INTRODUCCION

La citometra de flujo es una metodologa que permite obtener informacin

sobre las caractersticas fsicas y qumicas de clulas o partculas en
suspensin que atraviesan una fuente de luz (lser). Posee un amplio espectro
de aplicaciones, que abarcan desde el diagnstico clnico (principalmente en el
mbito de la Hematologa oncolgica y la Inmunologa), hasta complejos
proyectos de investigacin en el campo de la biomedicina y de la biologa
celular en general.
Despus de los primeros intentos sin xito para realizar un contaje celular
automatizado durante las primeras dcadas del siglo XX, se intent desarrollar
durante los aos 50 una tecnologa que permitiera el estudio de bacterias
durante la guerra fra para hacer frente a los peligros de armas
bactereolgicas. El perfeccionamiento de la cmara de flujo en la siguiente
dcada permiti las primeras aplicaciones en citmetros de flujo
experimentales, hasta que en la dcada de los 70 se empez la produccin en
serie de las primeras unidades. Paralelamente, bajo idnticos principios, se
desarroll la tecnologa de la separacin celular por defleccin electrosttica,
un hbrido entre un citmetro de flujo y una impresora de inyeccin de tinta. De
ste ltimo viene el acrnimo FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting).
El desarrollo de los anticuerpos monoclonales en la dcada de los 80, junto con
el perfeccionamiento de los citmetros de flujo, ha permitido el uso de la
citometra de flujo en el diagnstico clnico. Desde el estudio de subpoblaciones
linfocitarias CD4+ para monitorizar el desarrollo del VIH, pasando por el
diagnstico de patologas hematolgicas y estudios de ciclo celular (ploidas),
sta es una tcnica de uso rutinario en laboratorios clnicos. La posibilidad de
utilizar esta tecnologa para separar clulas (cell sorting) es una opcin
reservada generalmente al mbito de la investigacin.

DESCRIPCIN
Un citmetro de flujo tiene tres sistemas principales:
1. Sistema hidrulico
Se compone de un conjunto de controles neumticos y fludicos
necesarios para establecer un flujo laminar que permita a la suspensin
celular atravesar la cmara de flujo de forma estable e individualizada.
2. Sistema ptico
Consta de: lser, filtros, lentes.
La fuente de luz es producida normalmente por un o varios lser. En la
mayora de los citmetros se instala un lser de gas (comunmente
argn) refrigerado por aire, que produce una luz monocromtica de 488

nm como lser principal. Esta luz es utilizada para la excitacin de la

mayora de los fluorocromos y provoca la dispersin de luz que nos
informa de las caractersticas celulares. Las ltimas tecnologas han
desarrollado lser de estado slido que estn reemplazando a los lser
de gas por su menor consumo y mayor durabilidad. La presencia
de varios lser acompaando al primario nos permitir ampliar el
abanico de lectura de fluorocromos, desde el violeta hasta el rojo lejano.
La luz dispersada y la fluorescencia ser recogida por un sistema de
filtros y espejos que dirigirn las seales a los sensores
(fotodiodo/fotomultiplicadores).
3. Sistema electrnico-informtico
Los fotomultiplicadores convierten la luz dispersa (fotones) en seales
elctricas (voltaje). Estas seales analgicas, despus de varios
procesos de amplificacin y conversin, sern digitalizadas para
visualizarlos en el ordenador. Existen actualmente nuevos sistemas de
conversin a valores digitales que permiten modificar valores de
compensacin de seales fluorescentes y escalas lin-log posteriormente
a la adquisicin de datos.
4. La perfecta integracin de estos sistemas permite un rpido y preciso
anlisis de un elevado nmero de clulas en poco tiempo.
Proceso
La suspensin celular es preparada previamente con anticuerpos monoclonales
conjugados con diferentes fluorocromos (FITC, PE, PerCP, PECy5, APC, etc.) o
sondas fluorescentes (PI, DHR, DiOC,...) y es introducida en el sistema
hidrulico de manera que las clulas atraviesen individualmente la cmara de
flujo, donde el haz del laser intercepta las clulas. El contacto del haz del lser
con una clula produce dos tipos diferentes de dispersin: frontal y
lateral (90). La dispersin frontal (Forward Scatter) nos da informacin acerca
del tamao celular, mientras que la dispersin lateral (Side Scatter) nos
informa de lacomplejidad celular. Los fluorocromos de los anticuerpos
monoclonales o sondas presentes en la membrana o el interior celular son a la
vez excitados por la luz del lser y generan fluorescencias que son recogidas
por el sistema ptico para su posterior procesamiento y digitalizacin.
Aplicaciones
Deteccin de subpoblaciones celulares (inmunofenotipado)
Apoptosis
Ciclo celular
Viabilidad
Ensayos funcionales (metabolismo oxidativo, proliferacin, calcio intracelular,
pH,...)

Separacin celular
Ensayos multiplexados (Beads Arrays

7. CITOMETRA DE FLUJO.
7.1. FUNDAMENTO
La Citometra de Flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular multiparamtrico
cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de partculas
(generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un haz de
lser focalizado. El impacto de cada clula con el rayo de luz produce seales
que corresponden a diferentes parmetros de la clula y que son recogidos por
distintos detectores. Estos convierten dichas seales en seales electrnicas
que posteriormente sern digitalizadas para permitir la medida simultnea de
varios parmetros en una misma clula.
En el momento de realizar las mediciones en el citmetro de flujo, las clulas
pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensin celular y en
forma de clula nica. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz
lser mediante un flujo continuo, cada clula, a la vez que dispersa la luz,
emite luz fluorescente como consecuencia de la excitacin lser a la que es
sometida. Los parmetros que tpicamente se miden de forma simultnea por
cada clula son:
1. Dispersin frontal de la luz a 2 (forward scatter), valor proporcional al
tamao celular.
2. Dispersin de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de
estructuras granulares o complejidad de la clula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

7.2. ESTRUCTURA BSICA DE UN CITMETRO DE FLUJO

Los citmetros de flujo estn formados por complejos sistemas:
A) El sistema fludico permite un enfoque hidrodinmico del flujo celular hasta
conseguir el alineamiento de las partculas o clulas, y en los separadores
celulares o cell sorters, se produce una rotura del flujo en gotas de tamao
uniforme para conseguir la separacin de clulas individuales.

B) Los sistemas pticos permiten el enfoque lser en un haz con un dimetro

reducido para impactar sobre el menor nmero de partculas posibles
simultneamente.

Este sistema se compone de dos tipos de pticas:

La ptica de excitacin, compuesta de el lser y las lentes apra enfocar y
dirigir el haz de luz;
La ptica de lectura, compuesta por las lentes de recoleccin de luz emitida
luego de la interaccin entre el haz del lser y las partculas y el sistema de
espejos y filtros para direccionar longitudes de onda especficas hacia los
detectores correspondientes.
Los FILTROS OPTICOS son aquellos que seleccionan las longitudes de onda que
deja pasar hacia el detector. Estos pueden ser:
DE INTERFERENCIA (Dicroicos que reflejan las long de onda no deseadas);
DE ABSORCION (absorben las long de onda no deseadas). De stos hay tres
tipos:
Filtros Band Pass : Dejan pasar un rango de longitudes de onda (Por ej: 620
640 nm)
Filtros Short Pass: Dejan pasar por debajo de una longitud de onda
determinada ( Por ej: < 575 nm)
Filtros Long Pass: Dejan pasar por encima de una longitud de onda
determinada (Por ej: > 520 nm)

C) El sistema electrnico se encarga de la

cuantificacin de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el
control del ordenador, se consigue la carga electrnica de las gotas que

contienen las clulas de inters para poder someterlas a defleccin y

recogerlas en tubos especficos para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de
tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de clulas por cada
muestra, y representar los resultados grficamente.

7.3. INFORMACION OBTENIDA POR CITOMETRIA DE FLUJO

Bsicamente podemos obtener los siguientes datos:
El tamao celular relativo ( Forward Scatter o FSC)
La complejidad interna o granularidad relativa (Side Scatter o SSC)
Intensidades relativas de emisin de fluorescencia ( FL1, FL2, FL3
,FL4..etc..)
A travs de dos tipos de seales:
A) Seales de dispersin.
La dispersin resulta de la interaccin de la luz con una partcula que produce
un cambio de direccin (no de la longitud de onda) en todas las direcciones del
espacio. Las caractersticas morfolgicas que determinan la dispersin de la luz
son fundamentalmente el tamao celular, la membrana, el ncleo y el material
granular del interior de la clula, llamado complejidad. En los Citmetros de
Flujo se miden dos fracciones de dispersin:
-La luz dispersada en ngulo cnico pequeo (0-10) que casi coincide con la
direccin de la luz incidente, llamada FSC (Forward Scatter). Es una medida
proporcional al tamao de la partcula que produce la dispersin.
-La luz dispersada en ngulo recto llamada SSC (Side Scatter). Es proporcional
a la complejidad de la estructura interna de la partcula.
(WWW.CITOMETRIADEFLUJO.COM)

B) Seales de Fluorescencia.

Los citmetros de flujo permiten detectar seales de fluorescencia procedentes

de complejos Antigeno/Anticuerpo marcados con un fluorocromo y situados en
una clula, siendo la cantidad de seal de fluorescencia emitida igual a la
proporcin de la cantidad de componentes fluorescentes de la partcula.
7.4. ANLISIS DE DATOS
En general todos los citmetros presentan los datos en algunos formatos
standard.
Histograma: segn un parmetro.

Grficos de puntos: Cualquier combinacin de dos parmetros de los datos

obtenidos para la poblacin de clulas.

7.5. VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Debido a la necesidad de utilizar una suspensin de partculas (clulas,
ncleos, cromosomas, etc), para ser ledos de una en una hace que se pierda
informacin sobre la arquitectura de los tejidos que componen las clulas o de
las propias clulas, as como la ineraccin entre estas y el medio que las rodea
(patrones nodulares o difusos de los linfomas). Frente a este inconveniente la
CMF presenta mltiples ventajas frente al microscpio de fluorescencia y las
tcnicas citoqumicas, como:
Posibilidad de empleo de multiples frente a un solo marcaje de la citoqumica
y la microscopia de fluorescencia.
Posibilidad de analizar un elevado nmero de partculas en un corto perodo
de tiempo (5000 partculas/segundo).
Posibilidad de cuantificar la por medio de los canales medios de
fluorescencia.

 Mayor sensibilidad y objetividad que le permiten detectar enfermedad

mnima residual y caracterizar poblaciones celulares poco abundantes en
condiciones normales como los basfilos.
Posibilidad de analizar poblaciones celulares y epitopos celulares.
Permite almacenar informticamente la informacin del anlisis para poderla
utilizar en cualquier momento y reanalizar anlisis hechos con anterioridad.
Posibilidad de cuantificar las molculas antignicas presentes en un grupo
celular.
7.6. QU DATOS PODEMOS OBTENER DE LAS CLULAS UTILIZANDO UN
CITMETRO DE FLUJO? A QU VELOCIDAD?
La iluminacin de las clulas con luz LASER nos permite conocer el tamao y la
complejidad de los diferentes tipos de clulas. Si agregamos el uso de
molculas fluorescentes para marcar estructuras celulares (por ej. cido
desoxirribonucleico o ADN, cido ribonucleico o ARN, antgenos, etc.) se ampla
enormemente sus posibilidades de deteccin. Dichas sustancias fluorescentes,
al ser iluminadas por la luz LASER, emiten seales lumnicas en diferentes
longitudes de onda (que son captadas por diferentes detectores) con lo cual
podemos obtener valiosa informacin de las propiedades de una poblacin
celular. En un citmetro convencional logramos informacin sobre al menos 5
parmetros (por ejemplo tamao, complejidad, contenido de ADN, viabilidad
celular y presencia o ausencia de antgenos). Lo interesante de esta
metodologa es que no slo aporta muchos datos en forma simultnea, sino
que lo realiza a velocidades que parecen asombrosas porque es capaz de
analizar al menos 1000 clulas en solamente un segundo!
Los citmetros de flujo de mayor complejidad son tambin capaces de clasificar
a las clulas que resulten de inters para el investigador. Entendemos por
clasificar la posibilidad de separar del resto a un conjunto de clulas que
comparten una o varias propiedades y recolectarlas en un tubo, placa de
cultivo o portaobjeto. Esto permite llevar a cabo estudios ms sofisticados de
una poblacin de clulas similares, iniciar cultivos de un mismo tipo celular,
etc. Para dar una idea de la especificidad del mecanismo de separacin de los
citmetros de flujo cabe mencionar que se emplean para separar los distintos
tipos de cromosomas de la especie humana u otras especies. La obtencin de
suspensiones cromosmicas de elevada pureza mediante citometra de flujo ha
permitido formidables avances en el conocimiento del genoma humano y en la
obtencin de sondas moleculares aplicables a diagnstico citogentico de
diversas patologas.
Explicar en detalle el mecanismo que se utiliza para clasificar los diferentes
tipos de clulas o cromosomas excede los objetivos de esta introduccin. Basta
mencionar que para lograrlo se fragmenta la columna lquida en pequeas
gotitas haciendo vibrar la boquilla a ms de 20.000 veces por segundo!. Luego
de ajustes apropiados, se logra que cada gotita contenga una clula o
cromosoma. Cuando el citmetro detecta una clula o cromosoma de inters
para clasificar, el aparato carga elctricamente la columna liquida de forma tal

que slo la gota que contiene el evento de inters (clula) queda cargada.
Finalmente, el sistema direcciona dicha gota con la clula hacia un tubo
recolector al ser desviada por un intenso campo elctrico.
7.7. QU APLICACIONES TIENEN LOS CITMETROS DE FLUJO EN LA
INVESTIGACIN BSICA Y APLICADA?
El campo de aplicacin de este tipo de instrumentos crece rpidamente da a
da ya que son numerosas las reas de la biologa y medicina que se benefician
de su uso. Entre otras aplicaciones, se encuentra la tipificacin de las
leucemias y los linfomas que permite alcanzar un diagnstico preciso,
permitiendo un tratamiento y seguimiento ms adecuado y eficaz. Otra
aplicacin muy importante es el estudio de las poblaciones linfocitarias
afectadas por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del
Sndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) que permite conocer en los
individuos afectados su capacidad de respuesta inmunitaria, de capital
importancia para el seguimiento de la evolucin de la infeccin y el tratamiento
adecuado para el paciente.
El estudio de la cantidad de material hereditario (ADN) posee numerosas
aplicaciones. En medicina, se emplea para evaluar si existen cambios
genticos en poblaciones de clulas tumorales. La presencia de estos cambios
tiene importancia en el prnostico de la enfermedad maligna. Dado el elevado
nmero de clulas a analizar para realizar estos diagnsticos, el citmetro de
flujo es la herramienta indicada para este tipo de estudios. Tambin es posible
estimar si las clulas han sufrido cambios relevantes en el ADN, as como
evaluar su nivel de proliferacin ya que con frecuencia las clulas malignas
crecen con mayor rapidez que las normales. El citmetro es capaz de
cuantificar el grado de proliferacin celular, es decir la tasa con que las clulas
se multiplican. En el campo de la biologa, la citometra de flujo se ha tornado
el mtodo ms empleado para determinar el contenido exacto de ADN de cada
especie, lo cul es de suma importancia para estudios genticos, evolutivos y
biotecnolgicos. A su vez, se pueden realizar estudios del nivel de ploidia,
anlisis cromosmicos y estudios del dao del ADN.

CITOMETRA DE FLUJO
Los citmetros de flujo analizan clulas en suspensin que intefieren en
forma individual con una fuente de luz; la interseccin de cada clula con la luz
lser provoca la emisin de una serie de seales luminosas que permite
diferenciar poblaciones celulares dentro de la muestra analizada, por su
tamao relativo, por sus granulaciones o bien por su reactividad a
fluorocromos, previa incubacin con anticuerpos monoclonales.
Los instrumentos de la citometra de flujo (CF) pueden dividirse en tres
compartimientos funcionales: hidrulico, ptico y electrnico. El primero
consiste en un complejo de fludos de diferentes presiones que obligan a las
clulas a pasar en un arreglo constante y secuencial a travs de un pequeo

orificio hacia un punto espacial conocido como deinterseccin o

de interrogacin. En este punto las clulas son iluminadas por una fuente
de luz muy intensa, habitualmente rayos lser, y sus diversas reacciones son
detectadas por un sistema de lentes, filtros y espejos, que conducen las
seales luminosas hacia fotodiodos y/o fotomultiplicadores.
Estas seales son digitalizadas por un ordenador electrnico que integra la
informacin recibida de cada una de las clulas en su paso de interseccin.
La CF puede analizar as desde unas centenas de clulas hasta varios millones
de clulas en unos cuantos segundos.

La CF es una herramienta que da a da demuestra tener innumerables

aplicaciones en el rea biomdica por citar algunos ejemplos: en el monitoreo
de subpoblaciones linfocitarias, linfocitos CD4+ y CD8+ en el sndrome de
inmunodeficiencia adquirida, inmunotipaje de leucemias y linfomas, su utilidad
es evidente en el diagnstico de leucemias megacarioblsticas. En el
diagnstico de enfermedades autoinmunes como la prpura trombocitopnica
idioptica, las anemias hemolticas y las neutropenias. En la cuantificacin
de ADN, informa sobre la existencia o no de anomalas de ADN(aneuploidias),
y contribuye al diagnstico y valoracin pronstica con patologa tumoral.

En estudios de cariotipo representa un complemento y una alternativa a los

mtodos clsicos de los estudios de los cromosomas en metafase lo que
resulta de utilidad en la realizacin del mapeo gentico y en la produccin
de ADN recombinante. Otras aplicaciones son en la apoptosis y en el tipaje
dirigido al antgeno HLA-B27. Su aplicacin es tan amplia que esta tecnologa
ha pasado de ser una herramienta til en investigacin bsica a ser empleada
en la prctica habitual de muchos laboratorios clnicos.