GEN DE LA FRAGANCIA EN EL ARROZ

RESUMEN
El sabor o fragancia del arroz basmati y el arroz jazmn est asociado con
la presencia de 2-acetil-1-pirrolina. Un gen recesivo (fgr) en el cromosoma 8 del
arroz ha sido vinculado con esta importante caracterstica. Aqu, mostramos
que un gen homlogo al que codifica betana aldehdo- deshidrogenasa (BAD)
tiene polimorfismos significativos en la regin codificante de genotipos
aromticos en comparacin con los genotipos no aromticos. La acumulacin
de 2-acetil-1-pirrolina en genotipos de arroz aromtico, puede ser explicada por
la presencia de mutaciones, resultando en una prdida de la funcin del
producto del gen fgr. El alelo en genotipos aromticos tiene una mutacin en la
que se introduce un codn de parada antes las secuencias de aminocidos
clave conservados en otros BADs. El gen fgr corresponde al gen codificante de
BAD2 en arroz, mientras que BAD1 es codificado por un gen en el cromosoma
4. BAD ha sido vinculada a la tolerancia al estrs en plantas. Sin embargo, la
prdida aparente de la funcin de BAD2 parece no limitar el crecimiento de los
genotipos de arroz aromtico. La fragancia en el arroz domesticado
aparentemente se ha originado a partir de un ancestro comn y puede haber
evolucionado en una poblacin aislada genticamente, o puede ser el resultado
de un evento de domesticacin independiente. Este es un ejemplo de la
efectiva seleccin humana para un rasgo recesivo durante su domesticacin.
INTRODUCCIN
El sabor de una serie de alimentos, incluyendo palomitas de maz o
rosetas (Sschieberle, 1995), tortillas de maz (Buttery y Ling, 1995), baguettes
(Zehentbauer y Grosch, 1998), jamn (Carrapiso y colaboradores, 2002), queso
(Zehentbauer y Reineccius, 2002), frijn mungo (Brahmachary y Ghosh, 2002),
t verde (Kumazawa y Masuda, 2002) y vino (Herderich y colaboradores, 1995),
han sido asociados con la presencia de 2-acetil-1-pirrolina. Sin embargo, este
compuesto est ms estrechamente relacionado con la fragancia del arroz
basmati y el arroz jazmn (Buttery y colaboradores, 1983; Lorieux y
colaboradores, 1996; Widjaja y colaboradores, 1996; Yoshihashi y
colaboradores, 2002). Aunque muchos otros compuestos tambin se
encuentran en el top de las variedades de arroz aromtico, posiblemente
debido a los efectos secundarios relacionados con el fondo gentico de la
variedad de arroz, la 2-acetil-1-pirrolina es ampliamente conocida como la
principal causa de la fragancia caracterstica del arroz basmati y el jazmn. El
atractivo de la fragancia ha resultado en una fuerte preferencia y seleccin
humana por este rasgo.
Las variedades no aromticas contienen niveles muy bajos de 2-acetil-1pirrolina, mientras que los niveles de la misma en genotipos aromticos son
mucho ms elevados (Widjaja y colaboradores, 1996).
Un gen recesivo, en el cromosoma 8 del arroz, que controla en gran
medida el nivel de 2-acetil-1-pirroline, ha sido identificado en estudios
genticos. Los marcadores genticos para este gen han sido desarrollados para

permitir la seleccin de este rasgo en el cultivo de arroz. Hemos definido la

localizacin cromosmica del gen a travs del mapeo en poblaciones
segregantes mediante repeticin de secuencia simple (SSR) o mediante
microsatlites (Cordeiro y colaboradores, 2002) y marcadores de polimorfismo
de nucletido nico SNP (Jin y colaboradores, 2003). La disponibilidad de una
secuencia del genoma del arroz (Goff y colaboradores, 2002) proporcion una
oportunidad para descubrir el gen responsable mediante la comparacin de
secuencias de genotipos aromticos y no aromticos. Esto nos permiti ubicar
la resecuenciacin de genes y secuencias genmicas en un genotipo
aromtico, ms probablemente en el cromosoma 8.
RESULTADOS Y DISCUSIN
El mapeo gentico de marcadores moleculares y el fenotipo fragancia,
demostraron que los marcadores RM515 y SSRJ07 flanquearon fgr. La distancia
fsica entre RM515 y SSRJ07 es de 386.591 bp (creo que es pares de bases). La
informacin obtenida, sugiri que fgr estaba ms cerca de RM515 que de
SSRJ07. Una revisin cuidadosa de la data de mapeo sugiri que un
Cromosoma Bacterial Artificial (BAC), era el ms probable de contener el gen.
La resecuenciacin de 17 genes en este BAC revel variaciones de secuencia
significantes en slo uno; otros genes en esta regin mostraron un pequeo
polimorfismo. Este anlisis revel seis polimorfismos, tres de los cuales estaban
en exones, incluyendo un gran polimorfismo dentro de un exn del gen
candidato, enumerado en la pgina web de la Enciclopedia Biolgica Molecular
del Conocimiento basado en Oryza (KOME- Knowledge-based Oryza Molecular
Biological Encyclopedia), como clon de cDNA J023088C02, el cual codifica una
betana aldehdo-deshidrogenasa homloga. Este gran polimorfismo contiene
un total de 6 SNPs (polimorfismos de nuclotido nico) y ocho deleciones
dentro de una regin de 25 bp, causando la introduccin de un codn de
parada. Es muy probable que esta mutacin convierta a la protena en nofuncional; esto concuerda con la evidencia de que la fragancia es un rasgo
recesivo.
El anlisis de la secuencia de esta regin en 14 diversas variedades
fragantes y en 64 variedades no fragantes, arroj que las 14 variedades
fragantes mostraron un polimorfismo de secuencia idntica observado en
Kyeema, mientras que las 64 variedades no fragantes mostraron una secuencia
idntica a la secuencia Nippobare publicada, sugiriendo que este es fgr.
La secuencia de aminocidos predicha para la protena codificada por el
gen fgr se muestra en la Figura 3. Una secuencia peptdica (VTELGGKSP) y un
residuo de cistena (a 28 residuos de aminocidos de distancia tanto en la
betana aldehdo-deshidrogenasa 1 como en la 2 BAD1 y BAD2), conseguidas
en las protenas de arroz no fragante, son altamente conservados en aldehdodeshidrogenasas (Li y colaboradores, 2003). Estos elementos conservados se
pierden en la protena ms corta que sera codificada por el gen en variedades
aromticas. Las BADs tambin contienen el pptido conservado EGCRLGSVVS,
encontrado en el gen de variedades no fragantes. La BAD ha demostrado tener
una amplia especificidad de sustrato para aminocidos y compuestos
relacionados (Trossat y colaboradores, 1997; Livingstone y colaboradores,

2003); muchos de estos compuestos son estructuralmente similares a la 2acetil-1-pirrolina, sugiriendo que la misma (o sus precursores) es un probable
sustrato para la BAD. Los sustratos reportados para la BAD incluyen 3aminopropanoldehdo (no estoy segura :c este en ingles es
aminopropionaldehyde, pregunta por si acaso), 4-gunidinobituraldehdo
(Livingstone y colaboradores, 2003) y, ms significativamente, delta-1pirrolina, a medida que la delta-1- pirrolina existe en equilibrio con el 4aminobutiraldehdo (Trossat y colaboradores, 1997).
La BAD1 en el arroz es codificada por un gen en el cromosoma 4. Se ha
demostrado que la cebada contiene dos isoenzimas BAD, probablemente con
diferentes especifidades de sustrato (Nakamura y colaboradores, 2001). El gen
fgr corresponde al gen que codifica la BAD2 de la cebada. La comparacin de la
secuencia de aminocidos de las dos isoenzimas BAD de la cebada, revel que
la BAD2 carerca de la secuencia seal SKL C-terminal que est presente en la
isoenzima BAD1 (Nakamura y colaboradores, 2001), y se conoce que forma
parte de una familia de seales de focalizacin peroxisomal tipo 1 (Reumann,
2004).
En contraste, tanto BAD1 como BAD2 en el arroz, contienen la secuencia
SKL C-terminal, sugiriendo que ambas protenas estn dirigidas a los
peroxisomas. Esto indica que, a pesar de que ambas protenas BAD2 (la del
arroz y la de la cebada) pueden tener actividades similares in-vitro, pueden
tener un rol funcional diferente in-vivo al ir apareciendo para ser dirigidas a
diferentes locaciones subcelulares. Sin embargo, existen muchos factores que
influyen en la sealizacin de las protenas que contienen PTS1 (esto creo que
es un receptor!), tales como secuencias de seal N-terminal primordiales o el
plegamiento de protenas, lo que evita el reconocimiento de dicho receptor
(Reumann, 2004); estos pueden influir en el reconocimiento o sealizacin
subcelular de las protenas BAD1 y BAD2, tanto en el arroz como en la cebada.
La produccin de dos subunidades diferentes en el mismo
compartimento subcelular permite la posible formacin de heterodmeros de
las dos subunidades. La presencia de dichos heterodmeros, podra llevar a una
alteracin de la especificidad de sustrato de la protena BAD en el arroz. La
presencia de dos homlogos de BAD ha sido ampliamente reportada en
muchas hierbas, y la protena BAD2 en el arroz parece estar estrechamente
relacionada a la protena BAD2 del trigo, la cebada, el sorgo, el maz y a la
Zoysia tenuifolia (FIGURA 4). El anlisis de las secuenfcias en genes de otras
especies (FIGURA 4) muestra que BAD2s de diferentes especies estn ms
estrechamente relacionadas que protenas BAD de mismas especies,
sugiriendo un papelespecfico e importante para cada una de las dos BAD. Sin
embargo, solo la protena BAD2 en la Z. tenuifolia tiene un PTS1 similar en su
C-terminal.
Aunque no se ha establecido la ruta bioqumica que dirige a la fragancia
en el arroz, se ha demostrado que la L-prolina es un precursor del aroma en el
mismo (Yoshihashi, 2002). El gen frg puede codificar una protena que puede
catalizar la formacin o la eliminacin de 2-acetil-1-pirrolina. La fragancia es un
rasgo recesivo, lo que sugiere que una prdida de la funcin es responsable de

la acumulacin de 2-acetil-1-pirrolina. La versin truncada de la protena que es

codificada por los genotipos fragantes es menos probable que sea funcional y
favorece esta hiptesis. Sin embargo, la fragancia puede deberse a una
prdida de funcin en una ruta competente. Una prdida de la funcin de una
enzima que consume un precursor de 2-acetil-1-pirrolina, puede explicar los
elevados niveles en las variedades fragantes. Otros compuestos encontrados
en arroz fragante, pueden resultar de rutas metablicas alteradas introducidas
por este nico cambio en el gen.
Los diferentes sabores percibidos en algunos genotipos, pueden deberse
a la influencia modificadora de otras consecuencias metablicas secundarias a
esta mutacin en diferentes fondos genticos. Esta observacin sugiere que
este tipo de fragancia puede ser encontrada o producida en otras especies de
plantas. Pandan (Pandanus amaryllifolius Roxb) se cultiva como una fuente de
sabor de los alimentos y adems, tambin contiene 2-acetil-1-pirrolina
(Laohakunjit y Noomhorm, 2004). El sabor Pandan puede tener una base
gentica y molecular a la de arroz. Pandan es una planta monocotilednea,
pero los pandanales no se encuentran en el grupo de las commelnidas que
incluye las gramneas (Poaceae) (Chase, 2004). El origen de la 2-acetil-1pirrolina en organismos ms distantes, como la levadura (Munch y Schieberle,
1998), puede ser a travs de otro mecanismo.
Existe una fuerte evidencia de que los cereales han sido cultivados y
consumidos por los humanos durante un tiempo muy largo (Piperno y
colaboradores, 2004), pero la ruta de domesticacin de los cereales,
incluyendo el arroz, no ha sido entendida. Mutaciones clave asociadas con la
domesticacin de la cebada (Piffanelli y colaboradores, 2004) y el maz (Wang y
colaboradores, 1999), estn asociadas con cambios en la expresin gnica en
importantes loci. El gen fgr resulta paralelo al gen SD1 (Sasaki y colaboradores,
2002) para la estatura semi-enana, en que el rasgo se debe a una mutacin
que deriva en una prdida de funcin en un miembro de una familia de genes
que no es esencial para la supervivencia, mientras que la prdida de funcin en
otros miembros de la familia gentica podra ser letal.
La concentracin de 2-acetil-1-pirrolina en el arroz est influenciada por
el medio ambiente, y ha sido reportado que es mayor en plantas sometidas a
estrs hdrico (Yoshihashi y colaboradores, 2004). La BAD ha sido asociada con
tolerancia al estrs en plantas) Nakamura y colaboradores, 2001; Li y
colaboradores, 2003; Livingstone y colaboradores, 2003). Un gen que codifica
la BAD de una halfila (Saueda liaatungenis) mejora la tolerancia a la sal
cuando se expresa en el tabaco (Li y colaboradores, 2003). Se ha demostrado
que la introduccin de un gen de la cebada que codifica BAD en arroz, mejora
la tolerancia de las plantas a la sal, el fro y el calor (Kishitani y colaboradores,
2000).
La mutacin del gen que codifica BAD2 en las variedades de arroz
fragante no pareciera estar asociado a cualquier pedida de rendimiento de la
planta y puede tener un efecto positivo bajo algunas condiciones ambientales,
como la variedad aromtica Hhao Dawk Mali 105 , que fue seleccionada
inicialmente para tolerar la sequa (Yoshihashi et al., 2004). La concentracin

de 2-acetil-1-pyrroline en esta variedad fue encontrado para incrementarse en

respuesta a la sequa y al aumento de las concentraciones de sal (Yoshihashi et
al., 2004). La presencia de un alelo del gen en todos los genotipos de arroz
aromtico examinados es consistente con la caracterstica de ser heredado de
un genotipo comn fragante. Las variedades modernas de arroz analizadas
puede que se deriven del mismo padre fragante original. Este es un rasgo
difcil de criar, debido a la naturaleza recesiva del gen y la dificultad de evaluar
el aroma individual de los granos de arroz. El alelo mlo-11 (Piffanelly ER al.,
2004) probablemente fue elegido por estreses biticos en el medio ambiente
durante la domesticacin de la cebada. El alelo del gen sd1, responsable del
enanismo, fue introducido en el arroz por el fitomejoramiento moderno. El gen
fgr en el arroz basmati probablemente es el producto de la seleccin humana
para dar sabor antes del fitomejoramiento. Los 3 son ejemplos de la prdida de
la expresin gentica que conduce a un rasgo deseable.

El nico alelo del gen frg en el arroz aromtico sugiere una de varias
posibilidades: el arroz fragante puede venir de un evento de domesticacin
separado o puede haber surgido y evolucionado independientemente en un
pariente silvestre o en una poblacin geogrficamente o genticamente
aislada. Los tipos de arroz basmati previamente han sido descritos como un
grupo genticamente distinto que ha tenido una pobre habilidad de
combinarse con otros genotipos de arroz (Kasushik et al., 2003); cruzado con
variedades no aromticas a menudo conducen a la baja produccin de semillas
o esterilidad (Pinson, 1994).

La evidencia del gen que codifica BAD2 y frg es el mismo gen que viene
de muchas lneas de investigacin, incluyendo la posicional, gentica,
bioqumica y fisiolgica: (i) el gen que codifica BAD2 est en la ubicacin
cromosmica exacta sugerida por el mapeo gentico; (ii) la prdida de
funciones es consistente con el rasgo recesivo; (iii) un gen del metabolismo de
aminocidos siguiente a la prolina es demostrado por la evidencia metablica
(Yoshibashi et al., 2002) y BAD es un candidato bioqumico creble en este
camino; y (iv) ha sido reportada fragancia elevada en respuesta al estrs
(Yoshihashi et all., 2004), como sera predicha a partir de la bioqumica. La
asociacin completa de la delecin en el que codifica BAD2 con la fragancia en
una amplia gama de germoplasma no relacionado es una evidencia
especialmente convincente. Experimentos de complementacin gentica y
anlisis de si las reacciones bioqumicas catalizadas por BAD2 y BAD1 pueden
proveer nuevas perspectivas sobre la base de la fragancia en el arroz.

PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES.

Materiales vegetales.

Una poblacin de 168 ejemplares F crecidos en campo, derivados del

cruce entre Kyeema (Pelde//Della/Kulu) (altura, estilo jazmin, grano largo,
cultivar australiano) y Gulfmont (Lebonet//CI9881/PI 331581)(maduracin
temprana, semi-enano, no aromatico, grano largo, cultivar estadounidense)
suministrado por el instituto de Agricultura Yanco, Agricultura NSW, se utiliz
como el mapeo de la poblacin en este estudio.

Siguiendo el mapeo gentico, los genes candidatos fueron identificados

en la regin entre los marcadores de acompaamiento en la secuencia del
genoma publicado y re-secuenciado en la variedad de arroz fragante Kyeema.
Polimorfismos fueron identificados por una inspeccin visual del alineamiento
de secuencia derivada de Kyeema con la secuencia publicada del genoma de
Nipponbare, una variedad no fragante. Polimorfismos que fueron genotipados
en 14 variedades fragantes y 64 variedades no fragantes. Las variedades
fragantes analizadas fueron: YRF03, 00210-0-15, YRF07/1202, Yasmin, Amber,
Dumsorhk, Dellmont, YRF07, YRF04, 00210-33, Basmati370, Dragon Eyeball
100, Goolarah and Khao Dawk Mali 105. Las variedades no fragantes
analizadas fueron: TRM42/Wakamizu, Bluebelle, M9, Koshi, Nipponbare,
YRM62/M103/m201/Calrose, Rexmont, YRL118, YRL118, Calmochi 202, YRW4,
YRM54/Rexmont, Calrose, Rufipogen, Sakha102, M20/YRI96/Ardito/YRM54,
YRM54/Akitakomachi, Haenukai, Vialone Nano, M202,
YRM2/M101/M103/Koshihikari, Hungarian No. 1, Wakamizu, Shimuzi mocha,
Millin, Teqing, Giza178, Illabong, Gulfmont, RIL266, Somewake, Pi4,
BBL/M9/Pelde/YRI30/4/YRF07, YRL118/Inga, Koshihikari, YEM42IRBB59,
Giza182, M201/YRM3/Bogan/h989-4s, L202, YRM49, Jarrah, Dawn, Giza176,
Haenukai/Illabong, Akitomachi, Matsuribane, Sakha101, YRL/Inga/M9/213d.25,
Amaroo, M101, YRM62, Pelde, Moroebekan, Sakha103, YRM54/Akitomachi,
Ardito, M102, Kairyo Mochi, Sakha104, YRM54/Wakamizu, Ari Combo, M103,
M401, Echuca and BL24-2.

Mapeo Gentico.

La fragancia se evalu de acuerdo a Berner and Hoff (1986). Los

fenotipos de los individuos F fueron clasificados como fragantes,
segregadores o no fragantes por la degustacin de las semillas F
descascaradas. Por lo menos 12 semillas F de los individuos vegetales F
fueron probados individualmente. Las plantas F fueron clasificadas como
homocigotas fragantes o no fragantes si todas las 12 semillas F fueron
fragantes o no fragantes, respectivamente. Se esperaba que las semillas F

provenientes de plantas heterocigotas F contuvieran tanto semillas

aromticas como semillas no aromticas; por lo tanto, si la muestra de una
sola planta F fuera una mezcla de aromticas y no aromticas, la planta F no
se considerara heterocigota. La proporcin observada de segregacin de
aromticas: segregantes: las no aromticas fueron probadas por anlisis de X
contra la relacin esperada para un solo gen.

Luego de la identificacin, los SSr fueron evaluados para el polimorfismo

mediante la comparacin de los alelos parentales. Los SSr polimrficos fueron
genotipados en individuos F en el mapeo de la poblacin. Las distancias
genticas entre frg y los SSR polimorficos fue estimada utilizando MAPMAKER
versin 3.0 y determinada como el porcentaje de cromosomas recombinantes
(cM).

Bioinformtica y programas de computadora.

El principal gen que controla la fragancia en el grano de arroz fue

localizado entre los marcadores de restricciones de longitud polimrfica (RFLP)
RG1 y RG28 (Lorieux et al., 1996). 14 clones BAC fueron seleccionados
basndose en su proximidad entre los marcadores RFLP R1 y RG28 y en las
secuencias de BAC fueron obtenidas de GenBank (http://rgp.da.affrc.go.jp). Los
SSR fueron identificados utilizando la herramienta de identificacin de
repeticin
de
la
secuencia
simple
(SSRIT)
de
http://www.gramene.org/db/searches/ssrtool. Nueve marcadores microsatlites
entre RG1 y RG28 fueron seleccionados para la evaluacin del polimorfismo. La
primera secuencia para estos marcadores estn disponibles en:
http://www.gramene.org/microsat/ssr.html.

Los oligonucletidos fueron diseados utilizando Primer Premier versin

5.0 (Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EE.UU.). Los alineamientos de
secuencias se realizaron utilizando ChromasPro version 1.15 (Technelysium Pty
Ltd, http://eee.technelysium.com.au/ChromasPro-html). La secuencia BAC
AP004463 fue obtenida del sitio web de NCBI
(http://www.ncbi.nlmnih.gov.entrez.viewer.fcgi?db=nucleotide&val=24460082).
Las secuencias cDNA fueron obtenidas del sitio Web de KOME
(http://cdna01.dna.affrc.go.jp/cDNA/) utilizando el trmino de bsqueda
AP004463, y fueron seleccionados basndose en la proximidad a los
marcadores microsatelite SSRJ02 y el marcador SNP RSP04, y en las funciones
previstas.

Los arboles filogenticos fueron diseados utilizando Mac Vector 7.0

usando el apoyo de soporte de arranque basado en 10000 replicaciones. Las
alineaciones de los nucletidos y aminocidos fueron realizados utilizando
ClustalW.

Extraccin de ADN, reaccin en cadena de la polimerasa (PCR),

genotipado y secuencia de anlisis.

El ADN genmico fue extrado utilizando el Kit de plantas Qiagen

Dneasy 96 (Qiagen, doncaster, Victoria, Australia). Los cebadores de
oligonucletidos fueron sintetizados por Proligo Australia Pty Ltd (Lismore,
Nueva Gales del Sur, Australia). PCR fue realizada utilizando Platinum Taq
ADN polimerasa (Gibco BRL , (Invitrogen), Mulgrave, Victoria, Australia) bajo
condiciones estndar.

Los SSR fueron amplificados por PCR y se analizaron por electroforesis

utilizando tanto bromuro de etidio-manchado (0,5 mg / ml) 2,0% de agarosa o
utilizando un Corbett Robtica (Brisbane, QLD, Australia) Gen-Scan 2000
una escalera de peso molecular estndar de 100bp (Roche, Castle Hill, NSW,
Australia) fue utilizada para estimar el tamao del fragmento PCR.

Los productos PCR fueron purificados utilizando un dispositivo de

montaje de filtro PCR (Millipore Corporation, NorthRyde, NSW, Australia). Las
secuencias de reacciones fueron realizadas utilizando BigDye Terminator
versin 3.1 (Applied Biosystems, Scoresbye, Victoria, Australia) y las reacciones
completadas fueron purificadas con precipitacin de etanol. Los productos de
las reacciones fueron analizados en un analizador gentico Applied Biosystems
3730.