UNIVERSIDA

D NACIONAL
Facultad
PEDRO
de Ciencias
RUIZ
Biolgicas
GALLO
PRCTIC

A N
Investig
acin y
aislamie
nto de
ALUMNA:
Vibrio
cholerae Vilches Berros, Gabriela
Noem
y Vibrio
DOCENTE:
parahae
molyticu Albino Cornejo, Graciela
s
CURSO:
Microbiologa de los Alimentos
I
CICLO:
2014-IILambayeque, febrero de
2015

PRCTICA N:
Investigacin y aislamiento de Vibrio cholerae
y Vibrio parahaemolyticus
I.

Introduccin

El gnero Vibrio comprende varias especies de importancia

mdica,

relacionadas

muchas

de

ellas

con

enfermedad

gastrointestinal y en particular con enfermedades trasmitidas

por alimentos de origen marino. De todas ellas merece especial
atencin Vibrio cholerae, responsable del Clera epidmico, una
enfermedad infecciosa con un cuadro clnico caracterizado por
vmitos y diarrea intensa, que puede llevar a la deshidratacin
grave.
V. cholerae ingresa al organismo con el agua o los alimentos
contaminados. La enfermedad es endmica en por lo menos 80
pases

con

epidemias

que

ocurren

en

varias

regiones,

incluyendo frica, Sudamrica y el sur y sudeste de Asia.

V. cholerae O1, biotipo El Tor es el responsable de la sptima
pandemia que se inicio en 1961 cuando apareci la bacteria
como causa de epidemia de clera en Celebes (Sulawesi),
Indonesia. La enfermedad se propag rpidamente a otros
pases de Asia del este y lleg a Bangladesh en 1963, a India en
1964, y a la URSS, Irn e Irak en 1965-1966.
En 1970 el clera invadi el oeste de frica, la cual no haba
experimentado la enfermedad por ms de 100 aos. La
enfermedad se dispers rpidamente a varios pases de Africa y
se convirti en endmica en casi todo el continente.
Otras especies de este gnero tambin pueden estar implicadas
en enfermedades trasmitidas por alimentos, como

Vibrio

parahaemolyticus que se encuentra en el agua de mar como su

hbitat natural, se lo ha relacionado con enfermedad debido al
consumo de agua y productos de mar, mariscos o pescados

consumidos

crudos,

hbito

practicado

frecuentemente

en

nuestro pas.

II.

Objetivos

Investigar la presencia de V. cholerae y V. parahaemolyticus

en verduras, mariscos y agua marina.

Aislar e identificar V. cholerae y V. parahaemolyticus
mediante pruebas bioqumicas.

III.

Marco terico
Las bacterias Vibrio spp. son gram negativas, facultativamente
anaerbicas, motrices, en forma de bastn curvilneo, con un nico
flagelo polar. El gnero comprende al menos doce especies
patgenas para los seres humanos, ocho de las cuales pueden
causar, o estar asociados con enfermedades transmitidas por
alimentos. La mayora de las enfermedades transmitidas por
alimentos

son

causadas

parahaemolyticus o Vibrio.

La

por Vibrio
mayora

de

cholerae,

Vibrio

los

tienen

pases

directrices para detectar V. parahaemolyticus y V. cholerae O1 y

O139 en los mariscos, mientras que pocos las tienen para V.
vulnificus. En consecuencia, el anlisis microbiolgico de rutina de
los pescados y mariscos incluye el anlisis para detectar la
presencia de V. parahaemolyticus y V. cholerae O1 y O139, pero
rara vez la de V. vulnificus.
Algunas especies se asocian principalmente con enfermedades
gastrointestinales (V. cholerae y V. parahaemolyticus), mientras
que otras pueden causar enfermedades no intestinales, como la
septicemia (V. vulnificus). En las regiones de clima tropical y
templado, las especies de Vibrio que causan enfermedades estn
presentes naturalmente en el medio marino, costero y estuarino
(salobre), y son muy abundantes en los estuarios. Los vibrios
patgenos, en particular V. cholerae, tambin pueden recuperarse
de las cuencas de agua dulce de los estuarios , donde adems

pueden introducirse por contaminacin fecal. La presencia de

estas bacterias no suele guardar relacin con el nmero de
coliformes fecales y puede que la depuracin del marisco no
reduzca el nmero de stas. No obstante, es posible encontrar una
correlacin positiva entre la contaminacin fecal y los niveles de V.
cholerae en zonas donde se dan brotes de clera. Tambin se ha
demostrado en varias partes del mundo que existe una correlacin
positiva entre la temperatura del agua y el nmero de vibrios. Por
otra parte, segn datos procedentes de los Estados Unidos de
Amrica y Dinamarca, existe una correlacin positiva entre la
temperatura del agua y el nmero de vibrios aislados que son
patgenos para los seres humanos, y entre aqulla y el nmero de
infecciones

humanas

notificadas.

Esta

correlacin

es

especialmente conspicua en el caso de V. parahaemolyticus y V.

vulnificus .
El V. parahaemolyticus es una bacteria halfila Gram negativa, que
al igual que mltiples otros vibrios marinos, es una de las especies
que compone la flora normal en estuarios y del agua de mar y de
algunos

organismos

que

en

ella

viven.

El

nmero

de

V.

parahaemolyticus en el agua de mar estara asociado, al igual que

el

Vibrio

cholerae,

la

concentracin

de

zooplancton,

especialmente a coppodos y a la temperatura. Esto indicara que

las concentraciones de V parahaemolyticus en el agua de mar
pueden variar con aquellos factores que produzcan variaciones del
zooplancton, incluyendo temperatura, luminosidad, corrientes
marinas,

concentracin

de

nutrientes

concentracin

del

fitoplancton, entre muchos otros. El V. parahaemolyticus, por estar

en suspensin en el agua de mar, se concentra en moluscos
filtradores bivalvos que en nuestro pas son una importante parte
de la dieta diaria de la poblacin, incluyendo choros, Choromytilus

choro,

choritos,

Mytilus

chilensis,

cholgas,

Aulacomya

ater,

navajuelas, Tangelus dombeii, machas, Mesoderma demacium,

almejas, Venus antiqua, culengues, Gari solida, y ostiones,
Argopecten purpuratus, en cuyas carnes puede alcanzar grandes
concentraciones. Adems, en otros pases, esta bacteria se ha
encontrado contaminando camarones y carne de cangrejo y de
jaivay, ocasionalmente, carne de pescado. La infeccin humana se
adquiere por la ingestin de estos productos del mar, ya sea
crudos o parcialmente cocidos, conteniendo concentraciones
infecciosas de la bacteria, que algunos estudios han caracterizado
como de 1 x 104 bacterias por gramo de marisco. Factores
importantes en la concentracin de V. parahaemolyticus, en las
carnes de bivalvos ingeridos son la concentracin inicial de la
bacteria, la temperatura de almacenamiento y de transporte, y la
temperatura de coccin. V. parahaemolyticus tiene un tiempo de
generacin a la temperatura de 37 de 8 a 9 min, de tal modo que
puede alcanzar concentraciones muy altas en poco tiempo, ya que
la bacteria puede crecer despus de la recoleccin de los mariscos
si la temperatura es la adecuada para este crecimiento.

IV.

Materiales

Muestras:
- Lechuga
- Cangrejos frescos
- Agua de mar (Playa Pimentel)
Medios
-

V.

Agar TCBS
Caldo peptonado con pH 9,6
Caldo peptonado 3% y 0.5%

Procedimiento
Alimentos:

Realizar un homogenizado del alimento slido con Caldo

peptonado alcalino al 3% en un frasco estril.

Incubar a 37 C/5-8h.

Sembrar en placas que contengan Agar TCBS.

Incubar a 37 C/18-24h.

Agua de mar:

Tomar 1 ml de agua de mar y 10 ml de Caldo peptonado

alcalino con 0.5% de NaCl, homogenizar.

Incubar a 37 C/5-8h.
Sembrar en estras en placas que contengan agar TCBS.

Incubar 37 C/18-24h.
Observar colonias amarillas sacarosa (+), fermentan la
sacarosa,

pastoras,

semielevadas,

amarillas

ms

pronunciadas en el centro. (V. cholerae)

Observar colonias azules o azul verdosas ms acentuadas

al centro. Sacarosa (-) (V. parahaemoliticus).

Realizar las pruebas bioqumicas a las

colonias

sospechosas.

VI.

Resultados
Alimentos:
Cangrejos

Lechuga

Se observ el crecimiento de colonias amarillas de la muestra

de cangrejos.
De la muestra de lechuga no hubo crecimiento.
Agua de mar (Pimentel)

Cerca al muelle
A 200 m

A 50 m

A 100 m

A 150m

Se observ el crecimiento de colonias amarillas y verdes

(sacarolticas y no sacarolticas), notndose que la carga
bacteriana era mayor mientras ms cerca al muelle estaba el
sitio en que se tom la muestra.
Prueba del cordn

Positivo
Pruebas de tolerancia a NaCl

Tabla 1. Resultados de tolerancia a NaCl

Colonias
V1
V2
A

0%
3%
7%
+
+
+
+
+
V: colonia verde; A: colonia amarilla

10%
+
-

V1: Vibrio proteolyticus

V2: Vibrio panaeicida
A: Vibrio cholerae

VII. Conclusiones

No se report presencia de Vibrio en la muestra de lechuga.

Se logr aislar de muestras de agua de mar: Vibrio cholerae, V.
panaeicida y V proteolyticus.
Se observ que la carga bacteriana era mayor cerca al muelle,
deducindose que la contaminacin se debe a la concurrencia
de baistas.

VIII. Lincografa
http://www.bvsops.org.uy/pdf/vibrio.pdf
http://www.fao.org/docrep/008/y8145s/y8145s08.htm
http://es.slideshare.net/Prymer/gua-micro-aplicada
http://www.iiap.org.pe/promamazonia/sbiocomercio/Upload
%5CLineas%5CDocumentos/362.pdf

Cuestionario
1. Metodologa para aislar Vibrio cholerae de muestras de
agua
Mtodo cualitativo
Directo
El mtodo consiste en colectar un volmen determinado de muestra
de agua y enviarla al laboratorio en el menor tiempo posible, luego
colocar en un medio de cultivo alcalino, de igual volmen que la
muestra y de doble concentracin, con pH elevado.
Las muestras son incubadas durante 6 - 8 horas a temperatura de 35
- 37C 0.5.Luego se siembra en TCBS y las colonias tpicas son
sometidas a pruebas bioqumicas y serolgicas.
Concentracin
Existen varias tcnicas para el aislamiento a identificacin de Vibrio
cholerae en aguas. Entre los principales mtodos de concentracin se
tiene: mecha de gasa, mtodo de Moore, tierra de diatomeas y filtro
de membrana. El volmen de muestra est relacionado directamente
con el tipo de muestra.
Mtodo de Moore (mecha de gasa) modificado
Instalar la mecha en el lugar de muestreo, de tal manera que
permanezca sumergida en el agua durante 48 horas. Despus de 48
horas retirar la mecha con mucho cuidado e introducirla en un frasco
estril con tapa y capacidad de 500 ml conteniendo en su interior 300
ml de agua peptonada alcalina de doble concentracin. Incubar
durante 6 a 8 horas a 35 - 37C 0.5.
Concentracin con tierra de diatomeas
La tcnica de concentracin para anlisis cualitativo es emplear una
capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de
soporte. Volumenes de muestra son concentrados a travs de una
capa de tierra de diatomeas. El concentrado de los organismos
adheridos en la tierra de diatomeas y la almohadilla o pad son
colocados aspticamente en un frasco estril, conteniendo 250 300

ml de agua peptonada alcalina a doble concentracin. Incubar

durante 6 a 8 horas a 35 -37C 0.5.

Mtodo cuantitativo
El mtodo de cuantificacin emplear mayor tiempo que el mtodo
cualitativo, pero se hace necesario cuando se quiere determinar la
densidad de Vibrio en aguas de recreacin, en procesos de
tratamiento de aguas servidas, aguas superficiales, subterrneas y en
aguas de consumo humano.
Dependiendo de la calidad del agua, las muestras son procesadas
empleando mtodos como NMP, concentracin por filtro de
membrana y dentro de este ltimo, el de concentracin por tierra de
diatomeas.
Mtodo del Nmero Ms Probable
Este mtodo estima la densidad de Vibrio empleando tubos mltiples.
Al emplearse este mtodo se hace necesario conocer con
anticipacin la densidad probable de Vibrio.
Concentracin con tierra de diatomeas
La tcnica de concentracin para anlisis cuantitativo es emplear una
capa de tierra de diatomeas, con una almohadilla absorbente de
soporte. La finalidad de este mtodo es utilizar el concentrado de los
organismos presentes en la muestra. Esta tierra de diatomeas es
colocada encima de la almohadilla o pad, la que se encuentra sobre
la base de la unidad de filtracin. De acuerdo al mtodo de
Hammerstrom & Ljutov (1954), y M.I. Yaziz & B.J. Lloyd (1978),
volmenes de muestra son concentrados a travs de una capa de
tierra de diatomeas. El concentrado de organismos adheridos en la
tierra de diatomeas y la almohadilla o pad son colocados
aspticamente en un volmen de 105.5 ml de medio de
enriquecimiento a concentracin simple. Este volmen es distribuido
de la siguiente manera: 1 frasco con 50 ml tubos con 10 ml, 5 tubos
con 1 ml y 5 tubos con 0.1 ml.
Aplicacin

Este mtodo es el adecuado debido a que concentra las bacterias

presentes de un volumen de muestra conocida. Por este mtodo es
posible filtrar grades volmenes de muestra sin que llegue a
obstruirse.

Pruebas bioqumicas para V. cholerae

2. Pruebas bioqumicas para identificar a especies del gnero

Vibrio