelos antiguos, que posee la fuente de luz ubicada en la
base, por debajo de la platina. Es el microscopio de uso ms comn.
Microscopio invertido: La estructura del microscopio es invertida en
comparacin al microscopio convencional. La fuente de luz est ubicada
por encima de la platina y el principio de funcionamiento y formacin de
la imagen es el mismo que el del microscopio tradicional. Utilizado
principalmente para cultivos celulares (clulas vivas) sin una preparacin
previa y para monitorear actividades (crecimiento, comportamiento) (fig.
4-18).

Figura 4-18.-Microscopio invertido con el revlver y objetivos por debajo


de la platina. La fuente de luz se ubica en la parte superior. Tomado de Instrumental
Pasteur. Microscopio Olympus. (78).

Microscopio estereoscpico: Este tipo de microscopio proporciona


una imagen estereoscpica, en tres dimensiones (3D) del espcimen. Se
fundamenta en la visin binocular convencional, en la que los dos ojos
observan el espcimen con ngulos levemente distintos. El microscopio
estereoscpico debe ser binocular. Se utiliza para observar especmenes
de gran tamao, sin corte o preparacin previa puesto que emplea luz
incidente y no funciona por trans-iluminacin. Es ideal para realizar
microdiseccion (fig. 4-19).

Figura 4-19.-Microscopio estereoscpico. Tomado de Kosmos Scientific de Mxico (79).

Microscopio quirrgico: Es un microscopio que se emplea en


microciruga. Proporciona un campo muy bien iluminado y un aumento de
las estructuras anatmicas, facilitndole al cirujano una mayor visibilidad
de los tejidos sanos y patolgicos que sern manipulados ms
cuidadosamente y con menores posibilidades de lesin. Algunos modelos
ms sofisticados tienen piezas automatizadas robticas. Se utiliza
principalmente en intervenciones quirrgicas en las que se amerite una
minuciosa diseccin, como por ejemplo del crneo y cerebro o del globo
ocular (fig. 4-20) (80, 81).

Figura 4-20.-Cirujano empleando microscopio quirrgico. Tomado de Cerrn, V (80).

Microscopios fotnicos especiales: Ciertos especmenes,


principalmente las clulas vivas o muestras no coloreadas, al ser
observados en el microscopio comn de campo claro, muestran un muy
pobre contraste de sus estructuras y no aportan datos relevantes, a
pesar del poder de resolucin de los objetivos empleados. Para ello se
han creado microscopios con ciertas particularidades que permiten la
observacin de ese tipo de especmenes con un incremento muy
satisfactorio del contraste. Entre ellos se citan:
Microscopio de campo oscuro.

Microscopio de luz ultravioleta.


Microscopio de fluorescencia.
Microscopio de polarizacin.
Microscopio de contraste de fases.
Microscopios interferenciales.
Estos microscopios se estudian en el Captulo 6