ESTUDIO CINETICO DE LA ACTIVIDAD PROTEOLITICA DE LA ENZIMA

M.G. Bertoluzzo, S. M. R. Bertoluzzo, R. Rigatuso

Introduccin.
La ficina es una enzima proteoltica que se obtiene a partir del ltex de
diversas especies de Ficus, como el Ficus carica (higuera), es muy similar a
la papana obtenida del ltex de la papaya.
Ha sido denominada pepsina vegetal pero a diferencia de la pepsina, la
ficina acta en cualquier tipo de medio (acido, neutro, alcalino), tambin
hidroliza pptidos, amidas y steres.
Fabricacin de quesos, ablandamiento de carnes y digestin de protenas
son algunos de los usos que se le ha dado a esta enzima.
Debido a que la extraccin de ltex del higo en temporada de invierno es
muy limitada y que la actividad de esta enzima depende de la edad de la
planta, se construy un liofilizador para la conservacin del ltex a
temperatura ambiente y por largo tiempo. En este trabajo se analiz la
actividad enzimtica de ltex de higuera liofilizado.

Figura 1. Micelas de ltex de higuera, vistas al microscopio 40x.

La velocidad de reaccin de muchas reacciones enzimticas es descrita por

la cintica de Michaelis-Menten. Este modelo es vlido cuando la
concentracin enzima-sustrato es constante y cuando la concentracin de
sustrato sea mayor que la concentracin de la enzima.
Al aumentar la concentracin de sustrato(S) hasta alcanzar una velocidad
constante de formacin de producto se puede determinar la velocidad
mxima (vmx) de una reaccin enzimtica.
Las enzimas pueden ser caracterizadas por la concentracin de sustrato a la
cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima, a esta
concentracin de sustrato se conoce como constante de Michaelis- Menten
(KM).

Las estapas de las reacciones catalizadas enzimticamente segn el modelo

propuesto , son dos:
1.- Formacion del complejo enzima-sustrato(Es)
2.- Formacion del producto(P) y enzima libre:
Reaccion irreversible:

La concentracin (ES) es pequea y se mantiene casi constante a lo largo de

la reaccin enzimtica.

La constante de Michaelis- Menten(KM) se define como:

Entonces,

La velocidad de reaccin es:

Como la concentracin total de la enzima(Eo) es:

Finalmente obtenemos:

Procedimiento experimental.
Recoleccion de muestras de latex de higuera , una parte de estas se
congelo para liofilizacin.

Figura 2. Equipo de liofilizacin.

De una dilucin de ltex de las hojas de higuera y muestras de ltex
liofilizadas se determin su actividad enzimtica utilizando como sustrato
BAPNA(N-alfa-benzoyl-bL-Arginine4-nitroanilide- hydrocloride). Se sigui
espectrofotomtricamente el progreso de la reaccin mediante la medida de
la velocidad de formacin del producto. La concentracin de enzima E o se
determin midiendo la absorbancia de la muestra a 280 nm y aplicando la
relacin:

Resultados y conclusiones.

Figura 3. Absorbancia en funcin del tiempo para los primeros 4 minutos de

iniciada la reaccin.

Figura 4. Grfico de Lineweaver-Burk.

La velocidad mxima obtenida para las muestras liofilizadas fue de (2.0 +0.1)x10-6 M/s , para una concentracin de enzima de 1.7x10-5 M,
obtenindose una constante cataltica de 0.119 s-1, similar a la obtenida par
las muestras de ltex fresco.
Las muestras liofilizadas mantuvieron intacta la actividad enzimtica,
mientras que las muestras sin liofilizar guardadas en el congelador durante
5 meses mostraron desnaturalizacin de la protena y prdida de la
actividad enzimtica.

900
800
700
600

Vo

500
400
300
200
100
0

200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800

BAPNA

Figura 5. Grafica [BAPNA] contra Vo

https://www.youtube.com/watch?v=qhdg-ems3KU
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm#kv
http://tertuliadeamigos.webcindario.com/biocou04.html