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Control Biológico de Trichoderma Harzianum PDF
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RESUMEN
Se determinaron los hongos ms frecuentes causantes de enfermedades en frutos de postcosecha de
Carica papaya L. papaya amarilla, procedentes de las zonas de distribucin del distrito de Trujillo,
utilizando 220 frutos enfermos atacados por hongos, en el perodo comprendido entre Enero a Noviembre de
2011. Se realizaron aislamientos, monocultivos y microcultivos de las especies patgenas en medios de
cultivo Agar Sabouraud Dextrosa y Agar Lima Bean para efectuar observaciones macro y microscpicas de
las estructuras fngicas, previa coloracin con Azul de Amann. Posteriormente, se investig el efecto
antagnico de Trichoderma harzianum Rifai sobre los hongos patgenos de frutos de postcosecha de
papaya. Los hongos fitopatgenos determinados fueron: Rhizopus nigricans Ehr., Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.)Sacc., Alternaria alternata (Fr.)Keissl, Stemphylium lycopersici (Enjoji)W.
Yamamoto, Fusarium oxysporum Schlecht., Lasiodiplodia thebromae (Pat.)Griffon & Maubl. Trichoderma
harzianum, demostr realizar un efectivo control biolgico sobre los hongos patgenos de frutos de
postcosecha de Carica papaya papaya.
Palabras clave: Hongos, control biolgico, Trichoderma harzianum, enfermedades postcosecha, Carica
papaya.
ABSTRACT
The most frequent pathogenic fungi attacking to vegetables post-harvest of Carica papaya L. yellow
papaya, determined from zones of distribution of the Trujillo district, Per; between January to November
2011. Samples of the fungi were taken from sick vegetables and cultures were made on Agar Sabouraud
Dextrosa and Agar Bean Lima medium. Fixation and mounting were made with Amann blue. Subsequently,
it was investigated the antagonistic effect of Trichoderma harzianum on pathogenic fungi of post-harvest
"papaya" fruits. Certain phytopathogenic fungi were: Rhizopus nigricans Ehr., Colletotrichum
gloeosporioides (Penz.)Sacc., Alternaria alternata (Fr.)Keissl, Stemphylium lycopersici (Enjoji)W.
Yamamoto, Fusarium oxysporum Schlecht., Lasiodiplodia thebromae (Pat.)Griffon & Maubl. Trichoderma
harzianum, demonstrated to carry out an effective biological control on the fruits of Carica papaya "papaya"
post-harvest pathogenic fungi.
INTRODUCCIN
El reino de los hongos est constituido por organismos heterotrficos que se encuentran
ampliamente distribuidos en la naturaleza, caracterizados por su amplio nmero y ubicuidad,
participando en la degradacin progresiva de la materia orgnica y produciendo enfermedades en
los vegetales, animales y el hombre1.
En Latinoamrica como en el resto del mundo, existen numerosos hongos que son parsitos
obligados o facultativos de las plantas, y constituyen la principal causa de infecciones y
enfermedades en ellas2,3. En el Per, el panorama es parecido, encontrndose una gran variedad de
hongos que atacan a plantas superiores de inters econmico, como Carica papaya L. papaya,
planta arbrea, de tallo (estipe) fofo, con ltex lechoso, de gran importancia frutcola y elevada
demanda, cuya parte comestible: los frutos las papayas, poseen un ltex con una enzima
proteoltica, la papana, que es de uso medicinal como digestivo, en el comercio se utiliza en
forma de diversos preparados para ablandar la carne en procesos industriales. Es una Caricaceae
propia de clima templado a clido, ampliamente conocida y se cultiva casi en todos los pases de
regiones tropicales y subtropicales de Amrica4.
La principal caracterstica de la parte comestible, los frutos de papaya es su gran valor
nutritivo, caracterizndose por un adecuado balance de compuestos orgnicos e inorgnicos. Cien
gramos de la parte comestible contiene en promedio 39 Kcal de energa; 88,8% de agua; 8,90 g de
carbohidratos; 24,0 mg de Ca; 15,0 mg de P; 10,0 mg Mg; 3,1 mg de Fe; 3,0 mg de Na; 257,0 mg
de K; 61,8 mg de vitamina C; 38,0 mg de cido flico; 284,0 U.I. de vitamina A5.
En nuestro pas, Carica papaya papaya de inters econmico es considerada como importante
cultivo frutcola; toda la produccin de esta Caricaceae se destina al mercado nacional, razn por la
que se encuentran durante todo el ao. Realmente es un cultivo que crece con mucho xito. Los
frutos de papaya son de gran importancia en el desarrollo econmico y social de la agricultura a
nivel mundial, y sobre todo, en la alimentacin de nuestro pas; es por ello, que revierte su
importancia en el estudio de los hongos que le producen deterioro. A pesar de la existencia de
sistemas de proteccin naturales, la conservacin de las partes comestibles es limitada; asimismo,
las causas de la alteracin son variadas. Adems, de los deterioros enzimticos y desintegraciones,
los hongos desempean un papel fundamental como causantes de podredumbres6.
Las prdidas de los frutos de Carica papaya papaya, debidas a las enfermedades de
postcosecha, generalmente son directas; porque, disminuyen la calidad y cantidad de las hojas
afectadas. Por otro lado, uno de los efectos ms importantes de los ataques de hongos sobre la parte
comestible es la induccin a la micotoxicosis; es decir, enfermedades de animales y del hombre
ocasionadas por el consumo de alimentos invadidos por hongos que producen sustancias txicas
denominadas micotoxinas. La ingestin de alimentos que contienen micotoxinas, pueden producir
efectos graves, tanto en el hombre como animales. Estas sustancias pueden ocasionar enfermedades
graves a nivel heptico, renal, del aparato circulatorio y de los rganos hematopoyticos, aun
cuando sean ingeridos en dosis pequeas7.
Durante varios aos se han empleado fungicidas sintticos para controlar patgenos postcosecha;
sin embargo, en diversos estudios se ha demostrado que estos compuestos han causado resistencia
en microorganismos, incluyendo a los hongos y representan un potencial riesgo para la seguridad
del medio ambiente y la salud humana. En la bsqueda de alternativas naturales para el control de
pudriciones postcosecha se ha valorado el empleo de extractos vegetales, antagonismo microbiano
(control biolgico) y el quitosano8.
que iban creciendo, y luego, a partir de ellos se llev a cabo los microcultivos correspondientes para
su determinacin final.
Anlisis10
Se utiliz como medio de cultivo a Agar Sabouraud Dextrosa (DSA) y Lima Bean Agar al 3 %
(ABL). Se tom nota de las caractersticas que mostraban las lesiones causadas por los hongos y las
que presentaban stos, tanto en la macrocolonia, monocultivo y microcultivo; es decir, color,
aspecto de la colonia, textura, crecimiento vegetativo y elementos de reproduccin.
Determinacin de las especies
Se llev a cabo, teniendo en cuenta las caractersticas de las macrocolonias y los microcultivos de
los hongos hallados, confrontndolas con las claves taxonmicas existentes para este tipo de hongos
fitopatgenos, como las de Agrios (2), Fraire-Cordero et al. (8), Barnett & Hunter (11), Gilman (12), y
otros.
Prueba de antagonismo o cultivos duales13
Las pruebas de enfrentamiento se realizaron empleando la tcnica de cultivo dual en placas Petri
de 4.5 cm de radio, conteniendo 20 ml de Agar Sabouraud Dextrosa (ASD) pH 5.5. Se coloc en un
extremo de la placa Petri un disco de agar de 4 mm de dimetro con micelio del fitopatgeno y en
el extremo opuesto otro disco de 4 mm con micelio del antagonista a 5 cm aproximadamente entre
ellos. Se sembr en placas separadas, un disco de agar (inculo) con los hongos del antagonista y de
los patgenos, los cuales correspondieron a los controles; posteriormente, los cultivos se incubaron
a 251 C, 12 h continuas en luz, seguido de 12 h de oscuridad durante 10 das, hacindose
mediciones cada 24 h del crecimiento radial del micelio de la colonia de los hongos.
El antagonismo de T. harzianum se comprob estudiando las variables, Radio de Crecimiento
Antagonista (RCA), Radio de Crecimiento Patgeno (RCP), Micoparasitismo (MICMO) y
Porcentaje de Inhibicin del Crecimiento Radial (PICR).
La competencia por nutrientes y espacio se valor comparando la velocidad del crecimiento, para
esto, se midieron los radios de crecimiento de cada uno de los patgenos (RCP) y del antagonista
(RCA). Conjuntamente, se evalu el porcentaje de inhibicin de crecimiento radial (PICR),
empleando la frmula de Ezziyyani (14), PICR = (R1 R2)/R1 x 100, donde R1 es el radio del
patgeno testigo y R2 es el radio del patgeno en enfrentamiento.
Para indicar el micoparasitismo (MICMO) como posible mecanismo de accin de T. harzianum,
se realizaron observaciones macroscpicas de los cultivos duales, tomndose como ndice de
micoparasitismo, la invasin del antagonista sobre la superficie del micelio patgeno, tenindose en
cuenta la escala de la Tabla 1 creada por Elas y Arcos (1984) citada por Ezziyyani (14).
Para investigar el micoparasitismo, luego que T. harzianum alcanz a invadir al hongo
postcosecha, se tom una porcin del hongo con parte de medio de cultivo en la franja de unin,
donde se analizaron las interacciones de las hifas antagonistas con las del patgeno, ya sea por
enrollamiento o por penetracin, colocando en un portaobjetos con una gota de azul de Amann y
con la ayuda de un microscopio compuesto a 100x, se observ el mecanismo de accin del
biocontrolador.
Diseo experimental15: Se llev a cabo un diseo completamente al azar, con 7 tratamientos y 6
repeticiones por tratamiento, incluyendo a un testigo. Cada repeticin representaba una placa Petri.
Tabla 1. Escala creada por Elas y Arcos (1984) citada en Ezziyyani (2004) para evaluacin de la capacidad antagnica,
de acuerdo a la medida de la invasin de la superficie, colonizacin y esporulacin del antagonista sobre cada uno de los
hongos fitopatgenos.
Grado
0
1
2
3
4
Capacidad antagnica
Ninguna invasin de la superficie de la colonia del hongo patgeno.
Invasin de de la superficie de la colonia del hongo patgeno.
Invasin de de la superficie de la colonia hongo patgeno.
Invasin total de la superficie de la colonia del hongo patgeno.
Invasin total de la superficie de la colonia del hongo patgeno esporulacin sobre ella.
RESULTADOS
De los 220 frutos de postcosecha recolectadas con biodeterioro en las dos zonas de
distribucin del distrito de Trujillo, y sometidas al anlisis fitopatolgico, se aislaron 6 especies
fngicas causantes de enfermedades de postcosecha en frutos almacenados, con diferentes grados
de abundancia; como se observa en la Tabla 2.
Al analizar la frecuencia de aislamiento de las especies determinadas en los frutos
postcosecha de Carica papaya L. papaya amarilla, se hall que Rhizopus nigricans,
Colletotrichum gloeosporioides, Alternaria alternata, fueron los hongos ms frecuentes con 40.91,
24.18 y 15.45% respectivamente; en cambio, Lasiodiplodia theobromae fue el menos frecuente con
3.27%; como se aprecia en la Tabla 2.
Tabla 2: Frecuencia de aislamiento de los hongos causantes de enfermedades en frutos de postcosecha de Carica papaya
L. papaya
Frecuencia de aislamiento
N
225
133
85
62
27
18
Hongos
Rhizopus nigricans
Colletotrichum gloeosporiodes
Alternaria alternata
Stemphylium lycopersici
Fusarium oxysporum
Lasiodiplodia theobromae
%
40.91
24.18
15.45
11.27
4.91
3.27
Con respecto al estudio de la competencia por nutrientes y espacio segn la comparacin del
RCA y el RCP, al hacer la comparacin diaria del radio del crecimiento antagonista (RCA), con el
radio de crecimiento patgeno (RCP) de cada cultivo dual, se determin la competencia por
nutrientes y espacio, donde se encontr, que T. harzianum se desarroll a una velocidad superior a
la de los hongos patgenos, observndose que los aislamientos del antagonista tuvieron un
crecimiento promedio de 6.29 cm al dcimo da en enfrentamiento; mientras, que los patgenos
mostraron un crecimiento limitado en cultivo dual, con un promedio de 2.75 cm al dcimo da.
A. alternata, St. lycopersici y L. theobromae, fueron los hongos que resistieron mejor la accin
antagnica de T. harzianum, con crecimientos promedio de 3.32, 3.13 y 3.25 cm respectivamente;
en cambio, F. oxysporum mostr una gran susceptibilidad a la accin antagnica de T. harzianum
con un crecimiento micelial promedio de 1.92 cm, como se observa en Tabla 3; Fig. 1.
Tabla 3. Promedios del crecimiento micelial (cm) en la prueba de antagonismo
Hongo fitopatgeno
L. theobromae
R. nigricans
C. gloeosporiodes
A. alternata
St. lycopersici
F. oxysporum
Promedio
crecimiento
micelial
3.25
2.24
2.68
3.32
3.13
1.92
Hongo antagonista
T. harzianum
T. harzianum
T. harzianum
T. harzianum
T. harzianum
T. harzianum
Promedio
crecimiento
micelial
5.78
6.82
6.38
5.76
5.90
7.14
Fig. 1. Comparacin de promedios del crecimiento micelial del hongo antagonista y de los hongos fitopatgenos.
ambiental y temperatura comprendida entre 22 y 32C, concordando con lo que afirman al respecto
Agrios1 y Llcer et al 6.
As mismo, Alternaria alternata encontrado como hongo de almacn, causa una mancha oscura,
circular a oval y luego las lesiones son usualmente restringidas a la superficie del fruto y no causan
pudricin extensiva del tejido del parnquima, siendo su presencia favorecida por la alta humedad
ambiental y baja temperatura; coincidiendo, con lo sealado por Agrios 1, quien adems afirma que
Alternaria alternata produce una toxina llamada tentoxina, que no es especfica de su hospedante.
Con respecto a Stemphylium lycopersici, causante de manchas pequeas, circulares caf oscuras
en el fruto postcosecha, que despus se extienden y desarrollan mrgenes caf rojizos a prpura, se
observ que su presencia en almacenamiento era favorecida por una alta humedad ambiental;
coincidiendo, con lo sealado por Mont16.
En lo referente a F. oxysporum hallado como productor de pudricin del fruto que se mantiene
almacenado causando lesiones pequeas que despus son cubiertas por un micelio compacto
blanco-rosado, es reportado como patgeno de frutos postcosecha; coincidiendo con Deacon17,
quien seala que la contaminacin por Fusarium se produce en el campo antes o durante la cosecha,
aun cuando la infeccin pueda desarrollarse durante el almacenamiento de los frutos.
As mismo, Lasiodiplodia theobromae es un hongo que produce una pudricin de la superficie y
base de los frutos. Es una enfermedad menor pero puede ser importante durante ciertas condiciones.
Los sntomas tienen como caracterstica formar en los frutos chancros negros coriceos con
pudriciones blandas. La carne del fruto afectada toma un color azulado en las reas acuosas
infectadas y se forman bolsas de aire que se llenan del micelio gris, en condiciones ambientales de
baja temperatura y alta humedad; coincidiendo al respecto, con Pariona et al. 18, quin afirma que
una de las razones por la que generalmente se infecta el fruto, es la cantidad de humedad y los
nutrientes presentes en ella, necesarios para su desarrollo.
Cabe sealar, que la infeccin a los frutos de postcosecha era frecuentemente a travs de lesiones
de los tejidos protectores naturales; como por ejemplo, la cutcula del exocarpo, facilitando la
penetracin del hongo hacia el interior de los mismos, favoreciendo su alteracin en mayor o menor
profundidad, siendo los causantes de dichas lesiones, la accin en campo, los insectos, cortes,
golpes y en general cualquier agente traumatizante; como lo que afirma Mller 7. Al respecto
Deacon17, refiere que la causa alterante ya puede existir en la planta antes de su recoleccin, a pesar
de no manifestarse ms que durante su almacenamiento.
En cuanto a la Prueba in vitro del efecto antagnico, los resultados obtenidos demostraron que,
debido a la rapidez del crecimiento de T. harzianum y la capacidad de reducir el crecimiento de los
hongos fitopatgenos en frutos postcosecha de papaya, este hongo es un efectivo controlador
biolgico.
La inhibicin del crecimiento de los hongos fitopatgenos de frutos postcosecha de Carica
papaya por el hongo antagonista T. harzianum, aun estando a distancia del patgeno, est mediada
por diversos mecanismos, destacndose la produccin de compuestos inhibitorios al medio,
antibiosis por produccin de metabolitos voltiles y no voltiles entre los cuales se encuentran,
pirones, isocianatos, ppticos, y trichocinas13; adems, la produccin de enzimas extracelulares
difundibles tales como peptinasas, cutinasas, glucanasas, y quitinasas e inactivacin de las misma
hacia el patgeno, tal como lo sugieren Durn et al. 19.
Al respecto, Mont16, refiere que T. harzianum tiene una alta capacidad de competencia por
el substrato; como consecuencia de ello, el organismo afectado tiende a entrar en un estado de
latencia, que podra ser por deficiencia de nutrientes o la presencia de cierto nivel de sustancias
inhibitorias, lo cual impide que siga creciendo; coincidiendo, con los resultados obtenidos en el
presente trabajo, como lo demuestra la notable accin inhibitoria que ejerce T. harzianum sobre
Fusarium oxysporum y Rhizopus nigricans.
Ordoez20, seala que T. harzianum produce sustancias como Trichodermina, dermina,
sesquiterpeno, suzukacilia, alamethicina, rochotoxina y acetaldehdo, todas con propiedades
antifngicas y antibacteriales; as como, las enzimas -1-3 glucanasas, quitinasas y celulasa, las
cuales facilitan la habilidad del antagonista para atacar un amplio rango de fitopatgenos,
ejerciendo su efecto sobre las paredes celulares. Asimismo, Ezziyani 14, refiere que T. harzianum
presenta una gran adaptabilidad a diferentes temperaturas del medio ambiente, pudiendo crecer y
reproducirse normalmente hasta los 35C, a este nivel estas enzimas juegan un importante papel en
el micoparasitismo.
T. harzianum mostr una alta capacidad para parasitar a Fusarium oxysporum y Rhizopus
nigricans; adems, presenta una alta actividad competitiva frente al fitopatgeno, al impedirle su
crecimiento en el mismo substrato. Al respecto, Mont16, menciona que el xito de los antagonistas
en la planta tambin puede ser gobernada por su capacidad de colonizar y utilizar los substratos en
la superficie de la planta, permitiendo que compita efectivamente con los fitopatgenos.
Al respecto, se debe tener en cuenta que el micoparasitismo es un proceso complejo de
quimiotropismo cuya accin antifngica especfica es desconocida; sin embargo, se ha propuesto
una serie de etapas por la que T. harzianum lleva el antagonismo, las cuales son: (a)reconocimiento,
(b) penetracin de la hifa, (c) invasin y secrecin de enzimas hidrolticas, como lo sostienen
Vzquez-Garcidueas et al 21; siendo ste ltimo el de mayor inters, ya que no se ha determinado
con exactitud el mecanismo mediante el cual se controla la expresin de cada una de las enzimas
involucradas; as como, su orden. Durante la etapa de reconocimiento, se lleva a cabo un proceso de
quimiotropismo, el cual es mediado por el reconocimiento de lectinas, que se encuentran
incorporadas en el hongo fitopatgeno, y cuando el micoparsito reconoce al hongo, las hifas de T.
harzianum lo atrapan y lo rodean formando estructuras apresoras, como lo sostienen HernndezLauzardo et al 22.
As mismo, en cuanto a la penetracin de la hifa, sta se realiza mediante la degradacin de la
pared celular del hongo fitopatgeno, por medio de la secrecin de enzimas que actan
sinrgicamente y a las que se les denomina en conjunto como las enzimas degradadoras de pared
celular, conformado por -1,3-glucanasas, quitinasas y proteasas, las cuales se inducen por la
presencia de las paredes celulares de hongos fitopatgenos, como lo afirma Ordoez20.
Hernndez-Lauzardo et al 22 al respecto sealan, que en el micoparasitismo, la formacin y
secrecin de estas enzimas es el paso fundamental para la destruccin del hongo fitopatgeno, y que
el mecanismo de accin del hongo antagonista, que en ste caso es T. harzianum, puede ser variable
y depende del hongo a controlar y del aislamiento; as como, de la especie de Trichoderma
utilizada.
CONCLUSIONES
Los hongos causantes de enfermedades de post cosecha en frutos de Carica papaya papaya fueron:
Rhizopus nigricans Ehr., Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)Sacc., Alternaria alternata (Fr.)Keissl,
Stemphylium lycopersici (Enjoji)W. Yamamoto, Fusarium oxysporum Schlecht., Lasiodiplodia thebromae
(Pat.)Griffon & Maubl.
Rhizopus nigricans present la mayor frecuencia de aislamiento (40.91%); en cambio, Lasiodiplodia
theobromae present la menor frecuencia de aislamiento (3.27%).
Trichoderma harzianum demostr, en cultivos duales, ser un efectivo controlador biolgico de hongos
patgenos de frutos postcosecha de Carica papaya, inhibiendo el crecimiento del fitopatgeno mediante
su capacidad antagnica.
Trichoderma harzianum llev a cabo el micoparasitismo como mecanismo de accin antagnica.
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