Pasteurizacion

Efecto de tres Condiciones de Pasteurizacin sobre la Actividad
Enzimtica y Antimicrobiana de un Extracto de Glucosa Oxidasa

Nirza Noguera, Luis Ojeda*, Ingrid Velsquez, Ninoska Ramrez, Antonio Ypez.
Instituto de Investigaciones Biomdicas, Facultad de Ciencias de la Salud,
Universidad de Carabobo. Maracay-Venezuela. Apartado Postal 2351.
*Email: luis_ojedaojeda@yahoo.es
RESUMEN
En la actualidad existe una tendencia a incorporar enzimas en los alimentos como
aditivo; sin embargo, estas pueden perder actividad cuando son sometidas a tratamientos
trmicos, lo cual limita su aplicacin. La Glucosa oxidasa (GOX) posee una capacidad
antimicrobiana que favorece la conservacin de alimentos en estado slido y lquido, por
lo que se determin su potencial como aditivo natural, para ser incorporado durante el
procesamiento en bebidas, previo a la pasteurizacin. Para ello, se someti un extracto de
GOX a tres condiciones de pasteurizacin: (a) 63C por 30 min, (b) 72C por 1 min y (c)
80C por 1 min y se determin su efecto sobre la actividad cataltica y antimicrobiana del
mismo. La actividad antimicrobiana fue probada sobre una cepa de Escherichia coli ATCC
25922, cultivada en medio LB con 1 mg/ml de glucosa y 1 U del extracto por ml de medio.
Se encontr que la enzima experiment un descenso de su actividad cataltica de 33%
con el tratamiento trmico (condicin a), 36% con (b) y 62% con (c). En cuanto a la
actividad antimicrobiana, se observ que independientemente del tratamiento trmico, los
sistemas con presencia de la enzima mantuvieron la poblacin bacteriana aproximada a
4.5 x105 UFC/ml, mientras que la bacteria crecida en el medio sin la enzima alcanz una
poblacin superior a 1x106 UFC/ml. Esto demuestra que la GOX puede ser incorporada
previamente a los procesos de pasteurizacin y mantener sus propiedades cataltica y
antimicrobiana.
Palabras Clave: Glucosa oxidasa, pasteurizacin, actividad antimicrobiana.
ABSTRACT
Currently there is a tendency to incorporate enzymes as food additives. However,
these enzymes may lose activity when subject to thermic treatment, situation which limits
their application. Glucose oxidase (GOX) has antimicrobial properties which promote food
conservation either in solid or liquid state. Therefore, its potential as a natural additive
during drinks processing prior to pasteurization, was determined. For this purpose, a GOX
BioTecnologa, Ao 2013, Vol. 17 No. 2
31
extract was subjected to three pasteurization conditions: (a) 63C for 30 min, (b) 72C for 1
min and (c) 80C for 1 min and their effects on its catalytic activity and antimicrobial action,
were determined. Antimicrobial activity was tested on Escherichia coli strain ATCC 25922,
grown in LB medium containing 1 mg/ml glucose and 1 U extract per ml of medium. A
decrease in enzyme activity of 33% with thermic treatment (condition a), 36% with (b) and
62% with (c), was observed. Regarding antimicrobial activity, it was found that regardless
the thermic treatment used, the presence of enzyme maintained the bacterial population
approximately to 4.5 x105 CFU/ml, whereas the bacterial grown in medium lacking enzyme
reached a population greater than 1 x10 6 CFU / ml. These results show that GOX may be
incorporated prior to the pasteurization processes and maintain its catalytic and
antimicrobial properties.
Keywords: Glucose oxidase, pasteurization, antimicrobial activity.
la -D-glucosa a D-glucono-1,5-lactona,
INTRODUCCIN
En la industria de alimentos, suelen
perxido de hidrogeno y finalmente cido
utilizarse diferentes mtodos para la
D-gluconico en presencia de oxgeno
conservacin
(Fiedurek & Gromada, 2000; Zia, et al
de
los
productos,
los
cuales van desde tratamientos trmicos
2010).
(la pasteurizacin, esterilizacin, secado,
aerbicos y funciona normalmente en
deshidratacin osmtica, la refrigeracin
conjunto con la catalasa. La glucosa
qumicos
oxidasa (GOX) es obtenida por fuentes
fsicos
microbianas y normalmente es producida
la
congelacin);
(incorporacin
de
aditivos);
Est presente en organismos
(irradiacin, pulsos electromagnticos) y
por
biolgicos (incorporacin de enzimas).
Aspergillus niger y especies Penicillium
En
como Penicillium notatum, Penicillium
muchos
casos
se
busca
la
combinacin de varios de stos para

prolongar la vida til del alimento. El uso
la
fermentacin
aerobia
de
chrysosporium (Khurshid et al, 2011).

Esta enzima posee una capacidad
de enzimas en la conservacin de
antimicrobiana
que
favorece
la
alimentos es una prctica que se ha
conservacin de alimentos en estado
venido generalizando en el transcurso de
slido y lquido (Fresl et al., 1984;
los aos (Taylor & Richardson, 1979;
Dziezak, 1986; Field et al., 1986; Kantt &
Meyer & Isaksen, 1995).
Torres, 1993; Wong et al. 2008). Los
La glucosa oxidasa (EC1.1.3.4) es
productos obtenidos de la oxidacin de la
una enzima que cataliza la oxidacin de
-D-glucosa tienen capacidad probada
32
como bactericidas sobre especies como

Staphylococcus
aureus,
Salmonella
Extracto de Glucosa Oxidasa (GOX)
infantis, Clostridium perfringens, Bacillus
La obtencin del extracto enzimtico
cereus, Campylobacter jejuni, Listeria
se hizo siguiendo el protocolo propuesto
monocytogenes, Yersinia enterocolitica
por Ojeda et al. (2011).
(Tiina & Sandholm, 1989), Pseudomona

fragi (Yoo & Rand, 1985), Escherichia
coli enterotxica (Massa et al., 2001).
En
la
presente
investigacin
Actividad Enzimtica
La actividad de GOX se evalu
se
mediante la deteccin del perxido de
evalu el efecto que las temperaturas
hidrgeno
producido
pasteurizacin usadas en bebidas (63,
glucosa
72 y 80C), tienen sobre la actividad
colorimtrico descrito por Zoghbi et al.
cataltica y antimicrobiana de la enzima
(2008). La unidad de actividad (U) fue
GOX, con la finalidad de determinar su
definida como la cantidad de glucosa
potencial como aditivo natural, para ser
oxidasa que cataliza la oxidacin de 1
incorporado durante el procesamiento de
mol de D-glucosa por minuto a pH 7 y a
las bebidas, previo a los tratamientos
25C.
(sustrato),
al
por
oxidarse
el
la
mtodo
trmicos.
Actividad Antimicrobiana de GOX sobre
la cepa de E. coli ATCC 25922
Se
METODOLOGA
determin
la
capacidad
antimicrobiana del extracto producido
Microorganismos
La produccin del extracto de GOX
sobre la cepa de E. coli seleccionada,
se obtuvo a partir de una cepa silvestre
para ello se tom como referencia las
de Aspergillus niger, proveniente de un
investigaciones desarrolladas por Tiina &
aislado
el
Sandholm (1989) y Massa et al. (2001).
Departamento de Microbiologa de la
Se cultiv la bacteria en un medio Luria-
Escuela de Bioanlisis de la Universidad
Bertani estril (LB) con 1 mg/ml de
de
glucosa
clnico,
Carabobo
donada
por
(Maracay-Venezuela).
se
probaron
tres
Para probar el efecto antimicrobiano del
concentraciones de la enzima 0.1 U/ml;
extracto de GOX, se utiliz la cepa de
0.5 U/ml y 1.0 U/ml. El volumen de
Escherichia coli ATCC 25922, facilitada
cultivo fue de 50 ml, el inocul de 1x104
por el Instituto Nacional de Higiene
UFC/ml y las condiciones a 37C bajo
(Caracas-Venezuela),
agitacin continua (100 rpm) durante 4 h.
33
Como control se cultiv la bacteria en
inoculadas con un total de 1 x 10 5
medio LB estril con 1 mg/ml de glucosa
clulas/ml de E. coli, incubadas a 37C
sin extracto enzimtico. El experimento
bajo agitacin constante a 100 rpm y su
se realiz por duplicado y el crecimiento
crecimiento fue monitoreado durante 5 h
fue monitoreado por el cambio de
por turbidez a 600 nm, las medidas
absorbancia a 600 nm.
fueron transformados a UFC/ml. Este

ensayo
se
hizo
por
se
duplicado
incorporaron
Efecto de la pasteurizacin sobre la
adicionalmente
dos
actividad enzimtica
controles, uno positivo, en el que la
Se tomaron muestras de 1 ml de un
enzima fue adicionada al medio estril
extracto enzimtico, las cuales fueron
sin tratamiento trmico, y otro negativo,
sometidas
de
en el que no se incorpor la enzima.
pasteurizacin: (a) 63C, (b) 72C y (c)
Ambos controles fueron inoculados con
80C y diferentes tiempos de exposicin.
la
Para la temperatura de 63C los tiempos
incubados junto con las dems muestras.
considerandos fueron 10, 20 y 30 min.
Se trabaj con un total de 12 fiolas las
Para las temperaturas ms altas (72 y
cuales fueron arregladas bajo un diseo
80C) se consideran tiempos cortos de
completamente al azar.
tres
temperaturas
misma
cantidad
de
clulas
15, 30 y 60 s. Todas las mediciones se

realizaron por duplicado.
Anlisis Estadstico
Para la caracterizacin del efecto de
la
actividad antimicrobiana de la enzima
cataltica de las muestras, se calcularon
Para
determinar
sobre
la
actividad
efecto
los valores promedio y su desviacin
antimicrobiano despus del tratamiento
estndar con el fin de determinar los
trmico,
de
porcentajes de prdida de actividad. El
experimento tipo bloques al azar, en el
crecimiento bacteriano fue presentado
que se incorpor un volumen del extracto
mediante
enzimtico pasteurizado en medio LB
representar las UFC/ml por tiempo. Para
estril con glucosa 1 mg/ml, volumen
transformar los datos de absorbancia a
final de ensayo 50 ml. Las condiciones
UFC/ml se emple la ecuacin UFC/ml =
de pasteurizacin establecidas fueron:
4.8x104(Abs600) + 9.9x103 (R2 = 0.88);
(a) 63C por 30 min, (b) 72C por 30 s,
obtenida por regresin lineal al relacionar
se
aplic
el
temperatura
un
diseo
grficos
de
dispersin,
(c) 80C por 30 s. Las fiolas fueron

34
al
los datos de la turbidez y contaje en
utilizar concentraciones de 0.5 y 1 U por
placas (datos no mostrados).
ml de medio LB con glucosa a razn de 1

mg/ml, exhibiendo una mayor inhibicin a
la concentracin ms alta. En esta ltima
concentracin el sistema la poblacin
RESULTADOS Y DISCUSION
alcanz
un
GOX con una actividad enzimtica de 4.5
UFC/ml,
mientras
0.12 U/ml y con ste se desarrollaron
promedio en el sistema usado como
todos los experimentos descritos.
control fue de 7.5 x104 UFC/ml (Fig. 1).

Este
promedio
resultado
que
de
la
2.5
x104
Se obtuvieron 2.5 L de extracto de
poblacin
concuerda
con
los
Efecto del extracto de GOX sobre el
reportes previos del efecto inhibitorio
crecimiento de E. coli ATCC 25922
sobre el crecimiento bacteriano de la
Al
determinar
la
enzima GOX (Massa et al., 2001; Tiina &
capacidad
antimicrobiana del extracto sobre el
Sandholm,
crecimiento de E. coli se encontr que
resultados, se decidi emplear esta para
este
los siguientes ensayos la concentracin
fue
capaz
significativamente
su
de
retardar
crecimiento,
al
1989).
Dados
estos
de 1 U de GOX por ml de medio.
Nmero de Bacterias (UFC/ml)
1.0
x10
1,0E+05
7.5
x10
7,5E+04
Control
5.0
x10
5,0E+04
1U
GOX/ml
1.0U
GOX/ml
0,5U
0.5U GOX/ml
GOX/ml
4
2.5
x10
2,5E+04
0,1U
0.1UGOX/ml
GOX/ml
0
0,0E+00
0
60
120
180
240
Tiempo (min)
Fig. 1. Actividad antimicrobiana del extracto de GOX sobre E. coli ATCC 25922 cultivada en medio
LB estril con glucosa 1 mg/ml. Utilizando tres concentraciones del extracto 0,1; 0,5 y 1 U/ml y un
control de medio LB estril con glucosa sin enzima.
35
estadsticamente similar al inicial (4.5
actividad enzimtica
0.09 vs. 4.47 0.05; Tabla 1). En los
En cuanto a los efectos de las

temperaturas
de
pasterizacin
se
siguientes 30 s se presenta un cambi

drsticamente,
evidencindose
una
encontr que el extracto sometido al
disminucin de la actividad en 1.2 U/ml y
tratamiento trmico de 63C, exhibi un
para los 60 s es cercana a 1.5 U/ml,
descenso de la actividad de 0.77 U/ml
obteniendo
durante los primeros 10 min del proceso,
promedio al final del proceso cercana al
y para los siguientes 20min la cada fue
65% (Fig. 2).
una
actividad
residual
alrededor de 1.5 U/ml, tal como se
Para el tratamiento a 80C durante
muestra en la tabla 1. La actividad
los primeros 15 s la prdida de actividad
residual promedio al final del proceso fue
fue alrededor de 0.25 U/ml (Tabla 1), a
de 67% (Fig. 2).
medida que transcurri el tiempo de
Al
aumentar
la
temperatura
exposicin el descenso de la actividad
disminuir los tiempos se encontr que en
fue mayor alcanzando una actividad
el caso del tratamiento a 72C, se
residual de 38% (Fig. 2).
observ que durante los primeros 15 s la

prdida de actividad enzimtica promedio
fue
mnima,
obteniendo
un
valor
Tabla 1. Efecto de las condiciones de pasteurizacin sobre la actividad de GOX presente en el

extracto enzimtico.
Condiciones de Pasteurizacin del extracto de GOX
63C por 30 min
72C por 1 min
80C por 1 min
Tiempo
(min)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 0.09
Tiempo
(s)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 0.09
Tiempo
(s)
0
Actividad
(U/ml)
4.50 0,09
10
3.73 0.10
15
4.47 0.05
15
4.25 0.13
20
3.42 0.11
30
3.31 0.07
30
3.32 0.04
30
3.02 0.06
60
2.96 0.04
60
1.70 0.08
36
% de Actividad Residual
100
75
50
25
0
63 C por 30min
72 C por 1min
80 C por 1min
Temperatura ( C)
Fig. 2. Actividad residual del extracto de GOX al final de los procesos de pasteurizacin, partiendo
de una actividad inicial de 4.5 U/ml.
La desnaturalizacin trmica de GOX
inicia el proceso de desnaturalizacin
ha sido ampliamente estudiada, se ha
trmica, con una significativa prdida de
descrito que sigue una cintica de primer
su poder cataltico (Matos et al., 2012).
orden y que la prdida de actividad se
Estos
debe
la
exponer la enzima a 41C por 10 min
interacciones
ocurre una prdida del 50% de su
inicas e hidrofbicas, y a la ruptura de
actividad inicial. De igual manera, Zoldak
enlaces de hidrgeno y fuerzas de van
et al. (2004) demostraron que por arriba
der Waals,
cambios
de los 55C se evidencian cambios
conformacionales a nivel de la estructura
estructurales importantes que tienden a
secundaria,
la
ser irreversibles al superar los 58.5C. En
consecuente prdida del cofactor Flavin
consecuencia, la prdida de actividad
adenin dinucletido (FAD) (Matos et al.,
observada en el presente estudio, est
2012; Zoldak et al., 2004; Gouda et al.,
asociada
2003).
desnaturalizacin
principalmente
desestabilizacin
Se
que
que
ha
de
ocasionan
traen
consigo
reportado
que
temperaturas superiores a los 40C, se

autores
con
comprobaron
el
que
al
proceso
trmica.
de
Las
temperaturas de pasteurizacin probadas

37
estn
por
encima
valores
que las cultivadas en presencia del
previamente descritos. Sin embargo, hay
extracto de GOX pasteurizado exhibieron
que destacar el hecho de que el extracto
valores entre 45 x 105 UFC/ml. Lo que
de
implica
GOX utilizado
de
los
exhibi
una alta
que
la
enzima
GOX
sigue
termoestabilidad, ya que su exposicin a
manteniendo su actividad pese a haber
63C por 10 min slo ocasion una
sido sometida a tratamientos trmicos
prdida de actividad promedio del 16%,
(Figura 3). De hecho, la curva de
porcentaje que est por debajo del
crecimiento obtenida en los sistemas con
reportado por Matos et al. (2012) para
GOX pasteurizada a 63C por 30 min
una temperatura de 41C.
mostr
un
comportamiento
estadsticamente similar al crecimiento

en los sistemas con GOX sin pasteurizar,
actividad antimicrobiana
con
Al observar el crecimiento bacteriano
una
alrededor
poblacin
de
4x105
promedio
final
UFC/ml.
Estos
en los sistemas de cultivo donde se
hallazgos abren una gran posibilidad en
incorpor la enzima pasteurizada a las
el campo de la tecnologa de alimentos,
diferentes condiciones, se encontr que
puesto que se podra utilizar la GOX
la enzima mantuvo su efecto inhibitorio.
como aditivo natural en los procesos de
Las bacterias cultivadas en medio LB sin
elaboracin de bebidas, previo a su
adicin de GOX (control) incrementaron
pasteurizacin, para incrementar su vida
su poblacin a 1x106 UFC/ml, mientras
en anaquel.
38
1.4
x10
1,4E+06
Nmero de Bacterias (UFC/ml)
1.2
x10
1,2E+06
1,0E+06
1.0
x10
8.0
x10
8,0E+05
63 C por 30 min
72 C por 30s
80 C por 30s
6.0
x10
6,0E+05
Sin enzima
5
Enzima sin pasteurizar
4.0
x10
4,0E+05
2,0E+05
2.0
x10
0
0,0E+00
90
180
Tiempo (min)
270
360
Fig. 3. Curvas de crecimiento de la bacteria E. coli en medio LB glucosa 1 mg/ml en presencia de

un extracto de GOX (1 U/ml) pasteurizado a diferentes condiciones: 63C por 30 min, 72C por 30
s y 80C por 30 s.
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Efecto de tres Condiciones de Pasteurizacin sobre la Actividad

Enzimtica y Antimicrobiana de un Extracto de Glucosa Oxidasa

perxido de hidrogeno y finalmente cido

utilizarse diferentes mtodos para la

D-gluconico en presencia de oxgeno

(Fiedurek & Gromada, 2000; Zia, et al

cuales van desde tratamientos trmicos

(la pasteurizacin, esterilizacin, secado,

aerbicos y funciona normalmente en

deshidratacin osmtica, la refrigeracin

conjunto con la catalasa. La glucosa

oxidasa (GOX) es obtenida por fuentes

microbianas y normalmente es producida

Est presente en organismos

(irradiacin, pulsos electromagnticos) y

biolgicos (incorporacin de enzimas).

Aspergillus niger y especies Penicillium

como Penicillium notatum, Penicillium

combinacin de varios de stos para

chrysosporium (Khurshid et al, 2011).

alimentos es una prctica que se ha

conservacin de alimentos en estado

venido generalizando en el transcurso de

slido y lquido (Fresl et al., 1984;

los aos (Taylor & Richardson, 1979;

Dziezak, 1986; Field et al., 1986; Kantt &

Meyer & Isaksen, 1995).

Torres, 1993; Wong et al. 2008). Los

La glucosa oxidasa (EC1.1.3.4) es

productos obtenidos de la oxidacin de la

una enzima que cataliza la oxidacin de

-D-glucosa tienen capacidad probada

BioTecnologa, Ao 2013, Vol. 17 No. 2

como bactericidas sobre especies como

Extracto de Glucosa Oxidasa (GOX)

infantis, Clostridium perfringens, Bacillus

La obtencin del extracto enzimtico

cereus, Campylobacter jejuni, Listeria

se hizo siguiendo el protocolo propuesto

monocytogenes, Yersinia enterocolitica

por Ojeda et al. (2011).

(Tiina & Sandholm, 1989), Pseudomona

mediante la deteccin del perxido de

evalu el efecto que las temperaturas

pasteurizacin usadas en bebidas (63,

72 y 80C), tienen sobre la actividad

colorimtrico descrito por Zoghbi et al.

cataltica y antimicrobiana de la enzima

(2008). La unidad de actividad (U) fue

GOX, con la finalidad de determinar su

definida como la cantidad de glucosa

potencial como aditivo natural, para ser

oxidasa que cataliza la oxidacin de 1

incorporado durante el procesamiento de

mol de D-glucosa por minuto a pH 7 y a

las bebidas, previo a los tratamientos

antimicrobiana del extracto producido

sobre la cepa de E. coli seleccionada,

se obtuvo a partir de una cepa silvestre

para ello se tom como referencia las

de Aspergillus niger, proveniente de un

investigaciones desarrolladas por Tiina &

Sandholm (1989) y Massa et al. (2001).