BROMATOLOGA 1

TRABAJO PRCTICO N6

BROMATOLOGA 1
TRABAJO PRCTICO N 6
Determinacin de nitrgeno por semimicroKjeldahl y Reaccin
de Berthelot:
Fundamento:
El nitrgeno orgnico en presencia de H 2SO4 a 360 y en presencia de
catalizadores, se transforma en NH4+. (Las sales y xidos metlicos sirven para el
transporte de Oxgeno con formacin intermedia de Oxgeno Naciente. El K 2SO4
sirve para elevar el punto de ebullicin.
Del (NH4)2SO4 formado se libera NH3 por tratamiento alcalino y ste reacciona
con el fenol y el hipoclorito dando una coloracin azulada, proporcional a la
concentracin de amonaco presente
TCNICA
A) preparacin de la muestra:
En tubo de ensayo limpio y seco, colocar, pesado a la dcima de miligramo,
unos 50-100 mg de harina.
Agregar 400 mg de sales catalizadoras y 1 ml de cido sulfrico
concentrado. Colocar en el bloque calefactor de aluminio y calentar a unos 250C,
bajo campana.
Una vez aclarada la solucin, dejar una hora ms. . Dejar enfriar, retirando
los tubos de la plancha calefactora ,aadir cuidadosamente unos 3 ml de agua
destilada por las paredes. Trasvasar a un matraz aforado de 50 o 100 ml.
Enrasar con agua destilada, mezclar bien invirtiendo el matraz tapado varias
veces
b) Reaccin de Berthelot:
Tomar una alcuota apropiada segn clculos, colocar en un tubo de ensayos
graduado o matraz de 10 ml, agregar 0.1 ml de EDTA 1 %, luego 1 ml de Reactivo de
color A, 1 ml de Reactivo de color B. Completar con agua destilada a l0 ml.
Homogeneizar por inversin de los tubos. Llevar 30 minutos a estufa a 50 C,
Enfriar,(mantener protegido de la luz solar directa). Leer a 630 nm.
Obtener el % de N a partir de la curva de calibracin, realizada segn el mimo
esquema que la muestra
c)Obtencin de la curva de calibracin:
en 6 tubos graduados colocar

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VOLUMEN EN ML
Solucin de 1 ppm N
EDTA 1%
Reactivo color A
Reactivo color B
Agua destilada c.s.p.
Conc. Final, ppm N

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BLANCO
0
0,1
1
1
10
0

ST N1 ST N2 ST N3 ST N4 STN5
1
2
3
4
5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
10
10
10
10
10
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5

Leer a 630nm. Construir la curva de calibracin graficando absorbancia vs.

concentracin de N.
Reactivos:
1. Agua bidestilada .
2. Acido sulfrico concentrado, 93-98 %, recientemente

abierto, libre de

nitrgeno.
3. Mezcla de sales ms catalizador: mezcla ntima de 3 polvos finamente molidos:
100 partes de K2S04 + 10 partes de CuSO4.5H20 + 1 parte de Selenio.
4. Solucin de EDTA: 1 g. Na2EDTA / 100 ml de agua destilada. Usando pHmetro
llevar a pH 10 ( sirve para complejar a Ca( II), Cu (II), Se (IV), etc. y evita la
precipitacin de hidrxidos y fosfatos de calcio.
5. Reactivo de color A: preparacin extempornea en la proporcin de 100 partes,
en volumen, de reactivo A1 + 1 parte de Reactivo A2. Conservar en frasco
oscuro, solamente el da de la preparacin.
Reactivo A1: solucin al l % de fenol P.A.. Conservar en heladera
Reactivo A2: Nitroprusiato de sodio al 0.5 % en agua. Conservar en heladera ( es
catalizador de la reaccin)
6. Reactivo de color B: preparacin extempornea en la proporcin de 100 partes,

en volumen, de reactivo B1 + 2 partes de Reactivo B2. Conservar en frasco de

plstico slo el da de la preparacin.
Reactivo B1: 7.5 g NaOH + 4.7 g. Na 2HPO4.12H20 + 15.9 g. Na3PO4.12H20
disueltos en 500 ml solucin ( esta solucin fija el pH final entre 11- 12)
Reactivo B2: Hipoclorito de sodio P.A. conteniendo 8 % de cloro activo. No usar
lavandinas comerciales.
7. Solucin madre de 100 ppm de N: 472 mg de (NH 4)2SO4 secado durante 2 hs a

105 C/Litro. Conservar en heladera.

La solucin hija (de trabajo) es de 1 ppm (dura una semana a 4C).

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Factores para el clculo de protenas a partir del N determinado analticamente:

Alimento
Factor
Gelatina
5,55
Leche y productos lcteos
6,38
Carne, pescado, huevos
6,25
Frutos secos
5,4
Semillas oleaginosas
5,4
Verduras, frutas
6,25
Derivados de cereales
6,25
leguminosas
6,25
Trigo, harinas de trigo
5,7 (segn FDA)
Clculos:
Calcular el % de N y el de protenas en la muestra.