UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL

FRANCISCO DE MIRANDA
REA DE TECNOLOGA
COMPLEJO ACADEMICO EL SABINO
PROGRAMA DE INGENIERA QUMICA

EVALUACIN DE MTODOS EXTRACTIVOS DE COMPUESTOS

BIOACTIVOS A PARTIR DEL CULTIVO A ESCALA INTERMEDIA DE
Dunaliella sp.

Trabajo Especial de Grado

presentado ante la ilustre
Universidad Nacional experimental
Francisco de Miranda
Para optar al ttulo de Ingeniero Qumico

AUTOR(ES):
Arenas, Carmen. C.I. V- 19.648.568
Riera, Carlos. C.I. V- 20.553.557
TUTORA:
Barreno, Dilia. C.I. V- 13.554.681

Punto Fijo, Enero 2016

VEREDICTO

Quienes suscribimos miembros del jurado para evaluar el Trabajo Especial

de Grado titulado:
EVALUACIN

DE

MTODOS

EXTRACTIVOS

DE

COMPUESTOS

BIOACTIVOS A PARTIR DEL CULTIVO A ESCALA INTERMEDIA DE

DUNALIELLA SP.
Realizado por el Br. Arenas, Carmen C.I.: 19.648.568 y Br. Riera, Carlos
C.I.:20.553.557 mediante la presente hacemos constar que aprobamos el
referido trabajo presentado en cumplimiento de los requisitos establecidos en
el pensum del Programa de Ingeniera Qumica del rea de Tecnologa de la
Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda para optar al
ttulo de:
INGENIERO QUMICO

Jurado Principal

Jurado Principal

Coordinador

DEDICATORIA
A Dios, por regalarme la vida y guiarme en cada paso que doy para alcanzar
mis metas trazadas.
A mis padres, por su cario y apoyo incondicional en todo momento,
dedicando esfuerzos para verme alcanzar este ttulo de Ingeniero Qumico.
A mis padres de crianza, por estar ah cuando ms los necesito y por su
deseo de hacer de m una mujer integra con valores y con un ttulo
universitario.
A mi Hijo Sebastian, quien llego a este mundo para llenarme de fortalezas,
demostrndome que todos los sueos trazados se pueden cumplir.
A mi esposo, por apoyarme a lo largo de esta carrera, y por ayudarme a
superar cada tropiezo encontrado.

Carmen Julia Arenas Gmez

DEDICATORIA
A Dios padre todo poderoso, todo mi logro es para ti, te amo
inmensamente y contigo vendrn muchas bendiciones ms.
A mis padres, que han sido fuente de inspiracin para culminar este logro,
cosechando en m, valores para ser mejor hombre de Dios cada da, este
logro es de ustedes tambin, los amo.
A mis hermanos Karla Cristina y Luis Carlos, que estuvieron conmigo en
las dificultades y me dieron ese aliento para perseverar en la culminacin de
esta meta, los amo.
A mi novia Angelis, que desde que llegaste a mi vida, has iluminado con tu
carisma y tu ser, toda oscuridad que haba en ella, adems de llenar de
alegras mi alma para ayudarme siempre en la culminacin de esta meta, y
s que confiados en nuestro padre celestial, caminaremos juntos hasta el
cielo y la eternidad. Te quiero.

Carlos Enrique Riera Daz

AGRADECIMIENTOS
A Dios, por

llenarme de sabidura y perseverancia para luchar por mis

sueos.
A mis Padres, por creer en m, y brindarme el amor adems de sus aportes,
consejos y orientacin a lo largo de mi carrera para que obtuviera un titulo
profesional.
A mi mayor fuente de inspiracin, la luz de mis ojos, Mi VIDI Sebastian
Eduardo, quien ha llenado mi vida de alegra.
A mi Esposo, por su apoyo en todo momento, aun en los momentos ms
difciles.
A mi compaero de Tesis, por el apoyo y la comprensin demostrada
durante el desarrollo de nuestra tesis.
A la profesora Dilia Barreno, por ofrecernos la oportunidad de desarrollar
este trabajo de grado.
Al Tutor Industrial Jorge Jurado, por compartir sus conocimientos y
experiencias para la realizacin de esta investigacin.
A la profesora Yolanda Reyes, por las asesoras brindadas y por compartir
sus conocimientos.

Carmen Julia Arenas Gmez

AGRADECIMIENTOS
A Dios, gracias por brindarme el don de la sabidura y la ciencia, que
mediante tu espritu santo se hizo presente en m, en los momentos que ms
lo necesitaba, eres la gracia de toda mi vida y mi ser.
A mis padres, que han dedicado toda su vida para que hoy me vean
culminar este logro, gracias por su esfuerzo y hacerme cada da un mejor
hombre al servicio de Dios, mil gracias por todo. Los amo inmensamente.
A mis hermanos, por su apoyo y nimos en culminar este logro, gracias a
todos.
A mi familia Riera y Daz, que siempre estuvieron al pendiente del
desarrollo de mi carrera para que hoy sea un profesional integral, los quiero
a todos.
A mi novia Angelis, que siempre estuvo conmigo en los momentos difciles,
para ayudarme a levantarme, seguir adelante, para resurgir y nunca darme
por vencido, gracias por todo mi princesa del cielo. Te quiero.
A mi compaera de tesis, que a pesar de todas las cosas que nos pasaron,
nunca bajamos la cabeza y mutuamente continuamos en el desarrollo de
nuestro trabajo de grado.
A mi hermano del alma Edward Alcal, por siempre darme apoyo moral y
ayudarme en la culminacin de este trabajo, s que cada uno forjar su
destino con la mano de Dios en su camino, te quiero hermanazo, gracias por
todo.
A la profesora Dilia Barreno, por darnos la oportunidad de desarrollar este
trabajo de investigacin, gracias por su comprensin y su dedicacin.

Al tutor Industrial Jorge Jurado, por brindarnos sus conocimientos y

apoyarnos en el desarrollo de esta investigacin.
A la profesora Yolanda Reyes, por las asesoras brindadas y por compartir
sus conocimientos.
A mis compaeros, de esta lnea de investigacin, Roderich Castillo,
Vernica Urza, Ana Bermdez, Freddy Guzmn y Yosmeli Molina, por
apoyarnos en todo el desarrollo de este trabajo de investigacin.
A mis amigos de Sistema Qumico (SQ), Michel Gmez, Francisco
Polanco, Osnellys Andrade, que siempre me dieron ese aliento para seguir
adelante, gracias por su amistad y por su comprensin, uno ms que se
grada de nuestro grupo y que nuestra amistad siempre est unida con la
mano de Dios, los quiero.

Carlos Enrique Riera Daz

NDICE GENERAL
DEDICATORIA.......................................................................................................................... I
AGRADECIMIENTOS............................................................................................................. III
NDICE GENERAL................................................................................................................. VI
NDICE DE TABLAS............................................................................................................ VIII
NDICE DE FIGURAS............................................................................................................. IX
NDICE DE GRFICOS........................................................................................................... X
NDICE DE ANEXOS.............................................................................................................. XI
NDICE DE APNDICES....................................................................................................... XII
INDICE DE ECUACIONES................................................................................................... XIII
RESUMEN........................................................................................................................... XIV
INTRODUCCIN..................................................................................................................... 1
CAPITULO I............................................................................................................................. 3
EL PROBLEMA....................................................................................................................... 3
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.............................................................................................3
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIN............................................................................................ 5
Objetivos General............................................................................................................ 5
Objetivos Especficos....................................................................................................... 5
JUSTIFICACIN....................................................................................................................... 5
ALCANCE Y DELIMITACIONES................................................................................................... 6
CAPTULO II............................................................................................................................ 8
MARCO TERICO.................................................................................................................. 8
ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIN.....................................................................................8
BASES TERICAS.................................................................................................................. 11
Microalga Dunaliella....................................................................................................... 11
Compuestos bioactivos a partir de la microalga Dunaliella sp.......................................12
Beta () caroteno........................................................................................................... 14
Requerimientos para el crecimiento de la Dunaliella sp.................................................15
Produccin de Biomasa a partir de microalgas..............................................................17
Fotobiorreactor............................................................................................................... 19
Tcnicas de recuperacin de biomasa microalgal.........................................................20
Procesos de extraccin de aceites................................................................................21
Extraccin convencional con solventes......................................................................................22
Extraccin no convencional con FSC.........................................................................................22

Dixido de Carbono....................................................................................................... 24
Descripcin del mtodo de extraccin por medio de fluidos supercrticos (EFS)...........25
TRMINOS BSICOS.............................................................................................................. 26
CAPITULO III......................................................................................................................... 28

MARCO METODOLGICO................................................................................................... 28
TIPO DE ESTUDIO Y DISEO DE LA INVESTIGACIN..................................................................28
INSTRUMENTACIN Y TCNICAS DE RECOLECCIN DE DATOS...................................................29
TCNICAS DE PROCESAMIENTOS Y ANLISIS DE DATOS...........................................................30
POBLACIN Y MUESTRA........................................................................................................ 30
Poblacin....................................................................................................................... 30
Muestra.......................................................................................................................... 31
FASES DE LA INVESTIGACIN................................................................................................ 31
Fase I. Obtencin de biomasa algal...............................................................................31
-

Conservacin y escalamiento del cultivo...........................................................................31

Evaluacin cintica del crecimiento de Dunaliella sp........................................................33
Cosechado de biomasa algal............................................................................................34
Concentracin y productividad de biomasa.......................................................................35

Fase II: Aplicacin de mtodos extractivos de compuestos bioactivos en Dunaliella sp.

....................................................................................................................................... 36
I etapa. Mtodos de extraccin convencional............................................................................36
II etapa. Extraccin no convencional..........................................................................................39

FASE III: Analizar los rendimientos de los compuestos bioactivos obtenidos por los
mtodos de extraccin................................................................................................... 40
CAPTULO IV........................................................................................................................ 41
RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS...................................................................41
FASE I. OBTENCIN DE BIOMASA ALGAL.................................................................................41
Escalamiento del cultivo.................................................................................................41
Evaluacin Cintica del crecimiento de Dunaliella sp....................................................49
Evaluacin de tcnicas de cosechado...........................................................................51
Biofloculacin por quitosano......................................................................................................51
Autofloculacin........................................................................................................................... 54
Comparacin de mtodo de cosechado biofloculacin por quitosano y autofloculacin...........56

Concentracin y productividad de Biomasa...................................................................58

FASE II. APLICACIN DE MTODOS EXTRACTIVOS DE COMPUESTOS BIOACTIVOS EN DUNALIELLA
SP....................................................................................................................................... 60
Extraccin lquido-lquido con mezclas binarias.............................................................60
Extraccin slido-lquido con mezcla ternaria................................................................63
Extraccin con CO2 supercrtico....................................................................................64
FASE III. ANLISIS DE LOS RENDIMIENTOS DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS OBTENIDOS POR
LOS MTODOS DE EXTRACCIN............................................................................................. 67
Extraccin lquido-lquido con mezclas binarias.............................................................67
Extraccin con CO2 supercrtico....................................................................................71
Comparacin de los mtodos extractivos utilizados en la obtencin de carotenoides...72
CONCLUSIONES.................................................................................................................. 74
RECOMENDACIONES.......................................................................................................... 75
BIBLIOGRAFA..................................................................................................................... 76
ANEXOS................................................................................................................................ 82

APENDICES.......................................................................................................................... 97

NDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ventajas y desventajas de tipos de reactores de cultivo de
microalgas.......................................................................................................18
Tabla 2. Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes tipos de fluidos....24
Tabla 3. Resumen de condiciones del cultivo.................................................32
Tabla 4. Extracciones experimentales con mezclas binarias.........................37
Tabla 5. Condiciones de operacin de la planta piloto de extraccin.............39
Tabla 6. Parmetros cinticos de Dunaliella sp., en las diferentes etapas del
cultivo..............................................................................................................49
Tabla 7. Productividad de la biomasa del fotobiorreactor comparada con otras
investigaciones................................................................................................59
Tabla 8. Concentracin promedio de carotenoides totales por clula
(pg.cl-1 DS) extrados de Dunaliella sp........................................................60
Tabla 9. Carotenoides extrados con solventes orgnicos comparado con los
reportados por otras investigaciones..............................................................62
Tabla 10. Concentracin promedio de carotenoides totales por clula
(pg.cl-1 DS) extrados de Dunaliella sp........................................................63
Tabla 11. Extracciones experimentales de la primera experiencia.................65
Tabla 12. Extracciones experimentales varindo la muestra alimentada.......66
Tabla 13. Anlisis de varianza para la obtencin de carotenoides suma de
cuadrados tipo III.............................................................................................67
Tabla 14. Resumen de experiencia con fluidos supercrticos.........................71

NDICE DE FIGURAS
Figura 1. Clula de Dunaliella sp., en fase vegetativa y en condicin de
estrs...............................................................................................................12
Figura 2. Estructura del -caroteno................................................................15
Figura 3. Configuracin de fotobiorreactores: a: estanques, b: placas planos,
c: cilndricos, d: tubulares horizontales...........................................................20
Figura 4. Diagrama de fases slido/lquido/gas. PT: punto triple, PC: punto
crtico, Pc: presin crtica, Tc: temperatura crtica..........................................23
Figura 5. Escalamiento del cultivo..................................................................32
Figura 6. Biomasa seca de Dunaliella sp. (a), extraccin antes de la agitacin
(b), primera rplica de extraccin ternaria (c), segunda replica de extraccin
ternaria (d).......................................................................................................38
Figura 7 . Cultivo Control (a, b) y Fotobiorreactor (c, d).................................46
Figura 8. Sistema de aireacin en el fotobiorreactor......................................48
Figura 9. Cultivo en fase vegetativa (a), cultivo en fase carotenognicaautofloculacin (b)...........................................................................................54
Figura 10. Cultivos expuestos a condiciones de estrs propicias para la
autofloculacin................................................................................................55
Figura 11. Biomasa seca cosechada en cpsula Pietri..................................59
Figura 12. Dunaliella sp., junto al coosolvente hexano..................................66
Figura 13. Extracto obtenido...........................................................................67
Figura 14. Montaje Experimental de estacin fluidos supercrticos...............96

10

NDICE DE GRFICOS
Grfica 1. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 300 mL.............................43
Grfica 2. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 800 mL.............................43
Grfica 3. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 3 L....................................44
Grfica 4. Crecimiento Dunaliella sp en fotobiorreactor y cultivo control.......45
Grfica 5. Curvas de crecimiento de las repeticiones durante la puesta en
marcha del fotobiorreactor..............................................................................49
Grfica 6. Media de pH monitoreado en concentraciones 40 mg/L y 200 mg/L
.........................................................................................................................53
Grfica 7. Media de porcentaje de remocin de microalgas en cosecha de
quitosano a 40 mg/L y 200 mg/L.....................................................................54
Grfica 8. Porcentaje de remocin en autofloculacin...................................56
Grfica 9. Porcentaje de remocin de microalgas con los mtodos de
cosecha evaluados.........................................................................................58
Grfica 10. Efecto del Nivel de Acetona sobre la obtencin de carotenoides70
Grfica 11. Efecto de la mezcla de Solventes sobre la obtencin de
carotenoides....................................................................................................71
Grfica 12. Grfico de interacciones para el nivel de acetona-Mezcla de
Solventes.........................................................................................................71

11

NDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Conteo en cmara de Neubauer.....................................................82
Anexo 2. Formulacin de medios de Cultivo..................................................82
Anexo 3. Densidades celulares a escala 300 mL...........................................83
Anexo 4. Densidades celulares a escala de 800 mL......................................84
Anexo 5. Densidades celulares a escala de 3 L.............................................84
Anexo 6. Densidades celulares en Fotobiorreactor y Cultivo Control............85
Anexo 7. Densidades celulares en repeticiones del Fotobiorreactor.............85
Anexo 8. pH evaluado en cosechado con quitosano a 200 mg/L.................86
Anexo 9. pH evaluado en cosecha con quitosano a 40 mg/L.......................86
Anexo 10 .Conteo en sobrenadante en cosechado con quitosano a 200 mg/L
.........................................................................................................................87
Anexo 11. Conteo en sobrenadante en cosechado con quitosano a 40 mg/L
.........................................................................................................................87
Anexo 12. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con
Quitosano a 200 mg/L.....................................................................................88
Anexo 13. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con
Quitosano a 40 mg/L.......................................................................................88
Anexo 14. Conteo en el sobrenadante en el cosechado con autofloculacin 89
Anexo 15. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con
autofloculacin................................................................................................89
Anexo 16. Comparacin de % de remocin de microalgas entre mtodos de
cosecha utilizados...........................................................................................90
Anexo 17. Cultivos desde 300 mL hasta 3L...................................................90
Anexo 18. Cultivo control y fotobiorreactor.....................................................90
Anexo 19. Cosechado por Quitosano.............................................................91
Anexo 20. Cosechado por Autofloculacin.....................................................91
Anexo 21. Extraccin Binaria..........................................................................92
Anexo 22. Extraccin Ternaria........................................................................92
Anexo 23. Diagrama triangular para el sistema etanol-hexano-agua............92
Anexo 24. Extraccin con fluidos supercrticos..............................................93
Anexo 25. Fotobiorreactor tubular tipo serpentin cilndrico............................93
Anexo 26. Estacin piloto de extraccin supercrtica.....................................94

12

NDICE DE APNDICES
Apndice 1. Evaluacin cintica de los cultivos.............................................98
Apndice 2. Determinacin de la concentracin y productividad de la
biomasa microalgal producida......................................................................100
Apndice 3. Carotenoides calculados en la extraccin binaria....................101
Apndice 4. Carotenoides calculados en la extraccin ternaria...................102
Apndice 5. Mtodo de extraccin con fluidos supercrticos........................103

13

INDICE DE ECUACIONES
Ecuacin 1. Velocidad de crecimiento............................................................33
Ecuacin 2. Tiempo de duplicacin................................................................33
Ecuacin 3. Porcentaje de algas removido....................................................34
Ecuacin 4. Concentracin de Biomasa.........................................................35
Ecuacin 5. Productividad de biomasa...........................................................35
Ecuacin 6. Carotenoides totales...................................................................37
Ecuacin 7. Carotenoides totales...................................................................38
Ecuacin 8. Porcentaje del rendimiento de extracto......................................40

14

RESUMEN
Arenas, C; Riera, C. Evaluacin de mtodos extractivos de compuestos
bioactivos a partir del cultivo a escala intermedia de Dunaliella sp..
Trabajo Especial de grado para optar al Ttulo de Ingeniero Qumico.
Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Punto Fijo, Enero
de 2016.
El presente trabajo consisti en la evaluacin de dos mtodos
convencionales y el mtodo no convencional con fluidos supercrticos para la
extraccin de compuestos bioactivos a partir de la biomasa de la microalga
Dunaliella sp., proveniente de la salina Las Cumaraguas, a travs de una
investigacin experimental-descriptiva. Se instalaron sistemas de cultivos en
medio nutritivo Miguel de 0.3, 0.8, 3, 13 y 16 L, obteniendo la mayor
densidad celular para un volumen de 16 L en un fotobiorreactor piloto, de
5,17 E+07 cl/mL en un tiempo de 10 das de cultivo. Se evaluaron a la vez,
dos mtodos de cosecha, biofloculacin con quitosano y autofloculacin,
resultando este ltimo el elegido para las siguientes fases de la investigacin
debido a que reduce gastos energticos y permite las condiciones de
carotenognesis de la Dunaliella sp., reportando porcentajes de remocin de
algas de 88,46 %. Se proces la materia prima cosechada, obteniendo una
productividad de biomasa de 250 (mg/L*das) al final del cultivo de 20 das
totales. Para la evaluacin del mtodo de extraccin con solvente binarios,
se estudi la influencia de la composicin de acetona y mezclas de
solventes, donde la extraccin con mejores resultados experimentales fue
utilizando acetona-metanol en concentraciones de 70/30 con un resultado de
21,76 1,26 pg/cl; en el caso de la extraccin ternaria se obtuvieron valores
de 30,24 1,08 pg/cl. En la extraccin con fluidos supercrticos, se obtuvo
un rendimiento de 0,424 % para las condiciones de 60C, 1200 psi, 100
gramos de biomasa alimentada y un tiempo de retencin de 5 horas. Con
base a los resultados obtenidos, se considera que los mtodos de extraccin
estudiados influyen sobre el rendimiento de los carotenoides obtenidos, sin
embargo cada una de esta extracciones se realizaron a las distintas
condiciones, por lo que los resultados no son del todo comparables.
Descriptores: Dunaliella sp., Extraccin, Carotenoides

15

INTRODUCCIN

En la actualidad Dunaliella sp., es una de las microalgas que

ms se cultiva industrialmente, por su potencialidad de acumular
compuestos bioactivos, productos de alto valor aadido, generados a
partir del procesamiento de la biomasa microalgal y que son de inters
comercial. El cultivo de este microorganismo y la extraccin de
compuestos

bioactivos,

se

ha

convertido

en

una

vertiente

biotecnolgica con grandes expectativas, cultivndose con tres

propsitos comerciales, que son la obtencin de biomasa con alto
contenido proteico y antioxidante, carotenoides de alto valor (caroteno y la lutena), y la produccin de glicerol.
Los carotenoides, una clase de pigmento terpenoides, solubles
en compuestos apolares y con colaraciones que van desde el amarillo
al rojo (Melndez y Martnez, 2007), presente en las cepas de esta
microalga la convierte en una fuente natural y potencial para las
industrias farmacutica, alimenticia y qumica en general. La cantidad
de carotenoides. El -caroteno, el ms abundante y ms importante a
nivel comercial y cientfico (Barreno et al., 2015), es considerado como
provitamina A, la cual puede convertirse en fuente de vitamina A
activa. Junto con la lutena, el -caroteno, son sustancias que aportan
proteccin ante enfermedades degenerativas, como el cncer
(Melndez y Martnez, 2007).
Sin embargo, la tecnologa de extraccin de los compuestos
bioactivos es una fase que an se encuentra en estudio, debido a la
bsqueda de mtodos eficientes para la obtencin de estos
compuestos, entre los mtodos ms utilizados se tienen los
convencionales con solventes qumicos, pero representan un riesgo

para la salud por requerir procesos de eliminacin de solventes en los

extractos,

lo

cual

ha

llevado

la

bsqueda

de

procesos

medioambientalmente limpios, que garanticen calidad superior de los

productos. Una de las alternativas viables que coinciden con las
exigencias del

mercado

actual

es la

extraccin con

fluidos

supercrticos, por utilizar solventes como el dixido de carbono CO 2,

que no es txico, y no deja residuos indeseables en los extractos de
inters (Mendiola, 2008).
En este sentido el presente trabajo tiene como finalidad evaluar
los mtodos de extraccin convencional con mezclas de disolventes
orgnicos (binarias y ternarias) y el no convencional con fluido
supercrtico empleando CO2, con el propsito de analizar los
rendimientos de los extractos en ambos procesos. De igual manera
conocer la potencialidad microbiolgica que posee la salina Las
Cumaraguas del Estado Falcn.
Esta investigacin se presenta en cuatro captulos, describiendo
la conceptualizacin del problema y los objetivos que condujeron a la
solucin del mismo en el captulo I, los antecedentes y bases tericas
en el captulo II, los materiales y metodologa en el captulo III y en el
ltimo captulo IV, la discusin de resultados para finalmente presentar
conclusiones y recomendaciones.

CAPITULO I
EL PROBLEMA
Planteamiento del Problema
En el agua de la salina Las Cumaraguas, ubicada al noreste de la
Pennsula de Paraguan, municipio y estado Falcn, Barreno et al. (2015),
Chirinos y Vegas (2012) y

Ypez y Morales (1998), han confirmado la

presencia de la microalga Dunaliella sp., destacndola como una fuente

importante en la obtencin de compuestos bioactivos; sin embargo, existen
pocos enfoques respecto a la proyeccin de su produccin a futuro a escala
industrial, ya que actualmente el desarrollo endgeno en esta comunidad es
poco o bsicamente nulo, puesto que la explotacin minera de sal se est
realizando de manera artesanal por la comunidad, mientras se desaprovecha
el potencial microbiolgico que ofrecen estas aguas.
El gnero Dunaliella sp., contiene entre 50 y 60% de protena en
clulas verdes en base al peso seco y alrededor del 30% para clulas rojas,
adems de un porcentaje considerable de pigmentos como clorofilas ( a, b y
c) as como un amplio rango de carotenos (-caroteno, -caroteno) y
xantofilas (lutena, astaxantina) (Martinez, 2011). De todos estos compuestos
el -caroteno es el carotenoide principal, el cual puede alcanzar
concentraciones con intervalos entre 10 - 14% del peso seco del alga,
superando las fuentes naturales como la de la zanahoria, que no alcanza el
2 % (Mendoza y Valido, 2011).
Este pigmento adems de ser uno de los ms demandados, tiene una
importancia trascendental en la nutricin humana, ya que acta como
precursor de provitamina A y la deficiencia de esta vitamina est considerada
actualmente como uno de los mayores problemas en la alimentacin humana
a escala global, puesto que su carencia es la responsable de mltiples y

graves trastornos como deficiencias visuales, especialmente en los nios

(Mendoza y Valido, 2011).
Aunque existen importantes empresas dedicadas a la produccin a
nivel internacional de -caroteno a partir de fuentes naturales, el mayor
consumo en la actualidad de este caroteno es de origen sinttico, el cual
posee una composicin isomrica trans, lo que lo hace menos estable y con
un bajo poder antioxidante que la forma cis, que predomina en el -caroteno
de origen natural (Mendoza y Valido, 2011).
No obstante, en la produccin de carotenoides de inters comercial es
significativa la fase de extraccin, ya que determina la calidad del mismo, de
ah la importancia de su estudio. Existen diversos mtodos de extraccin,
entre los que se encuentran los convencionales con solventes qumicos y los
no convencionales con fluidos supercrticos, siendo los primeros los ms
utilizados, debido al contacto continuo que presenta el solvente o

sus

posibles combinaciones con la muestras, mas sin embargo se requieren de

procesos posteriores para eliminar trazas de solventes. El mtodo con fluidos
supercrticos (FSC) utilizando CO2, garantiza mejores resultados en cuanto a
que constituye un proceso limpio y permite la obtencin de pigmentos con
mayor grado de pureza en microalgas, pese a que necesita equipos
industriales,

convirtindolo

en

un

mtodo

de

extraccin

costoso

(Mendiola, 2008).
En este sentido, se evaluaron mtodos de extraccin convencional y
no convencional de carotenoides, a partir de un escalado en el volumen del
cultivo que permitieron la reproduccin de la biomasa masificada de la
microalga Dunaliella sp., autctona de la Pennsula de Paraguan, as como
tambin analizar los rendimientos de los extractos y la calidad de los mismos.
As mismo se espera contribuir con el desarrollo endgeno de la comunidad
de Las Cumaraguas, el cual podra sustentarse sobre nuevas actividades

pocas exploradas, con un gran potencial de desarrollo tecnolgico y de bajo

impacto ambiental.

Objetivos de la investigacin
Objetivos General
Evaluar mtodos extractivos para la obtencin de compuestos
bioactivos a partir del cultivo a escala intermedia de la microalga Dunaliella
sp.
Objetivos Especficos
-

Obtener biomasa algal a escala intermedia, a partir de Dunaliella sp.

Aplicar mtodos extractivos de compuestos bioactivos en Dunaliella

sp.

Analizar los rendimientos de compuestos bioactivos extrados a partir

de biomasa algal.

Justificacin
Las microalgas del gnero Dunaliella sp., han llamado la atencin
debido a su gran capacidad de acumular compuestos bioactivos como los
carotenoides (carotenos y xantofilas) que son de gran inters comercial en la
industria de alimentos, frmacos y cosmticos (Lpez , 2008).
En la industria alimentaria los carotenoides se usa por su
pigmentacin como colorante y por su composicin bioqumica como
antioxidante en muchos alimentos humanos como las margarinas, tambin
son responsables del aroma de algunos alimentos y de olores florales. As
mismo, en la acuicultura son utilizados como aditivos alimentarios esenciales
para mejorar la pigmentacin de salmones, truchas o mariscos, al tiempo que
5

aporta otra serie de beneficios tales como la nutricin necesaria para el

adecuado crecimiento y reproduccin de estas especies con alto valor
comercial (Martnez, 2011).
Adems de color, tienen importantes actividades biolgicas como la
inhibicin de las enfermedades que ocasionan los radicales libres presentes,
tales como la arteriosclerosis, cataratas, degeneracin de la mcula,
esclerosis mltiple y, quizs la ms importante, el cncer. Su ingesta es
metabolizada para generar vitamina A, la cual es necesaria para lograr una
dieta balanceada y coadyuvar en el mantenimiento del organismo,
fortaleciendo el sistema inmunolgico (Melndez y Martinez, 2007).
Al mismo tiempo, contribuye a estudiar la viabilidad biotecnolgica que
posee la comunidad de las Cumaraguas, ya que la posibilidad de asociar el
cultivo de esta microalga a la explotacin comercial de las salinas contribuira
a revitalizar esta actividad, la cual tiene una fuerte significacin cultural hacia
los recursos hasta ahora no aprovechados y pocos explorados.

Alcance y Delimitaciones
La presente investigacin permiti evaluar los mtodos de extraccin
convencional y no convencional de compuestos bioactivos, especficamente
de carotenoides presentes en la biomasa microalgal de Dunaliella sp.,
proveniente de la salinas Las Cumaraguas de la Pennsula de Paraguan,
cuantificando los extractos obtenidos y analizando los rendimientos de los
mismos.

Las actividades fueron desarrolladas en las instalaciones de la

Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda: la fase de cultivo y
obtencin de biomasa algal en el laboratorio de Acuicultura, adscrito al
6

Departamento de Ciencias Pesqueras; las extracciones no convencionales,

en la estacin supercrtica piloto adscrita al Laboratorio de Energtica
(LAEN); las extracciones convencionales y los anlisis de espectrofotometra
en el Laboratorio de Qumica Orgnica. Esta investigacin se llev a cabo en
un perodo de aproximadamente 22 semanas, comprendido entre los meses
de julio 2015 y diciembre 2015.

CAPTULO II
MARCO TERICO
Este captulo est constituido por los antecedentes del estudio que
sirven de soporte para la investigacin, las bases tericas y basamentos que
apoyan la conceptualizacin de los enfoques cientficos.
Antecedentes de la investigacin
A continuacin se citan en orden cronolgico, las investigaciones que
sirvieron de base en la realizacin de este trabajo.
Lpez y Rangel (2013), construyeron un fotobiorreactor tubular para
reproducir biomasa microalgal en el laboratorio de acuicultura de la UNEFM,
en el que reprodujeron dos tipos de microalgas, obteniendo un crecimiento
4
celular de 7,8 x 10

5
cl/mL para la primera prueba y 1,3 x 10

cl/ mL

para la segunda prueba, para el caso de Thallasiosira, y en el caso de

9
Chlorella el crecimiento celular fue de 3,9 x 10 cl/mL para la tercera

prueba. Esta investigacin se detall el funcionamiento y operacin del

equipo, el cual fue el utilizado para realizar la reproduccin de biomasa
microalgal de forma masificada que permitiera la caracterizacin de la misma
y las extracciones planteadas, as como tambin servir de fuente de datos
para comparar los resultados de la cintica obtenida de la cepa Dunaliella
sp., utilizada en la presente evaluacin.
Sandoval (2013), realiz cultivos de la Chlorella con un escalamiento
de cepas en envases de 250 mL, preparando inculos desde 250 mL a 4 L, y
de 4 L hasta 20 L, en un periodo entre 7 a 14 das. Para el cultivo de la
biomasa y su masificacin, dise un fotobiorreactor piloto cerrado, en
rgimen semicontinuo y capacidad de 15 L, con parmetros de control como
8

temperatura, pH, iluminacin, medio de cultivo Guillard o F/2, adems de un

sistema de cosechado y alimentacin de medio fresco. La evaluacin,
alcanz densidades celulares mayores a 70 x 10

cl/mL posterior al da 12

das de operacin con una produccin de 1 g/L, y un promedio de 4,11 % de

lpidos presentes en la biomasa seca. Esta investigacin sirvi de referencia
en el escalado de los cultivos, as como para obtener las ecuaciones que
permitieran

la evaluacin de los parmetros cinticos realizada a los

cultivos.
Chirinos y Vegas (2012), determinaron la presencia de la microalga
Dunaliella, en la Salina Las Cumaraguas del estado Falcn mediante
microscopa ptica e identificaron la presencia de -caroteno por medio de
tcnicas cromatogrficas para posibles fines industriales, utilizando acetona
para la extraccin de los pigmentos totales y hexano en la obtencin de caroteno. Obtuvieron un porcentaje de rendimiento de -carotenos extrado
respecto a los pigmentos totales y los carotenos totales de 45,18% y
76,14%, respectivamente. Este trabajo sirvi de apoyo metodolgico en
cuanto al proceso de extraccin de carotenoides totales; paralelamente, la
cepa utilizada proviene de la misma poblacin en estudio, por lo cual, los
resultados fueron pertinentes para la comparacin y discusin de los
alcanzados en esta investigacin.
Daz y Geraldo (2009), realizaron el diseo de la planta piloto de
extracciones supercrticas con dixido de carbono para procesar productos
naturales, conformado por un autoclave, un reactor y separador flash,
diseados para operar a presiones mximas de 1598,85 psi y temperaturas
de 194 F. Realizaron la evaluacin utilizando como materia prima la
almendra de Moringa oleifera lam, donde los contenidos de aceites y grasas
obtenidos con esta materia prima a presiones por debajo de 1200 psi y 160F
fueron de 55,05% de aceite y 26,17% de grasas, respectivamente; as, el
rendimiento de la extraccin con dixido de carbono supercrtico fue de
9

5,64% y 4,69%. Esta investigacin sirvi para el manejo y condiciones de

operacin del equipo, ya que fue el seleccionado para realizar las
extracciones con CO2 supercrtico de la biomasa en estudio.
La patente investigativa desarrollada por Fernndez y Garca (2009),
contribuy desde el punto de vista metodolgico para la extraccin de
carotenoides totales, ya que estos autores evaluaron un sistema de
extraccin de carotenoides totales mediante el uso de mezclas ternarias con
disolventes en una nica fase (hexano-etanol-agua), que puesta en contacto
con la materia prima de forma adecuada, extrae los carotenoides presentes
en la misma.
El trabajo de Guevara y Romero (2008), represent una referencia
metodolgica para el proceso de extraccin binaria de carotenoides totales.
La investigacin consisti en la seleccin del mejor sistema de extraccin de
carotenoides totales en dos cepas de Dunaliella salina, en el cual utilizaron
tres

mezclas

de

solventes

(acetona/agua,

acetona/metanol

tetrahidrofurano/etanol), en tres proporciones distintas (50/50, 70/30 y 90/10),

resultando acetona/metanol 90/10 el mejor sistema de solventes.
Mendiola (2008), en su tesis doctoral de extraccin de compuestos
bioactivos de microalgas mediante fluidos supercrticos obtuvo y caracteriz
extractos de Dunaliella salina con potencial actividad antioxidante realizando
extracciones en un equipo de escala analtica, las condiciones de diseo
experimentales oscilaron entre 182,7 y 483,3 atm y la temperatura entre 9,8 y
45,2 C, con ello consiguieron densidades entre 0, 85 y 1,03 g/mL. Los
mejores resultados, en trminos de rendimiento de extraccin, se obtuvieron
con densidades ms altas, empleando altas presiones y temperaturas bajas,
con valores superiores al 6%. Esta investigacin aport datos de presiones y
temperaturas a ser tomadas en cuenta para el diseo de experimento
respecto a las extracciones con fluidos supercrticos.

10

Bases tericas
Microalga Dunaliella
El gnero Dunaliella fue descrito por primera vez por Teodoresco en
1905. Debe su nombre a Dunal, quien fue el primero en reconocer que el
color rojo de ciertos reservorios hipersalinos era causado por un alga. Se
reconocen 29 especies y gran nmero de variedades y formas aun no muy
bien definidas (Garcia et al., 2000).
Segn Lpez (2008) la clasificacin taxonmica de Dunaliella descrita
por Teodoresco es la siguiente:
Reino: Plantae
Subreino: Viridiplantae
Divisin: Clorophyta
Clase: Clorophyceae
Orden: Volvocales
Familia: Dunaliellaceae
Gnero: Dunaliella
Especie: Dunaliella salina
Dunaliella es un alga verde unicelular de 8-25 micrones de longitud y
5-15 micrones de dimetro; se desplaza en el agua por medio de dos
flagelos situados en la parte apical de la clula. La clula de Dunaliella, as
como las de otras algas verdes, contiene cloroplasto, pirenoide, ncleo,
mitocondrias, pequeas vacuolas y aparato Golgi, pero a diferencia de

11

aquellas microalgas, carece de paredes rgidas de polisacridos, y est

cubierta por una fina membrana elstica. Esta propiedad le permite adaptar
su volumen celular, segn cambia la presin osmtica. Se reproducen por
divisin longitud de la clula mvil o por fusin de dos celular mviles para
formar un cigoto (Lopez, 2008).
Figura 1. Clula de Dunaliella sp., en fase vegetativa y en condicin de
estrs

Fuente: Daz & Ordoez (2006)

Compuestos bioactivos a partir de la microalga Dunaliella sp.

Las microalgas del gnero Dunaliella son consideradas las ms
estudiadas a nivel de la produccin de biomasa, ya que uno de los factores
que ha contribuido al aprovechamiento de estas microalgas es su capacidad
eurihalina (crecer en zonas de altas concentraciones salinas, temperaturas
extremas y elevada intensidad luminosa) lo que les permite acumular
carotenoides como un mecanismo de proteccin celular (Lpez, 2008).
Segn Lpez (2008) a continuacin se detalla la composicin

de

Dunaliella:
-

Protenas: forman aproximadamente entre el 50 y 60% del peso seco de la

clula, contienen casi todos los aminocidos existentes en la naturaleza ya
que posee 18 aminocidos de los 20 que se encuentran en la naturaleza.

12

Carbohidratos: contienen aproximadamente un 3040% del peso seco de la

clula. Los carbohidratos incluyen monosacridos (glucosa, galactosa,
manosa, xitosa, ribosa, raminosa), disacridos y polisacridos 1,4
glucsido y almidn. Los sacridos, en especial los monosacridos,
estabilizan y densifican el producto cosmtico que componen adems de

conferir una textura densa y suave.

Lpidos y cidos grasos: los lpidos constituyen el 6-18% del peso seco de
Dunaliella (segn las condiciones del hbitat). Entre los lpidos, el de ms
alta concentracin es el -caroteno. Los cidos grasos comprende cido
palmtico, cido trans-hexadecanoico, el cido linolico y el cido araqudico,
este ltimo producto del cido linolico. Los cidos grasos constituyen un
componente importante de los fosfolpidos y de las lipoprotenas de la
membrana celular. Cuando hay insuficiencia de cidos grasos esenciales se

observan sntomas de dermatitis escamosa y deshidratacin de la piel.

Glicerol: es un polihidroxialcohol ampliamente utilizado en las industrias
qumicas, farmacuticas y cosmticas en virtud de sus propiedades
humectantes, antispticas y espesantes. Se trata de un lquido incoloro,
viscoso y casi inodoro. La concentracin de glicerol que se puede alcanzar
en Dunaliella es significativa, de hasta el 10% en las clulas, cantidad que

puede incrementarse al aumentar la presin osmtica externa.

Vitaminas: adems del alto nivel de -caroteno, Dunaliella contiene complejo
b, tiamina, piridocina, riboflavina, cido nictico biotina y rocoferol (vitamina

E).
Clorofilas: la clorofila a, es el pigmento lipoflico predominante en vegetales,
responsable de la fotosntesis; debe su nombre a Pelletier y Caventon,
quienes la aislaron en 1817. Por su importancia para los sistemas vivientes,
pertenece al grupo de metalo-tetrapirroles denominados pigmentos de la
vida. La clorofila b difiere de la a en que contiene como sustituyente un grupo
formilo en vez de metilo en el anillo pirrlico. Esta molcula es esencial para
la transformacin de la radiacin electromagntica a energa termoqumica
durante la fotosntesis.

13

Carotenoides: son

pigmentos isoprenoides polinicos muy hidrofbicos,

derivados del licopeno, se acumulan masivamente, pero en mayor proporcin

el caroteno, que puede llegar a intervalos entre

10%-14 % del peso

seco del alga el cual es una fuente de vitamina A.

Bajo condiciones de estrs, especialmente dficit de nitrgeno, muchas
especies de algas verdes se tornan rojas o anaranjadas debido a la
formacin de grandes cantidades de -caroteno o combinaciones de sus
cetoderivados:

equinenona,

hidroxiequinenona,

cantaxantina,

hidroxicantaxantina y astaxantina. Estos carotenoides secundarios se

acumulan fuera del cloroplasto en forma de gotas (glbulos) liposolubles, o
bien en la pared celular, asociados con la esporopolenina, un polmero
estructural del cual pudieran ser precursores (Barreno et al., 2015).
La acumulacin de carotenos, en esta microalga, se realiza en dos fases,
la primera como resultado del papel fotoprotector de los pigmentos y la
segunda debida a la sntesis continua de -caroteno en clulas que han
dejado de dividirse, es decir, en la fase estacionaria del crecimiento, el
caroteno se concentra en organelos especiales llamados glbulos de
caroteno los cuales se encuentran localizados en el espacio intertilacoidal
de los cloroplastos microalgales, adems de este pigmento estos glbulos
contienen pequeas cantidades de otros lpidos (Barreno et al., 2015).

Beta () caroteno
Es un miembro de la familia de los carotenoides, posee frmula C 40H56
y

peso molecular de 536,9; once dobles enlaces conjugados, no tiene

grupos funcionales polares y representa un producto natural hidrofbico.

Presenta una pigmentacin rojo-violeta en estado cristalino, en solucin
oleosa, vara de amarillo a naranja, mientras que en dispersin acuosa es de
color naranja (Garcia et al., 2000).

14

Figura 2. Estructura del -caroteno

Fuente: Melndez y Martinez(2007).

El -caroteno fue el primer carotenoide purificado. En 1831,

Wackenroder lo aisl en forma cristalina a partir de la zanahoria, dndole el
nombre que lleva, derivado de la denominacin latina de este vegetal
(Daucus Carota), (Orozco, 2010). Este tipo de carotenoide se producen de
forma natural y al ser ingestados pueden ser convertidos en vitamina A por el
organismo, por lo que son denominados como Carotenoides Provitamina
A, el -caroteno es el ms abundante que se halla en diversas especies
vegetales.

Requerimientos para el crecimiento de la Dunaliella sp.

Dunaliella se desarrolla bien en un medio estrictamente inorgnico sin
necesidad de ningn factor orgnico. Los nutrientes inciden en la velocidad
de crecimiento y en la composicin bioqumica de las clulas en cultivo.
Segn Garcia et al (2000) los principales nutrientes requeridos para su
crecimiento son:

15

Carbono: es el macronutriente ms importante, constituye el 50 % de la

biomasa microalgal. Puede utilizar como fuente el dixido de carbono (CO 2) y
el bicarbonato (NaHCO3), ya que estimula el crecimiento mientras no se

produzca precipitacin de carbonatos.

Nitrgeno: es un nutriente bsico esencial para su crecimiento y tiene una
estrecha relacin con la capacidad de sintetizar -caroteno. Puede utilizar
nitrato, nitrito, amonio o urea como fuente de nitrgeno para su crecimiento,
siendo la preferente para los cultivos masivos el nitrato, ya que el amonio es
txico a concentraciones superiores a 5 mM y pH superior a 8, y la urea es
un suministro adicional de carbono inorgnico que estimula el crecimiento de

organismos hetertrofos y aumenta el contenido de amonio en el medio.

Fsforo: requiere concentraciones de fosfato inorgnico inferiores a 0,1 mM.
Este organismo puede acumularlo intracelularmente hasta concentraciones
de 0,5 M, as en un medio sin fsforo son capaces de utilizar reservas

durante varios ciclos de divisin.

Sulfato y magnesio: requiere concentraciones aproximadamente entre 1 y 2
mM. Sin embargo estos compuestos se encuentran relativamente abundante
en el agua de mar, por lo que no es necesario aadirlo, ya que a muy altas
concentraciones y en presencia de Calcio puede precipitar y reducir el

crecimiento del alga.

Otros nutrientes: Dunaliella necesita otros elementos como potasio y calcio,
sin embargo en cualquier medio de cultivo que contenga sal comercial o
agua de mar, no es necesaria la adicin de stos, pues su contenido excede
a los requerimientos del alga.
De igual manera necesita de factores ambientales que ejercen una
influencia en la tasa de crecimiento, entre los ms importantes se tienen los
siguientes:

Luz: es la fuente de energa que impulsa las reacciones de fotosntesis en las

algas, y por tanto su crecimiento; en este sentido se debe considerar su
intensidad, la calidad espectral, y la necesidad de fotoperiodo. Los

16

requerimientos varan ampliamente de acuerdo a la profundidad y la

densidad del cultivo algal; a menudo se emplean intensidades de luz entre
3000 y 4000 lux. La intensidad y calidad de la luz puede ser natural o
suministrada por tubos fluorescentes que emiten, ya sea el espectro
luminoso azul o rojo, (las partes ms activas del espectro de luz para la
fotosntesis) (Barreno et al, 2015).
-

pH: el pH del medio de cultivo afecta a muchos procesos asociados con el

crecimiento del alga y su metabolismo. El pH ptimo para el crecimiento de
Dunaliella es 7, tolerando un amplio rango entre 5,5 y 10. El ptimo para la
produccin de -caroteno es 9 (Garcia et al, 2000).

Salinidad: Dunaliella predomina en aguas saladas que contienen ms de un

10% (2 M) de sal. Esta microalga presenta una considerable capacidad de
adaptacin a distintas concentraciones de sal, creciendo en medios que
contienen desde 50 Mm de NaCl hasta casi 5,5 M de NaCl, considerndose
el organismo eucarionte conocido con mayor tolerancia a sal. (Garcia, 2000).

Temperatura: Dunaliella muestra una amplia tolerancia a la temperatura: la

ptima est comprendida entre 20 y 40C ; resaltando que las clulas
adaptadas a alta salinidad son ms resistentes a la temperatura,
probablemente debido al efecto protector del glicerol sobre las protenas
celulares (Garcia et al, 2000).

Produccin de Biomasa a partir de microalgas

Las caractersticas del crecimiento y la composicin de las microalgas,
dependen en gran medida de las condiciones de cultivo. Hay cuatro grandes
tipos de condiciones de cultivo de microalgas: fotoautrficos, hetertrofos,
mixotrficos y fotoheterotrficos. Los sistemas de cultivo fotoautrficos se
dan cuando se usa la luz solar como fuente de energa y el carbono
inorgnico para formar energa a travs de la fotosntesis. Los cultivos en
condiciones heterotrficas significan que ciertas especies de microalgas

17

pueden crecer en presencia de carbono orgnico y bajo condiciones de

oscuridad. En los cultivo de microalgas mixotrficos las microalgas son
capaces de vivir en cualquiera de las condiciones fototrficas o hetertricas.
Por otro lado, los cultivos fotoheterotrficos necesitan la luz y compuestos
orgnicos como fuente de carbono (Ruiz, 2011).
La produccin de biomasa de microalgas es generalmente ms
costosa que el crecimiento de los cultivos, puede llevarse a cabo en cultivos
abiertos y cultivos cerrados, siendo los fotobiorreactores, los nicos mtodos
para la produccin de microalgas a gran escala (Yusuf, 2007).
-

Cultivo abierto: son una tecnologa relativamente simple que consiste en

realizar el cultivo de microalgas en estanques o en canales de unos 20 a 50
centmetros de profundidad; se caracterizan por no estar protegidos de los
factores ambientales y por lo tanto estn expuestos a la contaminacin y a
factores tales como la lluvia, el polvo, las aves y los insectos (Barra &
Guartatanga, 2010).

Cultivo cerrado: este sistema tiene proteccin del medio ambiente con el
objetivo de proteger al cultivo de la contaminacin y mejorar las condiciones
ambientales, entre

ellas la

temperatura; cuando

se

habla

de un

fotobiorreactor se hace referencia a un sistema cerrado (Barra &

Guartatanga, 2010).
Tabla 1. Ventajas y desventajas de tipos de reactores de cultivo de
microalgas.
Tipo de
reactor

Ventajas

Desventajas

- Sencillos y baratos deLagunas

construir
Fciles
de
operar
y
Abiertas
mantener
Fotobiorreact- Alta productividad
Menor
contaminacin
or

18

Utilizacin deficiente de la luz

Luz y temperatura difciles de
controlar
Contaminacin y evaporacin
Costosos y complejos
Difcil control de la temperatura

mejor utilizacin de la- Dao celular por turbulencia

luz y mejor mezclado - Deterioro de equipo por
- Control
en
las corrosin
condiciones de cultivo - Acumulacin de oxgeno
Fuente: Piedrahita y Urbano (2012)

Fotobiorreactor
Es un contenedor biolgico artificial en el cual se pretende obtener las
condiciones

ambientales

internas

capaces

de

permitir

que

los

microorganismos, clulas o tejidos fotosintticos puedan crecer, desarrollarse

y realizar sus funciones metablicas en presencia de luz y otros, por lo que el
diseo y construccin de los fotobiorreactores es que el bioproceso se
desempee de manera rpida, eficiente para generar biomasa al igual que
los productos metablicos que se encuentran dentro de ella. En ellos se
busca que estos sistemas sean cerrados, que eviten el contacto con el medio
ambiente externo, para impedir contaminacin y cambios bruscos en las
condiciones internas del contenedor que podran afectar a la biomasa
(Sandoval, 2013)
Gran parte de los estudios de cultivo de microalgas en sistemas
cerrados se basa en configuraciones cilndricas, debido a sus caractersticas
de transferencia de masa y calor y los bajos costos de operacin. El dimetro
suele ser menor a 200 cm para evitar que no llegue luz al interior de la
columna y su altura se ve limitada a 4 m por motivos estructurales. Por otra
parte se tienen los tubulares con dimetro igual o menor a 100 cm,
dispuestos de modo horizontal, vertical, helicoidal o inclinado en el que la
biomasa es recirculada mediante bombas o empuje por aire. Y por ltimo se
encuentran los reactores planos, que tienen mayor superficie expuesta a la
radiacin solar, y la limpieza es fcil (Martinez, 2011).

19

Figura 3. Configuracin de fotobiorreactores: a: estanques, b: placas planos,

c: cilndricos, d: tubulares horizontales

Fuente: Piedrahita y Urbano (2012)

Tcnicas de recuperacin de biomasa microalgal

Hay una amplia gama de mtodos de cosecha que puede ser
empleado para la recuperacin de biomasa de microalgas. Sin embargo se
debe tomar en consideracin que la recuperacin de la biomasa puede ser
un importante problema debido al pequeo tamao que posee las
microalgas, por tanto se debe concentrar las clulas de las mismas para que
el cultivo no sea tan diluido (Bermeo, 2011). Entre las ms utilizadas se
encuentran:
-

Floculacin: este proceso consiste en aadir al caldo determinados

productos qumicos conocidos como floculantes con el objeto de favorecer la
formacin de partculas ms grandes (stokes) que llevaran a una rpida
sedimentacin (Bermeo, 2011).

20

Dado que las clulas de microalgas tienen una carga negativa que
impide la agregacin natural de las clulas en suspensin, la adicin de
floculantes como cationes multivalentes y polmeros catinicos neutralizan o
reducen esta carga de la superficie celular y forman precipitados que
mejoran el proceso de agrupacin y la sedimentacin. Existen dos fuerzas
principales involucradas: a grandes distancias, domina la repulsin
electrosttica (clulas negativas repelen otras clulas con carga negativa); en
distancias muy cortas; sin embargo, se produce la atraccin intermolecular o
fuerzas de Van der Waals, esta fuerza es grande en comparacin con las
fuerzas electrostticas, pero acta en un rango muy corto (Salazar, 2012).
-

Centrifugacin: es un mtodo por el cual se separan slidos de lquidos de

diferente densidad mediante una fuerza rotativa, la cual se imprime a la
mezcla con una fuerza mayor a la de la gravedad, provocando la
sedimentacin de los slidos o de las partculas de mayor densidad, para

luego separar el sobrenadante por drenaje (Bermeo, 2011).

Filtracin: se utilizan para especies de microalgas de un tamao mayor a 70
mm. Este mtodo opera bajo presin o succin. Para la recuperacin de las
clulas de algas menores a 30 mm se puede aplicar el principio de la
microfiltracin y ultrafiltracin con membranas, siempre y cuando los
volmenes de caldo sean bajos de aproximadamente 2 m 3/da o menores
(Bermeo, 2011).
Procesos de extraccin de aceites
Segn Marcilla (1998), la extraccin es una operacin unitaria de
transferencia de mezcla (lquida o que formen parte de un slido) en un
disolvente selectivo. Aprovecha por tanto, la diferencia de solubilidades de
los componentes de la mezcla en el disolvente aadido. Se hace la distincin
entre la extraccin lquido-lquido y la extraccin slido-lquido (llamada

21

tambin lixiviacin) segn si la materia a extraer est en un lquido o en un

slido respectivamente.

Extraccin convencional con solventes

La extraccin de lpidos con solventes qumicos ha sido utilizada
tradicionalmente para obtener lpidos de origen animal y vegetal; en el caso
de las microalgas, el solvente es por lo general adicionado a la biomasa seca
aunque en algunos casos es utilizado en biomasa con cierta cantidad de
agua, lo que disminuye los costos globales del proceso, pero disminuye
tambin la eficiencia de la extraccin (Gonzalez y Kafarov, 2009).
Existen una gran variedad de solventes que son empleados
para este tipo de extracciones en microalgas, como lo son el
hexano, acetona, etanol, cloroformo, metanol y isopropanol entre
otros, tambin se incluyen sus combinaciones. La seleccin del
solvente juega un papel muy importante debido a que stos tiene
selectividades definidas para extraer ciertas sustancias especficas
por lo que se tiene que seleccionar el adecuado para no extraer
sustancias no deseadas o desconocidas (Fuente y Aranda, 2014).
Debe seleccionarse un solvente conveniente de tal forma que las
caractersticas deseables: alto lmite de saturacin y selectividad respecto al
soluto por extraer, capacidad para obtener un extracto con una calidad no
alterada, estabilidad qumica en las condiciones del proceso, baja viscosidad,
baja presin de vapor, baja toxicidad e inflamabilidad, baja densidad, baja
tensin superficial, facilidad y economa de recuperacin de la corriente de
extracto y bajo costo (Velasco et al, 2007).

22

Extraccin no convencional con FSC

Propiedades de los fluidos supercrticos
Se define como fluido supercrtico (FSC) a una sustancia que se
encuentra por encima de su temperatura y presin crtica; bajo estas
condiciones el estado lquido y vapor saturado son idnticos, su
comprensibilidad isotrmica tiende a infinito y se imposibilita un cambio de
fase (Daz y Geraldo, 2009).
El diagrama de fases que se presenta en la Figura 4, es la
representacin grfica de todos los estados de equilibrio posibles de una
sustancia pura. En ella se distinguen zonas de nica fase slida, lquida y
gaseosa, lneas donde coexisten dos fases en equilibrio (slido-lquido o de
fusin, slido-gas o de sublimacin y lquido- gas o de vaporizacin) y el
punto triple (PT) donde las tres fases se encuentran en equilibrio a una
presin y temperatura, asocindose el cambio de fase al cambio brusco de
entalpa y densidad (Daz y Geraldo, 2009).

Figura 4. Diagrama de fases slido/lquido/gas. PT: punto triple, PC: punto

crtico, Pc: presin crtica, Tc: temperatura crtica

23

Fuente: Daz & Gerardo. (2009)

El punto crtico es definido por su temperatura (Tc), presin (Pc) y
volumen especfico (Vc). En este punto dejan de existir las fases lquida y
gaseosa como tales y aparece una nueva fase, la llamada fase supercrtica,
donde el poder disolvente puede ser bajo o alto, sin que se produzca un
cambio de fase, nicamente realizando pequeas variaciones de presin y
temperatura, sin llegar al equilibrio lquido-vapor, solo se observa un cambio
de densidades del fluido. (Mendiola, 2008)
En particular, la densidad y la viscosidad cambian drsticamente en
condiciones cercanas al punto crtico (Ver Tabla 2). Tensin superficial
despreciable sumada a coeficientes de difusin en orden de magnitudes
superiores y viscosidades cien veces menores a las de los solventes
lquidos, resultan en una gran penetracin del fluido en matrices slidas con
altas velocidades de transferencia del soluto en el fluido supercrtico.
Adicionalmente, en regiones donde un FSC es altamente compresible, su
densidad, y por tanto, su poder disolvente, puede ser ajustada sobre un
amplio rango, con modestas variaciones de temperatura o presin (Daz y
Geraldo, 2009).

Tabla 2. Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes tipos de fluidos

24

Estado del Fluido

Gas
Fluido supercrtico
Liquido

Densidad

Viscosidad

Difusividad

(g/ml)
10-3
0,2 - 0.9
1

(g/cm x s)
10-4
10-4
10-2

(cm2 / s)
10-1
10-3
10-6

Fuente: Mendiola (2008)

Dixido de Carbono
El CO2 es el fluido supercrtico ms utilizado debido a que es no
txico, no inflamable, no corrosivo, incoloro, no es costoso, se elimina
fcilmente, no deja residuos, sus condiciones crticas son relativamente
fciles de alcanzar y se consigue con diferentes grados de pureza, se puede
trabajar a baja temperatura y, por lo tanto, se puede usar para separar
compuestos termolbiles, se puede obtener a partir de procesos de
fermentacin alcohlica y ayuda a prevenir la degradacin trmica de ciertos
componentes qumicos del alimento cuando son extrados (Alvarez y Amaro,
2011).
Descripcin del mtodo de extraccin por medio de fluidos supercrticos
(EFS)

La extraccin supercrtica es una operacin unitaria de transferencia de

masa que se efecta por encima del punto supercrtico del solvente; esta
extraccin permite controlar y manipular propiedades tales como difusividad,
viscosidad y densidad del fluido mediante pequeos cambios de presin y
temperatura, lo que conlleva a una variacin en la selectividad y el poder
disolvente de este (Daz y Gerardo, 2009).
Mendiola (2008), expone que el proceso de extraccin mediante fluidos
supercrticos cuenta con cuatro etapas principales:

25

Presurizacin: su finalidad es alcanzar la presin necesaria del solvente para

la extraccin, ya sea por medio de un compresor o de una bomba.

Ajuste de temperatura: remocin o adicin de energa trmica, por medio de
intercambiador de calor, baos trmicos o resistencias elctricas, para que el

fluido comprimido alcance la temperatura requerida.

Extraccin: se lleva a cabo en un recipiente extractor a alta presin, el cual
contiene la matriz que ser procesada. En esta etapa el fluido entra en

contacto con la matriz y arrastra el soluto de inters.

Separacin: en esta etapa se separa la sustancia extrada del solvente
mediante cambios de presin y temperatura.
En general, el proceso de extraccin supercrtica comienza cargando
el material orgnico a extraer en el recipiente de extraccin, que ser
previamente preparado para ser introducido en el equipo, luego se procede a
presurizar el solvente a emplear a la presin critica la cual ser la necesaria
para la extraccin, y se ajusta la temperatura por encima del punto crtico
(PC) del solvente. Al alcanzar las condiciones crticas de operacin del
solvente stas deben mantenerse estables durante el tiempo de extraccin,
ste hace contacto con el soluto o materia prima a extraer en un reactor o
extractor y por ltimo se procede a la separacin del compuesto de inters
en le solvente mediante un separador flash (Daz y Geraldo, 2009).
Trminos bsicos
Alga: organismo eucaritico fotosinttico, unicelular o multicelular simple
(Chirinos y Vegas, 2012).
Compuestos bioactivos: tipo de sustancia qumica que se encuentra en
pequeas cantidades en las plantas y ciertos alimentos (como frutas,
verduras, nueces, aceites y granos integrales) que promueven la buena
salud, y previene enfermedades como el cncer, del corazn, entre otros
(Gmez, 1997).

26

Eurihalina: referente a las especies que tienen la capacidad de vivir en

zonas acuticas con diferentes grados de salinidad (Elma, 2014).
Estrs salino: alto contenido de sales en el agua que absorbe un planta o
en el suelo donde se desarrolla que provoca un estrs inico y un estrs
osmtico (Luna, 2005).
Halfilos: son aquellos que se encuentran en los ambientes hipersalinos los
cuales son capaces de reproducirse y realizar sus funciones metablicas de
una manera ms eficaz en presencia de altas concentraciones de sales que
en su ausencia (Pea y Gonzalez, 2002).
Hidrofbico: es cuando no es miscible con el agua, es decir cuando no son
capaces de interactuar con las molculas de agua, ni por puentes de
hidrgeno ni mediante interacciones in-dipolo (Gonzlez, 2010).
Microalga: organismo unicelular o pluricelular cuyas clulas realizan todas
las funciones vitales de forma independiente mediante la fotosntesis
(Chirinos y Vegas, 2012)

27

CAPITULO III
MARCO METODOLGICO
Este captulo describe los procedimientos, instrumentos y tcnicas
empleadas para la recoleccin y procesamiento de los datos. Por otra parte,
se explican detalladamente las fases realizadas en el proyecto, para el
desarrollo de los objetivos planteados.

Tipo de estudio y diseo de la investigacin

De acuerdo al planteamiento del problema y en funcin de los
objetivos, se clasifica el tipo de investigacin como un proyecto descriptivo, el
mismo consiste en la caracterizacin de un hecho, fenmeno, individuo o
grupo, con el fin de establecer su estructura o comportamiento (Arias, 2006).
En esta investigacin se observa el comportamiento de dos mtodos de
extraccin en estudio con la biomasa microalgal.
La investigacin se orienta hacia un diseo de campo ya que no se
manipularon las condiciones de crecimiento (nutrientes, salinidad, aireacin e
iluminacin) en la fase de cultivo. Mientras que en la fase de extraccin, est
enfocada a un diseo experimental, debido a que se manipularon variables
como la presin, temperatura y tiempo de residencia en la estacin
supercrtica y en los mtodos convencionales se variaron las mezclas de los
solventes y las proporciones de los mismos.

28

Instrumentacin y tcnicas de recoleccin de datos

Para el cumplimiento de los objetivos propuestos es primordial la

recoleccin de datos, donde

se utilizan tcnicas e instrumentos

para

obtener, registrar o almacenar informacin de inters (Arias, 2006).

Entre las tcnicas empleadas en esta investigacin se encuentran:
El anlisis documental: basado en revisiones de manuales, patentes,
artculos, trabajos de investigacin relacionados con el tema en estudio, para
abordar y desarrollar el marco terico, de igual manera establecer los
criterios para la metodologa aplicada y as afirmar los resultados obtenidos
en esta investigacin.
Observacin directa e indirecta: comprendi la visualizacin de los
cambios que se dan en los cultivos, como la coloracin, densidad celular, as
como tambin evaluar de forma cualitativa y cuantitativa los parmetros en
los procesos de extraccin supercrtica y no convencionales.
Los instrumentos utilizados para obtener los resultados de los anlisis
fisicoqumicos y microbiolgicos, se detallan a continuacin:
-

Microscopio binocular, marca Antimould, modelo XSZ-207.

Balanza digital, marca Citizen.
Refractmetro Visual.
pHmetro, marca Orion, modelo 410
Estufa.
Cmara de neubauer.
Cmara fotogrfica.
Spectronic 20D.

Computadora porttil con sus respectivas unidades para almacenaje

de informacin: disco duro o CD.

29

Unidades de almacenamiento masivos (USB).

Tcnicas de procesamientos y anlisis de datos

Los datos para el anlisis fueron proporcionados por la cuantificacin
celular diaria en las distintas etapas del cultivo y por las lecturas
espectroscpicas de los extractos generados por los mtodos de extraccin.
Las tcnicas empleadas para el procesamiento de los datos obtenidos
durante la realizacin de este proyecto fueron: tablas comparativas, grficos
ilustrativos, entre otros; que permitieron una organizacin y visualizacin ms
sencilla, prctica y ordenada de los datos.
Una vez realizada la recoleccin de datos cualitativos y cuantitativos,
la informacin se codific mediante el uso de programas informticos,
especficamente se transcribieron los datos en el software estadstico
Statgraphics Centurion XVI, versin 161.1.15 para el diseo de experimentos
y anlisis de resultados experimentales obtenidos.
Poblacin y muestra
Poblacin
La poblacin est constituida por el sistema de cultivo de Dunaliella
sp., conservada en el Laboratorio de Microscopa Electrnica (UNEFM - Los
Perozo), a una salinidad del 20%, aireacin continua, iluminacin blanca y
nutridos en medio Miguel.

Muestra
La muestra de este estudio est conformada por un volumen de 250
mL de cultivo de Dunaliella sp., que vali como cepa base para establecer el

30

sistema de conservacin y escalamiento del cultivo en este trabajo de

investigacin. El muestreo fue de tipo no probabilstico intencional, ya que la
seleccin de la cepa se realiz con base a criterios o juicios del investigador.

Fases de la investigacin
El proyecto de investigacin estuvo regido por tres fases, en las cuales
se desarrollaron diversas actividades cientficas:
Fase I. Obtencin de biomasa algal
-

Conservacin y escalamiento del cultivo

Para el desarrollo de esta fase se seleccion la muestra (250 mL) y se

realiz la siembra de inculos en cuatro envases de 350 mL, cada una con
10 mL y una densidad celular de 4 E+04 cl/mL en 300 mL de medio Miguel.
Siguiendo la metodologa usada por Sandoval (2013), este cultivo fue
mantenido durante 14 das previos a la fase de escalamiento, en los que
estuvieron expuestos a una aireacin continua, salinidad de 20% e
iluminacin blanca aportada por tubos fluorescentes (Ver Tabla 3). Esto con
el fin de proporcionar inculos para el escalamiento del cultivo o de reserva
en caso de ser necesarios.
El escalamiento del cultivo se realiz en envases de vidrios
previamente lavados y esterilizados, con similitud geomtrica cilndrica, para
que cumpliera con las proporciones aproximadas del fotobiorreactor. El
mismo estuvo compuesto de tres etapas: la primera con un volumen de 300
a 800 mL, la segunda de 800 a 3000 mL y la tercera de 3000 hasta 13000
mL (cultivo control) y 16000 mL (fotobiorreactor); este escalado se realizaba
al final del perodo de cada evaluacin del cultivo, a los catorce das (ver
Figura 5).

31

Figura 5. Escalamiento del cultivo

Durante la fase de produccin de biomasa, se realiz un monitoreo

diario de la densidad celular, mediante el uso de un microscopio ptico y una
cmara de Neubauer, expresando los resultados en grficas de densidad
celular en funcin al tiempo, adems de monitorear el pH, el cual se mantuvo
entre un intervalo entre 7,5 y 9.
Tabla 3. Resumen de condiciones del cultivo
Fotoperiodo
Iluminancia
Temperatura
Salinidad

24 horas continuas
Artificial/ blanca (tubos fluorescentes)
20 2 C
200 UPS
Constante, sin inyeccin adicional de

Aireacin
Tiempo

CO2
de

observacin
Medio de cultivo
Nro. de rplicas por

14 das en cada evaluacin

Agua de Miguel

4
medio
- Evaluacin cintica del crecimiento de Dunaliella sp
La determinacin de la concentracin celular se realiz por recuento
celular a travs de una cmara de Neubauer, la lectura se llev a cabo
tomando 10 mL de cultivo y se le adicion una gota de Lugol al 10%

32

aplicando agitacin manual para inactivar las clulas. Luego se tomaron 20

L de solucin y se efectu el conteo en los respectivos cuadrantes como
detalla el anexo 1, siguiendo la metodologa de Helm y Bourne (2006). Los
parmetros cinticos poblacionales para cada ensayo se determinaron segn
las siguientes frmulas descritas por Alvear y Castillo (2011):
Ecuacin 1. Velocidad de crecimiento
ln
=

N2
N1

( )

t 2t 1

Ecuacin 2. Tiempo de duplicacin

t d=

ln 2

Donde:
: velocidad de crecimiento (nmero de divisiones por da)
td: Tiempo de duplicacin
N2: Nmero de clulas del cultivo
N1: Nmero de clulas inicial del cultivo
t1: tiempo inicial
t2: tiempo final
-

Cosechado de biomasa algal

La cosecha de la biomasa de la Dunaliella sp., se realiz mediante la

tcnica de biofloculacin con quitosano y autofloculacin, descritas a

continuacin:
-

Biofloculacin por quitosano: para aplicar este mtodo, se sigui la

metodologa descritas por Chen y Zhao (2014). Se seleccionaron las
concentraciones de quitosano de 40 mg/L y 200 mg/L, evaluando el efecto

33

del pH y la remocin algal mediante el conteo de clulas en el sobrenadante

durante 10 das, para luego reportar el porcentaje de algas removido
mediante la ecuacin propuesta por Sunenik y Shelef (1984).
Ecuacin 3. Porcentaje de algas removido

P=

CO C
X 100
CO

Donde:
P: Porcentaje de alga removido en el cultivo
C: Concentracin despus de floculacin
Co: Concentracin antes de la floculacin.
-

Autofloculacin: para emplear este mtodo, se sigui la metodologa usada

por Mendoza y Valido (2011). Se seleccionaron cultivos de tres litros,
retirando la agitacin y aporte nutrientes durante 10 das expuesta al sol,
facilitando la precipitacin de la biomasa y adems induciendo a la fase de
estrs carotenognico propio de la Dunaliella sp. De igual forma, se realiz
un conteo de clulas en el sobrenadante, reportando el porcentaje de algas
removido mediante la La cosecha de la biomasa de la Dunaliella sp., se
realiz mediante la tcnica de biofloculacin con quitosano y autofloculacin,
descritas a continuacin:. Por ltimo se retir el sobrenadante mediante la
tcnica de sifonado, quedando la biomasa en el fondo.
Una vez obtenida la pasta microalgal, se procedi al proceso de
secado, donde la muestra fue colocada en cpsulas Pietri durante 24 horas a
una temperatura de 55C en una estufa. Luego la biomasa fue pulverizada a
travs de trituraciones y conservada en bolsas hermticas para evitar que
ingresara humedad del ambiente.

34

La concentracin de la biomasa obtenida, as como la productividad

de la misma, se determin mediante las frmulas aplicadas por Alvear y
Castillo (2011).

Concentracin y productividad de biomasa

Estas caractersticas se determinaron mediante las ecuaciones 4 y 5;

presentadas a continuacin:
Ecuacin 4. Concentracin de Biomasa

CB=

Pc biomasaPc vacio
V muestra

Donde:
CB: concentracin de biomasa (mg/L)
Pc biomasa: peso cpsulas con biomasa (mg)
Pc vaco: peso cpsulas sin biomasa (mg)
V muestra: volumen de muestra (L)

Ecuacin 5. Productividad de biomasa

PB=

CB
t cultivo

Donde:

35

PB: productividad de biomasa (mg/L*da)

CB: concentracin de biomasa (mg/L)
T cultivo: tiempo de cultivo (da)
Fase II: Aplicacin de mtodos extractivos de compuestos bioactivos en
Dunaliella sp.
Esta fase se desarroll en dos etapas, la primera evaluando mtodos
de extraccin convencional, con mezclas binarias y ternarias de solventes
qumicos y la segunda extraccin con fluidos supercrticos con CO 2
I etapa. Mtodos de extraccin convencional
-

Extraccin liquido-liquido con mezclas binarias

Para esta extraccin se dise un experimento tipo multifactorial

categrico, con dos factores de estudio por triplicado cada uno, factor 1:
mezcla de solventes y factor 2: composicin, con una muestra de 5 mL.,
resultando un total de 12 combinaciones (Ver tabla 4).

En el desarrollo del diseo, el factor 2 relacionado a la composicin,

se evala especficamente la influencia de la proporcin o nivel de acetona,
puesto a que es el compuesto que predomina en ambas mezclas estudiadas,
as como, por la afinidad y capacidad extractiva de carotenoides y otros
pigmentos como clorofila en Dunaliella, segn lo sugerido por Guevara y
Romero (2008).

36

Tabla 4. Extracciones experimentales con mezclas binarias.

Mezclas
Acetona/ Agua
Acetona/Metanol

Composici
n
70/30
y
90/10

Para la extraccin de los carotenoides totales en Dunaliella sp., se

tom la biomasa (procedente de la filtracin de 5 mL de cultivo y por
triplicado) cosechada al final del ensayo (10 das en cultivo de
fotobiorreactor) y se mantuvo durante 24 h a 4C, con 5 mL de cada una de
las

composiciones

de

las

mezclas

de

solventes.

Se

realiz

espectrofotometra a una longitud de onda de 480 nanmetros siguiendo la

metodologa de Guevara y Romero (2008) para los mximos de absorcin de
-caroteno.
La cuantificacin del contenido de carotenoides totales, en cada uno
de los sistemas de extraccin, se realiz segn lo descrito por Parsons y
Strickland (1972), mediante la Ecuacin 6 y los resultados obtenidos se
contrastaron a travs de un anlisis de varianza utilizando para ello el
software estadstico Statgraphics Centurin versin XVI.
Ecuacin 6. Carotenoides totales
|480|
C=4
Donde:
C: carotenoides (mg/L)
Abs: absorbancia a la longitud de onda especificada

37

Extraccin slido-lquido con mezcla ternaria

Para esta extraccin, se tomaron 20 g de biomasa seca pulverizada

(ver figura 6-a), se le aadieron 200 mL de la mezcla ternaria monofsica

compuesta por etanol-hexano-agua en proporciones de 77:17:6 y se
mezclaron de forma adecuada durante 5 minutos para maximizar el contacto
entre las fases (ver figuras 6 c-d), para finalmente decantar y retirar el
sobrenadante.
Figura 6. Biomasa seca de Dunaliella sp. (a), extraccin antes de la
agitacin (b), primera rplica de extraccin ternaria (c), segunda replica de
extraccin ternaria (d)

Los carotenoides extrados fueron analizados con el uso de un

spectronic 20D, leyendo estos compuestos a una longitud de onda de 451nm
siguiendo la metodologa de Melndez y Martinez (2007) para carotenoides
totales. La cantidad de carotenoides extrados, se calcul utilizando la
ecuacin 7:

38

Ecuacin 7. Carotenoides totales

CT=

AVC1000
A 11 Cm100V

Donde:
CT: Carotenoides totales (mg/L)
A: Absorbancia a 431 nm.
VC: Volumen de la muestra en la celda (mL)
V: Volumen de la muestra (L)
1

A 1 Cm : Coeficiente de absorcin especfico para carotenoides totales

(2500).
II etapa. Extraccin no convencional

Extraccin con CO2 supercrtico

En esta etapa se estudi la extraccin con CO 2 supercrtico, para lo

cual se dise un experimento tipo multifactorial categrico, con dos factores

de estudio: la presin y la temperatura, con una alimentacin al equipo de 50
gramos.
Tabla 5. Condiciones de operacin de la planta piloto de extraccin
Extracci
n

Presi
n (psi)

Temperatura
(C)

Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Ensayo 4
Ensayo 5
Ensayo 6

800
1000
1200
800
1000
1200

60
60
60
50
50
50

39

Se utiliz la estacin piloto de extraccin supercrtica con condiciones

de presin de diseo de 1200 psi, asistido por CO 2 como fluido de extraccin,
describiendo el proceso en el Error: Reference source not found.

FASE III: Analizar los rendimientos de los compuestos bioactivos obtenidos

por los mtodos de extraccin.

En los ensayos para las extracciones con mezclas binarias, los valores
obtenidos fueron analizados con el software estadstico, aplicando un anlisis
de varianza (ANOVA) a las extracciones experimentales binarias y aplicando
el test de Fisher con un 95% de confianza para cada factor de estudio.
Los rendimientos para las extracciones con fluidos supercrticos fueron
calculados con la ecuacin 8 utilizadas por Alvarez y Amaro (2011).
Ecuacin 8. Porcentaje del rendimiento de extracto

R=

producto obtenido
100
muestra alimentada

40

CAPTULO IV
RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS
En el siguiente captulo se detallan los datos, resultados y
conclusiones obtenidas en cada fase de experimentacin, as como los
rendimientos calculados, los grficos correspondientes a cada actividad
realizada, y los anlisis de cada uno de estos resultados.

Fase I. Obtencin de biomasa algal

La obtencin de biomasa a partir de Dunaliella sp., se realiz a
condiciones definidas, con 3 etapas de escalamiento, evaluando la cintica
de crecimiento, tcnicas de cosechado, as como la concentracin y
productividad de la biomasa. A continuacin se presentan los anlisis de los
resultados obtenidos en las diversas actividades que apoyaron esta fase
metodolgica.
Escalamiento del cultivo
La microalga Dunaliella sp., se desarroll en medio de agua de Miguel,
cultivo que vali como inculo inicial, con una densidad de 4,00E+04 cl/mL,
para las evaluaciones de los cultivos a escala de 300 mL, inoculando 10 mL
por cuadruplicado.

41

El estudio de la microalga Dunaliella sp., durante sus diferentes fases

de crecimiento permite determinar cada una de sus constantes cinticas,
intervalos de tiempos de reaccin y factores relevantes a tener en cuenta al
momento de su cosecha para as aprovechar los das en que exista una
mayor presencia de biomasa microalgal. Durante el tiempo de monitoreo del
cultivo se pudo evidenciar que para todas las etapas del cultivo, hubo
presencia de las distintas fases de crecimiento como lo son la fase de
latencia, fase de crecimiento exponencial y fase estacionaria.
La fase de latencia, donde la microalga se acopla a las condiciones
del medio establecido, estuvo comprendida desde el da 0 hasta el primer da
en cada uno de los bioensayos (Ver grafica 1, 2, 3, 4) demostrando la
adaptacin rpida de Dunaliella sp., en todas las etapas de escalamiento.
Alvear y Castillo (2011), en un cultivo evaluado por 12 das de Chorella
nativa, presentaron una fase de latencia de un da, luego de la cual todos los
cultivos comenzaron su fase exponencial, siendo muy similar el tiempo de
latencia evidenciada a la realizada en esta investigacin.
Por otra parte, Barreno et al, (2015), reportaron su fase de latencia
desde el segundo al sexto da para Dunaliella sp., proveniente de la misma
zona en estudio, retardo que se ve influenciado ya que, aislaron la cepa
directamente desde la salina Las Cumaraguas a condiciones de laboratorio
para su evaluacin, mientras que en la presente investigacin, el inculo ya
se encontraba aislada en un cepario, es decir, no sufri un cambio brusco de
condiciones. Esto lo que hace es afirmar la teora de la adaptabilidad halfila
de Dunaliella a las distintas condiciones para el rpido crecimiento y
establecer su levantamiento celular exponencial.
La fase exponencial es donde mejor se aprecia la cintica de
crecimiento del cultivo, sta vari en las 3 etapas del escalamiento. Para los
cultivos iniciales (300 mL) la fase exponencial en todos los bioensayos inicia

42

entre los das 1 a 12 (Grfica 1), mientras que la primera etapa de escalado
(300 mL - 800 mL) en los bioensayos (DN1, DN2, DN3, DN4) se observ un
comportamiento similar iniciando entre los das 1 a 10 (Error: Reference
source not found). As, en estos cultivos se prolong menos su fase
exponencial (9 das) con respecto a los cultivos iniciales (11 das), esto
puede deberse a que existe una menor dilucin del cultivo, y por ende las
microalgas llegan a una densidad celular estacionaria mucho ms rpido que
en la primera etapa.

Grfica 1. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 300 mL

Grfica 2. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 800 mL

43

En la segunda etapa de escalamiento (800 mL - 3 L), la fase

exponencial se evidencia entre los das 1 a 11 ( ver Error: Reference source
not found), con una mayor densidad en estos cultivos, esto puede deberse a
que se coloc una agitacin continua a los cultivos por medio de una bomba
de aireacin, mientras que los cultivos en la primera etapa, la agitacin se
realizaba de manera manual, favoreciendo el crecimiento de la microalgas ya
que ayuda a la homogenizacin de los nutrientes en todo el cultivo, por lo
tanto genera un mayor crecimiento celular y desarrollo poblacional tal como
lo describe Helm y Bourne (2006).
Grfica 3. Crecimiento Dunaliella sp. a escala de 3 L

44

En la tercera etapa del escalamiento (3 L - Culitvo Control,

Fotobiorreactor), la fase exponencial del cultivo control estuvo comprendida
desde el da 1 hasta el da 12, mientras que en el fotobiorreactor se prolong
desde el da 1 hasta el da 10 ( ver Error: Reference source not found). A
pesar de que ambos cultivos comenzaron su fase exponencial en el primer
da, el cultivo control mantuvo una densidad celular superior a la del
fotobiorreactor hasta el da 8, sin embargo; una vez que la Dunaliella sp., se
acopl a las condiciones del fotobiorreactor, se evidenci el salto de la
densidad celular que mantena el cultivo control, cortndose las lneas
exponenciales entre los das 8 y 9 de la evaluacin de los cultivos. La
densidad celular alcanzada en el fotobiorreactor, fue mayor que la obtenida
en el cultivo control, esto puede deberse principalmente a las condiciones de
irradiacin de luz del fotobiorreactor, que permiten a las microalgas dentro de
las mangueras absorber luz de una forma ms directa, colaborando en su
proceso de fotosntesis. Tambin es importante mencionar que la fase
exponencial en el fotobiorreactor (9 das) es ms rpida que en el cultivo
control (11 das), logrando estabilizarse en dos das menos.

45

Grfica 4. Crecimiento Dunaliella sp en fotobiorreactor y cultivo control

Alvear y Castillo (2011), reportaron su fase exponencial entre los das

2 y 5, en cultivos evaluados por 12 das de Chorella nativa, siendo mucho
ms corta que las reportadas en las 3 etapas de escalamiento de esta
investigacin. Sandoval (2013) en la construccin de la curva de crecimiento
para Chorella nativa, obtuvo su fase exponencial entre los das 1 y 8, usando
un fotobiorreactor de 15 L, en el que logr una estabilizacin ms rpida que
en el fotobiorreactor evaluado en esta investigacin (10 das). Esto pudo
deberse a factores como la agitacin, ya que el sistema de aireacin segn
su diseo, proporcionaba un movimiento constante a todo el volumen del
cultivo por ser un recipiente cilndrico, en comparacin con el fotobiorreactor
en

estudio

que

es

de

espiral

de

mangueras,

que

dificulta

una

homogenizacin completa del cultivo.

La fase estacionaria, para todas las etapas de escalamiento,
comprendi entre los das 10 y 14, donde se observ un crecimiento
sucesivo

pero

no

exponencial,

mantenindose

una

tendencia

del

microorganismo a estabilizarse en el da 14 de cultivo (da final de

46

evaluacin); no se present fase de muerte debido a que el cultivo pas

mltiples etapas de escalamiento, permitiendo un refrescamiento constante
de nutrientes.
Analizando el cultivo control y fotobiorreactor, se determin que la
mayor densidad celular y calidad de la microalga segn el color ms verde
oscuro obtenido (ver Figura 7-c, dError: Reference source not found), ocurre
en el fotobiorreactor. Por esta razn, se decidi utilizar los cultivos del
fotobiorreactor para las siguientes fases de esta investigacin, y realizando
experimento por triplicado.
Figura 7 . Cultivo Control (a, b) y Fotobiorreactor (c, d)

Essmann
(2011), en un

cultivo

de

Isochrysis aff.galbana, utilizando un fotobiorreactor tipo semicontinuo tubular,

en la fase exponencial de su investigacin, al 4 da del cultivo obtuvo una

densidad celular de 2,30E+07 cl/mL siendo una densidad inferior a la
alcanzada en esta investigacin. De igual forma, Lpez y Rangel (2013),
evaluaron en el mismo fotobiorreactor usado en este trabajo, un cultivo de

47

Chlorella sp., alcanzando la fase exponencial al sexto da, con una densidad
de 3,90E+06 cl/mL, muy inferior a la obtenida en esta investigacin.
Sin embargo, Sandoval (2013), en un fotobiorreactor con un cultivo de
Chlorella sp., evalu el crecimiento durante 16 das, obteniendo su fase
exponencial en el da 12 con una densidad de ms de 8E+07 cl/mL, la cual
resulta muy superior a los 5,17E+07 cl/mL obtenidos en esta investigacin
en el fotobiorreactor.
Esta diferencias de densidades celulares mencionadas anteriormente,
puede deberse a las dificultades cuando exista falla elctrica en el
laboratorio, esto adems de no proporcionar luz a las microalgas, tambin
generaba falta de aireacin, que no permita su recirculacin, quedando
estancado (una parte en fase oscura completa, al igual que otra en fase luz),
de igual forma significaba una prdida en el cultivo, puesto que la vlvula de
aireacin segn el diseo del fotobiorreactor (ver figura 8), permita un goteo
constante, ocasionando prdidas en el volumen del cultivo, que al estar por
debajo del nivel mnimo de cultivo para el funcionamiento, no permite la
recirculacin, y por consiguiente tampoco favorecer el crecimiento de las
microalgas.

Figura 8. Sistema de aireacin en el fotobiorreactor

48

A pesar de que el volumen funcional de 16 L, en las 3 corridas fue

inoculado con una media de densidad celular (da 0 con densidad celular
media de 2,47E+07), el comportamiento de la curva de crecimiento de las
microalgas fue similar pero no igual (ver Error: Reference source not found),
esto puede deberse a que son microorganismos y aunque se encuentren en
las mismas condiciones, su comportamiento pueden parecerse pero no ser
igual.
Grfica 5. Curvas de crecimiento de las repeticiones durante la puesta en
marcha del fotobiorreactor.

49

Evaluacin Cintica del crecimiento de Dunaliella sp.

Luego del monitoreo celular diario en cada una de las etapas del
escalamiento, se procedieron a evaluar los parmetros cinticos, mostrados
en la Tabla 6. Tanto la velocidad de crecimiento () como el tiempo de
duplicacin (td) se vieron afectados significativamente por el escalado del
cultivo, ascendiendo el valor , de 0,0922 Div/da a 0,1967 Div/da, al pasar
de la escala de 300 mL a la de 16 L; mientras que en el td descendieron sus
valores de 7,5187 a 3,5237 das respectivamente.

Tabla 6. Parmetros cinticos de Dunaliella sp., en las diferentes etapas del

cultivo.

Escala (mL de
cultivo

Muestra
s

(Div/da)

Td (das)

0,0912

7,6042

0,0922

7,5187

0,0919

7,5439

0,0896

7,7392

0,0938

7,3873

0,0985

7,0392

0,0893

7,7645

0,0934

7,4251

0,1207

5,7412

0,1079

6,4217

0,1217

5,6972

300

800

3000

50

Dc mx (cl/mL)

( x DS)
1,46E+075,00E+
05
1,50E+075,04E+
06
1,48E+074,98E+
06
1,4E+074,95E+0
6
1,88E+074,15E+
06
1,90E+074,35E+
06
1,83E+074,08E+
06
1,83E+074,17E+
06
2,49E+077,13E+
06
2,53E+076,81E+
06
2,52E+076,79E+

06

13000 (control)
16000
Fotobiorreactor

0,1240

5,5910

1
1

0,1147
0,1890

6,0409
3,6678

2
3

0,1935
0,1967

3,5814
3,5237

2,49E+076,94E+
06
4,20E+071,17E+
5,17E+071,98E+
07
4,95E+071,95E+
5,03E+071,91E+
07

(: velocidad de crecimiento, Td: tiempo de duplicacin, Dc: Densidad

celular)
Los resultados se obtuvieron como se esperaba para un cultivo
microalgal, ya que, a medida que aumenta la velocidad de crecimiento
disminuye el tiempo de duplicacin, el tiempo de duplicacin es lo que tarda
el cultivo en duplicar su densidad celular, es por ello que mientras ms bajo
sea este tiempo se incrementar la velocidad de crecimiento y por ende el
cultivo generar una mayor densidad celular.
Es evidente que las variables presentes en el escalado como la
agitacin y la iluminacin presentan una influencia decisiva en el crecimiento
y el tiempo de duplicacin, ya que la agitacin en los cultivos iniciales (300
800 mL) se realiz de forma manual; en los cultivos de 3 L se utiliz una
bomba de aireacin mientras que en el fotobiorreactor fue transmitida por el
compresor del laboratorio, contribuyendo a la homogenizacin de los
nutrientes, al movimiento constante de las clulas hacia la superficie
luminosa y a la optimizacin de la fotosntesis, adems de aportar el CO 2
para el crecimiento celular. De igual forma la iluminacin, tambin es una
variable influyente, puesto que determina la intensidad a la que se realiza la
fotosntesis, segn lo descrito por Contreras y Pea (2003), en este caso
mejor la disposicin de las microalgas de recibir luz gracias al diseo en
espiral del fotobiorreactor.

51

Investigaciones como la desarrollada por Sandoval (2013), acerca del

crecimiento de cultivos de Chorella sp., en un fotobiorreactor con una
capacidad de 15 L, seala que en una velocidad de crecimiento mucho
mayor a las obtenidas en el fotobiorreactor en la presente investigacin, con
un valor de 0,262 Div/das, las densidades celulares alcanzan valores de
hasta 8,14.106 cl/mL con un tiempo de duplicacin del cultivo de hasta 2,63
das. Otra investigacin que evalu el crecimiento de cultivos de Dunaliella
con un escalado, fue la desarrollada por Alvear y Castillo (2011), quienes
obtuvieron una velocidad de crecimiento mucho menor que las alcanzadas
por esta investigacin con un valor mximo de 0,093 div/da y un tiempo de
duplicacin de 7,479 das. Con los parmetros cinticos obtenidos, se pudo
destacar la importancia de la proporcin lumnica en el fotobiorreactor piloto
utilizado para la obtencin de biomasa de Dunaliella sp., lo cual puede
referirse como el parmetro que influy de forma ms notoria en las
respuestas fotosintticas del microorganismo, proporcionando velocidades
de crecimiento y tiempo de duplicacin aceptables y comparables con otras
investigaciones.
Evaluacin de tcnicas de cosechado
Los resultados de las tcnicas de biofloculacin por quitosano y la
autofloculacin para el cosechado de Dunaliella sp., evaluadas para separar
la biomasa producida del medio de cultivo, se presentan a continuacin.
Biofloculacin por quitosano
Los valores de pH mantuvieron un comportamiento similar en las
experiencias realizadas, la concentracin de quitosano de 40 mg/L se
mantuvo entre 8,24 0,40 mientras que la concentracin de 200 mg/L estuvo
entre 8,33 0,34 tomados de las experiencias por triplicado realizadas para

52

las dos concentraciones del quitosano evaluadas (ver anexo 4 y 5). Nieto y
Orellana (2011), evaluaron el pH (5, 7 y 9) para un ensayo de jarra en una
floculacin con quitosano para disminuir la carga contaminante de agua,
obteniendo mejores resultados para un pH neutro.
Foubert y Muylaert (2013), expone en su teora la influencia del pH
en la floculacin de microalgas sobre la estructura molecular del quitosano,
planteando que esto es debido a las diferencias en la protonacin de los
grupos amina en el biopolmero y las variaciones en la conformacin de la
cadena de macromolcula y en la estructura de los flculos. Segn estos
autores cuando el pH aumenta, aumenta su punto de neutralizacin, las
clulas de microalgas tienen la mayor carga negativa, y la eficiencia de la
floculacin se mejora con la interaccin electrosttica entre las clulas de las
algas y el quitosano, mientras que en soluciones cidas, el quitosano se
convierte en una cadena ms extendida, y por lo tanto, produce flculos ms
pequeos y flexibles, sin embargo para esta investigacin, en los 10 das del
proceso evaluado no hubo cambios bruscos en los pH reportados en las
experiencias (ver grfica 6), registrando valores alcalinos que muestran
relativa eficacia del quitosano.
Grfica 6. Media de pH monitoreado en concentraciones 40 mg/L y 200
mg/L

53

El

porcentaje

de

remocin,

calculado

por

la

diferencia

de

concentracin celular en el sobrenadante con respecto al cultivo sin flocular,

para las concentraciones de 40 mg/L y 200 mg/L, se observ de manera
creciente hasta el sptimo da (ver El porcentaje de remocin, calculado por
la diferencia de concentracin celular en el sobrenadante con respecto al
cultivo sin flocular, para las concentraciones de 40 mg/L y 200 mg/L, se
observ de manera creciente hasta el sptimo da (ver El porcentaje de
remocin, calculado por la diferencia de concentracin celular en el
sobrenadante con respecto al cultivo sin flocular, para las concentraciones de
40 mg/L y 200 mg/L, se observ de manera creciente hasta el sptimo da
(ver grfica 7), en este tiempo el porcentaje de remocin a la concentracin
de quitosano 40 mg/L fue mayor, sin embargo desde el sptimo da hasta el
dcimo da (da final de la evaluacin), el porcentaje se mantuvo creciente
pero no en grandes proporciones, obteniendo para el quitosano a 40 mg/L un
porcentaje final de remocin de 83,90% y para 200 mg/L un 85,93% (ver
anexo 13 y 14).), en este tiempo el porcentaje de remocin a la
concentracin de quitosano 40 mg/L fue mayor, sin embargo

desde el

sptimo da hasta el dcimo da (da final de la evaluacin), el porcentaje se

54

mantuvo creciente pero no en grandes proporciones, obteniendo para el

quitosano a 40 mg/L un porcentaje final de remocin de 83,90% y para 200
mg/L un 85,93% (ver anexo 13 y 14).), en este tiempo el porcentaje de
remocin a la concentracin de quitosano 40 mg/L fue mayor, sin embargo
desde el sptimo da hasta el dcimo da (da final de la evaluacin), el
porcentaje se mantuvo creciente pero no en grandes proporciones,
obteniendo para el quitosano a 40 mg/L un porcentaje final de remocin de
83,90% y para 200 mg/L un 85,93% (ver anexo 13 y 14).
Grfica 7. Media de porcentaje de remocin de microalgas en cosecha de
quitosano a 40 mg/L y 200 mg/L.

Chen y Zhao (2014), muestran en su investigacin una tabla con

concentraciones de quitosano para una serie de microalgas; sin embargo no
incluye la Dunaliella sp. Para Tetraselmis chui, se manifest una eficiencia
de floculacin de 80% mientras que para la utilizada de Chorella vulgaris
reporta una eficiencia de floculacin de 99,7%. Comparando con los valores
obtenidos en la presenta investigacin, se tiene que fueron superiores a los
valores de remocin en Tetraselmis chui, no obstante estuvo por inferior de la
utilizada por Chorella vulgaris.

55

Romero y Ferrn (2011), estudiaron varias concentraciones de

quitosano como biofloculante en la cepa Chlorella sp., resultando 117 mg/L
como la ptima para la biofloculacin, lo que representa porcentajes de
remocin mayores al 90%, superior a los obtenidos en Dunaliella sp, en esta
investigacin tanto a 40 mg/ L como a 200 mg/L.
Autofloculacin
En esta investigacin se determin que el tipo de cultivo fue de doble
fase como lo describe Mendoza y Valido (2011) ya que se observ un cambio
en la tonalidad de los cultivos (ver Figura 9-a) de un verde obtenido en la
primera fase (fase vegetativa) a un color naranja en la segunda fase en el
sobrenadante (fase carotenognica) (ver Figura 9-b). sto ocurre por los
cambios asociados a las condiciones de estrs, teniendo en cuenta que en
una primera fase los cultivos en fase vegetativa (fotobiorreactor) se
encuentran a alta disponibilidad de nutrientes, con densidades relativamente
altas, y luego el cultivo se somete a una segunda fase o fase de induccin de
carotenognesis, caracterizada por la supresin de nutrientes en el medio,
con una menor densidad celular y un aumento de la exposicin del cultivo a
la radiacin solar (ver figura 10), condiciones que propician la autofloculacin
(Mendoza y Valido, 2011;Sunenik y Shelef, 1984).
Figura 9. Cultivo en fase vegetativa (a), cultivo en fase carotenognicaautofloculacin (b)

56

Figura 10. Cultivos expuestos a condiciones de estrs propicias para la

autofloculacin

Se observ en el experimento una remocin de microalgas creciente

hasta el octavo da de evaluacin del cultivo, siguiendo una tendencia
constante desde el octavo da, hasta el dcimo da (ltimo da de
evaluacin), obteniendo un valor superior de remocin de 88,46% para la
tercera rplica, y un valor inferior de 83,46% para la segunda rplica como se
muestra en la grfica 8.
Grfica 8. Porcentaje de remocin en autofloculacin.

57

Moreno & Arias (2012), en la evaluacin de la autofloculacin de

Chlorella vulgaris, reportaron en la velocidad de autofloculacin, un 72% de
remocin de microalgas para una temperatura de 25 C, un valor menor que
los reportados en esta investigacin. Sunenik y Shelef (1984), exponen el
mecanismo de la autofloculacin, la importancia de que exista un pH mayor a
8,5 para que exista una remocin de microalgas, en condiciones de altas
radiancias de sol, pero sobre todo, la existencia de iones calcio y ortofosfato,
ya que en condiciones alcalinas un precipitado de calcio se forma en fostato,
la formacin de tales precipitados en el medio de cultivo, poseen una carga
superficial elctrica positiva, por lo cual puede ser absorbido y reaccionan
con clulas de las algas para neutralizar su superficie elctrica negativa
promoviendo as la floculacin de las algas.
En este sentido, para el caso de esta investigacin, a pesar de no
evaluar los valores pH en las cuales se sometieron a la autofloculacin, se
puede inferir que segn los componentes utilizados en el medio agua de
Miguel, existen iones calcio y fosfato, que ayudan a la formacin de los
precipitados de fosfato, para neutralizar la carga negativa de Dunaliella sp.,
hacindola ms densa y permitiendo una recuperacin de biomasa ms
eficiente.

58

Comparacin de mtodo de cosechado biofloculacin por quitosano y

autofloculacin

Se realiz una comparacin de los mtodos de cosecha utilizados, con

el fin de seleccionar el mejor para la produccin de microalgas en las
extracciones.
El porcentaje de remocin por biofloculacin fue mucho ms alta
durante los primeros 7 das antes de que se mantuviera constante, al igual
que en la autofloculacin (ver Grfica 9). Sin embargo, estadsticamente se
obtuvieron porcentajes de remocin parecidos para los dos mtodos de
cosecha (85,41% 1,08%) (ver Anexo 8.16).

Grfica 9. Porcentaje de remocin de microalgas con los mtodos de

cosecha evaluados

Analizando cada uno de los mtodos de cosecha evaluados, la

biofloculacin por quitosano es un buen mtodo de cosecha, ya que adems
de evitar la utilizacin de otros floculantes (sulfato de aluminio) ms

59

contaminantes Foubert y Muylaert (2013) seala que el quitosano, posee una

toxicidad prcticamente nula, adems que la presencia de los grupos amino
en el quitosano hace que sea un poli electrlito catinico (pKa= 6,5), pocos
encontrados en la naturaleza. No obstante, en la autofloculacin, no es
necesario agregar agentes qumicos que contaminen la biomasa a obtener,
adems de igual manera que el tiempo de cosecha es igual a 10 das,
facilitando el cultivo paralelamente a condiciones de estrs, conjuntamente
favorece

la

formacin

de

metabolitos

secundarios,

especficamente

carotenoides, para las extracciones posteriores en esta investigacin.

Por esta razn el mtodo de cosecha elegido para las posteriores
fases de esta investigacin es la de la autofloculacin, mediante un sistema
de cultivo de doble fase, con 10 das para la fase vegetativa, 10 das para la
carotenognica (autofloculacin), permitiendo la posterior cosecha y
extraccin de metabolitos secundarios.
Concentracin y productividad de Biomasa
En la tabla 7 se muestra las valores con respecto a la productividad de
la biomasa en distintas investigaciones; Alvear y Castillo (2011), en el
crecimiento de D. salina, obtuvieron hasta 71, 89 mg/L*da, mientras que
Gouveia y Oliveira (2009) y Takagi (2006) evaluaron la productividad en la
microalga D. tertiolecta obteniendo 120 y 100 mg/L*da respectivamente. As
mismo, Barreno et al. (2015), utilizando cepa de la misma microalga de Las
Cumaraguas lograron una productividad de 149,41 mg/L*da, para cultivos a
escala de laboratorio.
Es evidente que los resultados alcanzados en esta investigacin
superan los valores obtenidos por los autores mencionados anteriormente;
sin embargo, es importante destacar, que debido a que el crecimiento de
Dunaliella sp., en condiciones hipersalinas, al momento de la cosecha de la

60

biomasa sta conservaba restos de sal (ver Figura 11), por lo tanto el reporte
de la concentracin y productividad reflejado es una biomasa microalgal
bruta, pudiendo ser sta, una de las causas por las que se obtuvo una alta
productividad; pese a esto, Mata (2010), reporta una productividad con un
intervalo entre 220 y 340 mg/L*da,para el caso de D. salina siendo superior
a la obtenida en esta investigacin.

Tabla 7. Productividad de la biomasa del fotobiorreactor comparada con

otras investigaciones.
Autor

Microalga

CB
(mg/L)

PB
(mg/L*da)

Presente Trabajo
Barreno et al. 2015)
Alvear & Castillo (2011)
Gouveia & Oliveira
(2009)
Takagi (2006)

D. sp.
D. sp.
D. salina
D. tertiolecta

4777,78
4183,44
1078,4
---

238,89
149,41
71,89
120

D. tertiolecta
D. salina
D.
primolecta
D. tertiolecta

-------

100
220-340
90

---

120

Mata (2010)

Figura 11. Biomasa seca cosechada en cpsula Pietri

61

Fase II. Aplicacin de mtodos extractivos de compuestos bioactivos en

Dunaliella sp.
Los resultados de los mtodos de extraccin de compuestos
bioactivos a travs de mtodos convencionales con solvente orgnicos en
fases binarias y ternarias, as como con CO 2 supercrtico, se presentan a
continuacin.
Extraccin lquido-lquido con mezclas binarias
El contenido de carotenoides totales por clula, extrado de la cepa
Dunaliella sp., se muestra en la Tabla 8.
Tabla 8. Concentracin promedio de carotenoides totales por clula
(pg.cl-1 DS) extrados de Dunaliella sp.

62

Las mezclas de solventes evaluadas en las extracciones tuvieron una

gran influencia con respecto al contenido de carotenoides totales (ver Tabla
8), la mezcla acetona/metanol, en proporcin de 70/30 fue la que gener
mayor cantidad de carotenoides, mientras que la mezcla acetona/agua en
proporcin 70/30 obtuvo menor cantidad de carotenoides. Es relevante que
la mezcla extractiva acetona /agua en ambas proporciones, arroj los
resultados de menor cantidad de carotenoides extrados lo que puede
deberse, segn lo descrito por Guevara y Romero (2008), a que la polaridad
del agua influye en la extraccin que en cierta manera, por su condicin de
solvente muy polar y posibilidad de formar puentes de hidrgeno, neutraliza
el dipolo creado en la acetona.
Autores como Guevara y Romero (2008) as como Cifuentes &
Gonzalez (2001) tambin evaluaron mezclas de solventes, obteniendo los
ptimos para las condiciones de proporcin 90/10 en acetona/metanol (ver
Tabla 9), no obstante, sus resultados difieren de esta investigacin, en
cuanto a la proporcin de las mezclas en las que se obtienen mejores
valores de carotenoides (70/30), pero s coinciden en que la mezcla de
acetona/metanol posee mejor capacidad extractiva, esto puede deberse a lo
descrito por Fabregas y Herrero (1984), a que en este sistema de solventes
los dipolos entre el oxgeno y el carbono del grupo cetnico y otro entre el
oxgeno y el carbono del grupo alcohol pueden interaccionar por atraccin
electrosttica, con los dipolos transitorios que se forman a lo largo de la
estructura de los carotenoides, cuya nube electrnica est deslocalizada por

63

toda la estructura, interaccionando con los carbonos que actan como

centros positivos presentes en las molculas de acetona y metanol.
Tradicionalmente, las extracciones de los compuestos bioactivos se
realizan con un slo solvente, muchas investigaciones refieren la utilizacin
de solventes de alta afinidad con los carotenoides, que son las sustancias
con mayor proporcin en Dunaliella (ver tabla 9). De acuerdo a lo anterior, se
valoran los trabajos investigativos de Barreno et al,(2015), quienes realizaron
extracciones de carotenoides con solvente hexano en Dunaliella sp.,
proveniente del mismo cepario (salinas de Las Cumaraguas), obteniendo
valores de 64,8 pg.cl. Los resultados obtenidos en este estudio estuvieron
cercanos a los obtenidos por Serpa y Caldern (2005), quienes aplicaron ter
de petrleo al 90% obteniendo valores en la cantidad de carotenoides de
58,8 pg.cl-1. Por otra parte, Ypez y Morales (1998) as como Lpez (2008)
utilizaron como solvente acetona al 80%, obteniendo mximos valores de
carotenoides totales de 45,4 y 11,9 pg.cl -1, respectivamente. Igualmente
Marn (1998) en la extraccin de carotenoides con acetona 90% obtuvo 0,81,6 pg.cl-1 en cepas Dunaliella salina originarias de las salinas de Araya
(Venezuela), siendo menores a los obtenidos en la presente investigacin.

Tabla 9. Carotenoides extrados con solventes orgnicos comparado con los

reportados por otras investigaciones

Autor

Microalga

Solvente

Proporcin (%)

Presente Trabajo

D. sp.

Acetona/
metanol

70/30

Guevara &
Romero (2008)
Cifuentes &
Gonzalez (2001)

D. salina Coche
D. salina Araya
D. Salina Costa
Chilena

Acetona/
metanol
Acetona/
metanol

64

Carotenoides
(pg.cl-1)

90/10
70/30
90/10
70/30
90/10

21,76 1,26
16,76 0,36
24 0,67
21,50,30/
20 0,67
24,80,21

90/10

110,9

Marn (1998)
Lopez K (2008)
Yepez y Morales
(1998)
Barreno et al.
(2015)
Serpa y Caldern
(2005)

D. Salina Araya
D.tertiolecta
San JosMxico
Dunaliella
Viridis
D. sp.
Cumaraguas
Dunaliella salina

Acetona

90

Acetona

80

Acetona

80

Hexano
ter de
petrleo

100
90

0,8-1,6
11,9
45,4
64,8
58,8

Extraccin slido-lquido con mezcla ternaria

Los resultados obtenidos en la tabla 10, fueron mayores a los
reflejados en la experiencia con solventes binarios en esta investigacin, esto
puede atribuirse al hecho de que el uso de la mezcla ternaria permite ajustar
la polaridad de la fase extractante (hexano-etanol) de forma que el hexano,
con los dipolos y las fuerzas de Van de Walls, pueden interaccionar a lo largo
de la estructura de los carotenoides; sin embargo, este solvente no extrae
por completo los carotenoides oxigenados (xantofilas), por lo que se necesita
la polaridad del etanol para que su afinidad con el grupo oxigenado permita
extraer la mayor cantidad de carotenoides totales.
Tabla 10. Concentracin promedio de carotenoides totales por clula
(pg.cl-1 DS) extrados de Dunaliella sp.

65

A nivel de escalas superiores de obtencin de carotenoides, como el

-caroteno, las extracciones con disolventes orgnicos como hexano o etanol
en forma de compuestos puros, se complica pues, se hace difcil modificar la
capacidad extractante, y para obtener rendimientos prometedores, se debe
realizar extracciones mltiples y por ende, realizar procedimientos para
recuperar los solventes y evitar trazas de los mismos en los productos. La
mezcla ternaria propuesta por Fernndez y Garca (2009) permite ajustar la
polaridad de la fase extractante de forma que se incrementa la solubilidad en
ella de carotenoides (hasta un 90%), permitiendo obtener unos extractos con
pocas impurezas y muy concentrados en estas sustancias. No obstante, en
esta investigacin no se realizaron las caracterizaciones de los productos de
manera tal que se verificara esta teora.
A pesar de las ventajas de este tipo de extraccin, existe una limitante,
debido a la poca variabilidad de las concentraciones de cada uno de los
solventes en la mezcla ternaria al momento de realizar un estudio detallado
del efecto de las proporciones en la eficiencia de la extraccin, ya que al ver
el diagrama triangular de la mezcla ternaria, la curva binodal del sistema es
bastante amplio, al quedar un margen muy estrecho para mantener la
condicin de mezcla monofsica (Ver Anexo 22).

Extraccin con CO2 supercrtico

Al comenzar la experiencia, con el primer ensayo planteado, se pudo
constatar que una vez alcanzadas las condiciones de operatividad del
proceso y permitir el paso del fluido desde el autoclave al reactor, la presin
se distribuye en ambos; es decir, se produce una cada de presin del 20%
aproximadamente. Esta cada de presin, incidi directamente y de manera
relevante en las condiciones requeridas para que se llevara a cabo el
proceso de extraccin debido a que no se alcanz a las condiciones

66

planteadas en la metodologa, por lo que disminuy la capacidad extractante

del CO2, no reportndose en esta experiencia obtencin de extracto.
Por otro lado, en el reactor se verificaron prdidas de energa que no
permitieron mantener las condiciones de temperatura, por lo que se debi
instalar un material aislante para que el calentamiento mejorara. En funcin
de la experiencia, se decidi realizar una segunda extraccin, con las
condiciones planteadas para el ensayo 6, con la mxima presin de
operacin del equipo y la mxima temperatura (60 C) que puede soportar la
materia prima; sin embargo tampoco se obtuvo extracto, por lo que no fueron
realizados los otros ensayos planteados en la metodologa.
En la

Tabla 11, se reflejan los resultados obtenidos de las

extracciones realizadas, la misma, slo se presentan los ensayos 1 y 6, que

son los de las combinaciones con condiciones ms bajas y ms altas de
presin y temperatura.
Tabla 11. Extracciones experimentales de la primera experiencia
Tiem
Extracci
po
n
(h)
Ensayo 1
Ensayo 6

2
2

Temperat
ura (C)

Presi
n
(psi)

50
60

800
1200

Extract
Muestra
o
alimentad
obtenid
a (gr)
o (gr)
50
50

Es importante recalcar que segn Mendiola (2008) la presin de

extraccin para Dunaliella sp., se encuentra en un intervalo de 2674,66 a
6436,82 psi, y la presin de diseo del equipo en esta investigacin es de
1584 psi , siendo la principal limitante de esta investigacin, por no cumplir
con las condiciones favorables para la extraccin.
Por esta razn se decidi modificar la metodologa inicial de esta
investigacin, cambiando variables del proceso, como el tiempo de

67

residencia de la extraccin, aumentndolo hasta 5 horas, para evaluar la

relevancia del mismo de manera que el dixido acte eficientemente en el
momento de la extraccin, sin embargo, dicha variable no repercuti en los
resultados de las experiencias, ya que tampoco se obtuvieron extractos.
De igual manera se modific la cantidad de biomasa alimentada,
duplicando su valor a 100 g, as como tambin la utilizacin de un cosolvente (ver figura 12), que segn Mendoza y Moreno (2013) y Alvarez y
Amaro (2011) ayuda la efectividad del solvente principal (CO 2) y disminuye el
tiempo de retencin. El coosolvente seleccionado fue el hexano (C 6H14), por
su capacidad como disolvente en los compuestos bioactivos presente en
Dunaliella sp., avalado en investigaciones anteriores como es el caso
Chirinos y Vegas (2012), quienes realizaron sus experiencias con hexano
como solvente, para la obtencin de -caroteno as como tambin Barreno et
al (2015) lo utilizaron en la obtencin de carotenoides totales, -caroteno y
lutena.
Figura 12. Dunaliella sp., junto al coosolvente hexano

En la Tabla 12 , se refleja que para la extraccin con una biomasa de

100 g alimentada, se logr obtener una emulsin aceitosa (ver Figura 13); sin
embargo se presume que est formado por una gran cantidad del
coosolvente (hexano), ya que al momento de evaluar el rendimiento, se
evapor la mayora de la muestra recogida, por ser un solvente altamente

68

voltil. Se obtuvo 0,424 g de extracto, lo cual se debe al refuerzo del

coosolvente (hexano), para ayudar al solvente principal (dixido de carbono),
en el proceso de extraccin.
Tabla 12. Extracciones experimentales varindo la muestra alimentada
Tiem
Temperat Presin(
po
ura (C)
psi)
(h)
5
5

60
60

Muestra
alimentada
(g)

1200
1200

100
50

Extract
o
obteni
do (g)
0,424
-

Figura 13. Extracto obtenido

Se realiz una ltima extraccin, pero esta vez, disminuyendo la

cantidad de biomasa a alimentar (50 g). A pesar de utilizar el coosolvente, en
esta extraccin, no se obtuvo extracto, esto pudo deberse a que no hubo la
misma cantidad de biomasa alimentada y por consiguiente no se impregn el
CO2 de la misma manera.

Fase III. Anlisis de los rendimientos de los compuestos bioactivos

obtenidos por los mtodos de extraccin

69

Extraccin lquido-lquido con mezclas binarias

Los resultados obtenidos por el Statgraphics se reflejan en la siguiente
tabla 13:
Tabla 13. Anlisis de varianza para la obtencin de carotenoides suma de
cuadrados tipo III

La Tabla 13, muestra la variabilidad de la obtencin de carotenoides

debido a los dos factores en estudio (nivel de Acetona y mezcla de solventes)
y las interacciones entre los mismos con un 95% de nivel de confianza. Los
valores de P, prueban la significancia estadstica de cada uno de los factores
en este estudio, debido a que el valor-P es menor a 0.05 tanto para la mezcla
de solvente como para la interaccin entre nivel de acetona y mezcla de
solventes, mostrando as un efecto estadsticamente significativo sobre la
obtencin de carotenoides, por otro lado, nos muestra que el nivel de
acetona el valor-P es mayor a 0,05 por lo que no muestra un efecto
estadstico en la obtencin del producto evaluado.
En la encia entre s., se muestra el efecto de la composicin de
solvente sobre la obtencin de carotenoides, se puede notar que para el nivel
de acetona bajo, las cantidades de carotenoides son altas, sin embargo la
70

dispersin de cdigos de nivel para tal concentracin de acetona es amplia.

Si se observan los puntos de dispersin, para el nivel de acetona, estn ms
bajos, pero tambin para niveles de acetona bajo, se obtuvieron pocos
carotenoides, menores a un nivel de acetona alto. Estos valores mostrados
en el Statgraphics demuestran que los niveles del factor composicin de
solvente no tienen efecto significativo sobre la variable estudiada, por lo que
se sugiere que los niveles o el nivel de acetona a emplear en otros estudios
para profundizar este efecto sean mayores o con una mayor diferencia entre
s.
Grfica 10. Efecto del Nivel de Acetona sobre la obtencin de carotenoides

El efecto sobre la obtencin de carotenoides del factor mezcla de

solventes (ver gGrfica 11) muestra que para las extracciones con mezcla de
solventes

Acetona-Metanol,

la

cantidad

de

carotenoides

es

alta,

indiferentemente del nivel de acetona que se utilice en la extraccin,

observando los punto de dispersin, se encuentran agrupados los mejores
resultados

para Acetona-Metanol,

71

los

bajos

para AcetonaAgua,

corroborando el ANOVA, lo realizado anteriormente en donde la mezcla de

solvente tiene un efecto estadstico significativo sobre la variable evaluada.

Grfica 11. Efecto de la mezcla de Solventes sobre la obtencin de

carotenoides

En la Grfica 12, donde se detallan las interacciones de cada

extraccin, se observan indicios de interaccin de los factores de nivel de
acetona alta; sin embargo, no es la zona de interaccin deseada, puesto que
el objetivo es obtener mayores rendimientos, tambin se observa que para
las condiciones de un nivel bajo de Acetona, con mezcla de solvente
Acetona-Metanol, se logra obtener la mayor cantidad de carotenoides.
Grfica 12. Grfico de interacciones para el nivel de acetona-Mezcla de
Solventes

72

Estos
resultados demuestran que para la mezcla de solvente Acetona-Agua,
independientemente del nivel de Acetona que se encuentre en el solvente,
los rendimientos de carotenoides no son significativos debido al bajo
porcentaje de carotenoides extrados. Es importante resaltar que con mezcla
de Solventes Acetona-Metanol, se obtienen los mejores resultados de
Carotenoides obtenidos, por otro lado el nivel de acetona no es significativo,
ya que los rendimientos de carotenoides ms altos fueron para niveles de
acetona tanto altos como bajo, por lo tanto se establece las condiciones que
generen mayor contenido de carotenoides, los cuales son con una mezcla de
solventes Acetona-Metanol con un nivel de Acetona Bajo, destacando su
proporcin (70/30).

A pesar de que las extracciones con mezclas de

Acetona-Agua econmicamente eran ms factibles, no se tomaron en

cuenta, debido al bajo rendimiento obtenido en la extraccin de los
carotenoides.

Extraccin con CO2 supercrtico

Las experiencias realizadas en la estacin con fluidos supercrticos,
los resultados en rendimiento fueron no favorables, demostrado en la Tabla
14 ya que en una sola oportunidad se logr obtener extracto.

73

Tabla 14. Resumen de experiencia con fluidos supercrticos

Experiencia

Extracc Rendimie
in
nto (%)
1
2
3
4
5
6

1
2
3

0,424
-

Refiriendo a la extraccin, donde se obtuvo extracto al utilizar el cosolvente hexano, y aumentando la cantidad de biomasa seca alimentada (de
50 g a 100 g). Se puede decir que estos dos factores, indujeron de manera
notable en la obtencin del extracto, ya que al disminuir la cantidad de
materia prima a 50 g alimentados, se obtuvo de igual forma un resultado
negativo como en las dems experiencias.
Mendoza y Moreno (2013), realizaron extracciones con fluidos
supercrticos para la semilla de mamey, probando de igual

manera la

utilizacin de hexano como coosolvente en una de las experiencias, sin

embargo, no obtuvieron extractos en su investigacin. Por otro lado Alvarez y
Amaro (2011), utilizaron como materia prima el aguacate, separando las
experiencia con la semilla del fruto y otras con pulpa del aguacate, para el
caso de la semilla, todos los valores fueron negativos sin obtener extractos,
pero para el caso de la pulpa del aguacate, lograron obtener una emulsin
aceitosa a las condiciones de 1300 psi y 160 F, con un rendimiento de
4,73%, siendo mejores resultados que los obtenidos en esta investigacin;
no obstante, se trata de otra tipo de materia prima.

74

Comparacin de los mtodos extractivos utilizados en la obtencin de

carotenoides
Entre los mtodos de extraccin utilizados en este trabajo de
investigacin, el que mayor contenido de carotenoides se obtuvo fue con la
mezcla ternaria etanol-hexano-agua. De igual forma, se debe tomar en
cuenta, que ste es un sistema propuesto en una patente por Fernandez y
Garca (2009), adems solo se realizaron dos rplicas para esta extraccin, y
la cuantificacin fue mediante espectrofotometra, recomendando realizarla
mediante un HPLC (High Perfonmance Liquid Cromatography), para detallar
cuantitativamente los carotenoides presentes y sus cantidades.
El segundo mejor mtodo extractivo fue la extraccin con solventes
binario utilizando una mezcla acetona-metanol en proporciones de 70/30,
este estudio es confiable dentro de las variaciones que se realizaron para la
extraccin, debido a que la mezcla acetona-metanol propuesta por Guevara
y Romero (2008) poseen fuerzas intermoleculares dipolo y de Van der Walls,
lo que hace que sea poco polar y mas solubles en los carotenoides, que
son bastante apolares. Tomando en cuenta que el mtodo extractivo con
menos cantidad de carotenoides obtenido,

fue en el que exista mayor

presencia de agua, ya que existen fuerzas como puentes de hidrgeno,

hacindolos insolubles y extrayendo muy poco por la diferencia de polaridad
entre compuestos.
Para el caso de la extraccin con fluidos supercrticos, los resultados
fueron no favorables; sin embargo, no se descarta un estudio de este tipo de
extraccin, pero que se logren llegar a las condiciones propuestas por
Mendiola (2008), ya que en teora, el CO 2 supercrtico es el mejor agente
extractivo entre los tres utilizados, y es el mtodo menos contaminante a los
productos obtenidos, adems que no necesita de un segundo tratamiento
para separar el solvente de los productos extractivos, por esta razn a pesar

75

de que no se obtuvo extracto en la experiencia, interesa para otros

investigadores los resultados obtenidos para Dunaliella sp., en la estacin
supercrtica utilizada en esta investigacin.

76

CONCLUSIONES

La mayor densidad celular reportada en los cultivos fue de 5,17 E+07 cl/mL,
para un volumen de 16 L en el fotobiorreactor con un tiempo de 10 das de
cultivo.
Dentro de los mtodos de cosecha valorados, la autofloculacin se perfil
como el ms adecuado experimentalmente, por reducir gastos energticos y
permitir condiciones en Dunaliella sp., propicias para la obtencin de
carotenoides.
La mxima productividad de biomasa fue 250 mg/L*da as como la mayor
concentracin fue de 5000 mg/L.
La mezcla binaria Acetona-metanol en proporciones de 70/30, report los
mayores extractos, obteniendo un resultado 21,76 1,26 pg/cel.
La mezcla ternaria de Etanol/Hexano/Agua en proporciones 77:17:6 report
30,241,08 pg.cl-1 de carotenoides.
Las condiciones de presin mxima alcanzadas por el equipo de extraccin
con fluidos supercrticos, no fueron suficientes para lograr resultados
valorativos y comparables con la literatura para Dunaliella sp.
Estadsticamente la mezcla acetona/metanol tiene una influencia significativa
sobre la cantidad de carotenoides obtenidos en el sistema binario.
El rendimiento de extracto obtenido por el mtodo de fluidos supercrtico fue
de 0,424% para las condiciones de operacin de 1200 psi y 60C,
alimentando 100 g de biomasa con un tiempo de extraccin de 5 h, utilizando
50 mL de hexano como co-solvente.

77

RECOMENDACIONES

Utilizar una estacin de fluidos supercrticos, que su presin de diseo

alcance las reportadas por la literatura para esta materia prima, ya que las
presiones trabajadas en esta investigacin son muy inferiores, limitando la
extraccin en el equipo.
Realizar una caracterizacin a los extractos obtenidos, mediante una
cromatografa lquida de alta eficiencia (HPLC).

78

BIBLIOGRAFA
Alvarez, A. y Amaro, A. (2011). Optimizacin del proceso de extraccin
supercrtica de extractos de aceite del fruto persea americana mill (Aguacate)
y su comparacin con un mtodo tradicional. Trabajo de pre-grado.
Universiad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Falcn: Venezuela
Alvear, M. y Castillo, C. (2011). Evaluacin del pH y concentracin de
nitrgeno en el cultivo de las microalgas Dunaliella salina y Chlorella nativa
como fuente de aceite vegetal para la produccin de Biodiesel. Universidad
de Cartagena. Cartagena de Indias: Colombia.
Arancibia, M. (2011). Aplicacin del quitosano como material bioabsorbente
en el proceso de coagulacin-floculacin durante el tratamiento de agua para
consumo humano.Trabajo de Magister en produccin ms limpia.
Universidad Tcnica de Ambato. Ambato: Ecuador.
Araujo, J. (2013). Desarrollo de un procedimiento para la extraccin de caroteno y glicerol a partir de la microalga Dunaliella sp. en la salina las
Cumaraguas. Revista Cubana de Qumica, 15.
Arias, F. (1999). El proyecto de investigacin. Caracas: Episteme.
Barra, R. y Guartatanga, S. (2010). Diseo de un Fotobioreactor Industrial
para el Cultivo de Spirulina. Revista Tecnologica ESPOL, 1-7.
Barreno et al. (2015). Determinacin de las condiciones mas adecuadas para
la obtencin de productos bioactivos a partir de Dunaliella sp., a escala
laboratorio. Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda.
Falcn: Venezuela.
Bermeo, L. (2011). Estudio del cosechado de cultivos de microalgas en agua
residual mediante tcnicas de centrifugado. Universidad Tcnica Particular
de Loja. Trabajo de pre-grado. Cdiz: Espaa.
Chen, G., y Zhao, L. (2014). Chitosan and Its Derivates applied in Haversting
Migroalgae for Biodiesel Production: An Outlook. Hindawi, 1-10.
Chirinos, J. y Vegas, K. (2012). Obtencin de -carotenos con fines
industriales a partir de biofactoras sintticas de Dunaliella sp. del sector las
cumaraguas, municipio Falcn, Estado Falcn. Trabajo de pre-grado.
Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Falcn:
Venezuela.

79

Cifuentes y Gonzalez (2001). Cultivo de cepas de Dunaliella salina

(Teodoresco 1905) en diferentes medios bajo condiciones de laboratorio.
Universidad de Concepcin. Concepcin: Chile.
Contreras, C. y Pea, J. (2003). Avances en el diseo conceptual de
fotobiorreactor para el cultivo de microalgas. Red de Revistas Cientificas de
Amrica Latina, el Caribe, Espaa y Portugal, 28(8), 1-8.
Daz, D. y Geraldo, V. (2009).Diagrama de fase slido/lquido/gas. PT: punto
triple, PC: punto crtico, TC:temperatura crtica. [figura]. En Extraccin
experimental y diseo de una planta piloto para el procesamiento de
extractos naturales con dioxido de carbono supercritico. (12/pg).
Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda. Falcn:
Venezuela.
Daz, V. y Ordoez, C. (2006). Clula de Dunaliella sp.,en fase vegetativa y
en condiciones de estrs [figura]. En Evaluacin del pH y la agitacin del
medio mas adecuada para el crecimiento de Dunaliella salina en condiciones
de laboratorio.(50/pg). Pontifica Universidad Javeriana. Bogot: Colombia.
Elma.
(2014).
Portalpez.
Obtenido
http://diccionario.portalpez.com/eurihalino-vt3025.html

de

Essmann, M. (2011). Determinacin de los parmetros biolgicos de la

microalga Isochrysis aff.galbana: comparacin de un fotobiorreactor continuo
versus un cultivo batch. Trabajo de pre-grado.Universidad Austral de Chile.
Puerto Montt, Chile.
Fbregas. J, Abalde. C y Herrero. B (1984).Growth of the marine microalga
Tetraselmis Suecica in batch cultures with different salinities and nutrients
concentrations. Aquaculture.
Fernandez, F. y Garca, M. (2009). Patente n WO2009063100 A1. Espaa.
Foubert, I. y Muylaert, K. (2013). Flocculation based haversting process for
microalgae biomass production. Trabajo de doctorado.: Faculty of Bioscience
Engineering. Kortrijk, Blgica.
Fuente, M. y Aranda, M. (2014). Metodologa para extraccin de aceite de la
microalga Nannochloropsis oculata usando ultrasonido. Per.
Garcia et al. (2000). Biotecnologa del cultivo de Dunaliella en el Litoral
Andaluz. Universidad de Sevilla. Sevilla
Gomez, L. (1997). Cultivo y Aplicaciones de las microalgas Dunaliella Salina
y Chlorella Vulgaris en Cuba. Universidade da Corua. A Corua: Cuba.

80

Gonzalez, A. y Kafarov, V. (2009). Desarrollo de mtodos de extraccin de

aceite en la cadena de produccin de biodiesel a partir de microalgas.
Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga: Colombia
Gonzalez,
M.
(2010).
La
Gua.
Obtenido
de
http://quimica.laguia2000.com/conceptos-basicos/interacciones-hidrofobicas
Gouveia, L. y Oliveira, A. (2009). Microalgae as a raw material for biofuels
production. Obtenido de Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology:
http://link.springer.com/journal/10295
Guevara, M. y Romero, L. (2008). Cuantificacin de carotenoides totales y Caroteno en dos cepas de Dunaliella salina (chlorophyta, volvocales)
aisladas de lagunas hipersalinas de Venezuela. Universidad de Oriente.
Cuman: Venezuela.
Helm, M. y Bourne, N. (2006). Cultivo de bivalvos en criadero. Organizacin
de las Naciones Unidas para la agricultura y la alimentacin (FAO). Roma
Lpez, F. y Rangel, V. (2013). Construccin de un fotobiorreactor tubular
para la produccin de biomasa de microalgas para el laboratorio de
acuicultura de la UNEFM.Trabajo de pre-grado no publicado. Universidad
Nacional Experimental Francisco de Miranda. Falcn: Venezuela.
Lopez, K. (2008). Caracterizacin gnetica y de metabolitos secundarios de
diferentes aislamientos de Dunaliella Salina bajo condiciones de estress
salino. Instituto Politecnico Nacional. Yucatn: Mxico
Luna,
V.
(2005).
El
ergonomista.
http://www.elergonomista.com/fisiologiavegetal/salino.htm

Obtenido

de

Marcilla, A. (1998). Introduccin a las Operaciones de separacion.

Univesidad de Alicante.
Marn. (1998).Effect of nitrate concentration on growth and pigment synthesis
of Dunaliella salina cultivated under low ilumination and preadapted to
different salinities. Universidad de Oriente. Cuman: Venezuela.
Martinez, A. (2011). Puesta en marcha de un cultivo de microalgas para la
eliminacin de nutrientes de una agua residual urbana previamente tratada
anaerbicamente. Universidad Politcnica de Valencia. Valencia: Carabobo.
Mata, T. (2010). Microalgae for biodiesel production and other applications: A
review. Renewable and Sustainable Energy Reviews, 217-232.

81

Melndez, A., y Martinez, I. (2007).Estructura del -caroteno [Figura].En

Pigmentos carotenoides: consideraciones estructurales y fisicoqumicas.
(35/pag). Universidad de Sevilla. Sevilla: Espaa.
Mendiola, L. (2008). Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes tipos de
fluidos. [tabla]. En Extraccin de compuestos bioactivos de microalgas
mediante fluidos supercriticos. Universidad Autonoma de Madrid. (19/pg).
Madrid: Espaa.
Mendoza, H. y Valido, A. d. (2011). Planta Piloto de cultivo de Microalgas.
Grficas Tenerife.. Tenerife: Espaa.
Mendoza, R. y Moreno, J. (2013). Evaluacin de los mtodos soxhlet y fluido
supercrtico para la extraccin de aceite a partir de la semilla del fruto de
mamey (MAMMEY AMERICANA L). Trabajo de pre-grado. Universidad
Nacional Experimental Francisco de Miranda. Falcn: Venezuela.
Moreno, D. y Arias, N. (2012). Evaluacin de la autofloculacin de Chlorella
vulgaris utex 1803 para la concentracin de biomasa. Trabajo de pre-grado.
Universidad Industrial de Santander. Bucaramanga: Colombia
Nieto, C. y Orellana, V. (2011). Aplicacin del quitosano como promotor de
floculacin para disminuir la carga contaminante.Trabajo de pre-grado.
Universidad Politecnica Salesiana.
Olivares, R. (2010). Produccin de aceite para usos industriales a partir de la
microalga "Scenedesmus Obliquus". Universidad de El Salvador. San
Salvador:
Oren, A. (2005). A cien aos de Dunaliella de investigacin: 1905-2005.
Obtenido de http://viaclinica.com/article.php?pmc_id=1224875
Orozco, R. (2010). Extraccin supercrtica y cuantificacin HPLC de lutena y
beta caroteno presentes en vegetales de consumo popular. Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnologa. Guatemala.
Parsons, T. y Strickland, J. (1972). A practical handbook of seawater
analysis. Fisheries research board of Canada. Ottawa.
Pea, A., y Gonzalez, J. C. (2002). Estrategias de adaptacin de
microorganismos halfilos y Debaryomyces hansenii. Universidad Nacional
Autnoma de Mxico. Cuidad de Mexico.
Piedrahita, J. y Urbano, S. (2012). Ventajas y Desventajas de tipos de
reactores de cultivo
de microalgas.[tabla].Diseo del sistema de
alimentacin y control de temperatura en un fotobiorreactor para la
produccin de biomasa y cidos grasos a partir del cultivo de la microalga

82

Chlorella Vulgaris. (38/pg).Universidad Autnoma de Occidente. Santiago

de Cali.
Richmond, A. (2004). Handbook of microalgal culture: biotechnology and
applied phycology. Blackwell Science Ltd, 1-5.
Romero, T. y Ferrn, C. (2011). Floculacin de Chlorella sp. con la utilizacin
de quitosano. Instituto de Higiene y Epidemologa. Centro de investigaciones
pesquera. Habana
Ruiz, A. (2011). Puesta en marcha de un cultivo de microalgas para la
eliminacin de nutrientes de una agua residual urbana previamente tratada
anaerobicamente.Trabajo de master Universitario. Universidad Politcnica de
Valencia. Carabobo: Venezuela:
Salazar, L. (2012). evaluacin de mtodos de extraccin de aceite de
microalgas para la produccin de biodiesel. Universidad de Pirhua: Pirhua.
Sandoval, M. (2013). Diseo, construccin y puesta en marcha de un
fotobiorreactor piloto para el crecimiento de la microalga Chorella sp en el
laboratorio de biotecnologa y energas renovables de la empresa electrica
Quito. Escuela Politcnica del Ejrcito. Quito: Ecuador.
Serpa, R y Caldern, A. (2005). Efecto del estrs por salinidad en cuatro
cepas de Dunaliella salina teod. en el Per. Universidad Nacional Agraria La
Molina. Lima: Per.
Sunenik, A., y Shelef, G. (1984). Algal Autoflocculation- Verification and
Proposed Mechanism. Biothecnology and Bioengineering, 1-6.
Takagi, M. (2006). Effect of salt concentration on intracellular accumulation of
lipids and triacylglyceride in marine microalgae Dunaliella cells. Journal of
Bioscience and Bioengineering. Osaka: Japn
Torrentera, L. (1983). La produccin de alimento vivo y su importancia en
acuacultura. Obtenido de Deposito de documentos de la FAO:
http://www.fao.org/docrep/field/003/ab473s/AB473S00.htm#TOC
Ulloa, R. (2011). Induccin de productos bioactivos en la microalga marina
Tetraselmis suecica.Trabajo de doctorado. Universidad de Santiago de
Compostela. Santiago de Compostela: Chile
Velasco, R. Villada, H. & Carrera, J. (2007). Aplicaciones de los fluidos
supercriticos en la agroindustria. Revista informacin Tecnolgica.

83

Yepez,M y Morales, E. (1998). Efecto de la concentracin de nitrato y cloruro

de sodio sobre la densidad celular y contenido de pigmentos y protenas de
Dunaliella viridis. Universidad del Zulia, Maracaibo: Venezuela.
Ynga, G. (2011). Cultivo Masivo de Microalgas en Biorreactores Verticales.
Universidad Nacional de San Agustn. Arequipa: Per
Yusuf, C. (2007). Biodiesel from microalgae. Biotechnology Advances, 1-13.

84

ANEXOS
Anexo 1. Conteo en cmara de Neubauer

El Procedimiento para el conteo celular mediante el uso de

Hematocimetro o cmara de Neubauer se detalla a continuacin:
-

Mediante una pipeta Pasteur se toma una muestra y se desliza en la cmara

que previamente tiene adherido el cubreobjetos.

Se deja pasar 5~10 minutos para que la muestra se estabilice.
Se procede a contar mediante un contador de mano, en algunos casos es
necesario diluir la muestra cuando la densidad es alta.
Una vez que se tiene el promedio de clulas de las cmaras, el clculo
total de clulas por microlitro se lleva a cabo mediante la siguiente ecuacin:

Cel
=
L

n celulas en el cuadrante i
4
0,1.Dilucion

(Si la muestra no se diluye el factor es = 1)

Fuente: Helm & Bourne (2006)

Anexo 2. Formulacin de medios de Cultivo

Modo de preparacin del medio agua de Miguel (Torrentera, 1983)

85

Para la solucin A, se adicionan 20.2 g de KNO 3 en 100 mL de agua

destilada
Para la solucin B, se adicionan 4 g de Na 2HPO412H2O, 4 g CaCl26H2O, 2

mL de HCl concentrado y 2 mL de FeCl3.

Se calientan las soluciones para favorecer la dilucin de los componentes.
Para la esterilizacin, se introduce en autoclave durante 20 minutos, a 15

libras de presin.
Se dejan reposar durante 24 horas en ausencia de luz y bajas temperaturas.
Cuando se encuentran listas para utilizarse se adiciona 1 mL de solucin A y
2 mL de solucin B a 1 L de agua de mar.
Anexo 3. Densidades celulares a escala 300 mL

Anexo 4. Densidades celulares a escala de 800 mL

86

:
Anexo 5. Densidades celulares a escala de 3 L

Anexo 6. Densidades celulares en Fotobiorreactor y Cultivo Control

87

Anexo 7. Densidades celulares en repeticiones del Fotobiorreactor

Anexo 8. pH evaluado en cosechado con quitosano a 200 mg/L

88

Anexo 9. pH evaluado en cosecha con quitosano a 40 mg/L

Anexo 10 .Conteo en sobrenadante en cosechado con quitosano a 200 mg/L

89

Anexo 11. Conteo en sobrenadante en cosechado con quitosano a 40 mg/L

90

Anexo 12. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con

Quitosano a 200 mg/L

Anexo 13. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con

Quitosano a 40 mg/L

91

Anexo 14. Conteo en el sobrenadante en el cosechado con autofloculacin

Anexo 15. Porcentaje de remocin de microalgas en cosechado con

autofloculacin

92

Anexo 16. Comparacin de % de remocin de microalgas entre mtodos de

cosecha utilizados

Anexo 17. Cultivos desde 300 mL hasta 3L

Anexo 18. Cultivo control y fotobiorreactor

93

Anexo 19. Cosechado por Quitosano

Anexo 20. Cosechado por Autofloculacin

94

Anexo 21. Extraccin Binaria

Anexo 22. Extraccin Ternaria

Anexo 23. Diagrama triangular para el sistema etanol-hexano-agua.

Fuente: Fernndez y Garca (2009)

95

Anexo 24. Extraccin con fluidos supercrticos

Anexo 25. Fotobiorreactor tubular tipo serpentin cilndrico

Fuente: Lopez & Rangel (2013)

Principio de funcionamiento del fotobiorreactor

Una malla metlica que va a funcionar como base. Su forma es

cilndrica, y est envuelta por dos mangueras transparentes en paralelo de
dimetro de pulgadas que recorrer toda la estructura. El medio de cultivo

96

fluye desde la parte inferior hacia la superior, impulsado por aire inyectado
por un soplador (que viene de un compresor que alimenta al laboratorio) a
una altura determinada. El medio de cultivo desemboca en un colector (tubo
PVC) de cuatro pulgadas de dimetro, que ser colocado justo al lado de la
estructura.
Las dos mangueras estn conectadas entre s por un conector en
forma de T en la parte inferior y a su vez est conectada con el colector en
la base. La energa luminosa necesaria para la produccin de las microalgas,
cuales estn colocadas en la parte interna de la estructura de la malla
metlica; su forma cilndrica permite un mejor aprovechamiento de la luz,
debido a su uniformidad en el dimetro a la hora de la produccin de
microalgas.
Anexo 26. Estacin piloto de extraccin supercrtica
Se inicia la puesta en marcha del equipo, garantizando que no existan
fugas, para ello se conect la bombona de CO 2 al equipo el cual suministraba
el CO2 presurizado.
La muestra a emplear en el proceso de extraccin es debidamente
preparada y pesada antes de ser colocada en el portamuestra. Al proceso se
alimenta Dixido de Carbono presurizado, el cual es proveniente de una
bombona (B-01); el dixido de carbono es transportado al autoclave (A-01),
en el cual est dispuesta una resistencia elctrica que se encarga de
suministrar calor, con el objeto de producir un aumento de presin en el
fluido. Alcanzadas las condiciones deseadas de temperatura y presin
(verificadas en los medidores M-02 y T-01), se abre la vlvula (V-03)
conduciendo el fluido hasta el extractor E-01 , donde se pondr en contacto
con la muestra deseada a un tiempo de residencia fijo de 2 horas para todas
las experiencias. Es importante mencionar que no se lleva a cabo ningn tipo

97

de reaccin qumica, solo se ponen en contacto las dos fases (Ver Error:
Reference source not found).
Posteriormente cumplido el tiempo de extraccin, se abre la vlvula
(V-04), por donde fluye la mezcla extracto - Dixido de carbono, la cual se
transporta a un recipiente separador (S-01). En este equipo ocurre una
vaporizacin instantnea de la mezcla binaria y disminucin de la solubilidad,
dando como resultados dos productos; por el tope dixido de carbono el cual
es sometido a una neutralizacin con hidrxido de sodio, dando como
resultado la siguiente reaccin qumica:
CO2 + 2NaOH

Na2 CO3 + H2O

Y por el fondo el extracto, que es recolectado en un recipiente (R-01)

debidamente pesado.
El extracto colectado en el recipiente, se debe pesar en una balanza
analtica y transferirla a un recipiente de vidrio de color mbar,
almacenndola en un refrigerador para evitar una posible degradacin del
producto extrado.
Es importante mencionar que en la extraccin se emplea una
alimentacin por carga, ya que tiene la ventaja de permitir una mayor
penetracin del fluido en la microalga, alcanzando el equilibrio de reparto
entre el soluto (Dunaliella sp) y el solvente (Dixido de Carbono).

98

Figura 14. Montaje Experimental de estacin fluidos supercrticos

Fuente: Daz & Geraldo (2009)

99

APENDICES
Apndice 1. Evaluacin cintica de los cultivos.
Parmetros cinticos evaluados

Escala (mL de
cultivo

Frascos
1
2

300
3
4
1
2
800
3
4
1
2
3000
3
4
13000
(cultivo
control)
16000
Fotobiorreacto
r

1
1
2
3

N1
(cl/mL
)

N2
(cl/mL)

4,00E+
06
4,00E+
06
4,00E+
06
4,00E+
06
5,54E+
06
5,29E+
06
5,65E+
06
5,43E+
06
5,18E+
06
6,12E+
06
5,12E+
06
5,41E+
06

1,43E+
07
1,45E+
07
1,45E+
07
1,40E+
07
1,88E+
07
1,90E+
07
1,80E+
07
1,83E+
07
2,49E+
07
2,49E+
07
2,49E+
07
2,45E+
07

9,45E+
06

4,20E+
07

4,05E+
06
3,83E+
06
3,75E+

4,73E+
07
4,74E+
07
4,84E+

100

(Div/da
)

Td (das)

0,0912

7,6042

0,0922

7,5187

0,0919

7,5439

0,0896

7,7392

0,0938

7,3873

0,0985

7,0392

0,0893

7,7645

0,0934

7,4251

0,1207

5,7412

0,1079

6,4217

0,1217

5,6972

0,1240

5,5910

0,1147

6,0409

0,1890

3,6678

0,1935

3,5814

0,1967

3,5237

06

ln
a)

07

( NN 21 )

T 2T 1

b td =ln(2)/

Fuente: Alvear & Castillo( 2011)

Donde:
: velocidad de crecimiento (nmero de divisiones por da)
N1: Densidad celular inicial del cultivo
N2: Densidad celular final del cultivo
t1: tiempo inicial de cultivo
t2: tiempo final de cultivo
td: tiempo de duplicacin del cultivo
Calculo tpico para la muestra a escalado 300 mL envase 1.

ln
a =

( 1,43E+07
4,00E+06 )
=0,0912
140

b) td

ln (2)/0,0912=7,6042

El clculo de la velocidad de crecimiento y tiempo de duplicacin para los

ensayos restantes, se realizan de la misma manera.
101

Apndice 2. Determinacin de la concentracin y productividad de la

biomasa microalgal producida

a CB=(( P1000 mg/ gr ))/V

b PB=CB /Tf

Fuente: Alvear & Castillo (2011)

Donde:
CB: Concentracin de la biomasa (mg/L)
P: Peso de la biomasa seca (g)
V: Volumen de cultivo filtrado (L), (3 L)
PB: Productividad de la biomasa (mg/L*da)
Tf: Tiempo de cultivo (da) (20 das, cumpliendo su doble fase)

Para la rplica 1 del cultivo:

102

gr1000 mg
14
(
) =4666,6666
gr
a CB=
3L

b PB=

4666,6666
=233,333
20

El clculo de concentracin y productividad de biomasa, para los

ensayos restantes se realiz de la misma manera.

Apndice 3. Carotenoides calculados en la extraccin binaria

Lectura a 480 nm
Mezclas
Aceton
a/Agua
Aceton
a/Meta
nol

Proporcion
es
90/10
70/30
90/10
70/30

Densid
ad
celular
(cl/mL
)

1
0,2
2
0,0
9
0,2
2
0,2
6

0,18

0,18

0,13

0,14

0,21

0,22

0,28

0,3

Carotenos
mg/L
1

0,8
8
0,3
6
0,8
8
1,0
4

0,7
2
0,5
2
0,8
4
1,1
2

0,7
2
0,5
6
0,8
8

5,17E+07

a) CT= 4* abs480 nm
9

b) Pg.cl-1=

CT (mg/ L)10
cl
DC (
)
mL

Fuente: Parsons & Strickland (1972)

Donde:
103

1,2

Pg.cel-1
1
17,0
6,96
17,02
1
20,11
6

13,92
6
10,05
8
16,24
7
21,66
3

13,92
6
10,83
1
17,02
1
23,21
0

Pg.cl1
DS
14,96
1,46
9,28
1,67
16,76
0,36
21,76
1,26

CT:Carotenoides( mg/ L )
Abs480nm: Absorbancia a una longitud de onda de 480 nm
DC: Densidad celular en la fase exponencial en el fotobiorreactor (10
das) en fase vegetativa (5, 17 E+07 fue la densidad de la biomasa al
momento de realizar las extracciones).
Para la rplica 1 con una mezcla acetona/agua en proporciones 90/10:
CT= 4* 0,22 = 0,88 mg/L
0,8810

Pg.cl-1=

5,17 E+ 07

cl
( mL
)

Pg. Cl -1= 17 pg. Cl -1

Apndice 4. Carotenoides calculados en la extraccin ternaria

Mezclas

Proporcione
s

Etanol/Hex
ano/Agua
Densidad
celular
(cl/mL)

CT=

77:17:06

Replica

Replica

lectura a

carotenos

431 nm
mg/L
1
2
1
2
0,376 0,404
1,5072 1,6192
8
8
5,17E+07

AVC1000
1
A 1 Cm100V

Fuente: Melndez-Martnez et al, (2007)

Donde:
CT: Carotenoides totales (mg/L)
A: Absorbancia a 431 nm
VC: Volumen de la muestra en la celda (5 ml)
V: Volumen de la muestra (0,005 L)
104

Replica Pig.cel1
1
29,152
8046

pg.cl1DS

2
31,319
1489

30,24
1,08

A 1 Cm : Coeficiente de absorcin especfico para carotenoides totales

(2500 para hexano en carotenoides totales).
Calculo tpico para replica 1 a 1,5 mol NaCl/L evaluada en medio agua
de Miguel.
CT=

0,376851000
( 25001000,005
)

CT=1,5072

mg
L

Con la densidad celular:

-1

Pg.cl =

1,5072 mg/ L10 9

5,17 E+07

Pg.cl-1=29,1528
Apndice 5. Mtodo de extraccin con fluidos supercrticos

Clculo de la cantidad de producto obtenido en el proceso de

extraccin con fluidos supercrticos para las condiciones establecidas.

Muestra

Muestra
aliment
ada (g)

Extracci
n5

100

Peso del
envase (g)

Peso del
envase
mas
extracto
(g)

Extracto
Obtenido
(gr)

Rendimie
nto (%)

98,719

99,143

0,424

0,424

Gramos de extracto= (peso del envase con el extracto-peso del envase)

%Aceite= (gr Aceite/gr muestra)*100

105

Para el ensayo mostrado:

Gramos de extracto= 99,719-99,143

Gramos de extracto= 0,424 gr

% Rendimiento= (gr extracto /gr muestra alimentada)*100

% Rendimiento= (0,424 gr/100 gr)* 100
%Rendimiento = 0,424 %

106