TEMA 6

SECUENCIACIN

Mnica Bullejos

TEMA 6 SECUENCIACIN

OBJETIVOS
-

Comprender el fundamento del mtodo de secuenciacin

enzimtica

Conocer las modificaciones realizadas que permiten llevar a

cabo la secuenciacin de forma automtica

Conocer las diferencias entre la aproximacin del consorcio

pblico y la de Celera en la secuenciacin de genomas
completos

Conocer el fundamento
secuenciacin por sntesis

de

la

pirosecuenciacin

Mnica Bullejos Gentica Aplicada TEMA 6 / 2

TEMA 6 SECUENCIACIN

1
1.

SECUENCIACIN ENZIMTICA

2
2.

SECUENCIACIN AUTOMTICA

3.

SECUENCIACIN DE GENOMAS
COMPLETOS

4.

PIROSECUENCIACIN

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TEMA 6 SECUENCIACIN

OBJETIVO 1
CONOCER EL FUNDAMENTO DEL MTODO DE
SECUENCIACIN ENZIMTICA

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA

FUNDAMENTO
Empleo de dideoxinucletidos (carecen de grupo OH en el
carbono 3 de la pentosa) en la sntesis de una molcula de ADN

DEOXINUCLESIDO TRIFOSFATO

DI-DEOXIRIBOSA BLOQUEA LA ELONGACIN

GRUPO NO REACTIVO,
REACTIVO SNT.
SNT BLOQUEADA

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA
LA ELONGACIN DE LA CADENA TERMINA CUANDO UN
DIDEOXINUCLETIDO ES INCORPORADO AL ADN

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA
REALIZANDO EL ANLISIS

CON CADA UNO DE LOS OTROS ddNTPs

Se llevan a cabo cuatro

reacciones de
polimerizacin, cada
una de
d ellas
ll con un
ddNTP distinto.

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA

En cada caso se obtiene una mezcla de cadenas terminadas en el ddNTP

que se ha aadido a la reaccin

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA
DETERMINANDO LA LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS OBTENIDOS
SE AVERIGUAN LAS POSICIONES OCUPADAS POR G
La longitud de los fragmentos se determina mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida seguida de autorradiografa.
GEL DE SECUENCIACIN PARA G

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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA
LAS CUATRO REACCIONES SE
SEPARAN EN EL MISMO GEL
GEL DE SECUENCIACIN
PARA LAS 4 BASES

Animacion secuenciacion
enzimatica.swf

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/sangerseq.html

Secuenciacion
automatica.swf
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1. SECUENCIACIN ENZIMTICA

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TEMA 6 SECUENCIACIN

OBJETIVO 2
CONOCER MODIFICACIONES REALIZADAS QUE
PERMITEN LLEVARL A CABO LA SECUENCIACIN DE
FORMA AUTOMTICA

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

MEJORAS
- Marcaje radiactivo

ddNTP marcados con fluorocromos

- Autorradiografa

Lser durante electroforesis de gel

- Polimerasa Klenow

Taq
qp
polimerasa ((cycle
y
sequencing)
q
g)

- Cantidad de molde

Muy poca por el empleo de

secuenciacin por PCR

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA
MARCAJE CON FLUOROCROMOS

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/cycseq.html
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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

MARCAJE CON FLUOROCROMOS

El empleo de ddNTPs marcados con un fluorocromo permite
poner las cuatro reacciones en el mismo carril

GEL DE SECUENCIACIN PARA

LAS 4 BASES

SECUENCIACIN
FLUORESCENTE

AUTOMTICA

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

Secuenciador ABI 3700

~400,000 bases/da

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

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2. SECUENCIACIN AUTOMTICA

Whitehead Institute (MIT)

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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

CADA CROMOSOMA
HUMANO TIENE
100.000.000 pb
TOTAL: 3.2 BILLONES pb

1990 Human Genome Project Duracin estimada:15 aos

2003 Finalizado
Consorcio pblico (13 aos y $3,000,000,000)
C l
Celera
(3 aos
y $300,000,000)
$300 000 000)
Hoy da: 2.8 million base pairs /24 h (tres aos para genoma humano)
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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

ESTRATEGIAS ALTERNATIVAS: CELERA VS NIH

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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

CLONE-CONTIG

WHOLE GENOME SHOTGUN

(NIH)

(CELERA)

- Fragmentar el genoma

- Fragmentar el genoma

- Clonar los fragmentos

- Clonar los fragmentos

- Ordenarlos fsicamente

- Secuenciarlos aleatoriamente

- Secuenciar clone contigs

- Ensamblaje informtico

- Localizar contigs en el genoma

- Cerrar los huecos
shotgun.swf

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3. SECUENCIACIN DE GENOMAS COMPLETOS

HUMAN GENOME DRAFT SEQUENCE

Science, Feb. 16,2001, vol 291

Nature, Feb. 15, 2001, vol 409
~3
3.2
2 Billion bases in total

Y AHORA?
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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

PIROSECUENCIACIN

No es necesario realizar electroforesis o ningn otro

procedimiento para separar fragmentos
Mtodo ms rpido
p
q
que el mtodo de secuenciacin
enzimtico (terminadores marcados)
Cada vez que se incorpora un nucletido, tienen lugar
una serie de reacciones enzimticas que producen luz
luz,
que es detectada por un analizador.

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

OBTENCIN DE LIBRERA DE FRAGMENTOS
Fragmentacin del ADN (400-600 pb)
Reparacin
p
de extremos
Unin de adaptadores (A y B-biotinilado)
Inmobilizacin en micro partculas
Obtencin ANDcs

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

emPCR

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

Preparacin de la placa PicoTiter

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

Secuenciacin por sntesis

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

Lectura de la seal

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

454 (LIFE SCIENCES)

Ensamblaje de datos

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

The Genome
Sequencer FLX from
454 Life Sciences can
sequence 100 million
illi
bases per 8 hour
instrument run or
approximately
pp
y 300
million base pairs
per 24 hour period. At
this rate the human
genome can be
b
sequenced in about
ten days.
http://www.454.com/products-solutions/multimedia-presentations.asp
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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

SOLEXA SYSTEM (ILLUMINA)

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

SOLEXA SYSTEM (ILLUMINA)

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

SOLEXA SYSTEM (ILLUMINA)

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4. PIROSECUENCIACIN SECUENCIACIN POR SNTESIS

SOLEXA SYSTEM (ILLUMINA)

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OBJETIVOS
-

Comprender el fundamento del mtodo de secuenciacin

enzimtica

Conocer las modificaciones realizadas que permiten llevar a

cabo la secuenciacin de forma automtica.
automtica

Conocer las diferencias entre la aproximacin del consorcio

pblico y la de Celera en la secuenciacin de genomas
completos

Conocer el fundamento
secuenciacin por sntesis

de

la

pirosecuenciacin

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BIBLIOGRAFA

INGENIERA GENTICA (2002, 1 ED.)

Vol I: Preparacin, anlisis, manipulacin y clonaje de DNA. (ISBN: 84-7738-964-0)
AUTORES: J. Perera, A. Tormo y JL. Garca
EDITORIAL: SNTESIS
Lengua: Espaol
ISBN: 84-7738-966-7

PRINCIPLES OF GENE MANIPULATION AND GENOMICS. (2006, 7 ED.)

AUTORES: S.B. Primrose and R.M. Twyman.
EDITORIAL: Blackwell Science
Lengua: INGLS
ISBN: 1-4051-3544-1
http://www.blackwell-science.com/primrose

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OTROS LIBROS DE TEXTO

RECOMBINANT DNA: GENES AND GENOMES A SHORT
COURSE (2006, 3 ED.)
AUTORES: J.D. Watson, A.A. Caudy,
y R.M. Myers,
y
J.A. Witkowski
EDITORIAL: Cold Spring Harbour Press and Freeman
Lengua: INGLS
ISBN: 0
0-7167-2866-4
7167 2866 4

GENE CLONING AND DNA

ANALYSIS, AN INTRODUCTION
(2006, 5 ED.)
AUTORES: T.A
T A Brown
EDITORIAL: Blackwell Science
Lengua: INGLS
ISBN: 978-1-4051-1121-8

ANALYSIS OF GENES AND

GENOMES (2004, 1 ED.)
AUTORES: Richard J Reece
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 0-470-84380-2

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OTROS LIBROS DE TEXTO

UNDERSTANDING DNA AND GENE CLONING. A GUIDE
FOR THE CURIOUS (2004)
AUTORES: Karl Drlica
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 0471-43416-7
0471 43416 7

FROM GENES TO GENOMES. CONCEPTS AND APPLICATIONS

OF DNA TECHNOLOGY (2007)
AUTORES: J.W. Dale y M. von Schantz
EDITORIAL: Wiley
Lengua: INGLS
ISBN: 978-0-470-01733-3

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