Universidad Autnoma de Madrid

Papel de los receptores de kainato en la

regulacin de la transmisin sinptica
gabargica
Antonio Rodrguez Moreno

Tesis de Doctorado
Facultad de Ciencias
Director:

Dr. Juan Lerma Gmez

2000

NDICE
INTRODUCCIN....................................................................................................................1
1
1. RECEPTORES IONOTRPICOS DE GLUTAMATO.....................................
2 .
4
1.1. RECEPTORES DE NMDA...............................................................................................4
5
1.2. RECEPTORES DE AMPA...............................................................................................5
6
1.3. RECEPTORES DE KAINATO.......................................................................................6
7
1.3.1. Biologa Molecular de los receptores de kainato........................................
A. La familia de subunidades de los receptores de
kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.............................................................................7....7
B. Distribucin de las subunidades de los receptores de kainato............................... 7
C. Diversidad estructural................................................................................................ 8
10
1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato............................
A. Propiedades biofsicas. Propiedades de los receptores
10
de kainato a nivel de canal nico........................................................................10
B. Propiedades de activacin y de desensibilizacin
11
de los receptores de kainato..................................................................................11
C. Propiedades farmacolgicas de los receptores de kainato...................................... 13
13
C.1. Agonistas......................................................................................................13
C.2. Antagonistas.......... ....................................................................................... 14
1515
D. Papeles fisiolgicos de los receptores de kainato....................................

OBJETIVOS...............................................................................................................................17
17
MATERIALES Y MTODOS.......................................................................................18
18
1. CULTIVOS NEURONALES...........................................................................................18
18
Microcultivos de neuronas........................................................................................................

18

2. RODAJAS DE CEREBRO...............................................................................................18
18
19
3.REGISTROS ELECTROFISIOLGICOS...............................................................1
3.1. Cultivos...................................................................................................................................19
19
21
3.2. Rodajas....................................................................................................................................21

4. ANLISIS DE LOS REGISTROS................................................................................2

23
24
5. SOLUCIONES........................................................................................................................24
24

5.1. Cultivos....................................................................................................................................24
5.2. Rodajas.......................................................................................................................................... 24

6. EXPERIMENTOS IN VIVO................................................................................................. 25

RESULTADOS................................................................................................................................ 26
1. La activacin de los receptores de kainato produce una depresin
de la transmisin sinptica GABArgica en el hipocampo de rata................26
1.1. Kainato produce una depresin de la transmisin
GABArgica.................................................................................................................................
1.2. La modulacin de la transmisin GABArgica por kainato es de
origen presinptico.....................................................................................................................
1.3. El efecto de kainato no se debe a la activacin de los receptores
metabotrpicos de glutamato..................................................................................................
1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente..........................
1.5. Kainato no acta sobre otro tipo de receptores descritos
que regulan la liberacin de neurotransmisor.....................................................................
1.6. El agonista endgeno de los receptores de kainato, glutamato,
ejerce el mismo efecto que kainato sobre las eIPSCs.......................................................
1.7. Kainato deprime la transmisin GABArgica en la regin CA1 del
hipocampo in vivo......................................................................................................................

26
29
31
32
32
33
35

2. La modulacin de la liberacin de GABA por los receptores

de kainato involucra una funcin metabotrpica.................................................. 37
2.1. La activacin de una protena G sensible a toxina pertsica
y de protena kinasa C son necesarias para que se produzca
la disminucin de liberacin de GABA mediada por la activacin
de receptores de kainato.........................................................................................................
2.2. Kainato activa una poblacin particularde PKC.............................................................
2.3. La accin de kainato es independiente de la actividad
del receptor como canal inico.............................................................................................
2.4. AMPA no activa una cascada similar................................................................................
2.5. La activacin de los receptores metabotrpicos de tipo I
no ocluye la accin de kainato.............................................................................................
2.6. La activacin de los receptores de kainato modula la seal de calcio.....................

37
40
42
43
43
44

3. Las interneuronas de hipocampo presentan dos poblaciones

de receptores de kainato con mecanismos de
sealizacin diferentes.......................................................................................................

46

3.1. El aumento de actividad espontnea y el descenso de amplitud de las

respuestas evocadas son efectos producidos por la activacin
de receptores de kainato diferentes......................................................................

46

4. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por la

activacin de los receptores de kainato presinpticos
es un
fenmeno comn
a diferentes zonas del cerebro
4.1. Hipocampo................................................................................................................................
4.2. Cerebelo.....................................................................................................................................
4.3. Neocorteza................................................................................................................................

DISCUSIN.................................................................................................................................
1. La accin de kainato es presinptica....................................................................................
2. La curva dosis-respuesta para el efecto de kainato y de glutamato
presenta forma de campana...................................................................................................
3. La depresin de las corrientes inhibidoras mediada por activacin de
receptores de kainato requiere una cascada metabotrpica...........................................
4. Son las protenas exocitticas los efectores de una poblacin
especfica de PKC?....................................................................................................................
5. En las interneuronas de hipocampo coexisten las dos
poblaciones de receptores de kainato con sistemas
de sealizacin diferentes........................................................................................................
6. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por la activacin de
receptores de kainato presinpticos es un fenmeno comn a
diferentes reas del cerebro....................................................................................................
7. Relevancia fisiolgica del bloqueo de la liberacin de GABA mediada por
receptores de kainato...............................................................................................................

53
53
54
56

58
59
60
60
61
63
65
66

CONCLUSIONES...................................................................................................................

68

BIBLIOGRAFA.....................................................................................................................

69

ABREVIATURAS Y ACRNIMOS.
AMPA: cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropinico
AMPc:

adenosn monofosfato cclico

ATP:

adenosn trifosfato

ATPA:

cido (RS)--amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropinico

BIS:

bisindolilmaleimida

Ca2+:

ion calcio

CA:

Cornus ammonis (nombre de las subcapas del hipocampo)

CNQX: 6-ciano-7-nitorquinoxaln-2,3-diona
CV:

Coeficiente de Variacin

D-AP5: cido D-2-amino-5-fosfopentanoico

DNA:
DRG:

cido desoxirribonucleico
ganglios de la raz dorsal

EEM:

error estndar de la media

EGTA:

cido etilenglicol-bis-(-aminetilter)-N, N, N, N-tetractico.

eIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras evocadas

EPSPs:

potenciales postsinpticos excitadores de campo

GABA: cido -aminobutrico

GTP:

guanosn trifosfato

HEK:

Human embryonic kidney cells (clulas embrionarias de rin humano)

HEPES: N-(2-hidroxietil) piperacina-N-(2-cido etanosulfnico)

Hz:

Hercio

iGluR:

receptor de glutamato ionotrpico

IP3:

inositoltrifosfato

K+:

ion sodio

KBPs:

kainate binding proteins (protenas que unen kainato)

KDa:

Kilodalton

LTD:

long Term Depression (Depresin de larga duracin)

LTP:

long Term Potentiation (Potenciacin de larga duracin)

M:

megaohmios

Mg2+ :

ion magnesio

mGluR: receptor de glutamato metabotrpico

mIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras miniatura

mM:

milimolar

mOsm:

miliosmoles

mRNA:

cido ribonucleico mensajero

ms:

milisegundo

mV:

milivoltio

Na :

ion sodio

NMDA:

N-metil-D-aspartato

pA:

picoamperio

PKA:

protena kinasa A

PKC:

protena kinasa C

PLC:

fosfolipasa C

pS:

picosiemens

PTx:

toxina pertsica

sIPSCs: corrientes postsinpticas inhibidoras espontneas

SNC:

Sistema Nervioso Central

TEA:

tetraetilamonio

TTX:

tetrodotoxina

M:

micromolar

ii

Introduccin

INTRODUCCIN.
Han pasado 46 aos desde que se demostr por primera vez que la aplicacin de
glutamato monosdico en la corteza cerebral induca depolarizaciones masivas (Hayashi,
1954). A esta observacin puntual indicando un posible papel del glutamato como agente
excitador del Sistema Nervioso Central (SNC), le siguieron estudios electrofisiolgicos ms
detallados demostrando efectos depolarizantes tanto del glutamato como del aspartato en
neuronas aisladas del SNC de vertebrados y que stos eran el resultado de un aumento de
la conductancia de la membrana a sodio.
En la dcada de los 70 se realizaron los trabajos demostrativos de que el glutamato
cumpla la mayor parte de los criterios para ser considerado neurotransmisor en el SNC de
los mamferos. La presencia de receptores para glutamato en las membranas neuronales
(Evans et al., 1979), la liberacin de glutamato por las terminales nerviosas tras la
excitacin (Hamberger et al., 1979), as como la existencia de sistemas de transporte
especficos de alta afinidad tanto en clulas gliales como en terminales nerviosas (Logan y
Snyder, 1972), apoyaron fuertemente la hiptesis de que el glutamato era el
neurotransmisor excitador por excelencia en el SNC. Adems, el conocimiento de la
existencia de rutas metablicas biosintticas y degradativas de glutamato en neuronas as
como la presencia de un transportador dependiente de ATP implicado en el almacenaje de
glutamato en vesculas sinpticas, igualmente sirvieron para consolidar esta conclusin.
En la actualidad, est bien establecido que el glutamato es el agente neurotransmisor
usado en la mayora de las sinapsis excitadoras del Sistema Nervioso Central de los
mamferos. Adems de la funcin del glutamato como mediador de la transmisin sinptica,
este aminocido participa durante la formacin del sistema nervioso en procesos de
crecimiento y maduracin neuronal, en la formacin y eliminacin de sinapsis y, en
determinadas reas y de forma dependiente de actividad, en la formacin de patrones
precisos de conectividad sinptica. Igualmente desencadena cambios duraderos en la
eficacia sinptica, fenmenos conocidos como LTP (potenciacin de larga duracin, longterm potentiation) y LTD (depresin de larga duracin, long-term depression), que se
consideran el correlato celular de los procesos de aprendizaje y formacin de la memoria.

Introduccin

Adems, alteraciones de la neurotransmisin glutamatrgica estn implicadas en el dao

neuronal observado despus de episodios de isquemia y de hipoglucemia, as como en la
etiologa de una serie de estados neurolgicos patolgicos que incluyen la epilepsia y las
enfermedades de Alzheimer, de Parkinson, la corea de Huntington y la esclerosis lateral
amiotrfica.
El glutamato realiza sus funciones mediante la activacin de varias molculas
receptoras. Los receptores que el glutamato activa se han dividido en dos familias:
receptores metabotrpicos y receptores ionotrpicos. Los receptores metabotrpicos
(mGluRs) estn acoplados a protenas G (protenas que unen GTP) y regulan la produccin
de mensajeros intracelulares (Pin y Duvoisin, 1995). Esta superfamilia est formada por 8
genes diferentes (mGluR1-8), cada uno de los cuales da lugar a distintos mRNAs por
mecanismos de ayuste (splicing) alternativo. Segn el nivel de conservacin de su
secuencia aminoacdica estos receptores se han subdividido en tres grupos (tipos I, II y III)
(Nakanishi, 1992), con dos posibles mecanismos de transduccin (adenilato-ciclasa y
fosfolipasa C). Estos tres grupos presentan tambin propiedades farmacolgicas propias.
Por el contrario, los receptores ionotrpicos de glutamato (iGluRs) forman un canal
catinico con diferente selectividad inica segn el tipo de receptor, siendo permeables a
sodio (Na+), potasio (K+) y, en ocasiones, a calcio (Ca2+) (Nakanishi, 1992; Hollmann y
Heinemann, 1994).

1. RECEPTORES IONOTRPICOS DE GLUTAMATO.

Se estima que en el SNC de los mamferos, el glutamato es el neurotransmisor
empleado en el 90 % de las sinapsis excitadoras rpidas, donde acta sobre receptores
ionotrpicos (iGluR). En funcin del agonista que produce la activacin de stos con
mayor afinidad o selectividad, los receptores ionotrpicos de glutamato se han clasificado
en tres tipos: receptores de NMDA (cido N-metil-D-asprtico), receptores de AMPA
(cido -amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropinico) y receptores de kainato.
Desde el punto de vista molecular, los receptores ionotrpicos de glutamato son
protenas integrales de membrana formadas, probablemente, por cuatro subunidades que

Introduccin

GLUTAMATO
NMDA
EXTRACELULAR

Zn
GLU

AMPA

KAINATO

mGluR I, II, III

GLY
PA

Mg

INTRACELULAR
NR2A
NR2B
SUBUNIDADES NR1+
NR2C
NR2D

GluR5-7
KA1, KA2

GluR1-4

AdC
PLC

IONOTRPICOS

mGluR1-8

METABOTRPICOS

Figura 1. Los receptores de glutamato se dividen en ionotrpicos (canales inicos) y

metabotrpicos (acoplados a protenas G). Los receptores ionotrpicos se subdividen en funcin
de su activacin selectiva por los agonistas NMDA, AMPA y kainato. Por su parte, los
metabotrpicos se subdividen con respecto a la homologa de sus secuencias en los grupos I, II y
III. En la figura se incluyen tambin los nombres de las subunidades conocidas a la fecha para
cada uno de los diferentes tipos de receptor y, en el receptor de NMDA, se indican los diferentes
sitios de modulacin que se conocen. AdC, adenilato ciclasa; PLC, fosfolipasa C; PA,
poliaminas.

NH2
Sitio R/G
flip/flop

Glu
1

Sitio Q/R/N
Sitio I/V
Sitio Y/C

3 4

NH 2

Canal Inico

Glu
1 2 3 4 5 6 7

COOH
COOH

M2

Figura 2. Topologa de los receptores de glutamato. A) Los tres tipos de receptores ionotrpicos
poseen tres dominos transmembranales (1, 3 y 4) y un segmento hidrofbico que se introduce en la
membrana de manera incompleta (2) formando la pared del canal inico. El sitio de unin del
glutamato est formado por aminocidos de la regin N-terminal y del asa entre el tercero y el
cuarto dominios transmembranales. Tambin se muestra la posicin de los diferentes sitios
modificados por la edicin y el procesamiento o ayuste alternativo de los RNA mensajeros que
codifican estos receptores y que se discuten en el texto. B) Los receptores metabotrpicos poseen
siete dominios transmembranales anlogos a los observados en otras familias de receptores
acoplados a protenas G. El sitio de unin de glutamato est formado por aminocidos del
segmento N-terminal exclusivamente. C) La disposicin en el plano de la membrana de las
subunidades que conforman un receptor ionotrpico revela que se trata de un tetrmero en el que
el segmento hidrofbico M2 se ubica hacia el centro de la molcula formando el poro del canal.
3

Introduccin

forman un tetrmero (Rosenmund et al., 1998). Estas subunidades son cadenas

polipeptdicas de aproximadamente 900 aminocidos (100 KDa), las cuales estn
formadas por tres dominios transmembranales (M1, M3 y M4) y un dominio
intramembranal (M2); con el extremo carboxiterminal intracelular y el aminoterminal
situado en el lado extracelular. Se han identificado 28 subunidades distintas, codificadas
por, al menos, 17 genes diferentes. Tal variedad se genera porque los RNAs pueden ser
modificados mediante mecanismos de ayuste alternativo. Adems, se conocen variantes
generadas por edicin del RNA, lo que incrementa el nmero de isoformas.

1.1. RECEPTORES DE NMDA.

De los tres tipos de receptores ionotrpicos de glutamato, el mejor conocido es el
receptor de NMDA, debido sobre todo, a la rpida disponibilidad de ligandos selectivos,
como el agonista NMDA (N-metil-D-aspartato) y los antagonistas D-AP5, MK801 o
ketamina. Los receptores de NMDA son canales catinicos que permiten el paso a su
travs de Na+, K+ y Ca2+. Funcionalmente, se caracterizan por poseer una alta
permeabilidad a Ca2+ (Ascher y Nowak, 1988), presentar dependencia de voltaje debida al
bloqueo del canal por concentraciones fisiolgicas de magnesio (Mg2+)(Nowak et al., 1984;
Mayer y Westbrook, 1987), un tiempo de apertura largo (Nowak et al., 1984) y una
cintica de activacin y de deactivacin relativamente lenta (Lester et al., 1990).
Adems de los sitios de unin para el agonista, el receptor de NMDA presenta
diversos lugares de regulacin alostrica, que son diana para compuestos tanto endgenos
como exgenos. Estos sitios de unin incluyen: un sitio de alta afinidad para glicina
(Johnson y Ascher, 1987; Klecner y Dingledine, 1998; Lerma et al., 1990); un sitio
localizado en la luz del canal donde se unen el Mg2+ y molculas como las fenciclidinas
(PCP), el MK801, TCP o ketamina (Macdonald et al., 1991; Lerma et al., 1991); adems
de un sitio adicional en el que acta Zn2+ inhibiendo las respuestas inducidas por el agonista
de forma independiente de voltaje (Peters et al., 1987; Westbrook y Mayer, 1987).
Finalmente, es conocido que las poliaminas espermina y espermidina potencian de forma
alostrica el receptor de NMDA (Lerma, 1992). Igualmente, se ha descrito que los
receptores de NMDA son sensibles a altas concentraciones extracelulares de H+ (i.e. son
sensibles al pH) (Traynelis y Cull-Candi, 1990) y son susceptibles a los estados de

Introduccin

oxidacin-reduccin (Aizenman et al., 1989).

A nivel estructural estos receptores estn formados por, al menos, dos tipos de
subunidades: NR1 (Moriyoshi et al., 1991) y NR2 (Monyer et al., 1992; Meguro et al.,
1992). Esta ltima consta de cuatro isoformas, NR2A, NR2B, NR2C y NR2D. La
subunidad NR1 presenta 8 variantes generadas por ayuste alternativo (Sugihara et al.,
1992; Nakanishi et al., 1992), que tienen diferentes propiedades farmacolgicas.
Expresando en sistemas heterlogos la subunidad NR1 con cualquiera de las cuatro
subunidades NR2, se obtienen receptores de NMDA con caractersticas funcionales
similares a los nativos. La subunidad NR1 parece ser el constituyente comn de los
receptores de NMDA, puesto que ninguna de las cuatro subunidades NR2 es capaz de
generar receptores funcionales por s misma. Dependiendo de la subunidad NR2 que se
ensamble, los receptores heteromricos NR1-NR2 tienen caractersticas propias.
La subunidad NR1 se encuentra expresada en prcticamente todas las neuronas
(Moriyoshi et al., 1991) mientras que las distintas subunidades NR2 muestran patrones de
expresin espacio-temporales caractersticos en el cerebro y en la mdula espinal,
sufriendo alteraciones durante el desarrollo (Watanabe et al., 1992; Monyer et al., 1994).
Los receptores de NMDA estn involucrados en procesos fisiolgicos complejos del SNC.
Adems de participar en la transmisin normal de la informacin, la activacin de los
receptores de NMDA se requiere para la generacin de algunas formas de LTP (Nicoll et
al., 1988). Igualmente, la alta permeabilidad a calcio de los receptores de NMDA hace que
estos jueguen un importante papel en procesos de muerte celular por excitotoxicidad.

1.2. RECEPTORES DE AMPA.

La familia de los receptores de AMPA est formada por cuatro subunidades que
presentan una homologa entre ellas del 68 al 75 %. Se denominan GluR1-4 o GluRA-D,
segn el criterio seguido por el grupo que las clon. Cada una de las cuatro subunidades
presenta dos variantes generadas por procesamiento alternativo de los mRNAs,
denominadas flip o flop. Un determinante molecular importante para las propiedades
de canal de los receptores de AMPA es el aminocido situado en la posicin 586 (sitio
Q/R). En tres de las cuatro subunidades del receptor de AMPA (GluR1, 3 y 4) esta
posicin est ocupada por una glutamina (Q). Los canales formados por cualquiera de estas

Introduccin

subunidades presentan una marcada rectificacin entrante: dejan pasar ms corriente en

sentido entrante (potenciales de membrana negativos) que en sentido saliente (potenciales
de membrana positivos) y son significativamente permeables a calcio (Hollman et al.,
1991; Verdoorn et al., 1991; Burnashev et al., 1992). Por el contrario, la subunidad GluR2
presenta una arginina (R) en esta posicin. Este cambio hace que estos receptores
presenten rectificacin saliente (dejan pasar ms corriente a potenciales de membrana
positivos que negativos) y no permeen calcio. La subunidad GluR2 es fenotpicamente
dominante, determinando el comportamiento del canal.
De forma contraria a los receptores de NMDA, que poseen varios sitios de
modulacin, los receptores de AMPA carecen, aparentemente, de esta compleja
farmacologa. En 1990 se describi que la sustancia Aniracetam potenciaba las respuestas
de quisqualato a travs de los receptores de AMPA (Ito et al., 1990). Investigaciones
posteriores demostraron que una familia de compuestos, las benzotiodiacidas, eran capaces
de reducir la desensibilizacin de los receptores de AMPA. En este sentido, los diazxidos,
clnicamente usados como antidepresivos, son un orden de magnitud ms potentes que el
aniracetan. El compuesto ms efectivo de esta familia es la ciclotiacida que reduce
notablemente la desensibilizacin rpida de los receptores de AMPA, aumentando las
corrientes postsinpticas (Yamada et al., 1993; Patneau et al., 1993; Trussell et al, 1993).
Los receptores de AMPA se distribuyen por todo el cerebro, existiendo cambios de
expresin segn la etapa del desarrollo y el tipo de subunidad. De forma general, estos
receptores se encuentran altamente expresados en el hipocampo y en las capas
superficiales de la corteza. Por el contrario, las capas profundas de la corteza y el
caudado/putamen expresan niveles intermedios.
Adems de participar en la transmisin rpida de la informacin sinptica, estos
receptores tambin han sido involucrados en algunas formas de plasticidad sinptica.
Asimismo, una excesiva entrada de calcio a su travs en condiciones patolgicas tambin
contribuye a la muerte de las neuronas.

1.3. RECEPTORES DE KAINATO.

El receptor de kainato es el componente del sistema de sealizacin de glutamato que

Introduccin

se ha mostrado ms elusivo a los investigadores. La falta de herramientas farmacolgicas

especficas ha impedido la deteccin de este tipo de receptores en neuronas del Sistema
Nervioso Central (SNC), as como la determinacin de sus papeles fisiolgicos. Hasta la
clonacin de las subunidades que forman los receptores de kainato, la evidencia de su
existencia como receptores independientes era inexistente y slo recientemente se han
definido los procesos en los que estos receptores estn involucrados (Lerma, 1997a).

1.3.1. Biologa molecular de los receptores de kainato.

A. La familia de subunidades de receptores de kainato: GluR5-7, KA1 y KA2.
La familia de subunidades que puede contribuir a la formacin de receptores de
kainato nativos se puede dividir en dos subfamilias. Una primera incluye las subunidades
GluR5, GluR6 y GluR7 y muestran entre s un grado de homologa del 75-80 %. Todas
estas subunidades generan canales funcionales homomricos, conteniendo lugares de baja
afinidad para la unin de kainato. La otra subfamilia la constituyen las subunidades KA1 y
KA2, las cuales, aunque no forman canales homomricos por s mismas, generan lugares de
alta afinidad para la unin de kainato cuando se expresan en clulas de mamferos.
Mientras que las secuencias aminoacdicas de estas subunidades muestran un grado de
homologa entre s del 70 %, slo presentan un 45 % de homologa con las de la otra
subfamilia. De

forma similar a las subunidades de otros receptores de glutamato, las

subunidades de los receptores de kainato se componen de aproximadamente 900

aminocidos (100 KDa) y tienen una topologa de membrana similar a la descrita para las
subunidades de los receptores de AMPA y de NMDA.

B. Distribucin de las subunidades del receptor de kainato.

Estudios de hibridacin in situ han revelado que los receptores de kainato se
encuentran ampliamente distribuidos en el sistema nervioso. Sin embargo, los patrones de
expresin de las distintas subunidades son bastante heterogneos (Wisden y Seeburg, 1993;
Bahn et al, 1994). As, el trnscrito de GluR5 se encuentra presente sobre todo en neuronas
de los ganglios de la raz dorsal (DRG), el subiculum, el ncleo septal, el crtex piriforme y
cingulado as como en las clulas de Purkinje del cerebelo (Bettler et al., 1990); GluR6 es
abundante en las clulas granulares del cerebelo, en el giro dentado y en la regin CA3 del
hipocampo, al igual que en el estriado. La subunidad GluR7 est presente con bajos niveles
en el cerebro pero, se expresa en particular en las capas profundas del crtex cerebral, el
7

Introduccin

estriado, y en las neuronas inhibidoras de la capa molecular del cerebelo. KA1 se restringe
de forma casi exclusiva a la regin CA3 del hipocampo, aunque tambin se expresa en
bajos niveles en el giro dentado, en la amgdala y en el crtex entorrinal (Werner et al.,
1991). Por el contrario, el mensajero de KA2 se encuentra prcticamente en todos los
ncleos del sistema nervioso.
Aunque las diferentes subunidades de los receptores de kainato estn ya presentes a
nivel embrionario, la expresin emerge durante el perodo postnatal. As, la cantidad de
mRNA de GluR5 alcanza un pico entre P0 y P5, y luego comienza a declinar hasta los
valores adultos. Esto ocurre tambin con otras subunidades.

C. Diversidad estructural.
Los receptores de kainato tienen la misma topologa transmembrana y la misma
estequiometra que los receptores de AMPA y de NMDA. Es decir, son tetrmeros en los
cuales cada monmero lleva su propio lugar de unin y contribuye con una secuencia de
aminocidos especfica a la formacin del lumen del canal, llamado segmento M2. Ese
segmento est compuesto por residuos hidrofbicos que entran en la membrana formando
una estructura en forma de horquilla. Adems de esta secuencia hidrofbica, cada
subunidad posee tres segmentos transmembrana (M1, M3 y M4) distribuidos de tal forma
que el dominio N-terminal de la protena se sita extracelularmente y la regin C-terminal
est localizada intracelularmente (Hollmann et al., 1994; Roche et al., 1994; Taverna et
al., 1994; Wo y Oswald, 1994; Bennet y Dingledine, 1995). Por analoga con los datos
disponibles para los receptores de AMPA, se supone que el sitio de unin a glutamato en
los receptores de kainato est formado por residuos distribuidos entre el dominio Nterminal y el lazo extracelular existente entre los segmentos M3 y M4 (Stern-Bach et al.,
1994). Sin embargo, la estructura real del bolsillo de unin a kainato debe presentar
diferencias significativas entre los distintos receptores de glutamato, que podran ayudar a
explicar, entre otras cosas, porqu los receptores de AMPA pueden unir kainato con alta
afinidad mientras que algunos receptores de kainato no son capaces de unir AMPA.
Algunas subunidades de los receptores de kainato se presentan como isoformas
generadas por ayuste alternativo (e.g. Sommer y Seeburg, 1992). La subunidad GluR5 fue
inicialmente descrita en dos formas moleculares que difieren en la presencia (GluR5-1) o

Introduccin

ausencia (GluR5-2) de un fragmento de 15 aminocidos en el extremo N-terminal (Bettler

et al., 1990). Anlisis adicionales revelaron la existencia de dos formas moleculares
adicionales para GluR2 (Sommer et al., 1992), que difireren en regiones del extremo
carboxiterminal, por lo que la subunidad GluR5-2 puede presentar 3 regiones o dominios
C-terminal diferentes. Estas isoformas se denominaron GluR5-2a (la ms corta), GluR-2b y
GluR5-2c (la ms larga). Se desconoce si estas isoformas presentan el mismo
comportamiento farmacolgico, puesto que es la subunidad GluR5-2a la que se ha
estudiado ms, debido a que es la ms eficiente a la hora de expresarse cuando se
transfecta en clulas de mamferos (Sommer et al., 1992). La existencia de ayuste o
procesamiento aternativo no se ha descrito para las subunidades GluR6, KA1 y KA2. Por
el contrario, recientemente se ha descrito que la subunidad GluR7 existe en dos variantes
generadas por ayuste alternativo del extremo C-terminal, denominadas GluR7a y GluR7b.
(Schiffer et al., 1997).
Aunque se ha demostrado que las variantes por ayuste alternativo de otros receptores
de glutamato son fundamentales para la funcin del receptor, las implicaciones funcionales
de estas variaciones de los receptores de kainato todava estn por determinar. Se podra
hipotetizar que estas variantes con diferentes secuencias C-terminales podran
interaccionar con diferentes protenas del citoesqueleto dotando al receptor de un
mecanismo de interaccin diferencial con distintos sistemas de sealizacin (e.g.
Nishimune et al., 1998; Osten et al., 1998; Ehlers et al., 1996).
De forma similar a otros muchos receptores de neurotransmisores (ver Swope et al.,
1992 para revisin), las subunidades de los receptores de kainato contienen sitios consenso
de fosforilacin para diversas protenas kinasas. As, un residuo de serina en la posicin
684 parece ser el principal sitio de fosforilacin para la protena kinasa A (PKA).
Se dispone de algunas subunidades clonadas de pollo, sapo o peces que no forman
canales funcionales ni receptores heteromricos con otras subunidades cuando se expresan
en sistemas recombinantes. Estas subunidades han sido designadas protenas que unen
kainato (KBP, kainate-binding proteins), (ver Henley, 1994 para revisin).
La edicin de los mRNA es una fuente de heterogeneidad molecular para

Introduccin

determinadas protenas (Cattaneo, 1991; ver Sommer y Seeburg, 1992 para revisin). Las
subunidades GluR5 y GluR6, pueden sufrir edicin postranscripcional del mRNA en un
sitio localizado en la posicin 590 (GluR6) o 591 (GluR5), conocido como sitio
glutamina/arginina (Q/R). Es conocido que las propiedades de rectificacin de los
receptores de kainato estn controladas exclusivamente por el sitio Q/R, de forma anloga
a lo observado para los receptores de AMPA (Herb et al., 1992, Egebjerg y Heinemann,
1993; Kler et al., 1993). La versin no editada codifica para una glutamina (Q) y muestra
una clara rectificacin entrante, mientras que la versin editada codifica para una arginina
(R) en esta posicin y no rectifica (Egebjerg y Heinemann, 1993). GluR6 puede sufrir
tambin edicin en dos sitios adicionales localizados en el primer dominio transmembrana,
donde una isoleucina puede ser sustituida por una valina (sitio I/V) y una tirosina puede ser
sustituida por una cistena (sitio Y/C). La edicin del RNA en estas posiciones tiene
consecuencias funcionales en los canales GluR6 homomricos. Se ha visto que la
permeabilidad a calcio de los canales GluR6 es modulada por el sitio Q/R, cuando los sitios
I/V y Y/C del primer dominio transmembrana estn editados (Khler et al., 1993). El
alcance de la edicin es regulado durante el desarrollo. A diferencia de la subunidad GluR2
de los receptores de AMPA, una proporcin significativa de subunidades de receptores de
kainato no editadas est presentes tanto en el cerebro embrionario como en el adulto
(Paschen et al., 1997; Bernard y Khrestchatisky, 1994). Igualmente, se ha observado la
edicin parcial de las subunidades GluR5 en el sitio Q/R tambin en neuronas individuales
de hipocampo de rata adulta (Mackler y Eberwine, 1993). Aproximadamente el 60 % de
los mRNAs de GluR5 se encuentran editados en tejido adulto, mientras que para GluR6 la
proporcin encontrada es del 80 %.

1.3.2. Propiedades funcionales de los receptores de kainato.

A. Propiedades biofsicas. Propiedades de los receptores de kainato a nivel de canal
nico.
Los receptores homomricos editados GluR6(R) y GluR5(R) presentan una
conductancia unitaria del orden de femtosiemens. La edicin del sitio Q/R altera de forma
drstica la conductancia de canal nico, en el sentido que la forma no editada (Q) presenta
una conductancia unitaria mucho mayor. La combinacin de las subunidades GluR5 (R) o
GluR6 (R) con KA2 produce receptores heteromricos que tienen 2-3 veces mayor

10

Introduccin

conductancia que sus respectivos homomricos en la forma R, pero muestran menor

afinidad por su agonista (Howe, 1996; Swanson et al., 1996). Sin embargo, GluR6(Q)/KA2
presenta caractersticas de canal nico que son indiferenciables de las que presentan los
receptores homomricos GluR6 (Q), aunque la coexpresin de KA2 y GluR5 (Q) acorta la
duracin de las respuestas cuando se compara con los canales homomricos (Swanson et
al., 1996). Este efecto est de acuerdo con el hecho de que los mRNAs de las subunidades
KA1 y KA2 no son susceptibles de ser editados y ambos llevan una Q en el lugar Q/R.
En clulas embrionarias de rin (HEK) que expresan la forma Q de GluR5 o de
GluR6 en receptores homomricos (o heteromricos con KA2), se realizaron registros de
corrientes en la configuracin de parches de membrana escindidos, que permitieron
resolver tres niveles de subconductancias (Swanson et al., 1996).
Recientemente, se ha descubierto que la corriente de canal nico media de los
receptores de glutamato tambin depende de cuntos de los sitios de unin para agonista
estn ocupados (Rosemund et al., 1998) mientras el receptor no entre en estado
desensibilizado.

B. Propiedades de activacin y de desensibilizacin de los receptores de kainato.

Un sello de identidad de los receptores de kainato es que en presencia continuada del
agonista, la corriente que fluye a travs de los canales activados decae rpidamente. Ello se
debe a la desensibilizacin del receptor. En neuronas de hipocampo en cultivo el desarrollo
de la desensibilizacin sigue una curva exponencial nica (Lerma et al., 1993; Paternain et
al., 1998), aunque tambin se ha observado procesos que se ajustan mejor a una
exponencial doble (Lerma et al., 1993; Wilding y Huettner, 1997). La conclusin que
permiten alcanzar los datos observados por algunos autores en diferentes preparaciones es
que la desensibilizacin de los receptores de kainato es un proceso rpido y muy marcado.
La desensibilizacin del receptor sigue una exponencial con una constante de tiempo de
11-13 ms tanto en neuronas de hipocampo como en canales GluR6 recombinantes (Lerma
et al, 1993; Paternain et al, 1998). La velocidad de desensiblizacin estimada para
receptores GluR6 en parches de membrana escindidos es ms rpida (5-8 ms; Heckmann et
al., 1996; Traynelis y Wahl, 1997), pero no muy diferente a los valores medidos en
condiciones de clula completa.

11

Introduccin

Por el contrario, la recuperacin de la desensibilizacin de los receptores de kainato es

muy lenta. La recuperacin total de la respuesta inducida por glutamato en neuronas de
hipocampo se obtiene despus de 15 segundos de una aplicacin inicial, aunque la
velocidad de recuperacin depende del agonista usado para desensibilizar el receptor
(Paternain et al, 1998). Es necesario esperar 1 minuto para recuperar la amplitud inicial en
clulas de hipocampo, cuando se usa kainato para desensibilizar el receptor. En general la
recuperacin de la desensibilizacin sigue una exponencial simple, con una constante de
tiempo que depende del tipo de subunidades que componen el receptor. Por ejemplo, los
receptores homomricos GluR5 cuando son desensibilizados con (S)-5-IW se recuperan en
2.5 minutos, mientras que los receptores heteromricos GluR5/KA2 se recuperan de la
desensibilizacin con una constante de tiempo de 12 segundos (Swanson et al. 1998).
Independientemente del tipo de subunidad estudiada, estos datos implican que los
receptores de kainato tienden a estar largos perodos de tiempo en el estado desensibilizado
y que este estado puede ser considerado como un estado absorbente ya que el equilibrio
est casi completamente desplazado en este sentido. El anlisis de las curvas dosisrespuesta para el agonista endgeno, ya sea para receptores nativos o recombinantes,
permiten concluir que los receptores de kainato no tienen una alta afinidad por glutamato.
Sin embargo, en trminos de desensibilizacin en el estado estacionario, los receptores de
kainato son muy sensibles a la concentracin ambiente de agonista. Estos receptores son
aproximadamente dos rdenes de magnitud ms sensibles al agonista para su
desensibilizacin que para su activacin.
El clculo de la desensibilizacin en el estado estacionario para los receptores de
kainato expresados por las neuronas de hipocampo en cultivo da un valor de IC50, (i.e. la
concentracin de agonista a la cual el 50 % de los receptores se desensibilizan), de
aproximadamente 3 M para glutamato (Paternain et al., 1998). Esto significa que a
concentraciones de glutamato incapaces de producir activacin, los receptores estn
desensibilizados. Lo mismo ocurre cuando se usa kainato como agonista. Esta diferencia de
sensibilidad entre activacin y desensibilizacin tambin se encontr en receptores GluR6
recombinantes (Heckmann et al., 1996; Paternain et al., 1998). Curiosamente, los
receptores GluR6 recombinantes son ms sensibles a la desensibilizacin por glutamato
(IC1/2 de 0.3 M) que los nativos. Por el contrario, son menos sensibles a la activacin por

12

Introduccin

glutamato (EC50 de 500-700 M).

C. Propiedades farmacolgicas de los receptores de kainato.
El principal obstculo para el estudio de los receptores de kainato ha sido la falta de
agonistas y antagonistas especficos. El desarrollo de agonistas y antagonistas especficos
de los receptores de NMDA ha permitido determinar numerosos procesos en los cules
estos receptores estn involucrados. Sin embargo, la separacin funcional de los receptores
nativos de kainato y de AMPA en neuronas ha sido dificultosa ya que ambos receptores se
activan por la misma coleccin de agonistas, y durante mucho tiempo se denominaron
genricamente receptores de tipo No-NMDA. Por ejemplo, el AMPA carece de efecto
sobre los receptores de kainato recombinantes (Egebjerg et al., 1991; Herb et al., 1992)
dado que es completamente inactivo sobre GluR6 y GluR7 y presenta una EC50 de 3 mM
para GluR5 (Sommer et al., 1992). De forma similar, AMPA no activa los receptores de
kainato nativos en cultivos de neuronas de hipocampo, y slo a altas concentraciones a los
presentes en clulas de los ganglios de la raz dorsal (DRG) de la mdula espinal (Huettner,
1990; Lerma et al., 1993; Wong et al., 1994). Sin embargo, kainato, aunque con menor
afinidad que para los receptores de kainato, activa todos los tipos de receptores de AMPA
a dosis relativamente bajas.

C.1. Agonistas.
La afinidad de kainato por sus receptores vara segn la composicin de subunidades
de los mismos. Los valores de EC50 calculados para las distintas subunidades en sistemas
recombinantes corresponden a 33.6 M para GluR5 (Sommer et al., 1992), 299 M para
GluR6 (Paternain et al., 1998) y >1 mM para GluR7. Una situacin similar se encontr
cuando se us glutamato como agonista (631 M para GluR5, 270-762 M para GluR6 y
5.9 mM para GluR7). Estos datos nos indican que los receptores de kainato no muestran
alta afinidad ni por kainato ni por glutamato.
Adems de kainato y glutamato, se han encontrado algunas molculas capaces de
activar los receptores de kainato con cierto grado de especifidad. El domoato, una toxina
que se aisl de mejillones contaminados con algas, tiene 20-25 veces mayor preferencia por
los receptores de kainato que por los de AMPA en clulas de DRG y en receptores GluR5
recombinantes (Huettner et al., 1990; Sommer et al., 1992), aunque es inactivo sobre

13

Introduccin

GluR7 (Schiffer et al., 1997).

El cido (RS)--amino-3-hidroxi-5-tert-butil-4-isoxazolepropinico (ATPA), un
derivado de AMPA, ha sido descrito como agonista selectivo de receptores recombinantes
GluR5. La EC50 para ATPA es 0.6 M para receptores nativos en neuronas de DRG y de
2.1 M para receptores GluR5 recombinantes, un orden de magnitud mayor que kainato
(Clarke et al., 1997). Al mismo tiempo su afinidad por los receptores de AMPA es unas
500 veces ms baja.
El derivado de willardina, (S)-5-iodo-wilardina, muestra una selectividad de unas 130
veces mayor para los receptores de kainato que para los de AMPA. Su EC50 es 140 nM.
C.2. Antagonistas.
La bsqueda de antagonistas de los receptores de kainato no ha sido tan exitosa como
la bsqueda de agonistas. La primera generacin de antagonistas de los receptores de
glutamato de tipo No-NMDA, las quinoxalinodionas (CNQX; DNQX y NBQX), son
incapaces de discriminar entre los receptores de AMPA y los de kainato. El compuesto
denominado NS102, otro antagonista de receptores de tipo No-NMDA, fue descrito como
un producto que, en membranas de corteza, inhibe completamente la unin de kainato
(Johansen et al., 1993). Adems, NS102 antagoniza parcialmente las respuestas generadas
por activacin de receptores GluR6 en clulas embrionarias de rin (HEK) con un IC50 de
2.2 M (Verdoorn et al., 1994). Sin embargo, NS102 tambin es activo sobre los receptores
de AMPA, aunque de forma menos potente. Por ello, esta droga se consider ineficaz para
separar las actividades mediadas por ambos receptores (Paternain et al., 1996; Wilding y
Huettner, 1996).
El desarrollo de las 2,3-benzodiazepinas como antagonistas de los receptores de
AMPA (ver Vizi et al., 1996 para revisin), y la posterior demostracin de que estos
compuestos son selectivos para estos receptores (Paternain et al., 1995; Wilding y
Huettner, 1995), ha sido crucial para el entendimiento de la funcin de los receptores de
kainato. En particular GYKI 53655 (LY300168 segn el cdigo de Elli Lilly) es un
antagonista no competitivo de los receptores de AMPA, capaz de bloquear completamente
estos receptores a una concentracin de 100 M. A esta concentracin, no ejerce
14

Introduccin

antagonismo sobre los receptores de kainato, y por ello ha sido usado para desenmascarar
las corrientes de kainato en neuronas maduras (Paternain et al., 1995; Wilding y Huettner,
1997). Aunque GYKI 53655 es la mezcla racmica, presenta una IC50 de 1M para
antagonizar los receptores de AMPA (Paternain et al., 1995; Wilding y Huettner, 1997),
siendo el ismero activo, LY303070, ms potente.
Recientemente, se ha desarrollado una nueva serie de compuestos que muestran una
diferente sensibilidad para los receptores de AMPA y de kainato. LY293558 inhibe GluR5
pero no GluR6. Sin embargo, este compuesto tambin antagoniza las respuestas mediadas
por los receptores de AMPA (Bleakman et al., 1996). Otro derivado, LY294486, muestra
mayor selectividad para GluR5, y ms recientemente se ha demostrado que el compuesto
LY382884 es especfico para antagonizar la unin a los receptores GluR5, no presentando
afinidad significativa por las subunidades de los receptores de AMPA GluR1,2,3 ni por las
de kainato GluR6, GluR7 y KA2 (Simmons et al., 1998).

1.3.3. Papeles fisiolgicos de los receptores de kainato.

La primera evidencia acerca de la existencia de receptores de kainato se obtuvo en el
sistema nervioso perifrico. Los primeros estudios mostraron que los nervios perifricos de
la raz dorsal de ratas inmaduras, especficamente las fibras de tipo C, se depolarizaban con
kainato, un efecto que luego se observ que se deba a la inactivacin de canales de sodio
dependientes de voltaje (Davies et al., 1979; Agrawal y Evans, 1986). Estudios posteriores
demostraron que la aplicacin de kainato en clulas disociadas de los DRG induca
respuestas que se desensibilizaban rpidamente (Huettner et al., 1990), un efecto
sorprendente puesto que, el conocido hasta ese momento, se corresponda con una
respuesta a kainato sostenida debido a la activacin de los receptores de AMPA por
kainato. La posterior demostracin de que los receptores de kainato producan respuestas
desensibilizantes cuando se expresaban en sistemas heterlogos as como la localizacin de
subunidades de receptores de kainato en clulas de DRG, condujeron a la aceptacin de
que las respuestas observadas se deban, efectivamente, a la activacin de receptores de
glutamato de tipo kainato. Este constituy la primera evidencia de la presencia de
receptores de kainato especficos.
La disponibilidad del GYKI53655 como antagonista selectivo de los receptores de

15

Introduccin

AMPA, hizo posible el estudio de la participacin de los receptores de kainato en la

transmisin sinptica excitadora. Los primeros experimentos en cultivos de neuronas de
hipocampo indicaban que, al contrario que los de AMPA, estos receptores no participaban
en la transmisin sinptica excitadora. Aunque se demostr que las neuronas estudiadas
tenan receptores de kainato, no fue posible provocar corriente postsinptica alguna en
presencia de antagonistas de los receptores de AMPA y de NMDA (Lerma et al., 1997b).
Sin embargo, estudios posteriores en rodajas de hipocampo han permitido identificar una
serie de sinapsis donde los receptores de kainato parecen mediar una fraccin pequea de
la corriente sinptica. En este sentido, se ha demostrado que se pueden inducir corrientes
excitadoras postsinpticas (EPSCs) con caractersticas farmacolgicas propias de los
receptores de kainato en las sinapsis formadas por la fibras musgosas y las neuronas
piramidales de CA3 (Castillo et al., 1997; Vignes y Collingridge, 1997). Sin embargo, estas
respuestas slo se observan en circunstancias de actividad presinptica repetitiva y podran
reflejar disposicin extrasinptica de los receptores.
La corriente inducida por estos trenes de estmulos est ausente en ratones a los que se
les ha anulado el gen GluR6 (Mulle et al., 1998), lo que indica que los receptores de
kainato que contienen la subunidad GluR6 participan en la transmisin sinptica a nivel
fibra musgosa-neurona de CA3. Adems del hipocampo, se ha identificado la presencia de
receptores postsinpticos de kainato en neuronas de la amgdala lateral (Li y Rogawski,
1998), en neuronas del asta dorsal de la mdula espinal (Li et al., 1999) (posiblemente
implicados en nocicepcin), en algunas clulas bipolares de la retina (DeVries y Schwartz,
1999) y en el crtex cerebral (Kidd e Isaac, 1999).

16

Objetivos

OBJETIVOS.
Teniendo en cuenta la disponibilidad del antagonista especfico de los receptores de AMPA,
GYKI53655, se plante determinar el papel de los receptores de kainato en la fisiologa
cerebral. Para ello, en la presente tesis se han abordado los siguientes objetivos generales:
1. Determinar el papel de los receptores de kainato en la modulacin de la transmisin
sinptica inhibidora en el hipocampo.
2. Determinar el/los mecanismos mediante los cules estos receptores interfieren con la
transmisin inhibidora.

17

Materiales y Mtodos

MATERIALES Y MTODOS.
1. CULTIVOS NEURONALES.
Microcultivos de neuronas.
Las neuronas de hipocampo se cultivaron en condiciones de microcultivo (Fotografa
1), segn el protocolo descrito por Bekkers y Stevens (1991) con algunas modificaciones
(Lerma et al., 1997b). Las clulas se disociaron de hipocampos aislados de embriones de 1718 das de gestacin y se sembraron a una densidad de 100 clulas/mm2 en placas de Petri de
35 mm (Nunc). Cuarenta y ocho horas antes de comenzar el cultivo, el fondo de las placas de
Petri fue recubierto con una fina capa de agarosa estril (0.2 %) que se dej secar en el
interior de un incubador a 37 C. Antes de comenzar la disociacin, se pulveriz sobre la
agarosa una solucin que contuvo poli-D-lisina (100 g/ml) y laminina (16 g/ml), con el
objeto de producir mltiples microgotas de sustrato permisivo. La pulverizacin se ajust para
obtener islas con un dimetro de aproximadamente 100 m, con una densidad de 30-50
gotas/mm2.
El medio de cultivo usado fue Neurobasal con suplemento B27 al 4 %, (ambos de
Gibco) (Brewer et al., 1993) al que se aadi glutamina (0.5 mM), mercaptoetanol (25 M)
(Grill y Pixley, 1993), penicilina (100 unidades/ml) y estreptomicina (100 mg/ml). En los das
de cultivo 4, 7, 14 y 21 un 40 % del medio de cultivo de cada placa se reemplaz con medio
fresco. Tras una semana de cultivo, la distribucin aleatoria de las neuronas en las placas
permiti encontrar numerosas islas ocupadas por una sla neurona as como microgotas
conteniendo dos o ms clulas. En aquellas gotas que slo albergaban una neurona, esta al
crecer y desarrollarse termina estableciendo contactos sinpticos con ella misma (autapsis) y
en aquellas gotas en las cules se encuentran dos neuronas estas establecen contacto entre s y
as se obtuvieron conexiones heterosinpticas.

2. RODAJAS DE CEREBRO.
Las rodajas de hipocampo fueron preparadas de acuerdo con los procedimientos
descritos (Stuart et al., 1993), a partir de ratas Wistar de 14-16 das de edad. Brevemente, tras
sacrificar el animal por decapitacin, el cerebro fue sumergido en una solucin fra

18

Materiales y Mtodos

conteniendo (en mM) 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3 y
10 glucosa (300 mOsm). El cerebro completo conteniendo los dos hipocampos se posicion
sobre la platina de un vibratomo (Word Precision Instruments, VSLM1) y se seccion para
obtener rodajas transversales de 350 m. Las rodajas fueron transferidas a una cmara de
incubacin conteniendo la solucin descrita que se mantuvo oxigenada continuamente (95 %
O2, 5 % CO2, pH=7.4). As se mantuvieron a temperatura ambiente durante, al menos, una
hora antes de ser usadas para los registros electrofisiolgicos.
Las rodajas de cerebelo fueron obtenidas usando igual metodologa que en el caso de
las rodajas de hipocampo, salvo que en este caso se posiciona sobre la platina del vibratomo
slo el cerebelo que ha sido previamente separado del resto del cerebro, el cual se orient de
forma que al seccionar se obtuvieron rodajas sagitales del mismo.

Las rodajas de corteza se obtuvieron usando igual metodologa y soluciones que las
descritas para la obtencin de rodajas de hipocampo.

3. REGISTROS ELECTROFISIOLGICOS.

3.1. Cultivos.
Se hicieron registros de actividad sinptica entre pares de neuronas interconectadas
entre s y tambin en neuronas que establecen conexiones sinpticas consigo mismas. En los
pares de neuronas, una de ellas se utiliz como clula presinptica y la otra como neurona
postsinptica, de forma que se hizo disparar la neurona presinptica (aplicndole pulsos
depolarizantes) y las corrientes as evocadas se registraron en la clula postsinptica. En el
caso de las conexiones autpticas la misma neurona se us como pre y postsinptica.
Los registros se obtuvieron usando las tcnica de patch clamp en su configuracin de
clula completa (whole cell) en condiciones de fijacin de voltaje (Hamill et al., 1981) para la
clula postsinptica, para lo cual se us un amplificador Axopatch-200A y en condiciones de
fijacin de corriente para la clula presinptica, para lo cual se us un amplificador
Axoclamp-2A. Para el caso de los registros obtenidos de conexiones autpticas se us un
amplificador Axopatch-200A y se obtuvieron los registros en condiciones de fijacin de
corriente.

19

Materiales y Mtodos

Fotografa 1. Dos neuronas creciendo en microcultivo. Estas neuronas establecen

contactos sinpticos entre s y consigo mismas. La imagen corresponde a neuronas de un
cultivo de aproximadamente 21 das.

20

Materiales y Mtodos

Las micropipetas se fabricaron a partir de capilares de borosilicato en un estirador de

pipetas horizontal (Sutter P-81), y tuvieron una resistencia de 2.5-5 M cuando se llenaron
con la solucin interna. Con el fin de minimizar los cambios en el potencial de punta del
electrodo cuando se intercambiaron las soluciones, el bao se conect al amplificador
mediante un puente salino de agar (2 %; NaCl 135 mM) y mediante un hilo de plata
previamente clorurado en una solucin de cido clorhdrico 1 N.
Las respuestas fueron supervisadas continuamente con un osciloscopio (Tektronix
TDS 310). Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 C).
Las seales electrofisiolgicas se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron mediante un
convertidor analgico-digital (Lab-Master TM-40, Axon Instruments, USA) y se almacenaron
en un ordenador personal usando el programa de adquisin de datos Clampex (versin 5.5.1,
pClamp 5.6, Axon Instruments, USA). El programa Clampex igualmente permiti generar
protocolos de estimulacin que fueron usados para imponer cambios de voltaje a las clulas a
travs del amplificador.

3.2. Rodajas.
Las rodajas se transfirieron a una cmara de registro, montada sobre un microscopio
(Axioscop, Zeiss) y se mantuvieron en posicin mediante una rejilla de hilos de nylon con un
armazn de platino. Esta cmara se perfundi a razn de 3-4 ml/min con una solucin externa
igual a la descrita para la obtencin de las rodajas. Las clulas de las rodajas se visualizaron
por videomicroscopa infrarroja de contraste interdiferencial (IR-DIC) (Stuart et al., 1993) a
travs de un objetivo de inmersin en agua 40x. Las soluciones se aplicaron por gravedad
cambiando entre cuatro lneas de perfusin mediante una electrovlvula de multiples vas.
Todos los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22-25 C).
En el hipocampo, las corrientes inhibidoras postsinpticas (IPSCs) se indujeron
mediante pulsos elctricos aplicados con un electrodo bipolar colocado en el stratum oriens, a
50-150 m del lugar de registro. Los electrodos se fabricaron con capilares de borosilicato
presentando una resistencia de 5-10 M cuando se llenaron con la solucin interna. Las
corrientes se registraron en el soma de neuronas de la capa CA1 o CA3 en la configuracin de
clula completa tras el establecimiento de sellos >1 G.

21

Materiales y Mtodos

Registro
Estimulacin

CA1
St. Oriens

St. Radiatum

CA3

Figura 3. Diseo experimental para la obtencin de

registros de las clulas de la regin CA1 del hipocampo.
Como se observa en la figura, el electrodo de estimulacin
se coloca en el stratum oriens y la pipeta de registro en las
neuronas de la capa CA1 del hipocampo.

Para obtener respuestas inhibidoras al registrar el soma de clulas de Purkinje se

estimul (con un electrodo igual al descrito para hipocampo) en la zona de la capa molecular
cerca de la capa de clulas de Purkinje. Para obtener respuestas inhibidoras en las clulas de
los ncleos profundos del cerebelo se estimul en la zona de los terminales axnicos de las
clulas de Purkinje y se registr en el soma de las clulas de los ncleos profundos del
cerebelo.
En las rodajas de corteza, se obtuvieron registros de los somas de la neuronas
piramidales situadas en la capa V, estimulando las interneuronas situadas en las proximidades
de estas neuronas piramidales.
En todas los casos us un amplificador Axopatch 200A (Axon Instruments). La
resistencia de acceso fue monitorizada continuamente durante los registros, los cuales fueron
rechazados si durante un experimento sufri un cambi >15 %. Las seales electrofisiolgicas
se filtraron a 1-2 KHz, se digitalizaron y se almacenaron en el disco duro de un ordenador
personal.
Las corrientes elementales (miniatura, mIPSCs) fueron registradas durante periodos de
180-360 segundos bajo cada situacin experimental en presencia de tetrodotoxina (TTX; 0.522

Materiales y Mtodos

1M). Estas respuestas miniatura fueron adquiridas usando el programa Axotape 2.0 (Axon
Instruments) y almacenados en el disco duro del ordenador.

4. ANLISIS DE LOS REGISTROS.

Los registros se analizaron con el programa Clampfit, versin 6.02 (Axon Instruments,
USA). Las respuestas miniatura se analizaron, adems de con Clampfit, con Fetchan 6.02 y
con el programa de anlisis de corrientes elementales Snap, diseado en el Instituto Cajal por
el Dr. Imanol Martnez-Padrn. El anlisis estadstico se realiz usando los programas
SigmaPlot y Origin, versiones 2.0 y 3.5, respectivamente.
El grado de inhibicin (o de incremento) de la amplitud de las respuestas se calcul
como [1-(IPSCtest /IPSCcontrol)] 100. Donde, IPSCtest representa la amplitud de las corrientes
(en pA) tras aplicar kainato, glutamato o cualquier otra sustancia, segn el caso, a las clulas
en cultivo o a las rodajas y IPSCcontrol representa la amplitud (en pA) de las corrientes antes de
aplicar alguna sustancia a las clulas cultivadas o a las rodajas.
El Coeficiente de Variacin libre de ruido (CV) de las corrientes inhibidoras se calcul
como:

CV =

2 ( IPSC ) 2 ( ruido)
amplitud IPSC

donde 2(IPSC) y 2(ruido) son la varianza de las respuestas de corriente y la varianza del ruido
basal, respectivamente. La razn de CV en ambas situaciones (CVR) se obtuvo para cada
neurona como CVka/CVcontrol. La grfica comparando la variacin en la amplitud media de las
IPSCs (M) con respecto al estadstico 1/CV2 que refleja el cambio en la varianza de la
amplitud de las respuestas, se construy como se describe en Bekkers y Stevens (1990) y
Malinow y Tsien (1990; ver tambin Siegelbaum y Kandel, 1991 para una mayor
explicacin).
Las corrientes miniaturas fueron analizadas tras ser detectadas usando un programa de
deteccin. Este calcul la primera derivada de la corriente registrada, teniendo en cuenta slo

23

Materiales y Mtodos

aquellas respuestas que sobrepasan un umbral aleatorio, (tpicamente 1.5 veces la amplitud
del ruido; i.e. 8-12 pA). En algunos casos, la deteccin se hizo bajo control visual. Con el fin
de comprobar si las condiciones de registro influenciaron las variaciones en la amplitud
espontnea de las mIPSCs, se representaron tanto el tiempo de subida frente al tiempo de
cada de los eventos registrados en cada clula. Estos dos parmetros no mostraron ningn
tipo de correlacin significativa por lo que se conluy que el filtro electrotnico no fue una
fuente importante de variacin. La frecuencia de mIPSCs fue calculada mediante la
exponencial de las distribuciones cumulativas tanto de los intervalos como de las amplitudes.
Las distribuciones obtenidas tras la aplicacin de kainato o de glutamato se compararon
estadsticamente con las obtenidas en condiciones control usando el test de KolmogorovSmirnov.

5. SOLUCIONES.

5.1. Cultivos.
Solucin extracelular.
La solucin externa usada consisti (en mM) en: 165 NaCl, 2.5 KCl, 1.8 CaCl2, 2
MgCl2, 20 Glucosa y 10 HEPES. La solucin se ajust a un pH de 7.4 con NaOH. La
osmolaridad, medida con un osmmetro de presin de vapor (Wescor 5500), se ajust a 320330 mOsm mediante la adicin de sacarosa, cuando fue necesario.
Solucin intracelular.
Las pipetas de registro se llenaron con la siguiente solucin (en mM):
130 K-metanosulfonato, 20 CsCl, 0.5 CaCl2, 5 MgCl2, 4 mM ATP-Mg, 10 EGTA y 10
HEPES. Esta solucin se ajust a un pH de 7.3 con KOH. La osmolaridad se ajust a 315320 mOsm, siempre entre 5 y 10 mOsm inferior a la solucin externa.

5.2 Rodajas.
Soluciones extracelulares.
Las solucin externa usada en la mayora de los experimentos estuvo compuesta por
(en mM): 124 NaCl, 2.69 KCl, 1.25 KH2PO4, 2 MgSO4, 1.8 CaCl2, 26 NaHCO3 y 10 glucosa
(300 mOsm) (1).

24

Materiales y Mtodos

En los experimentos en los que el calcio extracelular se vari, los componentes fueron
los mismos, salvo que las concentraciones de CaCl2 se ajustaron a 0.5 o 10 mM.
En algunos experimentos la concentracin de Na+ se modific, ajustndose a 60 mM,
37.5 y, en algn caso, 0 mM, de forma que la solucin (1) se modific para obtener estas
condiciones, la osmolaridad se ajust a 300 mOsm usando N-metil-Glucamina y HCl.
Los agonistas o antagonistas que se emplearon se prepararon con estas soluciones a
partir de soluciones madre altamente concentradas.
Soluciones intracelulares.
En los experimentos realizados en condiciones de fijacin de voltaje (voltaje clamp)
la solucin interna usada estuvo compuesta por (en mM): 120 CsCl, 20 QX-314, 8 NaCl, 1
MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3, 287 mOsm). En los experimentos
realizados en condiciones de fijacin de corriente, la solucin interna usada estuvo compuesta
por (en mM): K-gluconato 120, 8 NaCl, 1 MgCl2, 0.2 CaCl2, 10 HEPES y 2 EGTA (pH=7.3).

6. EXPERIMENTOS IN VIVO.
En colaboracin con el Dr. Oscar Herreras del Departamento de Investigacin del
Hospital Ramn y Cajal, se realizaron algunos experimentos in vivo con el fin de comprobar
el efecto de kainato sobre la excitabilidad hipocmpica en el circuito intacto. Los
experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley de 200-250 g de peso, anestesiadas con
uretano (1-2 g/kg), cuya temperatura se mantuvo a 37 C usando una manta elctrica. Los
mtodos quirrgicos y estereotxicos usados han sido descritos previamente por el grupo (ver
Largo et al., 1996). Brevemente, se implant un electrodo bipolar concntrico en el lado
homolateral de CA3 para estimular ortodrmicamente las colaterales de Schaffer y un
electrodo de registro en la capa piramidal de CA1 con el fin de registrar el potencial de
campo. El estmulo consisti en pulsos de 0.1 ms a una frecuencia de 0.1 Hz y a una
intensidad que fue supramxima para evocar una espiga poblacional. Igualmente, se implant
una sonda de microdilisis, (dimetro externo, 220 m; longitud 0.8-1 mm) manufacturada de
la forma descrita (Herreras et al., 1994; Largo et al., 1996), la cual se us para introducir
kainato (3 M) en el fluido extracelular. La sonda se baj hasta una posicin en la que toda la
extensin dorso-ventral de CA1 qued expuesta a la dilisis.

25

Resultados

RESULTADOS.
1. La activacin de los receptores de kainato produce una depresin de la
transmisin sinptica GABArgica en el hipocampo de rata.
1.1. Kainato produce una depresin de la transmisin GABArgica.
En microcultivos de neuronas hipocmpicas y en condiciones de bloqueo de los
receptores de AMPA (con GYKI 53655, 100 M) y de NMDA (con D-AP5, 50 M), la
aplicacin de bajas concentraciones de kainato provoc una disminucin de las respuestas
inhibidoras postsinpticas (IPSCs) (Figura 4). Una concentracin de kainato de 0.6 M produjo
una disminucin del 43.0 11.5 % (n=5). En nuestras condiciones de microcultivo, slo el 25
% de los pares de clulas estaban conectados sinpticamente y menos del 20 % de estas
conexiones eran inhibidoras. Por lo tanto, este modelo no permiti hacer un anlisis exhaustivo
del efecto de kainato sobre la inhibicin sinptica. Sin embargo, se registraron un total de 6
pares, uno de los cuales fue descartado debido a que las respuestas inhibidoras mostraban una
marcada disminucin de la amplitud con el tiempo (rundown) que hizo imposible cualquier tipo
de cuantificacin. En el resto de los casos, se observ de forma clara un aumento en el nmero
de fallos en la liberacin de neurotransmisor (se genera un potencial de accin en la clula
presinptica pero no se produce liberacin de neurotransmisor) y en dos de estos pares se
observ un aumento en la latencia de las IPSCs en presencia de kainato. En dos casos
adicionales se evalu el efecto de 0.6 M de kainato en IPSCs autpticas (obtenidas en
neuronas que establecen conexiones sinpticas consigo mismas). Kainato no tuvo ningn efecto
en uno de estos casos, en el cual se comprob la falta de receptores de kainato en la membrana,
pero disminuy la amplitud de las IPSCs en el otro. Para descartar una posible interaccin del
GABA con su receptor se examin la respuesta a 100 M GABA en presencia y en ausencia de
kainato en neuronas de hipocampo en cultivo. La magnitud de las respuestas mediadas por
GABA fue similar en ambas condiciones indicando que la accin de kainato sobre las IPSCs no
se debe a una interaccin del kainato con los receptores de GABA postsinpticos.
Con el inters de extender estos resultados a modelos experimentales ms fisiolgicos,
se pas a realizar el estudio en rodajas de hipocampo de rata, las cuales retienen en gran medida
las conexiones sinpticas originales. Para ello, las interneuronas GABArgicas se estimularon
con un electrodo emplazado en el stratum oriens del rea CA1 y se registraron las corrientes
26

Resultados

Dos clulas en una isla

Post

Pre

B
Control
Bicuculina

100
pA

40 ms

Control

Kainato 0.6 M

Lavado

100
pA
40 ms

Vm=-30 mV

Figura 4. Kainato inhibe las eIPSCs mediadas por GABA en

microcultivos de neuronas de hipocampo. En una microisla se registraron
dos neuronas conectadas entre s (A) y se gener un potencial de accin en
una de ellas para evocar una respuesta sinptica en la otra.
B) Las corrientes postsinpticas fueron sensibles a bicuculina (100 M). Los
registros son el promedio de 10 respuestas.
C) La aplicacin de kainato redujo de forma reversible la transmisin
inhibidora, aumentando el nmero de fallos. Ntese, que durante la perfusin
de kainato, la latencia de las eIPSCs aumenta ligeramente. Resultados
similares se obtuvieron en 4 pares adicionales de clulas.

inhibidoras en clulas piramidales de CA1 usando la tcnica de patch-clamp en su

configuracin de clula completa. Estas clulas fueron identificadas visualmente mediante
microscopa de infrarrojos. Para evitar la activacin de los otros receptores ionotrpicos de
glutamato, se incluyeron en el lquido de perfusin, de manera sistemtica, el antagonista
especfico no competitivo de receptores de AMPA, GYKI 53655 (100 M) y el antagonista de
los receptores de NMDA, D-AP5 (50 M).
Debido a que la concentracin de Cl- en la pipeta coincidi con la del lquido de
perfusin (e.g. igual concentracin de Cl- en el interior y en el exterior celular) la apertura de
los canales de Cl- determin la salida de este ion al exterior celular, observndose como
corrientes entrantes. Las IPSCs as registradas se abolieron completamente en presencia de
bicuculina, el antagonista especfico de los receptores de GABA del tipo A, lo que demostr
que slo son responsables de las mismas receptores de este tipo.

27

Resultados

Los estmulos se aplicaron a una frecuencia de 0.1-0.2 Hz (un estmulo cada 10 cada 5
segundos) y tras la estabilizacin de la amplitud de las eIPSCs se adicion kainato a la cmara
de registro a diferentes concentraciones (0.3-300 M). Como muestra la figura 5A, durante la
perfusin de kainato la amplitud de las eIPSCs decreci, recuperndose la amplitud original
tras la retirada del kainato en la mayora de los casos. Las concentraciones ms efectivas de
kainato fueron 0.3-10 M (fig.5B), concentraciones mayores o menores a stas fueron menos
eficaces para disminuir las eIPSCs. De esta forma, la curva dosis-respuesta present forma de
campana.

Control

Control

Kainato
0.3 M

Lavado

50
pA

Kainato
10 M

Lavado
50
pA

Control

Kainato
200 M

Lavado

Inhibicion de eIPSCs (%)

IC1/2=0.37 M
80 EC50=20 M
60
40

Incluso a bajas concentraciones,100

kainato indujo
una corriente de membrana en direccin
20
pA
1 10 100 1000
entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin0.1
embargo,
este efecto fue variable de
100 ms

(M)de kainato usada.

clula a clula y no se observ una correlacin evidente con laKainato
concentracin
Figura 5. Efecto de kainato sobre la transmisin sinptica inhibidora en la capa CA1
del hipocampo en rodajas de cerebro de rata. A) Las corrientes sinpticas inhibidoras
(IPSCs) fueron registradas en neuronas piramidales de CA1 y provocadas por estimulacin
del stratum oriens. A -60 mV de potencial de membrana, las IPSCs fueron entrantes
debido a la concentracin simtrica de cloro. B) Curva dosis-respuesta para la inhibicin de
las IPSCs inducida por kainato. El grado de inhibicin se calcul como [1(IPSCKA/IPSCControl]100 y se represent grficamente frente a la concentracin de kainato.
Cada punto corresponde a un experimento. La lnea continua representa la curva dosisrespuesta en estado estacionario para los receptores de kainato con parmetros
determinados en clulas cultivadas de hipocampo. sta se calcul de acuerdo con la
expresin:

I=

[KA]
1 +
ni
( IC1 / 2 )
ni

1
+C
(EC50 )na
1 +
[KA]n a

con los siguientes parmetros: EC50= 20 M; IC1/2= 0.37 M; ni= 0.8 and na= 1.2. La
curva resultante fue escalada para ajustar con los valores mximos, aadiendo un 25 % de
offset.
28

Resultados

Incluso a bajas concentraciones, kainato indujo una corriente de membrana en direccin

entrante, indicando que tuvo un efecto depolarizante. Sin embargo, este efecto fue variable de
clula a clula y no se observ una correlacin evidente con la concentracin de kainato usada.
Por ejemplo, a 0.5, 10 y a 200 M, la amplitud fue de 23 3.4, 27 5.4 y de 30 3.5 pA,
respectivamente, presentando un valor medio para las clulas estudiadas de 31.9 3.1 pA
(n=54).
1.2. La modulacin de la transmisin GABArgica por kainato es de origen presinptico.
Para determinar si la modulacin de las respuestas inhibidoras GABArgicas se
produca a travs de un mecanismo de accin pre o postsinptico se usaron varias
aproximaciones experimentales basadas en el anlisis cuntico de la liberacin de
neurotransmisor. Dado que tanto en clulas microcultivadas como en rodajas de hipocampo,
kainato produjo un aumento en el nmero de fallos en la transmisin sinptica, se cuantific la
proporcin de stos representndose frente al grado de inhibicin de las eIPSCs observado,
independientemente de la concentracin usada de kainato. Para este anlisis se seleccionaron
12 de las 54 clulas estudiadas en las rodajas, clulas en las que los fallos en la transmisin
sinptica se pudieron identificar inequvocamente. Como muestra la figura 6B, el nmero de
fallos se correlacion bien con el grado de inhibicin de las eIPSCs inducido por kainato. Ello
sugiere que un cambio en la fiabilidad sinptica podra ser la causa de la reduccin de las
eIPSCs.
Para comprobar si realmente un origen presinptico poda explicar estos cambios, se
calcul el coeficiente de variacin (CV) de las respuestas sinpticas tanto en condiciones
control como en presencia de kainato, calculndose la razn entre ambos valores. Este valor,
fue >1 en 48 de las 54 clulas analizadas (1.82 0.1), lo cual segn est establecido, seala un
cambio en los parmetros de liberacin como la explicacin ms probable para la reduccin de
las eIPSCs. Esta conclusin fue tambin evidente cuando se represent la variacin de la
amplitud media de las eIPSCs (M) frente al cambio en el estadstico 1/CV2 (el inverso del
cuadrado del coeficiente de variacin), que denota la varianza de las eIPSCs (Fig. 6C). Se ha
establecido que un cambio en M no acompaado de un cambio correspondiente en la varianza
denota que slo el contenido cuntico (q) sufre modificacin durante un tratamiento dado,
indicando por tanto, un mecanismo postsinptico (Figura 6C, lnea punteada) como causa de la
modificacin de la transmisin. Por el contrario, un cambio en la amplitud de las respuestas

29

Resultados

acompaado por un cambio en el coeficiente de variacin (i.e. en el estadsitico 1/CV2), sugiere

una variacin en los parmetros de liberacin (n p), lo que indica fuertemente un origen
presinptico como fuente de la variacin (lnea discontnua en la figura 6C; ver revisin de
Thompson y Deuchars, 1995). Como se puede observar en la figura 6C, la reduccin en la
amplitud de las eIPSCs producida por kainato se vi acompaada de un cambio paralelo en
1/CV2, lo que indica un mecanismo de accin presinptico para kainato.

Kainato 0.3 M

Control

C
1.5

r=0.93

85

r=0.7 Postsinptico

1.0

1/CV

Inhibicin de eIPSCs (%)

65

0.5

45

Presinptico
25

25

50

75

100

Aumento de Fallos (%)

0.0

0.5

1.0

1.5

Figura 6. Kainato activ un mecanismo presinptico para inhibir la

transmisin GABArgica. A) Kainato produce una reduccin de la amplitud de las
eIPSCs y un aumento en el nmero de fallos.
B) El aumento en el nmero de fallos se correlacion con el grado de disminucin
de las eIPSCs, independientemente de la concentracin de kainato usada. Slo se
computaron las neuronas en las que los fallos pudieron determinarse de forma
segura (n=12). Las lneas discontinuas corresponden al intervalo de confianza de la
regresin del 95 %.
C) Las amplitudes medias y su coeficiente de variacin (CV) se midieron durante la
aplicacin de kainato y se normalizaron con sus respectivos valores control en cada
clula. La variacin proporcional de la amplitud (M) vs. la variacion proporcional en
1/CV2 en 49 neuronas se represent independientemente de la concentracin usada
de kainato. Ntese, que los datos experimentales siguen la relacin predicha para
una accin presinptica (lnea discontinua) ms que para una accin postsinptica
(lnea punteada). Por claridad, la recta de regresin (r=0.7, p<0.01) no se muestra,
pero fue indistinguible de la diagonal.

Est bien establecido que la frecuencia de las corrientes postsinpticas miniatura

(mIPSCs) puede ser, en determinadas condiciones, un buen indicador de los cambios
producidos en la probabilidad de liberacin por efecto de alguna sustancia. Para determinar con
30

Resultados

una tercera aproximacin si las reducciones de las eIPSCs inducidas por kainato poseen origen
presinptico, se estudiaron las corrientes miniatura (mIPSCs) antes, durante y despus de la
adicin de kainato 3-10 M a la rodaja. Para ello, se incluy tetrodotoxina a una concentracin
de 0.5-1 M para evitar la generacin de potenciales de accin. De las 38 clulas estudiadas, en
29 de ellas se observ un descenso en la frecuencia de las mIPSCs (39.0 3.8 %); en 3 clulas
el kainato no tuvo efecto notable y en las 6 restantes se produjo un aumento en la frecuencia
(17.3 4.0 %). En conjunto la disminucin media fue del 28.4 4.8 % (n=38 clulas de 24
rodajas). Por el contrario, la amplitud de los mIPSCs no sufri variacin significativa. La figura
7 muestra un ejemplo representativo en una neurona piramidal de CA1. Estos datos tambin
son congruentes con un modo de accin presinptico para kainato.

Kainato 3 M

Recuperacin

50
pA
4s

C
1.0
0.8

Control

0.6

Kainato
3 M

0.4
0.2
0.0
0

40

80

Amplitud (pA)

120

Probabilidad Acumulativa

Control

Probabilidad Acumulativa

1.0
0.8

Control

0.6

Kainato
3 M

0.4
0.2
0.0
0

8 10

Intervalo (s)

Figura 7. Efecto de kainato sobre las corrientes inhibidoras GABArgicas postsinpticas

miniatura (mIPSCs). Las respuestas miniatura se registraron en presencia de TTX 0.5-1 M. A)
Registros de las mIPSCs antes, durante y despus de la aplicacin de kainato. B) Distribucin
cumulativa de amplitud de las mIPSCs antes y durante la aplicacin de kainato. Como se puede
observar, no hay ningn cambio en la amplitud de las respuestas durante la aplicacin de kainato. C)
Distribucin cumulativa de intervalos entre miniaturas antes y durante la aplicacin de kainato 3 M.
Se puede observar que el intervalo de tiempo que pasa entre la ocurrencia de dos miniaturas aumenta
cuando se aplica kainato a las rodajas.

1.3. El efecto de kainato no se debe a la activacin de los receptores metabotrpicos de

glutamato.
Con el fin de descartar que un aumento en la concentracin extracelular de glutamato
inducido por la adicin de kainato a la rodaja, y la subsecuente activacin de los receptores de
glutamato metabotrpicos, fuera el origen de las acciones observadas, se ensay el efecto de
kainato en presencia de inhibidores de los receptores de glutamato metabotrpicos. Esta

31

Resultados

posibilidad se descart dado que en presencia de MPPG y MCPG (1.5 mM cada uno de ellos),
los efectos de kainato permanecieron inalterados.
1.4. CNQX antagoniza el efecto de kainato de forma dosis-dependiente.
Aunque CNQX est considerado como el antagonista prototpico de los receptores de
AMPA, tambin bloquea a los receptores de kainato. Dado que en nuestras condiciones
experimentales los receptores de AMPA se encuentran bloqueados con GYKI 53655, a todos
los efectos se puede usar CNQX como antagonista de los receptores de kainato. Como se puede
observar en la figura 8A, cuando se aplic kainato 10 M en presencia de CNQX, ste fue
menos efectivo en reducir la amplitud de las eIPSCs, efecto que fue dosis-dependiente. Estos
resultados sugirieron que la reduccin de la amplitud de las eIPSCs por kainato se debi,

Inhibicin de las eIPSCs (%)

100
80
60

40

20
0
KA
10 M

**

Reduccin de frec. mIPSCs (%)

por kainato 3 M

efectivamente, a la activacin de receptores de glutamato de tipo kainato.

+
CNQX
25 M 50 M 100 M

60
45
30
15
0
Control

Cctel

Figura 8. Propiedades farmacolgicas de la accin de kainato sobre las IPSCs.

A) La accin inhibidora de kainato fue antagonizada de forma dosis-dependiente por
CNQX. (* p 0.05; ** p 0.01, test t de Student). Las barras representan la media
EEM de 6 (control), 3 (CNQX 25 y 100 M) 2 (CNQX 50 M) experimentos. B)
Kainato fue igualmente efectivo en reducir la frecuencia de las mIPSCs an en
presencia de un cctel de antagonistas de otros receptores. Este consisti en: MCPG
(1.5 mM); MPPG (1.5 mM), Naloxona (100 M), Atropina (50 M), 2-OH-Saclofn
(100 M), DPCPX (0.1 M), D-AP5 (50 M) y GYKI 53655 (100 M).

1.5. Kainato no acta sobre otro tipo de receptores descritos que regulan la liberacin de
neurotransmisor.
Para descartar la posibilidad de que un mensajero indeterminado, liberado tras la
depolarizacin neuronal y/o glial fuera la causa del efecto descrito, al activar algn receptor
32

Resultados

presinptico, kainato se aplic en presencia de un cctel de antagonistas compuesto por: MCPG

y MPPG (1.5 mM cada uno), naloxona (100 M), atropina (50 M), hidroxisaclofn (50-150
M) y DPCPX (0.1 M). Sin embargo, el efecto de kainato sobre las mIPSCs estuvo presente
an en presencia de este cctel (Fig. 8B), con lo que se pueden descartar los receptores
metabotrpicos de glutamato, de opiceos, muscarnicos, de GABAB y A1 de adenosina como
mediadores de estos efectos. La somatostatina, aplicada al bao, no tuvo efecto alguno sobre
las eIPSCs, con lo cual tambin se puede descartar que tras la adicin de kainato a la rodaja
sta sea liberada y deprima las corrientes inhibidoras GABArgicas.
1.6. El agonista endgeno de los receptores de kainato, glutamato, ejerce el mismo efecto
que kainato sobre las eIPSCs.
Para verificar si el agonista endgeno de los receptores de kainato, glutamato, era capaz
de actuar sobre los receptores de kainato para regular la liberacin de GABA, este agonista se
aplic a las rodajas en presencia de una mezcla de bloqueantes compuesto por MCPG y MPPG
(1.5 mM cada uno), GYKI 53655 (100 M) y D-AP5 (200 M) para prevenir la activacin de
cualquier tipo de receptor de glutamato excepto la de los de kainato.
Al igual que el kainato, el glutamato redujo la amplitud de las corrientes inhibidoras
presentando una curva dosis-respuesta en forma de campana (Figura 9). Los datos
experimentales se ajustaron bien a la curva dosis-respuesta para glutamato calculada en
condiciones de estado estacionario a partir de los parmetros de activacin e inactivacin
obtenidos en neuronas en cultivo.
Al igual que ocurri cuando se aplic kainato, el coeficiente de variacin (medido como
1/CV2) fluctu de manera paralela a la variacin de la media (M) entre las condiciones test y
control. Ello sugiri de nuevo una localizacin presinptica para los receptores que median
este efecto. Igualmente en presencia de glutamato, la frecuencia de las mIPSCs disminuy
ligera pero significativamente (14.0 4.0 %, n=5, Glutamato 30 M), sin que se produjera
cambio alguno en la amplitud de las mismos. El efecto de glutamato sobre las eIPSCs (42.2
6.1% de reduccin, glutamato 10 M) fue antagonizado por CNQX (100 M; Fig. 10B) ya que
en presencia de este antagonista, glutamato produjo una depresin de la amplitud de las eIPSCs
de un 5.9 12.3 % (n=4).

33

Resultados

A
Control

Glutamato
3 M

B
Recuper.
80

Inhibicin eIPSCs (%)

200
pA
100 M
200
pA
1 mM

EC50 =300 M
IC1/2= 2.5 M

60
40
20
0
0.1

100
pA

100 ms

10 100 1000

Glutamato (M)

eIPSCs
Glu
Control

50
pA
100 ms

+ Cctel

Glu
Control

20
pA
100 ms

Reduccion IPSCs (%)

Figura 9. Efecto de glutamato sobre las eIPSCs. La aplicacin de glutamato en las

condiciones de estado estacionario del receptor, reduce la transmisin inhibidora en
neuronas de CA1 de acuerdo con la ventana predicha segn las propiedades de
activacin e inactivacin de los receptores de kainato. A) Corrientes sinpticas
inhibidoras (evocadas al estimular en el stratum oriens del hipocampo) registradas en
rodajas en neuronas piramidales de CA1 antes, durante y despus de la aplicacin de
glutamato. B) Curva dosis-respuesta. Los puntos rellenos corresponden a los valores
promedio EEM, mientras que los crculos no rellenos corresponden a valores
individuales. La lnea continua representa la curva dosis-respuesta terica para las
condiciones de equilibrio del receptor, calculada con los parmetros que se indican.

60

40

20

Glu
+
CNQX
10 M Cctel 100 M

Figura 10. Propiedades farmacolgicas del efecto de glutamato sobre las eIPSCs.
A), B) La accin depresiva de glutamato (10 M) sobre las eIPSCs se mantuvo en
presencia de un cctel de antagonistas de otros receptores (ver figura 8) y fue
antagonizada por CNQX.

34

Resultados

Finalmente, el efecto de glutamato sobre la amplitud de las eIPSCs persisti en

presencia del cctel anteriormente descrito (Fig. 10) (MCPG, MPPG, naloxona, atropina, 2-ohsaclofn, DPCPX, APV y GYKI 53655).
1.7. Kainato deprime la transmisin GABArgica en la regin CA1 del hipocampo in vivo.
De los resultados anteriores, obtenidos in vitro, es evidente que los receptores de
kainato regulan la liberacin de GABA. Estudios realizados en colaboracin con el laboratorio
del Dr. Herreras, del Departamento de Investigacin del Hospital Ramn y Cajal, indicaron
que este resultado tambin era el observado en experimentos in vivo. En este sentido, se
hicieron experimentos en el hipocampo de ratas anestesiadas, en las que se implantaron cnulas
de dilisis.
Se registraron potenciales de campo extracelulares en la capa piramidal de CA1,
evocados por estmulos elctricos en las colaterales de Schaffer (Figura 11A). En estos
registros, la onda negativa representa los potenciales de accin sincrnicos de una gran
poblacin de neuronas (espiga poblacional). Se ha demostrado que la amplitud de la espiga
poblacional es proporcional al nmero de clulas que dispara al mismo tiempo. La estimulacin
por pares de pulsos sirve para medir la efectividad de la inhibicin GABArgica mediante la
comparacin de la respuesta al segundo pulso (test) con la respuesta al primero (condicionada).
Estos 2 pulsos fueron separados 40 ms, y las respuestas de campo se promediaron cada 5
ensayos. En este intervalo, predomina la activacin inhibidora mediada por receptores de tipo
GABAA. Este experimento se repiti en 5 animales con resultados similares (Fig. 11). La
efectividad de la inhibicin fue drsticamente reducida cuando se introdujo kainato 3 M en la
cnula de dilisis. Se eligi una concentracin baja de kainato para evitar la activacin de los
receptores de AMPA (se estima que la concentracin que se alcanza extracelularmente es
aproximadamente 1/10 de la concentracin perfundida, Herreras et al., 1994). Incluso a esta
baja concentracin de kainato, una espiga poblacional, ausente en los controles, apareci
claramente en respuesta al pulso test, aumentando con el tiempo de perfusin. Este fenmeno
fue reversible tras retirar el kainato del lquido de perfusin (Figuras 11A y 11B). Por el
contrario, no se observ efecto alguno sobre la amplitud de la espiga inducida por la respuesta
condicionada, lo cual fue indicativo de que a estas concentraciones, kainato no produjo una
depolarizacin significativa. Adems, en dos animales se hicieron registros sobre la capa
sinptica (stratum radiatum), no observndose un efecto significativo sobre los potenciales
postsinpticos de campo excitadores (EPSPs). De acuerdo con su accin sobre la inhibicin
sinptica, durante la exposicin a kainato, en el electroencefalograma hipocmpico apareci un
35

Resultados

patrn de actividad similar al de los estados epilpticos (Fig. 11C), siendo evidentes la
presencia de espigas epilpticas en la actividad electroencefalogrfica (Fig. 11D inferior). Es
conocido que este tipo de actividad aparece en vivo y/o en rodajas despus de exponer el tejido

40 ms

Ringer

Kainato
3 M

t=1'
t=3'
t=8'
t=18'

Espiga Poblacional (mV)

a sustancias convulsantes que bloquean la inhibicin mediada por GABA.

12

Cond.

8
4
Test

Kainato 3 M

25

50

75

100

125

Tiempo de perfusin (min)

t=60'

2
mV

5
mV

1s
2
mV

20 ms

Figura 11. Efecto de bajas concentraciones de kainato sobre la inhibicin

GABArgica en experimentos llevados a cabo in vivo en el hipocampo. A) Para testar la
inhibicin recurrente, se registraron potenciales de campo en la capa piramidal de CA1
evocados por pares de pulsos en la ruta de las colaterales de Schaffer. Los estmulos fueron
separados 40 ms. Ntese la ausencia de espiga poblacional (la seal negativa puntiaguda)
en respuesta al segundo estmulo (test) en condiciones control. Esta espiga poblacional se
desarrolla progresivamente tras la inclusin de kainato en el lugar de perfusin. A tiempos
de exposicin prolongados aparecieron dobles espigas en el potencial de campo (inferior),
lo cual es una indicacin de actividad epilptica.
B) Evolucin de la amplitud de las espigas poblacionales evocadas por el primer
(condicionada, Cond.) y el segundo (Test) estmulo. La respuesta test fue aumentada de
forma reversible mientras que la primera espiga se mantuvo constante a lo largo del
experimento.
C) Kainato indujo actividad epilptica en el hipocampo, caracterizada por la presencia de
espigas interictales. El recuadro representa un registro expandido de 1 segundo.

36

Resultados

2. La modulacin de la liberacin de GABA por los receptores de kainato

involucra una funcin metabotrpica.
2.1. La activacin de una protena G sensible a toxina pertsica y de protena kinasa C
son necesarias para que se produzca la disminucin de liberacin de GABA mediada por
la activacin de receptores de kainato.
Una vez determinado que la activacin de los receptores de kainato produce una
depresin de la transmisin inhibidora GABArgica y que estos receptores deben estar
localizados en los terminales presinpticos de los contactos inhibidores, se intent determinar el
mecanismo mediante el cual se produce este efecto de disminuir la liberacin del GABA.
Para determinar si los efectos de kainato sobre la liberacin de GABA involucraban
la activacin de una protena G, se analiz, en primer lugar, la capacidad de este agonista para
deprimir las eIPSCs mediadas por GABA en rodajas que previamente haban sido incubadas
con toxina pertsica (PTx) (5 g/ml, 3-4 horas a 37 C). Al igual que en anteriores
experimentos, la activacin de los receptores de AMPA por kainato se evit aadiendo GYKI
53655 (100 M) en todos las experimentos y la activacin de los receptores de NMDA se evit
incluyendo D-AP5 (50 M). En las rodajas tratadas con PTx, las eIPSCs presentaron cinticas
de activacin y de deactivacin similares a las observadas en las rodajas sin tratar. En estas
rodajas, kainato fue incapaz de alterar la amplitud de las respuestas inhibidoras (Figura 12).
Kainato (3 M) produjo una reduccin de la amplitud de las eIPSCs del 9.4 5.3 % (n=6
neuronas de 5 rodajas diferentes) en rodajas que previamente fueron tratadas con PTx. Por el
contrario, el tratamiento similar con toxina colrica (20 g/ml) tuvo un efecto mnimo en la
accin de kainato sobre la amplitud de las eIPSCs (50.6 3.8 % de reduccin, n=5 rodajas).
Estos resultados indican que una protena G sensible a toxina pertsica es necesaria para que
tengan lugar los efectos depresores de kainato sobre las eIPSCs en el hipocampo.
Las protenas G pueden interaccionar de forma directa con dominios estructurales de
canales de calcio voltaje-dependientes (De Waard et al., 1997; Zamponi et al., 1997), siendo
ste uno de los mecanismos por el que actan algunos receptores acoplados a protenas G (e.g.
Dolphin et al., 1986; Boland y Bean, 1993). Para determinar si un mensajero soluble estaba
implicado o no en el efecto de kainato, se determinaron los efectos de kainato sobre las eIPSCs
tras incubar las rodajas con estaurosporina, un inhibidor de protenas kinasas de amplio

37

Resultados

espectro. A una concentracin de 500 nM, estaurosporina aboli completamente la accin de

kainato sobre las eIPSCs (2.0 13.9 %, 3 M de kainato; Figura 13), indicando que la
activacin de una protena kinasa, ms que una modulacin directa de los canales de calcio por
una protena G, era responsable de la accin observada sobre la transmisin GABArgica.

Kainato 3 M

Control

Lavado

100
pA

C
Reduccin de las eIPSCs(%)

Amplitud de las eIPSCs

B
Control
PTx 5 g/ml

1.5

1.0

0.5

Control

0.0
0

50

Kainato 3 M

100

150

Lavado

50 ms

60

40

20

**

0
Control

200

Tiempo (s)

PTx
ChTx
5 g/ml 20 g/ml

Figura 12. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por receptores de

kainato involucra una protena G sensible a toxina pertsica. A) Inhibicin de las
IPSCs por kainato. Las respuestas fueron registradas de neuronas de CA1 cuyo
potencial de membrana fue mantenido a -60 mV y fueron evocadas por estimulacin
del stratum oriens. Los registros son el promedio de 5 respuestas consecutivas. B)
Curso temporal de la amplitud de las eIPSCs antes, durante y depus de aplicar
kainato en rodajas sin tratar (crculos negros) y en rodajas tratadas con toxina
pertsica (crculos abiertos). Los valores son la media+EEM de 5 respuestas
consecutivas. C) Promedio del efecto de kainato 3 M sobre la amplitud de las
eIPSCs en rodajas normales (control) y en rodajas tratadas con toxinas pertsica (PTx)
o colrica (ChTx). Las barras representan la media+EEM de resultados obtenidos de
20, 6 (5 rodajas) y 5 (5 rodajas) neuronas, respectivamente.

Para determinar qu kinasa estaba involucrada en esta accin, se realizaron experimentos

farmacolgicos con inhibidores especficos. La inhibicin de la protena kinasa dependiente de
cAMP (PKA) por H-89, un inhibidor especfico, al cual la membrana plasmtica es permeable,
aplicado a 500 nM ( 10 veces su IC50) no modific el efecto de kainato sobre las eIPSCs (63.1

8.3 %, n=5 neuronas de 3 rodajas; Figura 13). Por el contrario, la calfostina C, un inhibidor

38

Resultados

altamente especfico de protena kinasa C (PKC), previno de forma dosis-dependiente la accin

de kainato (Fig. 13B), demostrando que la activacin de la PKC est involucrada en la
depresin de la liberacin de GABA inducida por kainato. De acuerdo con este resultado, la
activacin de PKC con steres de forbol (PDBu, 0.5 M) ocluy totalmente la accin
inhibidora de kainato 3 M (Figura 14). La incubacin de las rodajas con Sp-cAMPS (50 M),
un anlogo permeante de cAMP, activador de PKA, no afect a la reduccin de la amplitud de
las eIPSCs inducida por kainato (Figura 14B), siendo sta reducida en un 13 % (de un 63.2 % a
un 50.4 11.1 % en presencia de Sp-cAMPS, n=5 clulas de 4 rodajas). Igualmente, el bloqueo
de fosfolipasa C (PLC) tambin atenu en gran medida el efecto de kainato sobre la liberacin
de GABA (Fig. 14B). Incubando las rodajas con U-73122 (10 M), inhibidor de la PLC, se
redujo de forma significativa la atenuacin de las eIPSCs inducida por kainato (21.2 8.6 % de
inhibicin, n=7 clulas de 4 rodajas; cf. 63.2 % en el control), un efecto que fue especfico ya
que el anlogo inactivo, U-73343, no ejerci accin alguna sobre la inhibicin inducida por
kainato (52.0 8.5 % de inhibicin, n=4 clulas de 4 rodajas; Figura 14B).

Amplitud de las eIPSCs

2.0

Control
Estaurosp. 500 nM

1.5
1.0
0.5
C

0.0
0

Kainato 3 M

100

200

Lavado

300

400

Reduccin de las eIPSCs (%)

Tiempo (s)

60
40

**
20
0

**

**

.
C
C
sp
9
u ro M H -8 M lfo s. M lf os.
a
t
n
a

M
a
s

0
E 50
0 .5 C 0 .5 C 1

Figura 13. La modulacin de las amplitudes de las eIPSCs por kainato involucra la activacin
de una protena kinasa C. A) Experimento representativo en el cual la accin de kainato sobre la
amplitud de las eIPSCs se evalu en ausencia (crculos negros) y en presencia de estaurosporina
(crculos abiertos). Los valores son la media+EEM de 5 respuestas consecutivas. B) Efecto de
inhibidores especficos a los cuales la membrana es permeable, de protenas kinasas sobre la accin
de kainato. La inhibicin de las PKC por estaurosporina y por calfostina C previno el efecto de
kainato (3 M). La inhibicin de la PKA por H-89 no tuvo ningn efecto. Las barras representan la
media+EEM de 4, 5, 4 y 6 neuronas respectivamente. La barra horizontal rayada representa el
intervalo de confianza para el decremento en amplitud de las eIPSCs inducido por kainato (3 M) en
rodajas sin tratar. **p<0.01, test t de Student.

39

Resultados

Amplitud de las eIPSCs

1.5

Reduccin de las eIPSCs (%)

A
Control
PDBu 0.5 M

1.0

0.5

0.0

Control Kainato 3 M Lavado

50

150

250

350

60
40

*
20
0

450

Time (s)

**
S
u
3
2
34
DB
MP
12
73 M -73 M -cA M P 5 M
U
U 0
0.
Sp 0
1
10
5

Figura 14. La estimulacin de la PKC ocluy la accin de kainato. A) Experimento

representativo mostrando que kainato no afecta la amplitud de las eIPSCs en presencia del
ster de forbol PDBu. Los valores son la media+EEM de 5 respuestas consecutivas. B) La
inhibicin de fosfolipasa C, por U73122, previno el decremento en amplitud inducido por
kainato. El anlogo inactivo, U73343, no tuvo efecto. La activacin de PKC (con PDBu),
pero no la de PKA (con Sp-cAMPS) ocluy la accin depresiva de kainato. Las barras son
la media+EEM de datos obtenidos de 7, 4, 5, y 4 rodajas, respectivamente. La barra
horizontal rayada representa el intervalo de confianza para el decremento de la amplitud de
las eIPSCs inducido por kainato (3 M) en rodajas sin tratar. *p<0.05; **p<0.01, test t de
Student.

Estos resultados indicaron que los receptores de kainato activan una protena G
acoplada a fosfolipasa C (PLC). La activacin de PLC inducira la produccin de diacilglicerol,
el cual es sabido que es un potente activador de PKC.
2.2. Kainato activa una poblacin particular de PKC.
La activacin de la PKC produce un aumento de la liberacin de neurotransmisor en
sinapsis tanto excitadoras (e.g. Malenka et al., 1986) como inhibidoras (e.g., Copogna et al.,
1995). Sin embargo, nuestros resultados, muestran que kainato reduce la probabilidad de
liberacin de GABA a travs de un fenmeno mediado por PKC. La explicacin ms sencilla
consistente con estos resultados, es que existen dos poblaciones separadas de PKC y que la
activacin de cada una produce efectos diferentes. Para determinar si ste era o no el caso, se
disearon experimentos de oclusin con el ster de forbol PDBu. Tras perfundir la rodaja con
PDBu (0.5M), kainato fue totalmente inefectivo en decrecer la amplitud de las eIPSCs (Figura
14A); esto es, el ster de forbol ocluy completamente la accin de kainato. Con el fin de evitar
la modificacin de los receptores de GABA por los steres de forbol (e.g. Vaello et al., 1994),
40

Resultados

se midi la frecuencia de miniaturas (mIPSCs), registrados en presencia de TTX (0.5 M) (Fig.

15 ). PDBu triplic la frecuencia de mIPSCs (311.9 68.4 % , n=6 clulas). Kainato produjo
un aumento adicional de la frecuencia de mIPSCs (66.0 21.2 %). El efecto de PDBu fue
prevenido con la inclusin de 1 M de calfostina C (19.0 19.0 de aumento, n=4), lo que
demuestra que la accin general de la estimulacin de PKC ocluye totalmente la accin de
kainato. Cuando el experimento se realiz a la inversa, incluyendo PDBu una vez que kainato
hubo realizado su efecto, la inhibicin fue totalmente revertida, aumentando la frecuencia de
minis hasta 166.7 39.6 % del valor control (n=5). Por tanto, kainato fue incapaz de ocluir la
accin del ster de forbol. Estos resultados indicaban, que los receptores de kainato tienen
acceso a una poblacin limitada y especfica de PKC, cuya activacin no compromete a la
poblacin total.

Control
Kainato 3 M
Kainato 3 M + PDBu 0.5 M

75

75

mIPSCs (#/30 s)

mIPSCs (#/30 s)

20
1 s pA

50

25
Kainato
PDBu 0.5 M

0
0

50

25
PDBu
Kainato 3 M

8 10 12 14

Tiempo (min)

8 10 12 14

Tiempo (min)

Figura 15. PDBu ocluy la accin inhibidora de kainato pero kainato no ocluy la accin
estimuladora de PDBu. A) Registros de las corrientes inhibidoras miniatura (mIPSCs),
registradas en presencia de TTX (0.5 M) antes (superior), durante la aplicacin de kainato
(intermedio) y durante la aplicacin de kainato ms PDBu (inferior). B) Un experimento
representativo mostrando el efecto de PDBu y de la subsecuente inclusin de kainato (3 M)
sobre la frecuencia de mIPSC. C) En una neurona diferente, cuando el efecto de kainato sobre
las mIPSC alcanz un estado de equilibrio se aadi PDBu. Las lneas punteadas indican en
cada caso el valor medio de la frecuencia de mIPSC en esta clula en particular. Ms que
decrecer la frecuencia de minis, kainato la aumenta en presencia del ster de forbol. Resultados
similares se observaron en 5 (B) y 6 (C) neuronas.

41

Resultados

2.3. La accin de kainato es independiente de la actividad del receptor como canal inico.
Para determinar si la accin metabotrpica de kainato era dependiente o independiente de
la actividad del receptor de kainato como canal, se examin si el efecto inhibidor de kainato
cambiaba cuando se modificaba la concentracin extracelular de sodio. Es conocido que la
mayor parte de la carga a travs del canal es acarreada por este ion en la mayora de los
receptores ionotrpicos de glutamato. El sodio fue sustituido por concentraciones
equimoleculares de N-metil-D-glucamina. La reduccin de hasta el 60% del sodio extracelular
no impidi la generacin de potenciales de accin, y por tanto, se pudo estudiar la actividad
sinptica evocada. En estas circunstancias, kainato fue igualmente efectivo en reducir la
amplitud de las eIPSCs (Fig. 16C). Menores concentraciones de sodio (<60 mM) no
permitieron la generacin de potenciales de accin. A concentraciones de Na+ menores (37.5
mM; 25% de lo normal, en presencia de TTX), kainato fue igualmente efectivo en reducir la
frecuencia de mIPSCs (Figura 16A). Este experimento se repiti eliminando completamente el
sodio de la solucin extracelular con un resultado idntico (Fig. 16B).
Estos datos indican que la inhibicin de la liberacin de GABA por kainato es
esencialmente independiente de la funcin como canal del receptor.

A Na extracelular = 37.5 mM B 60 IPSCs miniaturas C 80

Kainato 3 M
30
pA

Lavado

2s

40

20

0
Na+
Na+
Na+
150 mM 37.5 mM 0 mM

Reduccin de amplitud (%)

Control

Reduccin frecuencia (%)

IPSCs evocadas

60
40
20
0

Na+
150 mM

Na+
60 mM

Figura 16. La regulacin de la liberacin de GABA por kainato es independiente de la

actividad del receptor como canal inico. A) Registros mostrando el efecto de kainato
sobre la frecuencia de mIPSCs en condiciones de bajo Na+ extracelular (25% del total). La
reduccin del sodio extracelular no afect al grado de reduccin en la frecuencia de mIPSC
inducido por kainato (B) ni al grado de reduccin de las respuestas evocadas (eIPSC) (C).
Las barras son la media+EEM de los valores obtenidos de 12, 5 y 4 neuronas,
respectivamente (B) y 20 y 3, respectivamente (C).

42

Resultados

2.4. AMPA no activa una cascada similar.

El antagonista competitivo de los receptores de tipo AMPA/kainato, CNQX,
previene de forma dosis-dependiente la accin inhibidora de kainato sobre las eIPSCs (ver
Figura 8A). En los experimentos descritos, la activacin de los receptores de AMPA se previno
aadiendo 100 M de GYKI 53655 a la solucin de perfusin. Sin embargo, como GYKI es un
antagonista no competitivo de los receptores de AMPA (Paternain et al., 1995), no impide la
unin del agonista al receptor. Tras la demostracin de que la subunidad del receptor de AMPA
GluR1 poda producir la activacin de una protena G de forma independiente a su actividad
como canal (Wang et al., 1997), todava podra ser posible que GYKI 53655 impidiera la
apertura del canal tras la unin del agonista pero no la subsecuente activacin de la protena G.
Para descartar la posibilidad de que kainato estuviese produciendo su actividad moduladora por
su accin como agonista de los receptores de AMPA, se determin si la unin del agonista
prototpico de los receptores de AMPA, era capaz de producir acciones similares sobre la
amplitud de las eIPSCs. Para ello, se incluy GYKI 53655 (100 M) y ciclotiazida (50 M)
(una sustancia que elimina la desensibilizacin de los receptores de AMPA). En estas
circunstancias, 50 M de AMPA fue completamente inefectivo en reducir la amplitud de las
eIPSCs (101.2 4.7 % del valor control, n=4), pudindose descartar que los receptores de
AMPA estn involucrados en la depresin de la transmisin GABArgica mediada por kainato.
2.5. La activacin de los receptores metabotrpicos de glutamato de tipo I no ocluye la
accin de kainato.
Es sabido que los receptores metabotrpicos de glutamato de tipo I estn acoplados a una
protena G, la cual es capaz de activar PLC y producir IP3 y diacilglicerol (ver Conn y Pin,
1997). Con el fin de comprobar si la activacin de esta ruta en los terminales inhibidores poda
ocluir la accin de kainato, se estudiaron los efectos de kainato en presencia de DHPG, un
agonista especfico de los receptores metabotrpicos del grupo I (Schoepp et al., 1994). DHPG
(100 M) produjo un aumento de la actividad espontnea as como un cambio en la corriente
de fijacin. Transcurridos 5 minutos, la actividad espontnea ces y la corriente de fijacin
volvi a sus valores originales, aunque la amplitud de la respuesta inhibidora evocada
permaceci aumentada un 29.6 13.3 %, n=4. En esta situacin, la adicin de kainato (3M)
produjo un decremento de las eIPSCs de igual magnitud que la de los experimentos control
(Fig.17), producindose una reduccin del 67.5 4.7 % (n=4; cf. 63.2 % en el control).

43

Resultados

Estos resultados demuestran que o bien no existen receptores mGluRs de tipo I en los
terminales inhibidores GABArgicos del hipocampo estudiados o que esta ruta de sealizacin
no converge con la activada por los receptores de kainato.

Inhibicin eIPSCs (%)

por KA 3 M

80

Figura 17. La activacin de los

receptores metabotrpicos de tipo I no
ocluye la accin de kainato. En
presencia de DHPG 100 M (un agonista
de los receptores metabotrpicos de
glutamato de tipo I) kainato fue capaz de
producir una depresin de las eIPSCs de
igual cuanta que en condiciones control.
Las barras representan la media EEM de
26 neuronas en el caso control y de 5
neuronas en presencia de DHPG.

60
40
20
0
Control

+ DHPG
100 M

2.6. La activacin de los receptores de kainato modula la seal de calcio.

Es conocido que la activacin de la PKC facilita la liberacin de neurotransmisor
porque, entre otras acciones, potencia las corrientes de Ca2+ al fosforilar los canales
responsables de esta corriente. Para que la activacin de la PKC produzca una reduccin de la
liberacin de neurotransmisor, como la encontrada en el presente trabajo para los receptores de
kainato, sera necesario que la PKC interaccionara con un canal de potasio, facilitando su
actividad, o con un canal de calcio, inhibindolo. Para comprobar la existencia de alguna
relacin entre los receptores de kainato y las corrientes de potasio o de calcio, se redujeron en
primer lugar las corrientes de potasio aadiendo tetraetilamonio (TEA, 2.5 mM) a la rodaja. El
bloqueo de los canales de potasio aument la liberacin de neurotransmisor, observndose un
aumento de la amplitud de las eIPSCs as como un enlentecimiento en la desactivacin de las
respuestas (Figura 18A). Sin embargo, el bloqueo de los canales de potasio no ocluy el efecto
de kainato 3 M (54.1 4.6 % de inhibicin con 2.5 mM de TEA, n=8 neuronas de 6 rodajas;
Fig 18). Un experimento similar se llev a cabo en presencia de bajo (0.5 mM) y alto (10 mM)
calcio. El aumento de la concentracin extracelular de calcio produjo un incremento de la
amplitud de las eIPSCs, indicando que, al igual que cuando se bloquearon los canales de K+, la
cantidad de calcio que ingresaba en el terminal estaba aumentada. Sin embargo, en este caso la
forma de la respuesta no se alter (Fig. 19A). En presencia de Ca2+ 10 mM, kainato redujo la
amplitud de las eIPSCs slo un 21.0 4.3 % (n=4), mientras que a calcio 0.5 mM, kainato fue
44

Resultados

ms efectivo en deprimir la transmisin GABArgica (70.6 12.3 %, n=4) que en las

condiciones control (i.e 1.8 mM calcio).

Control

TEA 2.5 mM

Normalizadas
C
T

100
pA

1.5

Control
TEA

1.0

0.5

0.0

100 ms

C
50

Kainato
150

Lavado

250

350

Reduccin de eIPSCs (%)

Amplitud de las eIPSCs

60
40
20
0

Control

450

Tiempo (s)

TEA
2.5 mM

Figura 18. Efecto del bloqueo de los canales de K + sobre la accin

inhibidora de kainato. A) Tetraetilamonio (TEA) aument la amplitud de las
eIPSC y prolong su curso temporal de decaimiento. Los registros son la
media de 5 respuestas consecutivas, las cules estn normalizadas en el panel
de la derecha. B) Un experimento representativo mostrando que el bloqueo
de los canales de K+ no tiene efecto sobre la accin inhibidora de kainato. C)
Promedio de todos los experimentos. Las barras representan la media EEM
de 5 (control) y 8 (TEA) neuronas.

Estos experimentos indican que la estimulacin de la PKC tras la activacin de los

receptores de kainato resulta en la fosforilacin de elementos que estn involucrados en la
liberacin de neurotransmisor inducida por calcio.

45

Resultados

Ca2+
2 mM

Ca2+
10 mM

Normalizadas
2
10
150
pA

C
2+

1.5

Reduccin de eIPSCs(%)

Amplitud de las eIPSCs

B
Ca 0.5 mM
2+
Ca 10 mM

1.0

0.5

0.0

50 ms

C
50

Kainato
150

250

Lavado
350

450

Tiempo (s)

80
60
40

**

20
0

Control Ca2+ Ca2+

0.5 mM 10 mM

Figura 19. Un aumento de la concentracin extracelular de Ca2+ atenu la

reduccin de las eIPSC inducida por kainato. A) Con el Ca2+ extracelular elevado se
aument la amplitud de las eIPSCs con un efecto mnimo sobre su curso temporal.
Ambos registros se representan en el panel derecho normalizados y sobreimpuestos. B)
Experimento representativo mostrando la falta de efecto de kainato (3 M) a altas pero
no a bajas concentraciones de Ca2+. C) Comparacin de las reducciones de amplitud de
las eIPSCs obtenidas a concentraciones normales (1.8 mM), bajas (0.5 mM) y altas (10
mM) de Ca2+ extracelular. Las barras son la media EEM de 20, 4 y 4 neuronas
respectivamente. **p<0.01, test t de Student.

3. Las interneuronas de hipocampo presentan dos poblaciones de receptores

de kainato con mecanismos de sealizacin diferentes.
3.1. El aumento de actividad espontnea y el descenso de amplitud de las respuestas
evocadas son efectos producidos por la activacin de receptores de kainato diferentes.
En nuestras condiciones experimentales, la aplicacin de kainato fue generalmente
acompaada por un aumento en la frecuencia de respuestas espontneas (sIPSCs), debido al
hecho de que kainato produjo la depolarizacin de las interneuronas (Fig. 20).

46

Resultados

Kainato 3 M

Control
Interneurona del S.O.

-65 mV

Recuperacin

2s

30
mV

Clula Piramidal

1s

40
pA

Figura 20. Kainato depolariza las interneuronas y aumenta la frecuencia de las sIPSCs en
las neuronas piramidales. A) Efecto depolarizante de kainato 3 M en presencia de GYKI
53655 100 M y D-APV 50 M sobre las interneuronas del stratum oriens. B) Simultneamente,
se observa un aumento en la frecuencia de las IPSCs espontneas en la neuronas piramidales de
CA1. Estos efectos revierten tras el lavado de kainato.

Para clarificar si la depresin de la transmisin inhibidora GABArgica evocada y

el aumento de actividad espontnea observado son fenmenos relacionados de forma directa o
no, se buscaron agonistas de los receptores de kainato que permitieran discriminar entre ambos
efectos.
Para ello, se determin el efecto de diferentes agonistas de los receptores de kainato
sobre la excitabilidad de las interneuronas del stratum oriens as como sobre las eIPSCs
registradas en neuronas piramidales de CA1, en condiciones de bloqueo de los receptores de
NMDA y AMPA. En algunos experimentos, se us el nuevo compuesto SYM 2206, que a 100

M muestra especifidad como antagonista de los receptores de AMPA sobre los receptores de
kainato. En los experimentos con glutamato, se evit la activacin de los receptores
metabotrpicos de glutamato incluyendo MPPG y MCPG (1-1.5 mM cada uno). En estas
condiciones, kainato (3 M) deprimi la amplitud de las eIPSCs (63.2 2.4 %; n=26). La
accin de kainato fue mimetizada por ATPA, un derivado de AMPA descrito como agonista
especfico de los receptores de kainato formados por subunidades GluR5 (Clarke et al.1997). A
10 M, ATPA caus una reduccin de la amplitud de las eIPSCs del 58.5 6.2 % (n=8). La
actividad de ATPA fue parcialmente antagonizada por CNQX. Por el contrario, S-AMPA fue

47

Resultados

inefectivo en reducir la amplitud de las eIPSCs a concentraciones suficientes para activar los
receptores de AMPA (i.e. 50 M; -0.1 6.4 %, n=9), siendo altamente efectivo a
concentraciones suficientemente altas para activar los receptores de kainato (92.5 3.5 % de
reduccin a 500 M; n=4).
Todos los agonistas anteriormente descritos tambin aumentaron la frecuencia de
sIPSCs en las clulas piramidales. Sin embargo, el agonista endgeno de estos receptores,
glutamato, cuando se aplic a bajas concentraciones (3-10 M) fue capaz de inhibir la eIPSCs
de forma significativa (42.2 6.1 %, n=11 p<0.01, Fig. 21), una accin que, tambin fue
prevenida por CNQX (5.9 12.3 %, n=4). Sin embargo, a pesar de este efecto, glutamato no
aument la frecuencia de sIPSCs (100.0 7.0 %, n=4), indicando que, a esta concentracin,
glutamato no produjo la depolarizacin de las interneuronas. Glutamato fue activo incluso a
ms bajas concentraciones (3 M, 20.0 4.2 % de depresin; n=4; p<0.01), sin alterar la
frecuencia de eventos espontneos en la clula sometida a registro (93 5 %; n=7) (Fig. 21a).
En estas mismas neuronas, se comprob que kainato (0.3 M) caus el incremento de la
frecuencia de sIPSCs (447 103 %; n=6), deprimiendo la amplitud de las eIPSCs un 32.1 4.6
% (n=3).
Por el contrario, se observ que ATPA a 1 M, era capaz de depolarizar las
interneuronas del stratum oriens (11.8 2.1 mV; n=4) y aumentar de forma notable su
frecuencia de disparo y subsecuentemente, la frecuencia de sIPSCs en las clulas piramidales
(1179 261 %; n=7; p<0.001). Sin embargo, a esta concentracin, ATPA, redujo la amplitud
de las eIPSCs slo un 16.1 3.2 %; n=11; p<0.001). A concentraciones ms bajas (0.3 M),
ATPA todava fue efectivo en aumentar la frecuencia de sIPSCs (303 65.6 %, n=5; p<0.001)
siendo inhbil sobre el eIPSCs (4.0 7.8 % de aumento de la amplitud, n=9) (Fig. 21C). La
accin de AMPA fue similar a la de ATPA en cuanto a que a bajas concentraciones (i.e. 50

M) aument de forma drstica la frecuencia de sIPSCs (973 178 %; n=5), mientras que no
tuvo ningn efecto sobre las eIPSCs (Fig. 22A,C).

48

Resultados

Figura 21. A) A 3 M el agonista endgeno de los receptores de kainato,

glutamato, no aument la frecuencia de actividad espontnea inhibidora
(sIPSCs) en neuronas piramidales, mientras que s disminuy la amplitud
de las respuestas evocadas (eIPSCs), inducidas por estimulacin del
stratum oriens (los registros de la derecha son el promedio de 12
respuestas). A 10 M, glutamato tuvo un efecto mayor sobre las respuestas
evocadas sin alterar la frecuencia de sIPSCs (B). C) El agonista de los
receptores de kainato de tipo GluR5, ATPA, aument de forma notable la
frecuencia de sIPSCs (izquierda) sin afectar a la amplitud de las eIPSC
(derecha).

Estos resultados indican que la sensibilidad para el agonista de los receptores que depolarizan
las interneuronas (i.e. aumento de la frecuencia de sIPSCs) y la de los receptores que controlan
la liberacin de GABA (i.e. amplitud de las eIPSCs) es diferente. Ello se ilustra tambin por la
falta de correlacin entre el aumento de sIPSCs y el grado de disminucin de la amplitud de las
eIPSCs inducida por diferentes agonistas de los receptores de kainato (Fig. 22B). Por tanto, se
puede concluir que los receptores que median cada efecto tienen una naturaleza diferente.
Para mejor sustanciar que el efecto de la activacin de los receptores de kainato sobre la
amplitud de las eIPSCs y sobre la depolarizacin de la membrana est mediada por receptores
diferentes, se estudi el efecto de kainato tras incubar las rodajas con toxina pertsica (5 g/ml,
3-5 h a 37 C), estaurosporina (0.5 M) y bisindolilmaleimida (inhibidor de la PKC) (BIS, 0.1

M).

49

100
75
50
25
0

60
40
20

*
3

*
10 0.3

*
1

Reducin de elPSCs (%)

Reduccin de eIPSCs (%)

1200
800
400

50 M

80
60
40
20
0
100

600 1100 1600

Frecuencia de sIPSC (%)

Glutamato ATPA AMPA

1300

* *

900

*
500

200

100

100

AMPA 50 M
2

Tiempo de Registro (min)

10

Amplitud de las eIPSC (%)

Frecuencia de sIPSC (%)

Frecuencia de sIPSC (%)

Resultados

Figura 22. A) Efecto de diferentes concentraciones de glutamato, ATPA y AMPA sobre la

frecuencia de sIPSCs (barras sombreadas) y sobre la amplitud de las eIPSCs (barras
negras). * p<0.001, test t de student. B) La frecuencia de sIPSCs durante la aplicacin de
agonistas de receptores de kainato (normalizada con respecto del control) se representa
frente al grado de reduccin de las eIPSCs obtenido frente a cada concentracin de
agonista, (glutamato, ATPA, AMPA y kainato). Ntese la falta de correlacin entre estos
dos parmetros (r2<0.01). C) Curso temporal de la accin de AMPA (en presencia de
GYKI 53655 100M) sobre la frecuencia de sIPSC y sobre la amplitud de las eIPSCs.
Cada punto representa el valor medio (EEM; n=6) de periodos consecutivos de 30
segundos. (* p<0.001, ANOVA y test t de student).

En todos los casos la accin de kainato sobre la modulacin de las eIPSCs fue
severamente impedida (Fig. 23 y 24A). Sin embargo, tanto kainato como ATPA fueron todava
capaces de depolarizar las interneuronas, no encontrndose diferencias ni en el grado de
depolarizacin ni en el grado de aumento de la actividad espontnea en las rodajas tratadas y no
tratadas. Todas las interneuronas del stratum oriens registradas (n=12) fueron sensibles a
ATPA (1-10 M). En promedio, 3 M de kainato depolariz las interneuronas un poco menos
que 1 M de ATPA (8.6 1.8 mV, n=7 y 12 1.8 mV, n=5, respectivamente). La frecuencia
de disparo inducida por 3 M de kainato fue de 3.9 0.4 Hz, un valor que no fue alterado en
rodajas tratadas con PTx (3.5 0.5, n=5) o con estaurosporina (4.2 1.0 Hz, n=3) (Fig. 25B).
Estos resultados, indican que, a diferencia del control de la liberacin de GABA, la
depolarizacin de las interneuronas mediada por la activacin de los receptores de kainato no

50

Resultados

requiere un acoplamiento a una cascada de segundos mensajeros.

Interneurona del stratum oriens

Kainato

Tratada con PTx

Control
KA 2 min
KA 6 min
KA 10 min
Lavado

20
mV
-65 mV

100
pA

100 ms

10 s

Figura 23. El efecto depolarizante de kainato pero no su accin sobre las

IPSCs persiste en rodajas tratadas con PTx. A) Efecto depolarizante de 3 M
de kainato sobre una interneurona del stratum oriens, en una rodaja tratada con
toxina pertsica. B) Kainato no reduce las IPSCs registradas en neuronas
piramidales de CA1 de una rodaja tratada con toxina pertsica. (5 l/ml) durante
3-5 horas a 37 C antes de ser registrada.

Frecuencia de sIPScs (%)

Frecuencia de disparo (Hz)

80
(26)
60

1000

PTx

**
(7)

(12)

(6)

No Tratada

BIS

750
500
250
0

**
(6)

BIS

**
(11)

20

**
(4)

Calfos.C

40

Estaurosp.

No tratada

Depresin de las eIPSCs

inducida por kainato 3 M (%)

6
5
4

(3)
(4)
(5)

3
2
1
0

No Tratada PTx Estaurosp.

Figura 24. A) El decremento de la

amplitud de las eIPSCs inducido por
kainato (No tratada, n=26) se aboli en
rodajas tratadas con toxina pertsica
(PTx, 5 l/ml), o con cada uno de los
siguientes
inhibidores
de
PKC,
aplicados a concentraciones 10 veces su
IC50: estaurosporina (Estaurosp., 0.5
M), Calfostina C (Calfos. C, 0.5 M),
o bisindolilmaleimida (BIS, 0.1 M). B)
El tratamiento con PTx o con
estaurosporina no tiene efecto sobre el
aumento en la frecuencia de disparo de

las interneuronas del stratum oriens inducido por 3 M de kainato. C) La

inhibicin de la PKC no fue capaz de modificar el aumento de actividad
espontnea (sIPSC) inducido por kainato. Los valores son la media EEM
del nmero de neuronas indicado en parntesis. ** p<0.001, test t de
Student.

51

Resultados

Finalmente, se pretendi determinar si la falta de efecto de kainato sobre las eIPSCs por
inhibicin de la PKC se poda revertir lavando el inhibidor. Para ello, se intent registrar la
misma neurona durante largos perodos de tiempo. En la neurona de CA1 mostrada en la figura
25A registrada de una rodaja tratada con estaurosporina, kainato produce un aumento en la
amplitud de las eIPSCs, ms que una disminucin. Sin embargo, tras 60 minutos de lavado de
la estaurosporina, la aplicacin de kainato fue efectiva en reducir la amplitud de las eIPSCs
registradas en la misma neurona (Fig. 25B). Tambin se llev a cabo el experimento inverso.
Tras demostrar la efectividad de kainato para disminuir la amplitud de las eIPSCs en una clula
de una rodaja control, sta se incub con estaurosporina. Como se puede ver en la figura 25D,
la incubacin durante 30 minutos con estaurosporina disminuye notablemente la accin de
kainato para deprimir la amplitud de las eIPSCs. Estos mismos resultados fueron replicados en
4 rodajas diferentes.

A Estaurosporina 0.5 M
Control KA 3 M

200
pA
50 ms

C Ringer

Control KA 3 M

B Lavado de la estaurosporina (60)

Control KA 3 M

Promedio (n=10)
C
KA

100
pA
50 ms

200
pA
50 ms

KA

KA
C

100
pA

50 ms

D Estaurosporina 0.5 M (30)

Control KA 3 M

Promedio (n=10)
C

60
pA
50 ms

Promedio (n=10)

Promedio (n=10)
C

40
pA
50 ms

60
pA
50 ms

KA

40
pA

50 ms

Figura 25. A) El efecto inhibidor de kainato sobre la amplitud de las eIPSCs registradas en
neuronas de CA1 desapareci en rodajas que previamente haban sido tratadas con
estaurosporina. A la izquierda se muestran respuestas individuales superpuestas y a la derecha
su promedio. Esta neurona se pudo mantener estable durante el periodo en el que la
estaurosporina se lav (60 min). En esta situacin, la aplicacin de kainato indujo una reduccin
significativa de la amplitud de las eIPSCs (B). C) En una rodaja control, kainato aument la
actividad espontnea, reduciendo la amplitud de las corrientes inhibidoras evocadas. D)
Despus de incubar esta misma rodaja con estaurosporina durante 30 minutos, el efecto de
kainato sobre la amplitud de las eIPSCs registradas en la misma clula se elimin. Ntese, que
el aumento en la actividad espontnea (sIPSCs) persisti, y que la depolarizacin postsinptica,
inducida por kainato, fue similar en cada caso. Estos resultados se obtuvieron en cuatro
ocasiones.

52

Resultados

4. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por la activacin de

receptores de kainato presinpticos es un fenmeno comn a diferentes
zonas del cerebro.
Para determinar si en otras reas del cerebro la activacin de los receptores de kainato
produce igualmente la modulacin de la liberacin de GABA, se llevaron a cabo experimentos
sobre la transmisin inhibidora en otras zonas del cerebro.
4.1. Hipocampo.
Se registraron las IPSCs evocadas en las neuronas piramidales de CA3 tras la estimulacin
de las interneuronas del stratum oriens o del stratum lucidum en presencia de GYKI 53655 y de
D-AP5. La aplicacin de kainato 3 M a las rodajas de hipocampo en las que se registraron las
eIPSCs en CA3 produjo un 60.2 6.0 % de disminucin de la amplitud media de estas
respuestas (n=5) (Fig. 26), un efecto similar al observado en CA1. Igualmente, la aplicacin de
kainato produjo una corriente entrante postsinptica de 69.4 2.1 pA. Tambin se observ un
aumento significativo en la actividad espontnea, que aument hasta el 1249 360 % (n=5).

Control

Kainato 3 M

100
pA

C
80

100
ms
1.5

60

1/CV2

Inhibicin de eIPSCs (%)

Recuperacin

40
20
0

1.0
0.5
0.0
0.0

Kainato
3 M

0.5

1.0

1.5

Figura 26. En la regin CA3 de hipocampo kainato tambin

reduce la liberacin de GABA. A) Registros en los que se observa
la accin depresora de kainato sobre las eIPSCs. Este efecto revierte
tras el lavado de kainato. B) Cuantificacin del efecto de kainato 3
M sobre las eIPSCs registradas, en esta zona de hipocampo (n=5
clulas de 5 rodajas diferentes). C) El estadstico 1/CV2 vara de
forma paralela a la amplitud media de las corrientes, lo que indica
un mecanismo de accin presinptico.

53

Resultados

El estudio del coeficiente de variacin de estas respuestas indic un mecanismo de accin

presinptico como la accin ms probable de kainato. Como se puede observar en la figura
26B, el punto medio se sita sobre la diagonal, lo que indica que la variacin en la amplitud se
corresponde con un cambio proporcional en los parmetros de liberacin.
4.2. Cerebelo.
En primer lugar se estudi el efecto de kainato sobre la transmisin sinptica inhibidora
a nivel de las clulas de Purkinje del cerebelo. Para ello, el electrodo de estimulacin se coloc
en la capa molecular, cerca de la capa de las clulas de Purkinje, registrndose las corrientes
inhibidoras en las neuronas de Purkinje en condiciones de bloqueo de los receptores de AMPA
y de NMDA. La aplicacin de kainato 3 M produjo un descenso de la amplitud media de las
eIPSCs de un 44.2 9.3 % (n=15) (Fig. 27). Tambin se observ la generacin de una corriente
entrante de 14.0 5.4 pA, lo que sugiere la presencia de receptores de kainato funcionales en
las clulas de Purkinje. Sin embargo, estos experimentos no revelaron cambio significativo en
la actividad espontnea (sIPSCs) tras la aplicacin de kainato (96.4 5.3 %, n=8)
El estudio del coeficiente de variacin (Fig. 27B) indic un mecanismo presinptico de
accin, ya que que, como en el caso anterior, el punto medio se situ sobre la diagonal.
En segundo lugar, se estudi el efecto de kainato sobre la liberacin de GABA que tiene
lugar en las sinapsis establecidas por las clulas de Purkinje sobre las neuronas de los ncleos
profundos del cerebelo. En estas rodajas el electrodo de estimulacin se coloc sobre las fibras
que forman los axones de las clulas de Purkinje, registrndose las respuestas evocadas en las
neuronas que forman dichos ncleos (DCN). Al aplicar kainato (3 M) a estas rodajas en
condiciones de bloqueo de los receptores de AMPA y NMDA, se observ un descenso de la
amplitud media de las eIPSCs de un 44.0 4.6 % (n=7) (Fig.28). En estas clulas, la aplicacin
de kainato produjo un cambio de la corriente de fijacin de 34.3 4.4 pA. Igualmente se valor
si la aplicacin de kainato tuvo efecto sobre la actividad espontnea, observndose que en
presencia de kainato se produjo un aumento de 4 veces en esta actividad (397.2 95.1 %, n=5).
Una vez ms se determin el coeficiente de variacin, comprobndose que el punto
medio caa sobre la diagonal de la grfica, lo cual, sugiere un mecanismo de accin
presinptico.

54

Resultados

Control

Kainato 3 M

Recuperacin
50
pA

C
60

1.5

40

1.0

1/CV2

Inhibicin de eIPSCs (%)

100
ms

20

0.5
0.0

0.0

Kainato
3 M

0.5

1.0

1.5

Figura 27. Efecto de la activacin de los receptores de kainato sobre

las eIPSCs registradas de clulas de Purkinje de cerebelo. (A y B)
Kainato (3 M) produjo una reduccin de la amplitud media de las
eIPSCs. C) El estudio del cambio de 1/CV2 con respecto del cambio de
la amplitud media de las corrientes sugiere un mecanismo de accin
presinptico.

Control

Kainato 3 M

Recuperacin
50
pA
50
ms

C
60

1.5

40

1.0

1/CV2

Inhibicin de eIPSCs (%)

20
0

0.5
0.0
0.0

Kainato
3 M

0.5

1.0

1.5

Figura 28. Efecto de la activacin de los receptores de kainato sobre

las eIPSCs registradas de neuronas de los ncleos profundos de
cerebelo. (A y B) Kainato (3 M) produce una reduccin de la amplitud
media de las eIPSCs que vari de forma paralela al cambio del
estadstico 1/CV2 (C).

55

Resultados

4.3. Neocorteza.
Se registraron clulas piramidales de la capa V de la neocorteza en rodajas preparadas
de corteza suprahipocampal. Para generar IPSCs, el electrodo de estimulacin se coloc en el
entorno de la clula registrada. La aplicacin de kainato (3 M) produjo un ligero descenso de
la amplitud media de las corrientes inhibidoras (18.2 9.3 %, n=4) (Fig. 29). Tambin se
observ en estas clulas que kainato induca una corriente entrante de 72.3 17.1 pA y un
incremento en el nmero de eventos espontneos (al 814.8 273.5 %, n=4). Como en casos
anteriores, el estudio del coeficiente de variacin indic un mecanismo de accin presinptico
como explicacin ms probable para estos resultados.

Control

Kainato 3 M

Recuperacin

50
pA
100
ms

C
1.5

40
30

1/CV2

Inhibicin de eIPSCs (%)

20
10
0

1.0
0.5
0.0
0.0

Kainato
3 M

0.5

1.0

1.5

Figura 29. Efecto de la activacin de los receptores de kainato

sobre las eIPSCs registradas en neuronas piramidales de la capa
V de corteza tras estimular las interneuronas adyacentes. A)
Kainato (3 M) produjo una reduccin de la amplitud de las eIPSCs
que fue paralela al cambio del estadstico 1/CV2 (C). B)
Cuantificacin del efecto de kainato 3 M. La barra representa la
media EEM de 4 neuronas de 4 rodajas diferentes.

En la figura 30 se presenta de forma comparativa el efecto de kainato 3 M sobre

las eIPSCs en las diferentes reas estudiadas. Ntese que al igual que en CA1 del hipocampo,
no parece existir correlacin alguna entre la disminucin de las corrientes evocadas y el efecto
producido sobre la actividad espontnea (Fig. 30C).

56

Resultados

Estos resultados indican que los receptores de glutamato de tipo kainato estn
presentes en la parte presinptica de los contactos inhibidores en diferentes reas del cerebro y
que, al menos en estas zonas, estos receptores tienen una funcin similar, que es modular a la
baja la liberacin del neurotransmisor GABA.

80

70
60
50
40
30
20
10
0

Aumento de sIPSCs (%)

Reduccin de eIPSCs (%)

Reduccin de eIPSCs (%)

A
60
40
20
0
CA1CA3 DCN P

1000
500
0
CA1CA3 DCN P

1500

400 800 12001600

Frecuencia de sIPSCs (%)

Figura 30. Comparacin del

efecto de kainato 3 M sobre
las eIPSCs en diferentes reas
del cerebro. A) Kainato
deprime las eIPSCs en las
regiones CA1 y CA3 de
hipocampo, en las clulas de los
ncleos profundos (DCN) y de
Purkinje (P) del cerebelo y en
las neuronas piramidales de
corteza (C) B) Efecto sobre la
frecuencia
de
respuestas
espontneas (sIPSCs).

C) Representacin grfica de la correlacin entre la depresin de las

corrientes evocadas y el cambio producido sobre la actividad
espontnea. Como se puede observar, no existi correlacin entre
ambos fenmenos.

57

Discusin

DISCUSIN.
Los resultados expuestos demuestran que kainato regula la transmisin GABArgica
en el rea CA1 del hipocampo reducindola. Esta accin es compatible con la bien conocida
naturaleza convulsante y excitotxica del cido kanico (Coyle, 1983). En el presente trabajo,
se disearon experimentos en diferentes modelos experimentales, microcultivos, rodajas de
cerebro e in vivo, obtenindose en todos los casos resultados compatibles. Ello demuestra que
este efecto es una accin general y no un resultado inherente a una preparacin experimental
en particular.
Hace ms de 15 aos, cuando kainato empez a usarse como agente excitotxico,
algunos autores describieron acciones de este compuesto sobre la inhibicin GABArgica.
Sloviter y Damiano (1981) fueron los primeros en sugerir que kainato decreca la inhibicin
en el hipocampo, un resultado que desde entonces ha sido encontrado por diferentes autores
(Westbrook y Lothman, 1983; Fisher y Alger, 1984; Kehl y McLennan, 1985; Gaiarsa et al.,
1994). Sin embargo, la falta de conocimiento sobre los receptores de kainato y de sus
propiedades evit alcanzar conclusiones vlidas en esos momentos.
Considerando que los receptores de AMPA, los otros receptores susceptibles de ser
activados por kainato, fueron sistemtica y completamente bloqueados por GYKI 53655 y que
el bloqueo de los receptores metabotrpicos de glutamato no previno el efecto observado, se
puede concluir que la accin de kainato sobre la inhibicin GABArgica es mediada por la
activacin de receptores de kainato. La falta de antagonistas especficos de los receptores de
kainato impidi la demostracin de una implicacin directa de estos receptores en la
inhibicin de las eIPSCs. Sin embargo, en presencia de GYKI 53655, el antagonista de los
receptores de AMPA y kainato, CNQX pudo ser usado como antagonista de los receptores de
kainato. Como se ha descrito, este antagonista inespecfico fue capaz de inhibir la accin de
kainato de forma dosis-dependiente.
La posibilidad de que kainato produjera en las rodajas la liberacin de algn tipo de
sustancia que, al activar sus propios receptores, fuera capaz de producir el efecto observado,
fue descartada dado que en presencia de un cctel de antagonistas para bloquear los
receptores posibles, kainato sigui produciendo la depresin de las corrientes inhibidoras. El

58

Discusin

hecho de que glutamato, el agonista endgeno de estos receptores, tuviera un efecto similar
sobre la transmisin inhibidora, permite concluir que la activacin de estos receptores por el
agonista endgeno produce la desinhibicin de las poblaciones neuronales. Por tanto,
considerando el perfil farmacolgico y las propiedades de la accin de kainato sobre la
funcin sinptica GABArgica descritos en esta memoria, podemos concluir que la depresin
de la inhibicin es mediada por activacin de receptores de glutamato de tipo kainato
presentes en la parte presinptica de los contactos inhibidores y que ste es uno de los papeles
principales que los receptores de kainato desempean en la fisiologa cerebral.

1. La accin de kainato es presinptica.

Efectivamente, kainato redujo notablemente la amplitud de las eIPSCs tanto en
microcultivos como en rodajas de hipocampo. Todas las evidencias obtenidas con diferentes
aproximaciones sugirien un sitio de accin presinptico para kainato. En primer lugar, se
comparar la proporcin de fallos en la liberacin de neurotransmisor antes y durante la
aplicacin de kainato. Para este anlisis slo se consideraron aquellas clulas en las que los
fallos pudieron ser determinados sin ambigedad. El aumento en el nmero de stos estuvo
correlacionado con la magnitud del decremento en la amplitud de las eIPSCs. Ello sugiere un
cambio en la probabilidad de liberacin de neurotransmisor durante la aplicacin de kainato.
En neuronas microcultivadas, una situacin en la cual la generacin de la espiga presinptica
pudo ser controlada, se observ igualmente un aumento en el nmero de fallos. En segundo
lugar, kainato redujo la frecuencia de mIPSCs sin producir cambio alguno en la amplitud de
las mismas, un resultado igualmente compatible con un decremento en la probabilidad de
liberacin. El anlisis del coeficiente de variacin de las respuestas evocadas (i.e. el
estadstico CV2), se modific proporcionalmente a la variacin de la amplitud media de las
respuestas, resultado igualmente demostrativo de un modo de accin presinptico para
kainato.
Algunos autores han tratado de determinar la distribucin subcelular de los receptores
de kainato, a pesar de la carencia de buenos anticuerpos. Sin embargo, ninguno de ellos ha
podido concluir de forma inequvoca su localizacin. Aunque la seal inmunocitoqumica se
ha encontrado preferentemente en la densidad postsinptica de sinapsis asimtricas, en
algunos casos se ha observado marcaje en axones no mielinizados y en terminales
presinpticos (Huntley et al., 1993; Petralia et al., 1994). Ello de acuerdo con nuestros
59

Discusin

resultados, sugiere la existencia de receptores de kainato presinpticos. No obstante, la

identificacin de las subunidades de los receptores de kainato presentes en los botones
sinpticos GABArgicos requerir estudios definitivos de microscopa electrnica del tipo de
los llevados a cabo para otros receptores de glutamato (e.g. Lujn et al., 1996; Shigemoto et
al., 1996; Rubio y Wenthold, 1997).
2. La curva dosis-respuesta para el efecto de kainato y de glutamato presenta forma de
campana.
En el presente trabajo, la accin de kainato sobre las eIPSCs se evalu en condiciones
de equilibrio. Experimentos realizados en nuestro laboratorio indican la existencia de una
ventana de activacin por el agonista de este receptor (Paternain et al., 1998). Esta ventana
surge de las propiedades de activacin e inhibicin de estos receptores en condiciones de
estado estacionario. En las rodajas de hipocampo, la curva dosis-respuesta de la inhibicin de
las eIPSCs calculada tanto para kainato como para glutamato present forma de campana,
existiendo un rango de concentraciones efectivas. Este hecho se debe a que dosis ms altas o
ms bajas impiden que se mantenga una actividad del receptor en estado estacionario, debido
a que las ms bajas son incapaces de activar el receptor y las ms altas lo desensibilizan
rpidamente. Ello resulta en una curva dosis-respuesta terica en forma de campana para las
condiciones de funcionamiento del receptor en estado estacionario. La ventana de corriente
terica mostrada en la figura 5B como una lnea continua se calcul como la fraccin de
canales no inactivados que pueden ser activados por cada concentracin de kainato, teniendo
en cuenta las curvas de activacin y de inactivacin para los receptores de kainato nativos
determinadas previamente en neuronas de hipocampo en cultivo. Como se puede observar, los
valores experimentales de la accin de kainato sobre las eIPSCs en rodajas de hipocampo
ajustan razonablemente bien con los datos obtenidos en neuronas cultivadas. En este sentido,
esta curva present un mximo a concentraciones de kainato en torno a 10 M y de
aproximadamente 100 M para glutamato.
3. La depresin de las corrientes inhibidoras mediada por activacin de receptores de
kainato requiere la activacin de una cascada metabotrpica.
Con la aproximacin farmacolgica llevada a cabo, los resultados descritos muestran
de forma clara que la depresin de la liberacin de GABA inducida por la activacin de los
receptores de kainato en la zona CA1 de hipocampo resulta de la iniciacin de una cascada de
segundos mensajeros producida por la activacin de una protena G sensible a toxina
60

Discusin

pertsica. La ruta involucra la activacin de fosfolipasa C y de PKC, constituyendo una

accin metabotrpica de los receptores de kainato que es independiente de su actividad como
canal inico. Recientemente se ha mostrado en neuronas corticales, que los receptores de
AMPA pueden regular los niveles de AMPc mediante la activacin de una protena Gi,
aunque no existe ninguna evidencia acerca del papel fisiolgico que esta interaccin pudiera
desempear. Sin embargo, estos resultados indican igualmente que, adems de formar canales
inicos, los receptores ionotrpicos de glutamato pueden exhibir accin metabotrpica. En el
caso de los receptores de kainato, semejante actividad afecta profundamente a la actividad
neuronal ya que resulta en la modulacin de la inhibicin mediada por GABA.
En sinaptosomas de hipocampo tambin se ha encontrado acoplamiento de los
receptores de kainato a protena G (Cunha et al., 1999). Si el receptor de kainato se acopla
directamente a la protena G o lo hace a travs de una protena adaptadora es difcil de
predecir. Sin embargo, se ha observado que la afinidad por kainato de estos receptores en el
pez dorado (carpn dorado), presenta cierta sensibilidad a PTx as como a la ADP ribosilacin
de una protena de 40 KDa, que podra coincidir con los receptores de kainato de este pez
(Ziegra et al, 1992). Aunque estos datos son consistentes con una interaccin directa de los
receptores de kainato con una protena G sensible a toxina pertsica, la topologa de las
subunidades de los receptores de kainato es, en principio, difcil de reconciliar con la
estructura de los receptores de la familia de los metabotrpicos, que presentan sitios
especficos de interaccin con las protenas G (ver Pin y Duvoisin, 1995). Por ello, es posible
que una protena adaptadora pueda estar implicada en transmitir la seal desde el receptor de
kainato hasta la protena G tras la unin de glutamato.
4. Son las protenas exocitticas los efectores de una poblacin especfica de PKC?
Es sabido que la activacin de la PKC (p.e. con steres de forbol) aumenta la
liberacin de neurotransmisor en sinapsis inhibidoras (Capogna et al., 1995), un resultado que
fue replicado en nuestras condiciones experimentales. Sin embargo, la activacin de los
receptores de glutamato de tipo kainato conduce a la activacin de un reservorio de PKC que
produce un descenso en la probabilidad de liberacin de GABA. Este resultado indica la
existencia de, al menos, dos poblaciones o reservorios de PKC en los terminales
GABArgicos. La estimulacin de uno de ellos producira un aumento de la liberacin de
transmisor mientras que el otro la inhibira. En este sentido, la oclusin de la accin de
61

Discusin

kainato por PDBu puede ser explicada por la activacin de todos los reservorios de PKC por
parte del ster de forbol, impidiendo cualquier tipo de activacin por parte de kainato. Por el
contrario, la activacin por parte de kainato de una poblacin inhibidora de PKC,
cuantitativamente pequea, no es capaz de impedir la accin de los steres de forbol. Por
tanto, se puede hipotetizar que la ruta de sealizacin activada por los receptores de kainato
involucra una poblacin particular de PKC (ver Nishizuca, 1988). Es interesante hacer notar
que en presencia de PDBu, ms que disminuir la frecuencia de miniaturas (mIPSCs), kainato
la aument y que esta accin fue adicional al efecto de PDBu. Este resultado podra ser
esperado si se produjera una suave depolarizacin del terminal presinptico por un receptor
acoplado a un canal catinico (Lena y Changeux, 1997; ver tambin McGehee y Role, 1996;
Glitsh y Marty, 1999), como sera el caso de los receptores de kainato.
Otro e importante aspecto de los datos presentados es que la inhibicin de la liberacin
de GABA inducida por kainato puede ser reducida aumentando la fuerza electromotriz de
Ca2+. Esto prodra significar que la poblacin de PKC susceptible de ser activada por los
receptores de kainato interfiere con un paso en el mecanismo de liberacin en el cual el Ca2+
debe de estar involucrado. En principio, la reduccin en la liberacin de neurotransmisor
puede provenir de alguno de estos fenmenos: (1) la cantidad de calcio que entra en el
terminal disminuye como consecuencia de la inhibicin de los canales de calcio. (2)
disminuye la sensibilidad a calcio de la maquinaria de liberacin. En ambos casos, el
resultado es una disminucin en la liberacin y en ambos casos un aumento en el gradiente
qumico para el calcio podra restaurar las condiciones iniciales. Sin embargo, es bien
conocido que la activacin de PKC produce un aumento de las corrientes a travs de los
canales de calcio y, por tanto, un aumento en la cantidad de neurotransmisor liberado (Swartz,
1993; Swartz et al., 1993). Aunque la activacin de PKC ha sido tambin implicada en una
inhibicin de los canales de calcio inducida por la liberacin de neurotransmisor (e.g.;
Divers-Pierluissi y Dunlap, 1993), la mayora de la inactivacin de canales de calcio
inducida por la liberacin de neurotransmisor involucra mecanismos mediados por protenas
G delimitados a la membrana plasmtica, sin la participacin de protenas kinasa (revisado
por Hille, 1992). Para minimizar un eventual dficit de calcio, se bloquearon los canales de
potasio para prolongar la duracin de los potenciales de accin y, por tanto, la duracin de la
entrada de calcio en los terminales. El aumento en la entrada de calcio al bloquear los canales
de potasio, no fue suficiente para impedir la accin de kainato, aunque si se aument la
liberacin de neurotransmisor (Fig. 15). Sin embargo, aumentando el gradiente qumico para
62

Discusin

el calcio se aument la concentracin de calcio que entr en el terminal sin cambiar la cintica
de la entrada. Este proceder fue bastante efectivo en prevenir la accin inhibidora de kainato.
Este resultado indica que la modulacin de la liberacin de GABA por kainato es consistente
con un cambio mediado por PKC en la sensibilidad a calcio de las protenas involucradas en
la exocitosis, ms que una accin directa de la PKC sobre canales de calcio presinpticos (e.g.
Retting et al., 1997).
En resumen, estos resultados proporcionan la evidencia que sustenta una actividad
metabotrpica de un receptor tpicamente ionotrpico con claras consecuencias fisiolgicas.
Los receptores de kainato parecen controlar la actividad de una poblacin particular de PKC
que influye notablemente la liberacin de GABA en el hipocampo. Este hecho aade ms
diversidad a la funcin de los receptores de glutamato y abre nuevas vistas sobre el modo de
operacin de los receptores de glutamato de tipo ionotrpico (Fig. 31).

GLUTAMATO
NMDA
EXTRACELULAR

Zn
GLU

AMPA

KAINATO

mGluR I, II, III

GLY
PA

Mg

INTRACELULAR
NR2A
NR2B
SUBUNIDADES NR1+
NR2C
NR2D

GluR5-7
KA1, KA2

GluR1-4

AdC
PLC

mGluR1-8

IONOTROPICOS
METABOTROPICOS

Figura 31. Clasificacin de los receptores de glutamato de acuerdo a su composicin

subunitaria, sus propiedades farmacolgicas y a sus mecanismos de sealizacin. Los
receptores de kainato y los de AMPA, adems de funcionar como canales tambin presentan
funcin metabotrpica.

5. En las interneuronas de hipocampo coexisten las dos poblaciones de receptores de

kainato con sistemas de sealizacin diferentes.
Tanto el agonista endgeno, glutamato, como ATPA, un agonista de receptores
GluR5, y AMPA, un activador de algunos tipos de receptores de kainato, son capaces de
disociar el aumento de actividad espontnea (sIPSCs) observada por la accin depolarizante
63

Discusin

de los receptores de kainato de sus efectos sobre la liberacin de GABA. Adems, el efecto
sobre la liberacin de GABA pero no la accin depolarizante de kainato fue sensible al
bloqueo de protenas G o de PKC en las interneuronas de hipocampo. Estos resultados
indican, de forma inequvoca, la existencia de dos poblaciones de receptores de kainato en las
interneuronas del hipocampo que presentan desigual sensibilidad a agonista y que usan
diferentes sistemas de sealizacin (Fig. 32).
Estos resultados estn en clara contradiccin con uno de los argumentos usados por
algunos autores en contra de la existencia de receptores presinpticos de kainato,
fundamentados en la observacin de que la estimulacin repetitiva (i.e. 6 Hz) de las rutas
inhibidoras disminuye la amplitud de las eIPSCs. Aunque no se muestra, hemos evaluado esta
posibilidad en nuestras condiciones experimentales, no encontrndo una reduccin de las
eIPSCs tan marcada como la descrita (Frerking et al., 1998). Por el contrario, en nuestros
experimentos, la estimulacin repetitiva, provoc una reduccin media de las respuestas
similar a la recientemente observada en experimentos con activacin sostenida de las sinapsis
inhibidoras corticales (Galarreta et al., 1998). En definitiva, en nuestras condiciones
experimentales, esta depresin dependiente de frecuencia de las eIPSCs es claramente
insuficiente para explicar la reduccin de las eIPSCs observada tras la adicin de kainato al
bao. De hecho, nuestros resultados demuestran que bajas concentraciones de glutamato
deprimen las eIPSCs GABArgicas en ausencia de disparos presinpticos repetitivos.
Adems, si el aumento de actividad espontnea fuera responsable de la depresin de las
eIPSCs, algn tipo de correlacin tendra que existir entre el aumento de actividad de las
interneuronas y el descenso de la amplitud de las eIPSCs, independientemente del agonista
usado. Sin embargo, de acuerdo con nuestras observaciones ste no fue el caso (Fig. 22) ni en
el hipocampo ni en las otras estructuras examinadas (Fig. 30).
La diferente sensibilidad a los diferentes agonistas de los tipos de receptores
responsables de un fenmeno u otro, indica que estos receptores difieren en su composicin
molecular. Aunque las interneuronas del hipocampo expresan predominantemente la
subunidad GluR5 de los receptores de kainato, recientemente tambin se ha encontrado que
una importante poblacin de interneuronas expresa la subunidad GluR6 y que estas dos
subunidades (GluR5 y GluR6) pueden ensamblarse formando receptores heteromricos con
propiedades farmacolgicas propias (Paternain et al., 2000). En consecuencia, la diversidad
de receptores de kainato es mayor de lo que se prevea y hasta el momento no se puede
64

Discusin

establecer ninguna conclusin sobre el tipo de subunidades que componen los receptores que
median cada efecto.
Curiosamente, la sensibilidad a glutamato de los receptores de kainato responsables de
la regulacin de la liberacin de GABA, fue mayor que la de los que producen la
depolarizacin somatodendrtica. Esto es lo que se esperara para un receptor situado en un
sitio que no es capaz de sensar el glutamato sinptico. La concentracin real de glutamato que
sensan los receptores de kainato in vivo es desconocida y probablemente limitada por la
actividad de los transportadores de glutamato. Estimaciones recientes indican que sta puede
llegar a ser de 160-190 M en el espacio extrasinptico. Este rango de concentraciones
pueden ser suficientes para la activacin de receptores de glutamato situados a distancia de los
lugares de liberacin, dado su aparentemente alta sensibilidad a glutamato. Por tanto, los dos
requerimientos para que la modulacin de la liberacin de GABA ocurra en respuesta a la
liberacin sinptica de glutamato, una concentracin suficiente fuera de la sinapsis y alta
sensibilidad del receptor, parecen cumplirse. De hecho, un estudio reciente (Min et al., 1999),
ha demostrado que la liberacin sinptica de glutamato de las colaterales de Schaffer es
suficiente para reducir la amplitud de las eIPSCs mediante un mecanismo cuya farmacologa
es compatible con la de los receptores de kainato.
6. La modulacin de la liberacin de GABA mediada por la activacin de receptores de
kainato presinpticos es un fenmeno comn a diferentes reas del cerebro.
La disminucin de la liberacin de GABA producida por la activacin de receptores
de kainato situados en terminales presinpticos parece ser un fenmeno general, puesto que,
se ha podido poner de manifiesto en las zonas CA1 y CA3 del hipocampo, en los ncleos
profundos del cerebelo, en las sinapsis inhibidoras que se establecen sobre las clulas de
Purkinje, as como en la capa V de corteza cerebral. Los datos experimentales tambin
muestran que se produce una depolarizacin de las clulas registradas y un aumento variable
de la actividad espontnea, no existiendo tampoco correlacin entre el aumento de actividad
espontnea observado y la depresin de las corrientes evocadas. Aunque no se ha estudiado
sistemticamente, existe la posibilidad de que en todos los casos los receptores de kainato
situados en los terminales estn asociados a protenas G y que tengan funcin metabotrpica
al igual que ocurra en la zona CA1 del hipocampo. Sea como fuere, estos resultados indican
que en diferentes reas del cerebro existen receptores de glutamato de tipo kainato cuya
activacin produce una depresin de la transmisin sinptica inhibidora GABArgica.
65

Discusin

Receptores de Kainato
somatodendrticos
(Depolarizacin)

Receptores de kainato
presinpticos
(Inhibicin de la liberacin de neurotransmisor)

ATPA>KA>Glu>AMPA

KA>Glu>ATPA>>AMPA

Figura 32. En las interneuronas del hipocampo coexisten dos poblaciones de

receptores de kainato con sistemas de sealizacin diferentes y con diferente
sensibilidad a agonistas.

7. Relevancia fisiolgica del bloqueo de la liberacin de GABA mediada por receptores

de kainato.
Es conocido que el glutamato puede regular no slo su propia liberacin sino tambin
la liberacin de GABA activando receptores de glutamato metabotrpicos localizados
especficamente en terminales excitadores y GABArgicos. El significado funcional exacto de
este hecho an no ha sido bien establecido. Nuestros resultados identifican otro receptor de
glutamato capaz de ejercer esta misma actividad moduladora.
Cabe imaginar que si las sinapsis inhibidoras y excitadoras estn parcialmente
integradas, el glutamato sinptico puede desbordarse (Kullmann et al., 1996) y alcanzar
concentraciones lo suficientemente altas para activar receptores de kainato en los terminales
GABArgicos presinpticos. Teniendo en cuenta el dramtico efecto que algunas
concentraciones de glutamato tienen sobre la liberacin de GABA en condiciones de estado
estacionario (cuando slo una pequea cantidad de receptores estn activos), el efecto de
glutamato en el pico de activacin puede tener como consecuencia la completa supresin de la
funcin GABArgica. Sin embargo, para este tipo de interaccin computacional se requiere
un cronometraje exacto de la ocurrencia tanto de la liberacin de glutamato como de la
invasin de la terminal inhibidora por el potencial de accin. La coincidencia temporal de
seales excitadoras e inhibidoras en el hipocampo es comn y, de existir este mecanismo,
podra ser detectada en la dendrita de la clula postsinptica como una gran y duradera
depolarizacin que no se dara si no existiera este tipo de interaccin. Por tanto, ste podra
ser un mecanismo de asegurar y/o reforzar la comunicacin excitadora entre clulas. Para que
esta posibilidad sea posible, es necesario adems que los terminales excitadores e inhibidores
66

Discusin

estn lo suficientemente cerca en el Sistema Nervioso Central. Se asume de forma general,

que las sinapsis inhibidoras se disponen en los troncos dendrticos y en los somas. Por el
contrario, las espinas dendrticas se han considerado siempre como blancos de los axones
excitadores, formando sinapsis asimtricas. Sin embargo, estudios inmunocitoqumicos
combinados con microscopa electrnica, han mostrado de forma convincente que las espinas
dendrticas reciben igualmente axones GABArgicos (Ribak, 1978; Hendry et al., 1983;
Houser et al., 1984; revisado por DeFelipe y Farias, 1992). Consecuentemente la posibilidad
de que los terminales GABArgicos sensen la cantidad de glutamato sinptico liberado existe
realmente.
La hiptesis anterior no excluye la posibilidad de que el tono inhibidor est bajo el
control del glutamato extracelular. Los receptores de kainato presentan una ventana de
concentraciones de agonista activas. Para el agonista endgeno, esta ventana presenta un
mximo a 100 M (menos de 10 veces la concentracin alcanzada en la hendidura sinptica).
Adems, una concentracin de aproximadamente 100 M es la calculada como valor
alcanzado en el fluido extracelular en condiciones isqumicas (Benveniste et al., 1984). La
prediccin es que a esta concentracin de glutamato, la funcin GABArgica puede estar
seriamente

comprometida,

resultando

probablemente

excitotoxicidad. En efecto, en experimentos recientes,

en

actividad

epilptica

ratones a los que les falta el

transportador de glutamato astroctico, en los cules permanece elevada la concentracin

extracelular de glutamato en el fluido extracelular durante largos perodos, presentan ataques
epilpticos espontneos (Tanaka et al., 1997).
En resumen, nuestros resultados demuestran que los receptores de kainato modifican
la fiabilidad de las sinapsis GABArgicas pudiendo modificar la fuerza de las conexiones
inhibidoras. Este efecto se alcanza, no obstante, dentro de un preciso rango en la
concentracin extracelular de agonista. Concentraciones ms altas o ms bajas no son lo
suficientemente eficientes en alterar la fiabilidad. De este modo, la excitabilidad del circuito
estara bajo el fino control de la concentracin extracelular de glutamato a travs de la
activacin transitoria o tnica de los receptores de kainato. Este hecho implica la existencia de
reglas computacionales para la funcin de los receptores de kainato en la integracin
neuronal.

67

Conclusiones

CONCLUSIONES.
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se han alcanzado las siguientes
conclusiones:
1. La potente actividad epileptgena del cido kanico, conocida desde hace ms de 15
aos, se debe, al menos en parte, al efecto depresor de la inhibicin GABArgica
que conlleva la activacin de los receptores de kainato presinpticos.
2. Los receptores de kainato presentan dos tipos de sealizacin celular
independientes, uno asociado a su actividad como canal inico; el otro asociado a la
activacin de una protena G que dispara una cascada de segundos mensajeros,
constituyendo sta la primera evidencia fisiolgica de una funcin metabotrpica
para los receptores de glutamato de tipo kainato.
3. Los dos tipos de receptores de kainato coexisten en las interneuronas del
hipocampo. Una poblacin se localiza en el compartimento somatodendrtico y su
activacin provoca la depolarizacin de la membrana; la otra se localiza en la parte
presinptica de las sinapsis inhibidoras y su activacin produce la disminucin de la
liberacin de GABA a travs de un mecanismo que involucra la activacin de la
protena kinasa C.

68

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