COLEGIO CRISTIANO EL BUEN PASTOR

ASIGNATURA: BIOLOGIA

INVESTIGACION: EL ADN NECESITA

PALINDROMOS

AUTOR DE LA INVESTIGACION: YAHIR

APARICIO

GRUPO: Xll D

AO DE REALIZACION DE LA
INVESTIGACION: 2016

Indice:
. antecedentes.
. delimitacin de problemas .
.formulacin de una o varias hiptesis .
. conclusin.

El ADN necesita polindromos

Antecedentes
En la dcada de 1950 se descubri que los genes no eran nada ms y nada
menos que cadenas de nucletidos. Un descubrimiento que parece tan sencillo
desencaden, sin embargo, el nacimiento de una nueva era: la de la tecnologa
del ADN recombinante.
La primera molcula de ADN recombinante fue creada por Paul Berg, a
comienzos de los 70. Para aquella poca, los bilogos moleculares haban
aprendido a alterar genes individuales, cortar y pegar pedazos de ADN de
diferentes organismos y moverlos de uno a otro.
Otros pioneros de esta tecnologa fueron Stanley Cohen, un genetista
estadounidense, y Herbert Boyer, un bioqumico de la misma nacionalidad .
Cohen estaba interesado en aprender cmo los genes de plsmidos otorgan
resistencia a las bacterias y Boyer trabajaba con enzimas de restriccin por lo
que decidieron trabajar juntos en la combinacin de dos plsmidos resistentes
a antibiticos diferentes para crear una bacteria resistente a ambos.
Qu es la tecnologa del ADN recombinante?
ADN recombinante es una molcula que proviene de la unin artificial de dos
fragmentos de ADN. Por lo tanto, la tecnologa de ADN recombinante es el
conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen de un organismo, para su
posterior manipulacin e insercin en otro diferente. De esta manera podemos
hacer que un organismo o un virus produzca una protena que le sea
totalmente extraa.
Estas tcnicas se emplean normalmente para la produccin de protenas en
gran escala, ya que podemos hacer que una bacteria produzca una protena
humana y lograr una superproduccin, como en el caso de la insulina humana,
que actualmente es producida por bacterias en grandes recipientes de cultivo,
denominados biorreactores. Como las bacterias se multiplican muy
rpidamente y pueden expresar grandes cantidades de protenas, es posible
lograr una sobreproduccin de la protena deseada. A esto justamente se
dedica la biotecnologa, es decir a la utilizacin de organismos vivos o de sus
productos con fines prcticos.

El desarrollo de la tecnologa del ADN recombinante fue posible gracias a varias

lneas de investigacin:
1) el conocimiento de las enzimas de restriccin,
2) la replicacin y reparacin de ADN,
3) la replicacin de virus y plsmidos y
4) la sntesis qumica de secuencias de nucletidos.

Cmo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: enzimas de restriccin

En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O. Smith descubrieron un tipo de protenas
-las enzimas endonucleasas o enzimas de restriccin- que actan como "tijeras
moleculares", cortando la doble cadena de ADN a travs del esqueleto de
fosfatos sin daar las bases. El descubrimiento de estas enzimas condujo a
dichos microbilogos al Nobel en 1978 y dio origen a la ingeniera gentica.
Las enzimas de restriccin son producidas por bacterias como mtodo de
defensa contra virus y degradan el ADN extrao.
A su vez, el propio genoma bacteriano est protegido contra sus enzimas de
restriccin mediante metilaciones Estas molculas son indispensables para la
ingeniera gentica, ya que producen fragmentos que se pueden unir entre s
fcilmente
Las enzimas de restriccin cortan dejando extremos cohesivos o romos. Los
extremos cohesivos son generados cuando la enzima corta las dos hebras
asimtricamente, dejando los extremos de cada hebra de simple cadena
complementarios entre s. Por otro lado, los extremos romos son generados
cuando la enzima corta las dos hebras por el mismo lugar, generando dos
extremos doble cadena.
Enzimas de restriccin. Este tipo de endonucleasas puede dejar dos tipos de
extremos. En el primer caso, el corte genera nuclotidos de simple cadena
llamados extremos cohesivos. Estos extremos se pueden unir por medio de
otra enzima, la ADN ligasa. En el segundo caso, se generan extremos doble
cadena . Estos extremos tambin pueden ser unidos con la ayuda de una
enzima ligasa pero, como no los extremos no son complementarios, la unin
ser ms inespecfica.
Las enzimas de restriccin permiten cortar el genoma de cualquier organismo
en pequeos fragmentos llamados fragmentos de restriccin. La coleccin de
miles o millones de estos fragmentos se llama biblioteca gnica.

Una vez que los bilogos encontraron cmo fabricar ADN recombinante usando
enzimas de restriccin y ligasas, el desafo siguiente fue cmo producir
grandes cantidades de genes y cmo introducirlos en bacterias u otras clulas
husped. El primer problema fue solucionado con el uso de plsmidos,
pequeas molculas de ADN circular presente en muchas bacterias.
Los plsmidos contienen uno o ms genes de resistencia a antibiticos y son
capaces de autorreplicarse, ya que contienen una secuencia de iniciacin. Esto
les permite replicarse de manera independiente del ADN genmico.
Podemos crear una molcula de ADN recombinante usando un plsmido. Este
proceso consta de las siguientes etapas:

Cortamos el ADN circular del plsmido con enzimas de restriccin, para generar
extremos cohesivos.
Cortamos el ADN que queremos multiplicar. Debemos asegurarnos de que los
extremos del plsmido y los del ADN a insertar sean complementarios y
puedan unirse.
Unimos el gen que queremos introducir por medio de la enzima ADN-ligasa y
luego introducimos el plsmido con inserto en bacterias.
Seleccionamos las bacterias que hayan introducido el plsmido con la ayuda de
antibiticos. Dado que los plsmidos contienen un gen de resistencia a
antibitico, al exponer las bacterias a ese antibitico, slo las que hayan
incorporado el plsmido sobrevivirn, mientras que las que no lo tengan
morirn.
Esta es una manera relativamente eficaz de obtener millones de copias del
ADN incorporado. Dado que todas las copias del gen provienen de una sola
molcula multiplicada a partir de una nica bacteria que dio origen a la colonia,
esta tcnica lleva el nombre de clonacin. El trmino clon proviene de la
jardinera; desde hace siglos los jardineros generan plantas nuevas a partir de
gajos. Estas plantas son genticamente idnticas y constituyen un clon.
Un clon es un grupo de clulas u organismos genticamente idnticas.
El uso fragmentos de ADN como vectores cumple un rol fundamental en la
ingeniera gentica, ya que sirven para transferir material gentico de un
organismo a otro.
Vector: cualquier organismo o virus capaz de mover genes de un organismo a
otro
Cmo amplificar el ADN? Reaccin en cadena de la polimerasa

Durante las dcadas de 1970-1980, la manera ms prctica de hacer mltiples

copias de una secuencia particular de ADN era introduciendo una molcula de
ADN recombinante (un plsmido ms un gen) en una clula husped. Esto
poda resultar un poco engorroso, ya que muchas veces se dispona de una
cantidad muy pequea de molculas de ADN para realizar pruebas.
A mediados de la dcada de los 80, la invencin de una tcnica capaz de
generar centenares de miles de copias de una secuencia sin la necesidad de
clonarla en ningn tipo de vector resolvi este problema. Kary Mullis, un
bioqumico americano que trabajaba sintetizando ADN, resolvi este problema
con la invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa.
Esta se basa en la separacin de ambas hebras de ADN, la posterior unin de
pequeos fragmentos y la extensin de estos fragmentos usando de molde el
ADN de la muestra. As se obtienen dos copias idnticas por cada molcula en
cada ciclo de reaccin. Para llevar a cabo esta reaccin se requiere de una
enzima polimerasa que sea capaz de soportar la alta temperatura del proceso
de desnaturalizacin. Esta enzima es una ADN-polimerasa especial obtenida de
una bacteria termfila resistente a altas temperaturas.
La reaccin en cadena de la polimerasa permite amplificar la muestra de
manera espectacular y su sensibilidad es tal que alcanza con una molcula
para que la reaccin genere una infinidad de copias. Esto la convierte en una
importante, si no imprescindible, herramienta para el anlisis de filiacin o de
criminalstica forense, ya que con slo una pequesima muestra se pueden
realizar diferentes estudios comparativos que nos permiten conocer el dueo
de un "rastro" gentico en particular.
Tambin se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnstico mdico,
como la deteccin de virus o de mutaciones que provocan enfermedades
genticas, a partir de una muestra de ADN tan pequea como un cabello o una
gota de sangre.
Otra aplicacin de la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa es la
transcripcin inversa de ARNm. Mediante el uso de una enzima de origen viral
denominada transcriptasa reversa puede usarse como molde una molcula de
ARNm, transcribirla a una secuencia de ADN, y luego ser amplificada como
cualquier otra secuencia por la reaccin en cadena de la polimerasa, con lo que
se obtiene una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas molculas de
ARNm. Esta tcnica es muy empleada para el estudio de expresin gnica, as
como para la produccin de protenas en diferentes organismos.
Hasta hace relativamente poco, encontrar un gen en un genoma era como
encontrar una aguja en un pajar. Si tuviramos que realizar dicha tarea,
probablemente usaramos un imn para atraer la aguja. De manera anloga,

hoy da podemos encontrar genes o protenas usando, respectivamente,

sondas y anticuerpos, que actan como imanes moleculares.
Las sondas son fragmentos de ADN o ARN de simple cadena complementarias
a la regin de ADN o ARN que queremos encontrar. Contienen alguna "marca"
que permite revelar su unin (hibridacin) a la secuencia elegida y de esa
manera revela presencia de la regin buscada.
Cmo se marcan esas sondas o fragmentos de cidos nucleicos? Las sondas
pueden ser "coloreadas" durante su sntesis utilizando nucletidos marcados
con istopos radiactivos. Otra manera de marcarlas es mediante la unin con
una molcula que pueda ser detectada posteriormente como fluorescente, un
marcador qumico que puede ser detectado por un anticuerpo, o una enzima
cuya actividad produce el cambio de color de su sustrato.
Una de las tcnicas ms empleadas para localizar fragmentos determinados
del genoma (o la expresin de algn gen en particular por medio de la
deteccin de la presencia de su correspondiente ARNm) es la hibridacin in
situ. Durante este proceso se incuba el ADN con una sonda (de ADN o ARN)
complementaria a la secuencia buscada, y marcada radiactiva o qumicamente.

La sonda "navega" por el interior de la clula hasta encontrar una secuencia

complementaria a ella. Una vez que esto ocurra se formar una doble cadena
que permitir no slo detectar la presencia de esta secuencia, sino indicar el
lugar especfico que ocupa dentro de la clula. Si se tratara de un fragmento de
un cromosoma, nos permitira saber su localizacin exacta o locus.
Para revelar la presencia de hibridacin de la sonda, la muestra debe
exponerse a una placa radiogrfica; en el caso de las sondas marcadas
qumicamente se procede a su revelado mediante el uso de molculas
fluorescentes o que puedan ser detectadas por colorimetra
Se puede tambin utilizar colonias de bacterias con ADN recombinante con una
tcnica similar, pero que usa anticuerpos en vez de sondas. Se comienza por
una colonia de bacterias que contengan y expresen el gen de ADNc. Luego se
trata las bacterias con un anticuerpo marcado, que se unir a la colonia que
sintetice la protena deseada. De esta manera se puede localizar el gen en
cuestin y clonarlo para obtener mltiples copias.
Si visitamos un laboratorio de biologa molecular, probablemente
encontraremos una cuba con un gel al cual se le aplica una corriente elctrica.
Este mtodo, llamado electroforesis en gel, es muy usado para separar
molculas de diversos tamaos y es la base de las tcnicas que describiremos
para identificar ADN, ARN, y protenas. En los prrafos siguientes describiremos

entonces la electroforesis para poder comprender luego cmo funcionan las

dems tcnicas.
Separacin de cidos nucleicos y protenas. Electroforesis en gel
La electroforesis en gel es uno de los mtodos ms utilizados en los
laboratorios para separar cidos nucleicos o protenas, de acuerdo con su
tamao. Esto se logra por la diferencia de desplazamiento de las molculas a lo
largo de un gel sometido a un campo elctrico. La carga elctrica sirve como
fuerza impulsora que atrae las molculas cargadas negativamente hacia el otro
extremo del gel que posee carga positiva. Existen distintos tipos de gel;
comnmente se utiliza agarosa o poliacrilamida.
La velocidad de desplazamiento de las molculas es inversamente proporcional
a su tamao. En los cidos nucleicos la carga est dada por los nucletidos, por
lo que el tiempo que tardar la molcula en atravesar el gel ser directamente
proporcional al nmero de nucletidos que tenga, es decir a su tamao. De
esta manera, para un tiempo determinado, las molculas ms grandes
quedarn ms retrasadas en el gel que las molculas ms pequeas.
La separacin de protenas es un poco mas complicada, ya que stas poseen
una estructura tridimensional compleja y compacta, adems de una carga neta
que depende de la identidad de los aminocidos que la componen. Esto hace
ms difcil separarlas slo por su tamao y por eso se emplea una versin
modificada conocida como electroforesis en gel de poliacrilamida. Las protenas
forman bandas de acuerdo con su tamao; si se corre una muestra con
protenas de tamao conocido se puede determinar el tamao de la protena
estudiada por la distancia recorrida en el gel. Las protenas ms grandes
quedarn arriba y las ms chicas quedan abajo (y las de tamao medio
quedarn entre las dems). Adems, el grosor de la banda obtenida depender
de la cantidad de protena que se haya sembrado; cuanto mayor sea la
cantidad de protenas, ms gruesa ser la banda.
electroforesis
Electroforesis en gel. Se siembra la muestra en un gel que es sometido a una
corriente elctrica. Las molculas se mueven a travs del gel impulsadas por
dicha corriente. Esta tcnica permite separar molculas de acuerdo a su
tamao y carga ya que las ms pequeas se mueven con mayor velocidad. El
grfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta cantidad
y tamao de la muestra de protenas.
presencia de Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin en gel por
electroforesis como primer paso para identificar la determinadas molculas
dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en
1975 para la deteccin de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se

realiza la transferencia de las muestras a una membrana para su posterior

revelado. Luego se utiliz el mismo sistema para detectar ARN y se lo
denomin Northern Blot
Estas dos tcnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y
emplean secuencias especficas (sondas) complementarias a la molcula de
cido nucleico a identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridacin de cidos
nucleicos para la deteccin de las molculas buscadas. Los principios generales
son los mismos, pero hay diferencias en el procedimiento debidas
principalmente a que el ARN se degrada mucho ms fcilmente que el ADN;
esto hace necesario tomar muchas ms precauciones.
Una vez sembradas las muestras en un gel, se realiza una corrida
electrofortica hasta lograr que las molculas se separen por tamaos de
manera tal que se puedan distinguir las buscadas. Luego se transfieren los
cidos nucleicos del gel a la membrana. De esta manera los que quedan
retenidos pueden ser sometidos a ensayos de hibridacin con sondas
especficas para detectar la presencia de determinadas secuencias.
Estas dos tcnicas persiguen fines distintos: el Southern Blot, que detecta la
presencia de ciertas secuencias en el ADN, se usa, por ejemplo, para estudiar
mutaciones en el genoma. El Northern, en cambio, permite detectar qu genes
son transcriptos en determinadas condiciones. Hemos visto que dos clulas del
mismo organismo se distinguen por los genes que expresan y no por su ADN. El
Southern Blot nos permite evidenciar el mismo material gentico y el Northern
Blot, la expresin de diferentes genes.
Si luego queremos detectar protenas, usaremos otra tcnica similar: el
Western Blot, que deriva de la electroforesis en gel y separa protenas
mediante la utilizacin de anticuerpos especficos. Una vez que la muestra con
las protenas que se quiere identificar ha corrido en un gel, se la transfiere a
una membrana especial donde las protenas quedan "ancladas" o adheridas.
Despus, se incuba esta membrana con el anticuerpo especfico contra la
protena blanco, y se revela. Con esta tcnica pueden obtenerse datos
aproximados del tamao de la protena y su concentracin en la muestra
sembrada.
Otra tcnica que emplea la hibridacin de sondas especficas marcadas es la
de microarreglos que consta de una membrana dividida en celdillas que
poseen adheridas sondas que representan un gen en particular. En conjunto,
estas celdillas contienen todos los genes conocidos de un organismo. De esta
manera, cuando se coloca una muestra en estos chips se ir hibridando cada
gen que se encuentre en la muestra con su sonda correspondiente en la casilla
determinada. Cuando una celdilla da positivo, quiere decir que ese gen
determinado est presente en la muestra.

Los ensayos con microarreglos son rpidos de realizar, pero muy engorrosos de
analizar. Adems, estn muy limitados a los genes que ya se conocen.
Permiten obtener un pantallazo rpido sobre qu est pasando en la clula en
ese momento determinado, en cuanto a qu genes estn encendidos y cules
apagados. Sin embargo, los resultados obtenidos nunca deberan ser
concluyentes, sino que tendran que ser validados mediante otras tcnicas.

Delimitacin de problemas:
1.
2.
3.
4.

de que manera introducir ADN recombinante en las bacterias?

de que manera encontrar el gen adecuado?
de que manera estudiar la expresin de diversos genes?
De que manera encontrar el gen adecuado con microarreglos?

Formulacin de una o varias hiptesis:

PREGUNTA UNO

Una vez que los bilogos encontraron

cmo fabricar ADN recombinante
usando enzimas de restriccin y
ligasas, el desafo siguiente fue cmo
producir grandes cantidades de genes
y cmo introducirlos en bacterias u
otras clulas husped. El primer
problema fue solucionado con el uso
de plsmidos, pequeas molculas de
ADN circular presente en muchas
bacterias.
Los plsmidos contienen uno o ms
genes de resistencia a antibiticos y
son capaces de autorreplicarse, ya
que contienen una secuencia de
iniciacin. Esto les permite replicarse
de manera independiente del ADN
genmico.

PREGUNTA DOS

Hasta hace relativamente poco,

encontrar un gen en un genoma era
como encontrar una aguja en un
pajar. Si tuviramos que realizar dicha
tarea, probablemente usaramos un
imn para atraer la aguja. De manera

PREGUNTA TRES

PREGUNTA CUATRO

anloga, hoy da podemos encontrar

genes o protenas usando,
respectivamente, sondas y
anticuerpos, que actan como imanes
moleculares.
presencia de Existen diferentes
tcnicas que emplean la separacin
en gel por electroforesis como primer
paso para identificar la determinadas
molculas dentro de una muestra.
Una de ellas fue inventada por
Edward M. Southern en 1975 para la
deteccin de ADN. Una vez finalizada
la corrida en el gel, se realiza la
transferencia de las muestras a una
membrana para su posterior revelado.
Luego se utiliz el mismo sistema
para detectar ARN y se lo denomin
Northern Blot
Estas dos tcnicas consisten en una
electroforesis seguida de
transferencia y emplean secuencias
especficas (sondas) complementarias
a la molcula de cido nucleico a
identificar. Es decir, ambas utilizan la
hibridacin de cidos nucleicos para
la deteccin de las molculas
buscadas. Los principios generales
son los mismos, pero hay diferencias
en el procedimiento debidas
principalmente a que el ARN se
degrada mucho ms fcilmente que el
ADN; esto hace necesario tomar
muchas ms precauciones.
Otra tcnica que emplea la
hibridacin de sondas especficas
marcadas es la de microarreglos que
consta de una membrana dividida en
celdillas que poseen adheridas sondas
que representan un gen en particular.
En conjunto, estas celdillas contienen
todos los genes conocidos de un
organismo. De esta manera, cuando
se coloca una muestra en estos chips

se ir hibridando cada gen que se

encuentre en la muestra con su sonda
correspondiente en la casilla
determinada. Cuando una celdilla da
positivo, quiere decir que ese gen
determinado est presente en la
muestra.

Conclusiones:
El ADN recombinante es resultado del uso de diversas tcnicas que los bilogos
moleculares utilizan para manipular las molculas de ADN y difiere de la
recombinacin gentica que ocurre sin intervencin dentro de la clula. El
proceso consiste en tomar una molcula de ADN de un organismo, sea virus,
planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro
de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresin de un gen,
para producir protenas en el tratamiento de una enfermedad gentica,
vacunas o con fines econmicos y cientficos.