RuizBovino

Palomo
López,
Yagüe,
S. A.
Ruiz López, S.

OVUM PICK UP (OPU) en bovinos:

Aplicaciones en Biotecnología
de la reproducción
Dr. Salvador Ruiz López
Dpto. Fisiología. Facultad de Veterinaria
Universidad de Murcia
E-mail: sruiz@um.es - www.um.es/grupo-fisiovet

En 1981, nació el primero ternero (Virgil) mediante la aplicación de sistemas de producción

in vitro de embriones (PIV). Hasta la fecha, se puede estimar que más de 200.000 terneros
han nacido en todo el mundo mediante PIV (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006).

reproducción asistida veterinaria se inicia de embriones de 1´80 por sesión. En

❱ Introducción
La técnica de aspiración folicular
transvaginal guiada por ultrasonografía
(OPU, Ovum Pick-Up), desarrollada ori-
ginalmente para la reproducción asistida
en la especie humana (Lenz & Lauritsen,
1982), es usada por primera vez, en
ganado vacuno en Holanda al final de las
década de los 80 (Pieterse et al., 1988). El
empleo de la OPU de forma rutinaria en
en 1994 (Kruip et al. 1994).
En la actualidad, y según datos de
la Asociación Europea de Transferencia
de Embriones (AETE), el número total
de sesiones de OPU realizadas solo en
Europa en 2008 fue de 3.753, lo que
supone un aumento del 8´1% con respec-
to al año anterior. Con una producción, en
ese año, de 6.751 embriones transferibles
y una media de eficiencia de producción
2008, cuatro países de Europa (Países
Bajos, Alemania, Italia y Francia) aplicaron
sistemas de OPU/PIV para la producción
comercial de embriones (Merton, 2009).
La OPU es una técnica con muchas
posibilidades ya que puede ser usada en
vacas adultas en varios estados fisiológi-
cos: cíclicas, no cíclicas, durante el primer
tercio de la gestación y en las que no
responden a estímulos hormonales, pero

58
 OVUM PICK UP (OPU) EN BOVINOS: aplicaciones en Biotecnología de la reproducción
nº 31

también en animales viejos con desórde-
nes reproductivos de origen no genético
(Galli et al., 2001), y en terneras y novillas
prepúberes a partir del 6º-8º mes de edad
(Taneja et al., 2000).
La OPU supone una alternativa a la PIV
de embriones bovinos realizada mediante el
empleo de ovocitos procedentes de mata-
dero. En la OPU trabajamos con ovocitos
obtenidos de vacas vivas utilizando material
genético de origen conocido. Se consigue
producir mediante esta técnica un mayor
número de embriones (hasta 100 embriones
al año por vaca) que los obtenidos median-
te protocolos estándar de transferencia
de aspiración y la presión de vacío (Bols
et al., 1995, 1996) con lo que se ha
conseguido mejorar la calidad de los
ovocitos recogidos reduciendo el número
de ovocitos denudados, aunque sin que
se haya provocado un incremento del
número total de ovocitos obtenidos por
sesión de OPU. La mejora técnica más
significativa ha sido la sustitución de la
aguja original de 50 cm de longitud por
una aguja mucho más corta (7 cm), esté-
ril, descartable y fácilmente reemplazable
entre diferentes donantes, reduciendo así
el riesgo de contaminación. Además, estas
agujas tienen un volumen muerto menor
lo que minimiza el tiempo en el que los
2. Factores Biológicos. Entre éstos
podemos incluir los siguientes: el animal
donante, la pre-estimulación hormonal, el
tiempo y frecuencia de la OPU y la expe-
riencia del operador.
Animal donante. Al igual que en los
sistemas MOET, la vaca donante puede
explicar aproximadamente un 20% de
la variación observada en términos de
ovocitos por OPU y de eficiencia en la
producción de embriones.
Pre-estimulación con FSH (Fig. 1). La
mejora más significativa con respecto al
rendimiento en la calidad de los ovocitos

Figura 1. Imagen ecográfica de ovario de vaca que ha sido previamente estimulado con FSH (izquierda) y ovario sin estimulación (derecha), donde se aprecia un
folículo y un cuerpo lúteo.

embrionaria (TE). La aplicación conjunta complejos cúmulo-ovocito (COCs) están y, por consiguiente para la producción
de ambas tecnologías (OPU/PIV) permite la expuestos a un ambiente desfavorable y de embriones fue la pre-estimulación
producción de más de 50 terneros por vaca permite la obtención de fluido folicular hormonal previa a la OPU mediante el
donante y año. Por lo que, ambas se con- de folículos individuales para propósitos uso de gonadotropinas (De Roover et
vierten en las herramientas adecuadas para de investigación. al., 2005, 2008). Muchos autores han
obtener nacimientos adicionales de donan-
tes de alto valor genético que no pueden
ser sometidos a un programa convencional
de superovulación (van Wagtendonk-de
Leeuw, 2006).

La recuperación repetida de ovocitos

mediante OPU permite obtener la mayor
descendencia posible de animales con
alto valor genético y acelerar los procesos
de selección y mejora animal (vía paterna
y materna) a la vez que supone una fuen-
te extraordinaria de ovocitos para clona-
ción y transgénesis (Ding et al., 2008).

❱ Factores que afectan

a la OPU
Después del desarrollo inicial de la
técnica de OPU, se han llevado a cabo
muchos estudios investigando diversos
factores que puedan incrementar los
resultados. Éstos pueden ser divididos en
factores técnicos y biológicos.

1. Factores Técnicos. Se ha inves-

tigado sobre la geometría de la aguja Figura 2. La experiencia del operador es de gran importancia para la obtención de buenos resultados en OPU.

59
Palomo
BovinoYagüe, A.
Ruiz López, S.
Figura 3. Administración de inyección epidural de procaína (detalle).
descrito un efecto positivo general de la
pre-estimulación con FSH antes de la OPU
sobre el desarrollo posterior de los ovocitos.
Blondin et al. (1997) observaron que el
mejor desarrollo aparece cuando la estimu-
lación es seguida por 48 h de la aspiración.
Chaubal et al. (2006) realizan un estudio
comparativo entre sistemas de OPU con y
sin estimulación hormonal y concluyen que,
la retirada del folículo dominante seguida
de la administración de FSH y de OPU 48 h
más tarde, fue el mejor protocolo en base
a la respuesta folicular, la recuperación de
ovocitos y la producción de embriones. El
ensayo fue realizado con éxito, durante 10
semanas seguidas. Estos autores emplean
una dosis semanal única de FSH, reducida
en comparación con la dosis completa
estándar que se utiliza en la ovulación
múltiple de rutina y el sistema MOET. Este
sistema además de evitar la hiperestimula-
ción ovárica reduce el estrés asociado con
múltiples inyecciones de FSH.
60
Aunque los sistemas de estimulación
hormonal pueden dar lugar a una mayor
producción de embriones por vaca y
OPU, el rendimiento de embriones por
unidad de tiempo por vaca puede no ser
superior, ya que la estimulación hormonal
sólo puede hacerse una vez a la semana
(Merton et al., 2003). Sin embargo, la
combinación de un período de OPU con
estimulación con uno sin estimulación en
la misma semana puede dar lugar a una
Figura 4. Foto supe-
rior: sonda transva-
ginal, mango de OPU
y guía de punción.
Foto inferior: sonda
montada para OPU
(detalle).
producción de embriones superior por
unidad de tiempo y animal.
La desventaja de usar la pre-estimula-
ción es la reintroducción de hormonas y,
por lo tanto, se pierde una de las consi-
deradas ventajas (la no necesidad de uso
de hormonas en la OPU) con respecto a
los sistemas MOET. Aunque en el caso
de la OPU no son necesarias múltiples
inyecciones y un manejo extra, lo que
representa una ventaja desde el punto de
vista del bienestar animal.
Frecuencia de OPU. El intervalo entre
sesiones de OPU tiene influencia sobre
la cantidad y calidad de los ovocitos
obtenidos. El periodo de tiempo entre dos
aspiraciones afecta, de forma significa-
tiva, la tasa de producción de ovocitos.
Obteniéndose un mayor número en el día
7 en comparación con la obtención cada
3 ó 4 días. Sin embargo, la calidad de los
ovocitos, en cuanto al número de capas
de células del cúmulo, resulta mayor con
OPU a intervalos de 3 días y menor con
intervalos de 7 días, el desarrollo embrio-
nario también se ve afectado (19’7%
vs. 13’5%) (Merton et al., 2003). Estos
resultados son coincidentes con la hipó-
tesis de que el folículo dominante ejerce
un efecto negativo sobre el posterior
desarrollo de los ovocitos. Con la técnica
más utilizada de obtención cada 3-4 días
(lunes/jueves) ó 2-5 días (lunes/miércoles)
no se ve afectado el número de ovocitos
recogidos por sesión, sin embargo, la cali-
dad fue mayor en el intervalo de 2 días,
lo que puede ser atribuido al efecto del
folículo dominante.
Experiencia del operador (Fig. 2). La
técnica de OPU se realiza por 1 ó 2 per-
sonas y, en determinadas empresas, la
misma persona lleva a cabo el desarrollo
de la técnica de una forma similar duran-
te años, usando las mismas condiciones
técnicas. La experiencia del operador (en
un sistema de una sola persona) o del
operador y el ayudante (en un sistema
de dos personas) tiene un efecto sig-
nificativo en el número y la calidad de
los ovocitos recolectados (Merton et al.,
2003) y hasta cierto punto una adecuada
selección de los operadores y/o asistentes
puede ayudar a mejorar los resultados.
❱ Metodología y técnica
de OPU
La OPU precisa de la tranquiliza-
ción previa del animal, ésta se llevará
a cabo con el animal en pie en un
potro de contención, mediante xilacina
(i.m.) al 2% (Rompún, 0’25 ml/100 kg).
Posteriormente, se debe administrar pro-
caína (Procasel 2%, 3-4 ml para novillas,
5-7 ml vacas adultas) vía epidural (Fig.
3), para reducir los esfuerzos expulsivos
y facilitar la manipulación del ovario. Tras
el vaciamiento del recto y la limpieza y
desinfección de la vulva y área perineal
se introducirá el transductor en la vagina,
convenientemente lubricado y protegido
por una cubierta sanitaria de látex.
Para la visualización de los folícu-
los ováricos empleamos un ecógrafo
Pie Medical (mod. FalcoVET) equipado
con una sonda transvaginal (Pie Medical
R-10) de 5-7’5 MHz y un “handgrip” o
mango de OPU de 60 cm de longitud
donde se colocará la guía de punción (Fig.
4). Por la guía se introducirá una aguja
de punción desechable (20 G, 0’9 x 70
mm) conectada a un tubo estéril de 50
ml mediante una conducción de Teflón.
El equipo de OPU se completa con una
bomba de vacío accionada por pedal con
la que se aplicará una aspiración constan-
 OVUM PICK UP (OPU) EN BOVINOS: aplicaciones en Biotecnología de la reproducción
nº 31
nº 13

te de 50-53 mm Hg (20 ml/min). El tubo
de recogida debe mantenerse atemperado
a 37ºC en baño termostático.
Los ovarios se posicionarán vía rectal
delante de la sonda para ováricos visibles
de más de 3 mm de diámetro. Antes de
iniciar la sesión de punción se drenará el
sistema aspirando una pequeña cantidad
de medio de recogida. Tras la aspiración
de cada 3-4 folículos se realizará un
lavado exhaustivo del fluido folicular en
la aguja de aspiración y en el sistema de
recolección con medio de lavado y recogi-
da [PBS suplementado con heparina sódi-
ca (2’2 UI/ml) y suero fetal bovino (1%)].
El fluido obtenido de cada animal
contenido en un tubo de recogida de 50
ml será inmediatamente filtrado (50 μm
∅), los restos de sangre serán eliminados
por continuos lavados en PBS fresco y se
pasará a una placa de Petri para localizar
y evaluar morfológicamente bajo este-
reomicroscopio los complejos cumulus-
ovocito (COCs) aspirados (Fig. 6).
Clasificaremos los COCs obtenidos en
cinco categorías, según homogeneidad,
morfología del citoplasma y compactibi-
lidad de las células del cúmulo (Oropeza
et al., 2004):

- Categoría I: Ovocitos con más de tres

capas de células de cúmulo com-
pactas y con citoplasma homogéneo
uniformemente granulado.

- Categoría II: Ovocitos con menos de

tres capas de células del cúmulo y
citoplasma generalmente homogéneo.

- Categoría III: Ovocitos con una sola

capa de células del cúmulo y cito-
plasma de aspecto irregular con
áreas oscuras.

- Categoría IV: Ovocitos denudados.

- Categoría V: Ovocitos madurados in

vivo, con cúmulo expandido.

Los COCs de las categorías I-III se

considerarán aptos para su procesamien-
Figura 5. Sujeción del ovario (mano izquierda) y manejo del mango de OPU (mano derecha). to en maduración, fecundación y pos-

Tabla 1. Recuperación y capacidad de desarrollo embrionario de ovocitos de OPU en ganado bovino en diferentes estados reproductivos y con y sin pre-estimula-
ción hormonal.

Tipo animal Nº Nº ovos Nº ovos viables % Blastos /

Referencias
Donante OPUs OPU/animal OPU/animal OPU / animal
Vacas
34 7’2 5’0 1’1
Lactantes
Vacas
40 6’9 4’4 1’0
Secas Bungartz et al.
Vacas (1995)
36 5’0 4’8 0’4
Gestantes
Terneras
41 5’7 3’9 0’5

Terneras
130 3’9 1’8 0’4
Gestantes Rust et al.
Vacas (1999)
214 4’1 2’0 0’4
Gestantes
Vacas Kniep
780 5’7 3’8 0’8
en puerperio (2001)
Vacas Oropeza et al.
80 8’9 5’7 1’3
Lactantes (2004)
Vacas estimuladas 3’4 -7’1 De Roover et al.
60 2’6 - 5’8 0’9 - 2’4
con FSH (según dosis FSH) (2005)
Vacas
30 3’9 - 5’3 3’8 - 5’2 0’8 -1’4
sin estimulación Chaubal et al.
Vacas estimuladas (2006)
30 4’9 - 10’6 4’8 - 10’1 1’1 - 2’4
con FSH
Vacas Ruiz et al.
84 5’1 4’2 -
Secas (2009a, b)
61
Palomo
BovinoYagüe, A.
Ruiz López, S.
Figura 6. Filtrado del líquido folicular obtenido en OPU (izquierda). Búsqueda y evaluación morfológica por estereomicroscopio de los COCs aspirados (derecha).
terior producción in vitro de embriones,
los ovocitos de categorías IV y V no se
utilizarán para PIV, considerándose ovo-
citos no viables.
❱ Resultados
En la tabla 1 mostramos algunos
resultados de obtención de ovocitos y
embriones producidos por OPU/PIV en
distintos tipos de animales con y sin pre-
estimulación hormonal.
❱ Bibliografía
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LSC bovin 220x145 SPand5/05/06
oocytes in vitro 11:16
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63
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