EXPERIMENTO 5

ENZIMA CATALAZA
ACTIVIDAD ENZIMATICA. FACTORES QUE LA AFECTAN.
DETERMINACION DE LA CONSTANTE DE
MICHAELIS-MENTEN. EFECTO DE INHIBIDORES SOBRE LA
ACTIVIDAD ENZIMATICA.
REQUISITOS
Repasar la deduccin
de la frmula de
Michaelis-Menten, sus
premisas y aplicacin.
Balance de ecuaciones
y titulacin

1.

OBJETIVOS
Describir algunas
caractersticas de las enzimas.
Determinar la actividad
enzimtica de las catalasas, su
Km y el efecto de inhibidores
sobre la actividad enzimtica.

FUNDAMENTOS

Las enzimas son catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Esto significa que son protenas cuya
funcin es acelerar las reacciones bioqumicas. Aunque se trata de protenas muchas requieren, para ser
activas, un componente no proteico conocido como coenzima o grupo prosttico, segn se encuentre
dbil o firmemente asociado a la matriz proteica. La estructura de este componente no proteico va a
++

++

++

variar desde un ion (Ca , Mg , Mn , y otros) hasta molculas complejas como NAD+, NADP+ y
FAD. En estos casos la actividad enzimtica va a depender de la presencia simultnea de una porcin
proteica (apoenzima) y una porcin no proteica (coenzima) y el conjunto activo apoenzima mas
coenzima, se conoce como holoenzima.
La actividad enzimtica se estudia en el equilibrio, donde no hay cambio neto en la cantidad de sustrato
o de producto. En los sistemas biolgicos, las enzimas abaten la energa de activacin y permiten que
se produzcan reacciones, que de otro modo, no ocurriran a velocidades mesurables. Las enzimas no se
consumen en el proceso y las reacciones catalizadas no alteran la naturaleza de la reaccin, solo
disminuyen la energa de activacin. (Figura 1)
60

Figura 1

Diagrama de energa para reacciones con G positiva y negativa comparando una

reaccin catalizada contra una no catalizada.

Una consecuencia del hecho de que las reacciones bioqumicas sean catalizadas por enzimas es la
especificidad de stas hacia el substrato: una enzima cataliza la transformacin de un solo tipo de
molcula o de unos tipos diferentes de molculas estructuralmente muy relacionadas, la especificidad
representa una ventaja para la clula.
Las enzimas dependiendo de las reacciones que catalizan, se han clasificado por la comisin
internacional de enzimas (E.C) en cuatro dgitos que anteceden al nombre recomendado para la enzima,
este nombre esta compuesto por uno corto unido al nombre de la reaccin que cataliza, los dgitos son:
el primero se refiere a la clase y van del 1 al 6, representan la reaccin general catalizada, el segundo la
sub-clase, el tercero la sub-subclase y el cuarto designa a cada enzima especifica. En la tabla a
continuacin se muestra la clasificacin solamente del primer dgito:

61

Tabla 1. Clasificacin de las enzimas en su primer dgito.

62

Como protenas que son, las enzimas, son molculas de uso delicado por ser fcilmente
desnaturalizables. Debido a esto, deben manipularse bajo condiciones que no favorezcan la
desnaturalizacin puesto que sta conduce a la inactivacin. Entre las condiciones que se deben
controlar durante la manipulacin de las enzimas, cabe destacar:
1.1

Condiciones a controlar durante la manipulacin de las enzimas:

La temperatura: La estructura terciaria de una protena es muy sensible a los cambios de la temperatura
ya que, como sabemos, se mantiene gracias a fuerzas no covalentes altamente sensibles al calor. Esto
hace que la actividad enzimtica muestre una dependencia de la temperatura como la representamos en
la figura. 2.
Figura. 2

Influencia del aumento de la temperatura sobre la actividad enzimtica

Actividad Enzimatica
U/L

Influencia del aumento de la temperatura sobre la

actividad enzimatica
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1

10

11

12

13

14

Aumento de la temperatura (grados centgrados)

1.1.1. El pH: Debido a que los cambios de pH modifican las concentraciones de los iones H y OH de
la solucin, las interacciones electrostticas intra e intermoleculares as como las interacciones entre las
molculas de protenas y la solucin de un valor de pH a otro, modificndose as tambin la
estructura tridimensional y la actividad de la protena. La grfica que se obtiene cuando se estudia la
actividad enzimtica en funcin del pH se parece a la obtenida en el pargrafo anterior como se puede
notar en la siguiente figura.

63

Figura. 3.

Influencia del aumento del pH sobre la actividad enzimtica

Actividad Enzimtica U/L

Influencia del aumento del pH sobre la actividad

enzimtica
8
7
6
5
4
3
2
1
0
1

10

11

12

13

Aumento del pH

1.1.2. La fuerza inica: Como la fuerza inica esta relacionada con la concentracin de los diferentes
iones de una solucin y stos pueden influir sobre la estabilidad y la actividad de una protena debe
mantenerse un control sobre este parmetro.
1.1.3. La agitacin: Las soluciones de protenas tienen baja tensin superficial, lo cual determina que
cuando estas soluciones se agitan violentamente, se forma espuma. la formacin de espuma es un factor
que favorece la desnaturalizacin.
1.2.

Determinacin de la actividad enzimtica

Cuando en el laboratorio se desea estudiar la actividad de una enzima particular, se comienza por
controlar algunos parmetros que van a determinar la reproducibilidad de los ensayos. Entre estos
parmetros se pueden destacar:
1.2.1. Mtodos de deteccin: Lo primero de que se debe disponer es de un mtodo que permita
detectar y cuantificar el producto formado o el substrato remanente despus de la reaccin. Los
mtodos ms usados por su rapidez y sencillez, son los colorimtricos y espectrotofomtricos; luego se
encuentran la cromatografa en papel, en capa fina o de gases; titulacin, respirometra, otros.
1.2.2. Tiempo de incubacin: Para determinar una actividad enzimtica es necesario fijar un intervalo
de tiempo conveniente durante el cual se consuma una cantidad mensurable de substrato. Debe siempre
garantizarse que haya un exceso de sustrato. Para determinar el tiempo de incubacin, se mezclan los
reactantes en varios recipientes y se detiene la reaccin a diferentes tiempos.
Se consigue que mientras no ha ocurrido la saturacin de la enzima por el substrato, la actividad es
proporcional al tiempo de incubacin; la saturacin provoca la prdida de la proporcionalidad; sin
64

embargo, no se debe confundir la situacin en que se alcanza la saturacin con la situacin en que se ha
agotado el substrato; por esto el substrato debe estar en exceso. La grfica que debe encontrarse es la
que se muestra en la figura 4.
Figura 4.

Velocidad de reaccin frente concentracin del sustrato (V vs. [ S ])

Para estudiar la reaccin, se puede elegir cualquier lapso comprendido dentro de la barra a y se debe
desechar el lapso representado por b, el tiempo debe ser tal que se pueda hacer una determinacin
confiable de la actividad.
1.2.3. Concentracin de la enzima: Determinado el tiempo de incubacin y en la seguridad de que la
concentracin de substrato es excesiva se incuban las mezclas de reaccin durante el tiempo
predeterminado pero con cantidades diferentes de enzimas; si el substrato se encuentra en exceso, se
debe hallar una proporcionalidad directa entre la actividad y la concentracin de enzima (Figura.5).

65

Figura 5

Actividad enzimtica frente a la concentracin de la enzima

Actividad enzimtica U/L

Actividad enzimtica frente a la concentracin de

la enzima
12
10
8
6
4
2
0
1

10

Concentracin de la enzima g

Se debe elegir una cantidad de enzima que permita una determinacin confiable de la actividad.
1.2.4. Concentracin del substrato: La determinacin de este parmetro es muy importante por dos
razones principales:
a.

Permite el clculo de las propiedades cinticas Km y Vmax para ese sustrato.

b.

Indica definitivamente qu concentracin de sustrato se puede considerar saturante.

Por lo general, se considera saturante y se emplea rutinariamente una concentracin de sustrato [s] = 10
Km. Diga el estudiante a qu fraccin de Vmax corresponde la actividad enzimtica cuando [s] = 10 Km.
Como ya el estudiante debe imaginarse, esta determinacin se realiza empleando una cantidad fija de
enzima e incubando durante un mismo lapso de tiempo pero con diferentes concentraciones de sustrato.
Al hacer esto hay que tomar en ciertas precauciones prcticas: Debe cuidarse con las concentraciones
inferiores que no se agote el sustrato en el lapso de tiempo fijado con la cantidad de enzima usada. Para
evitar esto hay varias alternativas: aqu las mencionaremos y el estudiante deber averiguar como se
justifican:
a.

No hacer ninguna modificacin al tiempo ni a la cantidad de enzima determinados.

b.

Reducir la cantidad de enzima e incubar durante el tiempo determinado.

c.

Reducir el tiempo de incubacin y mantener fija la cantidad de enzima determinada.

66

d.

Reducir el tiempo de incubacin y la cantidad de enzima.

e.

No emplear concentraciones de sustrato demasiado bajas.

1.2.5. Temperatura de incubacin: Sabemos que la velocidad de una reaccin qumica aumenta al
elevarse la temperatura; esto tambin es cierto para las reacciones enzimticas pero el rango de
activacin por la temperatura es limitado, generalmente 0C y 45C; aunque estas cifras no son
absolutas, por lo general a menos de 0C la actividad es prcticamente indetectable mientras que a
ms de 45C la enzima se inactiva, por las razones expuestas previamente. La temperatura ptima de
reaccin se determina incubando bajo condiciones constantes de los parmetros previamente
determinados y a temperaturas diferentes; la grfica es la mostrada en la Figura 2.
1.2.6. pH de incubacin: Se procede igual que para determinar la temperatura ptima pero slo se
vara el pH de la mezcla de reaccin; la grfica que se obtiene es la mostrada en la Figura 2.
1.3.

La determinacin de la constante de Michaelis y el efecto de inhibidores sobre la actividad

enzimtica
Partiendo de la hiptesis de la formacin del complejo enzima sustrato de que la velocidad de
descomposicin del sustrato es proporcional a la concentracin

del complejo intermediario ES,

Michaelis y Menten derivaron una ecuacin que indica como vara la velocidad de reaccin en funcin
de la concentracin de sustrato.
Esta ecuacin tiene la expresin:
V max. [S]
v = -----------------Km + [S]

Km =

Vmax.
v = ---------------------Km + 1
-----------[S]

V max.
[S] ( --------------------V

- 1)

La constante de Michaelis es un parmetro de gran importancia y al mismo tiempo una caracterstica de

cada enzima con un valor constante slo para condiciones definidas del sistema. Si una enzima acta
para varios sustratos tendr un KM para cada sustrato.
La constante de Michaelis puede definirse como la concentracin del sustrato a la semi velocidad
mxima de reaccin; tiene por consiguiente las dimensiones de una concentracin de sustrato en mol/L.
67

V. max.
Esta definicin proviene de la frmula de Km puesto que cuando v = ------------2
entonces Km = [S].
1.3.1 Mtodos para determinar la constante Michaelis-Menten.
1.

Si la velocidad inicial de la reaccin se grfica como funcin de las concentraciones del sustrato

se puede determinar la velocidad mxima y tambin la concentracin del sustrato a la semi-velocidad

mxima de reaccin (Km ).
2.

Un procedimiento o mtodo ms empleado es el de Lineweaver y Burk el cual consiste en

graficar los recprocos de las velocidades de reaccin contra los recprocos de las concentraciones del
sustrato con lo cual se obtiene una lnea recta.
Vmax. [S]
Tomando la inversa de la ecuacin v = -------------------Km + [S]

Se obtiene

1
---- =
v

Km + [S]
--------------------Vmax. [S]

1
Km
------- = --------------------v
V. max. [S]

1
------v

[S]
------------------V. max. [S]
1

---------------V max.

Km
+

----------------V max.

(1)

[------ ]
[S]

Esta es la ecuacin de una recta ( y = a + b x ) cuyo coeficiente angular es Km / Vmax. y el valor de la

ordenada en el origen es 1/ Vmax. en el eje 1/v.
Cuando 1/v = 0, entonces

-1
1
----- = -----Km
[S]

De este modo es posible obtener grficamente los valores de Vmax. (en la interseccin de 1/v) y calcular
el valor de Km. La siguiente figura representa
68

1.3.2 Inhibicin de la actividad enzimtica.

Algunas sustancias actan sobre las enzimas o coenzimas que intervienen en una reaccin enzimtica
afectando la Vmax. de reaccin y/o la afinidad de la enzima por el sustrato. El uso de estas sustancias
inhibidoras ha permitido conocer la naturaleza de grupos funcionales del centro activo, la especificidad
del sustrato, posibles mecanismos de reaccin enzimticos y la participacin de algunos grupos
funcionales en el mantenimiento de la conformacin de la enzima especfica para su actividad
biolgica.
La inhibicin puede ser: reversible o irreversible. En el primer caso es posible eliminado el inhibidor
por dilisis recuperar la enzima intacta. En el segundo caso el inhibidor reacciona con la enzima
destruyendo uno ms grupos funcionales de la enzima y no puede eliminarse dicho inhibidor por
dilisis. En exceso de inhibidor su accin aumenta con el tiempo ya que la formacin del complejo EI
es irreversible.
Inhibicin reversible: Especifica. El inhibidor se combina con el centro activo de la enzima D con
grupos funcionales esenciales para la actividad enzimtica pero que no estn en el centro activo. Este
tipo de inhibicin puede ser: Competitivo o no competitivo.
Inhibicin competitiva: La enzima puede enlazar en su centro activo una sustancia estructuralmente
relacionada a su verdadero sustrato previnindose de esta manera la unin al sustrato; el S y el I
compiten por alcanzar el centro activo de la enzima; esta inhibicin se revierte por exceso de sustrato.
El valor de la Km cambia pero no Vmax. alcanzada en la reaccin sin inhibidor.
Inhibicin no competitiva: Ocurre cuando se produce inhibicin especfica y reversible que depende
slo de la concentracin del inhibidor y no se elimina por aumento de la concentracin del sustrato.
Esto indica que el I se une a E en un punto esencial para la actividad enzimtica diferente del centro
activo. Con el inhibidor no competitivo la Km permanece invariable pero Vmax. alcanzada es menor que
la que se logra en ausencia de inhibidor.
1.3.3 Mtodos para determinar el efecto de inhibidores: Las figuras a continuacin (6, 7 y 8),
muestran el efecto de los diferentes tipos de inhibicin por los mtodos de Michaelis-Menten y
Lineaweaver-Burk

69

Figura 6

Inhibidor competitivo (Km alterada y la Vmax. es igual). Por los mtodos de

Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

70

Figura 7

Inhibidor no competitivo (Km inalterada y Vmax. menor en ausencia de inhibidor).

Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

71

Figura 8

Inhibidor irreversible no competitivo (Km y Vmax menor en ausencia de inhibidor).

Por los mtodos de Michaelis-Menten y Lineaweaver-Burk

72

2.

MATERIALES EQUIPOS Y REACTIVOS:

Soportes Universales
Pinzas
Nueces
Buretas de 50 ml
Pipetas de 125 y 10 ml
Fiolas de 125 ml
Agua oxigenada (H2O2)
2.1
Procedimiento:

Embudos
Cronmetro (aportados por los alumnos)
cido sulfrico 2N
Permanganato de potasio 0,1N
Papel milimetrado (aportado por los alumnos)
Soluciones tampn a diferentes pH

2.2.1. Preparacin de la enzima:

A un litro de agua destilada enfriada en hielo agregue 1 ml de sangre obtenida por venipuntura y
mezcle volteando suavemente el recipiente dos veces. Esta solucin se mantiene siempre en hielo.
Puede usarse 1 ml de homogeneizado de hgado o rin de res o ratas.
2.2.2. Deteccin de la actividad enzimtica: Se detectar la actividad enzimtica de la catalasa
titulando con permanganato de potasio 0 1N el agua oxigenada presente en cada fiola, despus de
agregrsele cido sulfrico 2N.
La ecuacin en que se basa el mtodo de deteccin es:
MnO4-

+ H2O2 + H

O2 + Mn

++

+ H2O

El estudiante debe balancear la ecuacin y analizarla ya que a partir de ella se realizarn los clculos
que se van a necesitar durante la prctica. Igualmente el alumno deber repasar lo aprendido en
qumica inorgnica sobre titulacin.
2.2.3 Determinacin del volumen de enzima:
a.

Numere 10 fiolas y siga el esquema de trabajo mostrado a continuacin:

Fiola N

H2O2 (ml)

H2O (ml)

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5

8.0
8.0
7.5
7.5
6.5
6.5
5.5
5.5
4.5
4.5

H2SO4 (ml)
t = min
3
3
3
3
3
73

Enzima (ml)
0.5
0.5
1.0
1.0
2.0
2.0
3.0
3.0
4.0
4.0

H2SO4 2N (ml)
t = min.
3
3
3
3
3

b.

Proceda as: Numere las fiolas, aada H2O2 y H2O.

Si se trata de las fiolas 1, 3, 5, 7, 9, adales el H2SO4 al tiempo cero antes de aadir la enzima.

d.

En el caso de la otras fiolas aada primero la enzima (no aada el cido) y

simultneamente ponga a funcionar el cronmetro mezclando nuevamente.

e.

Espere el tiempo indicado (1 min) para aadir el cido. Mezcle y titule con la solucin

de

permanganato.
f.

Se hace una grfica representativa del nmero de moles de H2O2 descompuestos por minutos en

funcin del volumen de enzima empleado y en base a esa grfica el grupo escoger el volumen de
enzima que emplear en las experiencias siguientes.
2.2.4. Determinacin del tiempo de reaccin:
a.

Realice la siguiente experiencia:

Fiola N

H2O2 (ml)

H2O (ml)

enzima (ml)

t(min)

H2SO4 2N(ml)

1.5

8.0

1.5

8.5-x

1.5

8.5-x

1.5

8.5-x

1.5

8.5-x

Nota: X es el volumen de enzima escogido en la experiencia anterior.

b.
El cido sulfrico se agrega despus de transcurrido el tiempo prescrito a partir de la adicin de
la enzima excepto en fiola 1.
c.
Titule el H2O2 remanente en cada fiola y haga una grfica que represente la cantidad
de
moles de H2O2 descompuestos en funcin del tiempo de incubacin y en base a ella elija el tiempo
de incubacin que emplear en las experiencias sucesivas.
3.
AUTO-EVALUACIN
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Qu papel (es) juega el cido sulfrico?

Qu concluye respecto a los resultados de las fiolas 1, 3, 5, 7 y 9?
Por qu puede suceder esto?.
La ecuacin siguiente es en la que se basa el mtodo de deteccin, efecte el balance:
+
++
MnO4- + H2O2 + H O2 + Mn
+ H2 O
Disear un protocolo que le permitan determinar los siguientes parmetros: a. Temperatura
b. pH ptimo, c. Constante de Michaelis (Km) y velocidad mxima (Vmax), d. Efecto de la azida
de sodio sobre la actividad enzimtica.
Calcule cmo se preparan 250 ml de una solucin de H2SO4 2N a partir de una botella que tiene
las siguientes especificaciones: d =1.84 g/ml y pureza 97%.
74

4.

INFORME 6

(CATALASA)

Apellidos

Nombres

Grupo de prcticas

N del mesn

Fecha

N del estudiante

Calificaciones
Entrada
1.

Desarrollo

Informe

Disee una tabla en esta hoja para presentar sus resultados.

75

Definitiva

2.

Anexe sus grficas realizadas en papel milimetrado, recorte y pegue en el espacio a

continuacin.

3.

Interprete sus resultados experimentales. Sea breve y ordenado

Nota: El informe debe ser entregado al finalizar la prctica, sin anexar hojas.

76