Fundamentos y tcnicas de anlisis microbiolgicos

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I.

Medios de cultivo - 1
U.T. 14 -1 Bloque temtico III

INTRODUCCIN

Los grmenes, patgenos o no, buscan generalmente el hbitat ms idneo para su

supervivencia y multiplicacin. En el hombre existen diversas localizaciones que por su
temperatura, humedad, nutrientes, etc., les proporcionan el lugar ms adecuado para su
establecimiento y supervivencia.
Una vez all, como ya sabis, pueden quedar como simples comensales, o esperando
la oportunidad de progresar, afectando a los tejidos, bien sea localmente o mediante
toxinas. En caso de producir enfermedad, estos microorganismos se multiplican
rpidamente en el interior del husped, desapareciendo, en general, en cuanto el
organismo es capaz de desarrollar los mecanismos adecuados de contencin de esa
multiplicacin.
Uno de los pilares del desarrollo de la moderna microbiologa, apoyado en los
postulados de Koch, fue posibilitar la recuperacin del microorganismo presuntamente
responsable del cuadro infeccioso a partir de muestras obtenidas del paciente infectado.
El nmero de bacterias que es posible recuperar de un tejido infectado puede
variar desde pocos cientos a miles de millones. Si tenemos en cuenta el pequeo tamao
de las bacterias (en torno a los 2 m de longitud y 2 fl de volumen) podremos
comprender la gran cantidad de individuos necesarios para poder hacer visible una
poblacin bacteriana.
Los microorganismos crecen fcilmente cuando se les facilitan todas las
condiciones necesarias para su multiplicacin (tipo de atmsfera, grado de humedad,
temperatura, elementos nutritivos, etc.). De esta manera una sola bacteria puede dar
lugar a la generacin de miles de millones de individuos en pocas horas. Estas clulas,
creciendo y acumulndose por superposicin sobre una superficie slida, dan lugar a
una masa de bacterias que conocemos con el nombre de colonia, cuyo tamao pude
oscilar entre 0,1 mm y 1 cm (o ms), dependiendo de la rapidez de reproduccin y del
tiempo transcurrido.
Si al inocular la muestra en el medio, las bacterias quedan depositadas sobre la
superficie del medio de cultivo con una separacin pequea, lo ms probable es que las
colonias se mezclen y no podamos distinguir claramente sus caractersticas
morfolgicas. Si la separacin entre una bacteria y otra es mayor que el tamao de la
colonia, entonces s es posible la obtencin de colonias aisladas, para utilizarlas
posteriormente en los procedimientos de identificacin y determinacin de
susceptibilidad antimicrobiana.
La inoculacin de una muestra en un medio debe procurar, aparte del
crecimiento bacteriano, el aislamiento de colonias, lo cual nos permitir, adems de
diferenciar floras polimicrobianas, trabajar con una gran cantidad de clulas bacterianas
con las mismas caractersticas.
Al laboratorio le corresponde simular experimentalmente las condiciones
ptimas para el crecimiento de estos grmenes. Si tenemos en cuenta que a veces
tendremos que aislar un nico microorganismo de una poblacin muy diversa, o que en
otras ocasiones debemos buscar grmenes cuyas condiciones de crecimiento
desconocemos, podremos comprender que la empresa que intentamos acometer es ms
ardua de lo que en principio podra parecernos.
Para poder comprender mejor todo este complejo proceso, vamos a empezar
hablando de las caractersticas generales del crecimiento bacteriano y de la fisiologa de
su crecimiento; a continuacin hablaremos de los medios de cultivo, su clasificacin, y
explicacin tcnica de los ms importantes. Por ltimo abordaremos la preparacin
prctica de un medio de cultivo como el agar nutritivo.

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II.

Medios de cultivo - 1
U.T. 14 -1 Bloque temtico III

CRECIMIENTO BACTERIANO

El crecimiento de los microorganismos es la sntesis equilibrada y especfica de los

componentes protoplasmticos a partir de las sustancias nutritivas presentes en el medio
externo. Adems, los compuestos sintetizados deben ser reunidos y almacenados
adecuadamente para producir rplicas exactas de la unidad funcional. Este complicado
proceso depende de los tipos y concentraciones de las sustancias nutrientes disponibles,
y del aporte continuo de energa necesaria para llevar a cabo las reacciones de sntesis.
El crecimiento de las bacterias puede ser considerado desde dos puntos de vista: el
primero es el ensanchamiento o alargamiento de la clula individual, acompaado de la
sntesis de nuevos constituyentes citoplasmticos y celulares; el segundo es el aumento
del nmero de clulas que se produce cuando la clula madre se divide para dar dos
clulas hijas.
En general, la forma ms comn de multiplicacin bacteriana es la fisin binaria. El
tamao mximo que debe alcanzar la clula antes de la divisin suele ser constante. El
tiempo de generacin en fisin binaria, es decir, el tiempo transcurrido entre dos
divisiones celulares, es variable, pudiendo oscilar entre 10 minutos y varios das. De
esto depende que el crecimiento de una bacteria sea rpido o lento.
II.A FASES DE CRECIMIENTO
El crecimiento de las bacterias en cultivo puede determinarse midiendo
experimentalmente el incremento de la materia celular o el incremento del nmero de
clulas. La curva de crecimiento bacteriano se divide en segmentos o fases de
crecimiento. Las partes ms significativas son la fase de latencia, durante la cual no
existe aumento cuantitativo o ste es muy pequeo; la fase logartmica o de
crecimiento exponencial, durante la cual las bacterias se multiplican a la mxima
velocidad; y la fase estacionaria, en la que se alcanza el mximo de crecimiento.
La fase de latencia es el perodo necesario para que las clulas viables del
inculo acumulen enzimas e intermediarios esenciales para la sntesis de componentes
celulares a concentraciones compatibles con el punto de mxima sntesis. Cuando el
inculo se ha tomado de un cultivo en fase exponencial, se elimina en gran medida o
totalmente el perodo de latencia, debido a que las clulas se encuentran ya en estado de
equilibrio fisiolgico, lo que hace posible la sntesis a velocidad mxima.
La fase de crecimiento exponencial representa una situacin prcticamente
estable en cuanto a la relacin de las bacterias con su entorno. Esta estabilidad es
aproximada, debido a que el medio es alterado continuamente por los microorganismos,
y limitada, porque se mantiene slo durante una parte de la vida del cultivo. La
velocidad de crecimiento est determinada por factores ambientales tales como la
concentracin de algn nutriente esencial, la cantidad de sustrato oxidable o el grado de
difusin del oxgeno dentro del cultivo.
El final de la fase de crecimiento exponencial, est marcado por un descenso
relativamente rpido de la tasa de divisin celular, lo que seala el comienzo de la fase
estacionaria. En dicha fase no se para por completa la divisin, pero las clula
comienzan a morir, y las divisiones ocasionales contrarrestan estas muertes, de forma
que el nmero de microorganismos viables permanece relativamente constante durante
un tiempo.
Siguiendo a la fase estacionaria se produce generalmente la muerte de parte de
las clulas presentes, de forma rpida o lenta pero siempre exponencialmente.

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Actualmente existen sistemas automatizados que nos permiten conocer la

velocidad de crecimiento de un cultivo bacteriano en medio lquido mediante diferentes
mtodos (bioluminiscencia, turbidez).
Representacin del crecimiento bacteriano
En general, la forma ms comn de multiplicacin bacteriana es la fisin binaria.
El tamao mximo que debe alcanzar la clula antes de la divisin suele ser constante.
El tiempo de generacin en fisin binaria, es decir, el tiempo transcurrido entre dos
divisiones celulares, es variable, pudiendo oscilar entre 10 minutos y varios das
Si se representa el nmero de clulas de una poblacin en crecimiento
exponencial en ordenadas y el tiempo en abscisas, ambas magnitudes en escala
aritmtica, se obtiene una curva exponencial (verde). Por ello se prefiere la
representacin semilogartmica (roja), en la cual se coloca en ordenadas el logaritmo del
nmero de clulas. En este tipo de representacin el crecimiento exponencial se
reconoce por una recta.
La pendiente de la recta corresponde a la tasa de duplicacin, y es tanto
mayor cuanto mayor sea la pendiente de la recta.

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Clculo de valores de crecimiento bacteriano

Las bacterias se multiplican por divisin binaria; su multiplicacin se
corresponde, por lo tanto, con una progresin exponencial: 20 21 22 23 .... 2n , siendo n el
nmero de generaciones o divisiones celulares. En un determinado momento, el
nmero de microorganismos N en un cultivo al cabo de un tiempo determinado, ser

N = No . 2n, siendo No el nmero inicial de microorganismos

Definimos el tiempo de generacin g como el tiempo que tarda en duplicarse
un cultivo.
Consideramos t el tiempo transcurrido desde el inicio del crecimiento
bacteriano, aunque realmente es el tiempo transcurrido desde el comienzo de la fase de
crecimiento exponencial
La relacin entre estas tres variables es g = t / n, o n = t / g
La velocidad de crecimiento (en divisiones/hora) viene determinada por la
inversa de g y se denomina k. En algunos libros esta velocidad de crecimiento se
denomina tambin tasa de divisin y se simboliza por v.
k=1/g

k=n/t

Ejemplo: Ponemos una bacteria en un caldo de cultivo lquido. Tras una hora de fase latencia, que no
tendremos en cuenta, entra en fase de crecimiento exponencial y se divide a un ritmo constante de 2
divisiones por hora.
Calcula el nmero de bacterias al cabo de 16 horas
4294967296

II.B REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LAS BACTERIAS

Las bacterias utilizan para su metabolismo diferentes sustancias que les permiten
desarrollarse sin dificultad. Las bacterias que utilizan nutrientes simples y no dependen
casi para nada de la clula husped se denominan auttrofas; aquellas que son
incapaces de utilizar estos compuestos y necesitan sustancias previamente sintetizadas
por otra clula se denominan hetertrofas.
Algunas bacterias son bastante restrictivas con respecto a la clase de sustancias
que utilizan para la obtencin de energa (p.ej. slo hidratos de carbono); otros sin
embargo, pueden utilizar aminocidos, cidos grasos, hidratos de carbono y hasta
compuestos aromticos como fuentes de energa.
La mayor parte de las bacterias son cultivables en medios artificiales, siempre
que el medio de cultivo les proporcione todos los elementos necesarios para su
crecimiento y multiplicacin en una forma asimilable. A este respecto, las necesidades
de las bacterias son extremadamente variables y pueden dividirse en:

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1) Necesidades elementales:
Son los elementos que entran a formar parte de la composicin del
microorganismo, es decir, aquellos que constituirn las protenas, cidos nuclicos,
glcidos, lpidos, etc. Los ms importantes son:
Carbono puede ser obtenido a partir del CO2 atmosfrico, o ms habitualmente suele
ser proporcionado por una fuente orgnica, como protenas, glcidos, etc.
Nitrgeno se obtiene de los grupos amino, sales de amonio, N orgnico, nitratos o N
Atmosfrico
Hidrgeno y oxgeno obtenido de las fuentes anteriores, y principalmente del agua
Azufre generalmente obtenido de los sulfatos
Fsforo generalmente obtenido de los fosfatos
Metales son utilizados en forma inica .K, Mg, Ca, Fe.- deben ser aadidos al medio.
.Oligoelementos (Mn, Zn, Co, Cu, etc.).- Estn generalmente presentes como impurezas
en los componentes del medio

2) Necesidades energticas:
Son indispensables para cubrir los gastos que lleva consigo la sntesis. Las fuentes
utilizadas para obtenerla son la energa luminosa, y ms normalmente la energa
qumica, liberada a travs de las reacciones redox.
3) Necesidades de factores de crecimiento:
En ocasiones es necesario suministrar a las bacterias determinados compuestos que ellas
no son capaces de sintetizar. Son los llamados factores de crecimiento: aminocidos,
bases pricas y pirimidnicas, vitaminas, etc. Estas necesidades especficas son ms
frecuentes, y ciertos grmenes exigen la presencia de muchos de estos factores.
II.C ATMSFERA DE CRECIMIENTO.
Las bacterias necesitan para su crecimiento no slo una temperatura ptima y la
presencia de unos nutrientes adecuados; la existencia de ciertos compuestos gaseosos
puede facilitar o impedir su crecimiento.
El gas o la mezcla de gases ms importante en la naturaleza es el aire. Las
bacterias se clasifican en aerobias y anaerobias en funcin de su capacidad para crecer o
no en presencia de oxgeno. Las bacterias aerobias pueden obtener la energa necesaria
para el crecimiento gracias al oxgeno, ya que utilizan a ste como aceptor final de
electrones. Al grupo de bacterias que pueden obtener energa del oxgeno, pero tambin
son capaces de crecer en ausencia de ste se les denomina anaerobias facultativas. Las
bacterias que requieren O2 para crecer, pero a unas concentraciones menores del 20% se
denominan microaerfilas. Recordad que stas NO crecen en ambientes totalmente
anaerobios.
Las bacterias anaerobias s pueden obtener energa en ausencia del oxgeno ya
que el aceptor final de electrones es un compuesto diferente. Los microorganismos que
no pueden vivir en presencia de oxgeno se denominan anaerobios estrictos; los

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aerotolerantes son aquellos microorganismos anaerobios que no utilizan el oxgeno

pero no son perjudicados por l.
La mayora de las bacterias necesitan adems, para un ptimo crecimiento, de un
5 a un 10% de CO2 en la atmsfera de incubacin.
Los sistemas utilizados para conseguir la atmsfera ms apropiada para cada
grmen son muy diversos.
Vamos a describir brevemente los ms utilizados:
1) Frasco hermtico con vela encendida.Es el mtodo ms antiguo y clsico. En estas condiciones se produca una
pequea cantidad de CO2 junto con vapor de agua a la vez que disminua
ligeramente la presin de O2.
2) Generadores de gases.Existen preparados comerciales que producen una cantidad determinada
de gas(es) al ser hidratados. Teniendo en cuenta que estos generadores se
introducen en unos recipientes hermticos de volumen conocido, la
concentracin de gases obtenida puede ser perfectamente calculada por el
fabricante para que coincida con nuestras necesidades o, mejor dicho, con las del
microorganismo que pretendemos cultivar.
Los generadores de gases se presentan en forma de sobres con un contenido
pulverulento, para facilitar la reaccin de la mezcla con el agua. Los generadores
ms utilizados son los que proporcionan una atmsfera con una concentracin de
CO2 entre el 5 y el 10% y los que producen una atmsfera pobre en O2 para
cultivo de anaerobios.
Los recipientes ms utilizados son las "jarras" cilndricas en las que es posible
introducir de 10 a 20 placas. Sin embargo, en los laboratorios que no tienen
mucho volumen de muestras, se utilizan unos sobres de plstico que se cierran
hermticamente mediante un clip y que permiten la produccin de una atmsfera
determinada para una o dos placas.
3) Estufas de CO2
Algunas estufas de cultivo vienen preparadas para conectarse a bombonas de
CO2 de manera que, mediante una serie de manmetros y reguladores, es posible
conseguir una concentracin determinada de este gas en el interior de la estufa.
II.D

METABOLISMO BACTERIANO.
Las bacterias utilizan una gran cantidad de fuentes de energa: unas recurren a la
luz, y otras a componentes qumicos, orgnicos o inorgnicos. Casi todas las vas de
formacin de energa conducen a la formacin de ATP o PNH ( NADH y NADPH ). El
ATP proporciona la energa necesaria para la creacin de nuevos enlaces, y los PNH son
una excelente fuente de electrones para la mayora de las reacciones que requieren un
agente reductor.
II.E

TEMPERATURA DE CRECIMIENTO.
Las bacterias pueden clasificarse segn su temperatura ptima, que
generalmente se toma como aquella a la cual se produce el mximo crecimiento.
Bacterias sicrfilas son aquellas que se desarrollan entre 0 y 20 C. En el
extremo opuesto se encuentran las bacterias termfilas, cuya temperatura ptima supera
los 45C, soportando un mximo de 75 C.

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Las bacterias mesfilas son aquellas cuya temperatura ptima alcanza valores
medios, generalmente unos 37C, englobndose la gran mayora de las bacterias dentro
de este grupo. La mayor parte de las bacterias patgenas son mesfilas, y su temperatura
ptima se halla con frecuencia prxima a la de su husped natural.
La temperatura ptima se consigue en estufas de cultivo, que normalmente son
capaces de regularla entre los 20 y los 60 C.
II.F

OTRAS CONDICIONES NECESARIAS PARA EL CRECIMIENTO.

La composicin del medio de cultivo no es la nica condicin necesaria para un
buen cultivo microbiano.
Este no se producir si no se respetan adems ciertas condiciones fsico-qumicas:
1) Hidratacin:
La cantidad de agua presente en el medio es fundamental para la reproduccin
ptima de las bacterias.
2) Presin osmtica:
La mayor parte de las bacterias son muy tolerantes a las variaciones de presin
osmtica, debido a la presencia de una pared celular extraordinariamente rgida.
Aunque se trabaja habitualmente en isotona, las bacterias presentan una gran
resistencia a la hipotona (suspensin de grmenes en agua destilada), aunque no
toleran concentraciones osmticas extremadamente elevadas.
3) pH:
Tiene una gran importancia, fundamentalmente porque permite un ptimo
funcionamiento de los sistemas enzimticos encargados de la sntesis. En
condiciones normales el pH ptimo es normalmente cercano a la neutralidad.
Por tanto y salvo excepciones, el pH de los medios se ajustar entre 6 y 7.
4) Potencial redox:
Aunque en condiciones normales no se tiene mucho en cuenta, si se hace en
condiciones experimentales, donde la presin parcial de oxgeno juega un papel
determinante.
III.

CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo pueden clasificarse segn diferentes criterios, pero los ms
importantes son aquellos que se basan en:
a) su consistencia
b) su utilizacin
c) su composicin
III.A SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).
1) Medios lquidos:
Son los que se presentan en este estado, denominndose por esta razn caldos.
El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente
de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la
obtencin de una suspensin bacteriana de una determinada concentracin.
2) Medios slidos:

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Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un agente gelificante. Los ms

utilizados son la gelatina y el agar.
Gelatina:
Es una protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de
que es hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado
porque su punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la
que no puede utilizarse para cultivos a 37C, que es la temperatura ptima de
crecimiento para muchos microorganismos.

Agar-agar:
Es un polmero de azcares obtenido de algas marinas. Se trata de una
molcula insoluble en agua pero soluble en agua caliente; una solucin al 1,5%
p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y no se funde por debajo de 85C. Funde
a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los 45C. Tiene el
inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos que pueden
falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un microorganismo.
Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937, los
dividi en dos grupos:
- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, y
- agaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas.
La proporcin de agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de
origen.
El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes
son: agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares
purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la
mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo
que es importante la ausencia de metales txicos.
3) Medios semislidos:
Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente
solidificante en una proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus
usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias.
III.B SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios comunes:
Son aquellos que poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el
crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio
ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la
adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar
tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento:
Son aquellos que, adems de las sustancias nutritivas normales, incorporan una
serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos

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exigentes. Este enriquecimiento se hace por adicin de sangre u otros productos

biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores.
En ocasiones es posible aadir suplementos artificiales a los medios para
producir un enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc)
El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para su crecimiento. Estas
sustancias son aportadas por la sangre calentada adicionada al medio de cultivo
(agar chocolate).
3) Medios selectivos:
Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias
contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de estos medios
consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin
microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que
se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de
enterobacterias.
4) Medios inhibidores:
Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el
crecimiento de una poblacin microbiana, se le denomina medio inhibidor.
Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de
antimicrobianos o de cualquier otra sustancia que inhiba completamente el
desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey
que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el
crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales:
Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar
gneros o especies. La adicin de un azucar fermentable o un sustrato metabolizable se
utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite
distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin
lo son el C.L.E.D. (lactosa +/-), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es
doblemente diferencial), etc.
6) Medios de identificacin:
Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos
para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer
los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el
sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el
resultado.
El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le
haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios
utilizados en identificacin.
Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios
especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se
consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin.
Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID (Biomerieux),
utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la
placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos.
7) Medios de multiplicacin:

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Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo

ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la
industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos.
El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios.
8) Medios de conservacin:
Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese
mantener.
Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y
reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa.
En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
9) Medios de transporte:
Se usan para el transporte de muestras clnicas que no pueden sembrarse
inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la torunda con la que
se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en un tubo). Son
ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, Cary-Blair, etc.
III.C ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de
cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos:
Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de
tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es
exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto
puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la
reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan
excelentes resultados y son los ms empleados.
2) Medios sintticos:
Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias
qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas,
resultando un medio de composicin perfectamente definida.
3) Medios semisintticos:
El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace
que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o
demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la
forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de
tejidos, etc.).
Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste,
hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas.
Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

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IV.

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DESCRIPCIN Y UTILIZACIN DE LOS MEDIOS DE

CULTIVO

IV.A MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.

Son los ms corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos,
s son los ms conocidos en un laboratorio de Microbiologa.
Agar nutritivo:
Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no presentan
exigencias particulares.
No es diferencial.
Agar sangre:
Es un medio enriquecido que se utiliza adems para la investigacin de los
diversos tipos de hemlisis (? , gamma). Se utiliza para el crecimiento de
estreptococos.
Para la preparacin del agar sangre se puede utilizar el agar nutritivo enriquecido
con cloruro sdico o un preparado enriquecido con otras sustancias como Columbia o el
tripticase de soja.
La adicin de sangre a un medio de cultivo no proporciona las sustancias que
estn en el interior de los hemates, pero s puede aadir factores inhibidores del
crecimiento bacteriano presentes en el suero. Este es un inconveniente que puede
solucionarse calentando la sangre para romper los eritrocitos y para que se destruyan
las sustancias inhibidoras, que son termolbiles.
La sangre utilizada como aditivo a estos medios suele ser sangre de carnero
diluida al 5%, pero en algunas ocasiones es necesario utilizar sangre de otras especies
(caballo, conejo, humana), pues facilitan las reacciones hemolticas o contienen
determinados factores de enriquecimiento o no poseen sustancias inhibidoras del
crecimiento de determinados grmenes.
Agar chocolate:
El agar chocolate se obtiene calentando la sangre antes de aadirla al medio
base. Por esta razn el agar chocolate contiene hemoglobina, que aporta al medio un
importante elemento para el crecimiento: el factor X o hemina termoestable.
El agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de
Neisserias (gonococos y meningococos) y Haemophilus, pero en l pueden crecer
muchos otros microorganismos exigentes.
El agar chocolate puede convertirse quizs en uno de los medios ms
enriquecidos si aadimos una mezcla de factores de crecimiento no contenidas en la
sangre. Estas mezclas, denominadas de forma diferente segn las casas comerciales
(Polivitex, Isovitalex, etc.) contienen ms de una docena de compuestos que confieren a
este medio unas cualidades nutritivas extraordinarias.
Por adicin de uno o varios antibiticos pueden lograrse medios inhibidores
utilizados para la recuperacin y seleccin de determinados microorganismos. Un
ejemplo clsico es el Thayer-Martin, utilizado para el aislamiento del gonococo y que
no es otra cosa que un agar chocolate enriquecido al cual se ha aadido una mezcla de
tres antibiticos especficos que impedirn el crecimiento del resto de la flora
acompaante.

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Agar MacConkey:
Es un medio utilizado para el aislamiento e identificacin de enterobacterias. Es
un medio inhibidor de los grmenes Gram positivos por su contenido en cristal violeta y
selectivo para enterobacterias por su contenido en sales biliares.
En su composicin lleva un azcar (lactosa) y un indicador (rojo de metilo) que
lo convierten en un medio diferencial. Los grmenes que fermenten la lactosa producen
una acidificacin del medio que hacen aparecer de color rojo fuerte a las colonias
resultantes. Las colonias lactosa negativas sern incoloras, apareciendo del mismo color
que el medio subyacente (naranja).
Agar C.L.E.D.:
El medio C.L.E.D. (Cistina Lactosa Electrlito Deficiente) est recomendado
para el recuento e identificacin presuntiva de los microorganismos de las vas
urinarias. Su bajo contenido en electrolitos evita la invasin de los cultivos por Proteus.
La presencia de lactosa en su composicin le confiere el carcter de medio
diferencial, aunque la interpretacin sea diferente al anterior medio por la incorporacin
de otro indicador: el azul de bromotimol. Las colonias lactosa positivas aparecern de
color amarillo y las lactosa negativas lo harn con un color verdoso, blanco o azulado.
Agar S.S.:
El agar SS es un medio selectivo empleado para el aislamiento de Salmonella y
Shigella a partir de muestras fecales. El medio contiene sales biliares y verde brillante
para impedir el crecimiento de coliformes y grmenes Gram positivos. La presencia de
lactosa y rojo de metilo nos permiten diferenciar las colonias que fermentan la lactosa
(rosas o rojas) de las que no lo hacen (incoloras).
Las especies de Salmonella y Shigella no fermentan nunca la lactosa por lo que
este medio es excelente para descartar todas las colonias que no cumplan este requisito.
El agar SS es doblemente diferencial, porque adems de indicarnos el
comportamiento de los grmenes con relacin a la lactosa, nos muestra los grmenes
que son capaces de producir cido sulfhdrico, que se manifiesta como un precipitado de
color negro en el centro de la colonia.
As, una colonia incolora y con un punto negro central es sospechosa de
Salmonella, y ser exclusivamente a estas colonias a quienes se hagan las pruebas
bioqumicas confirmatorias de esta especie.
El agar SS es un medio muy inhibidor que a veces impide incluso el crecimiento
de ciertas especies de Salmonella y sobre todo de Shigella. Por esta razn debe
utilizarse siempre junto con otro medio menos inhibidor como el Hektoen.
Agar Hektoen :
Es un medio ms diferencial y menos selectivo que el agar SS. Se utiliza para
facilitar el aislamiento de las enterobacterias. La presencia de tres azcares (lactosa,
sacarosa y salicilina ) permiten ampliar el poder diferencial de este medio. Este medio
es capaz de detectar los grmenes formadores de SH2, igual que el SS.
Las cualidades del agar Hektoen se deben a su riqueza en peptonas y azcares,
que neutralizan el efecto inhibidor de las sales biliares respecto a ciertos grmenes de
cultivo delicado (Shigella en particular).
El crecimiento de Salmonella es excelente, igual que el de Shigella, obtenindose
colonias ms numerosas y voluminosas que en los medios selectivos usuales. La

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inhibicin tiene lugar, esencialmente, sobre E. coli y en menor medida sobre Proteus y
Citrobacter. Hay que sealar que el vibrin colrico crece bien en este medio.
C.P.S. ID3. :
Medio cromognico desarrollado por Biomerieux, que permite la identificacin
de E. coli, P. mirabilis y E. faecalis, con la simple visualizacin del cambio de color de
la colonia sobre el medio (rojo burdeos, azul o marrn). La identificacin solo requiere
la adicin de un reactivo para confirmar o descartar la especie sospechada. Otros
microorganismos diferentes requieren los sistemas de identificacin habituales (API, p.
ej)
Granada, Islam o New GBS:
Medios utilizados para deteccin de Streptococcus agalactiae, mediante la
utilizacin de un sustrato cromognico especfico de este microorganismo.
Agar Mueller-Hinton:
Es el medio universalmente aceptado para la realizacin de los antibiogramas o
pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos. A l nos referiremos ms ampliamente en
el captulo correspondiente.

IV.B

OTROS MEDIOS DE CULTIVO.

Agar Tripticase de soja:

Es un medio utilizado para el crecimiento de grmenes exigentes, como
Brucella, Neisseria o Streptococcus. Es un medio muy enriquecido, pero no es
diferencial.
Caldo tioglicolato con resazurina:
Es un medio recomendado para controles de esterilidad. Permite el cultivo de
aerobios, anaerobios y microaerfilos. Tiene un bajo potencial redox que, al aumentar,
se manifiesta por un color rosa del medio.
Agar Chapman:
Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos. Su elevado contenido
en cloruro sdico permite la inhibicin de la mayora de los otros grmenes. La
presencia de manitol y rojo fenol convierten a este medio en diferencial: as se puede
identificar presuntivamente el Staphylococcus aureus, ya que este grmen crece bien en
medios salados y fermenta el manitol (colonias amarillas).
Agar Baird-Parker:
Permite el crecimiento de estafilococos coagulasa positivos, a la vez que los
diferencia del resto.
Medio de Loeffler:
Es un medio especfico para el cultivo de Corynebacterium difteriae.
Agar Desoxicolato Citrato Lactosa Sucrosa (DCLS):

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Similar al agar SS. Es un medio diferencial e inhibidor a la vez.

Agar Kligler:
Medio especfico para pruebas de identificacin de enterobacterias. Aunque de l
hablaremos con ms detenimiento en el captulo de pruebas de identificacin bacteriana,
podemos ir adelantando que se trata de un medio diferencial que permite conocer el
comportamiento del microorganismo ante dos azcares (glucosa y lactosa), investigar la
formacin de gas y comprobar si el microorganismo puede producir sulfato ferroso a
partir del tiosulfato sdico.
Agar Levine EMB (Eosina azul de metileno):
Se utiliza para aislamiento de enterobacterias, pues impide el crecimiento de
Gram positivos y diferencia muy bien a E. coli, cuyas colonias adquieren un color
negruzco con un brillo metlico caracterstico.
Caldo selenito-F:
Se utiliza exclusivamente para enriquecimiento de Salmonellas.
Agar Cetrimida. Agar King:
Permiten el crecimiento de Pseudomonas, inhibiendo Gram positivos y la
mayora de enterobacterias.
El segundo pone adems de manifiesto la pigmentacin fluorescente de Pseudomonas
bajo luz UV.
Agar Schaedler:
Es un medio con sangre y vitamina K muy adaptado para el cultivo de
anaerobios.
Agar Gardnerella:
Agar con sangre humana ms una mezcla de antibiticos que permiten la
observacin de colonias beta hemolticas caractersticas de Gardnerella vaginalis
Agar CIN, Skirrow o Campylosel:
Se utiliza para el aislamiento de Campylobacter intestinales creciendo a 42 C en
microaerofilia.
Agar BCYE (Buffer Charcoal Yeast Extract):
Se utiliza para el aislamiento de bacterias del gnero Legionella
Lwenstein-Jensen:
Este medio se utiliza para el cultivo de Mycobacterium tuberculosis. Contiene
verde malaquita para inhibir parcialmente el crecimiento de otras bacterias. El huevo se
utiliza como sustancia de enriquecimiento.

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V.

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PREPARACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Actualmente pocos laboratorios conservan la pesada e ingrata tarea de hacer sus

propios medios de cultivo. Esta labor, que hasta hace pocos aos era habitual en
laboratorios pequeos y grandes, ha sido sustituida por la compra de los medios ya
emplacados, ms baratos, ms homogneos y con mayores garantas de calidad. Sin
embargo, hemos de tener en cuenta que, aunque el proceso de fabricacin masiva de
placas est totalmente automatizado, no podemos descartar que alguna vez trabajemos
en un laboratorio que conserve esta labor tradicional. Por ello y aunque slo sea a modo
de prueba, tenis que saber preparar un agar nutritivo. Esta es la razn por la que os
damos unas breves nociones sobre la preparacin de medios de cultivo.
Las casas comerciales proporcionan los extractos secos necesarios para la
fabricacin de cualquier tipo de medio. En general se suministran en forma de polvo o
en tabletas. Esta segunda modalidad nos evitar la tarea de tener que pesar los
componentes, pues las tabletas contienen la cantidad exacta de polvo desecado para
ser disuelta en un volumen concreto de lquido. No obstante el procedimiento de
preparacin es idntico para ambos.
La preparacin de los diferentes medios de cultivo ha de hacerse siguiendo las
instrucciones especficas para cada uno de ellos. No obstante existen unas cuantas
normas generales que han de tenerse muy presentes:
1) Debe emplearse vidrio perfectamente limpio.
2) Es imprescindible una correcta pesada de los componentes y una perfecta
medicin del volumen de agua.
3) Es aconsejable utilizar agua destilada o desmineralizada.
Para la preparacin de medios se parte de mezclas deshidratadas de los compuestos que
la integran. Habitualmente slo es necesario aadir el agua y esterilizar en autoclave,
pero en algunas ocasiones es necesario aadir despus de la esterilizacin algn
componente termolbil que no hubiera resistido el calor.
Los medios deshidratados presentan numerosas ventajas:
1) Son muy estables.
2) Su utilizacin es muy simple, pudiendo prepararse poco tiempo antes de su
utilizacin.
3) Una pequea cantidad de producto permite la preparacin de una importante
cantidad de medio, no necesitando un gran volumen de almacenamiento.
4) Son muy econmicos.
La tcnica utilizada para rehidratar los medios de cultivo desecados es muy importante
para obtener productos de buena calidad.
Es conveniente disolver todo el medio en menos de la mitad del agua que
corresponda. Mezclar bien hasta disolver totalmente y por ltimo completar con agua
destilada el volumen necesario.
Es posible acelerar la disolucin utilizando agua caliente a 45 o 50 C. El
calentamiento es necesario a veces para obtener una disolucin completa.
Si el medio contiene agar conviene homogeneizar completamente la mezcla
antes de llevar a ebullicin. No sobrecalentar intilmente (de uno a dos minutos de
ebullicin son suficientes).
Verificar rpidamente el pH y ajustarlo, si es necesario, al valor indicado por el
fabricante. Es indispensable efectuar esta verificacin, pues el pH del agua destilada

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puede variar segn las condiciones de obtencin y almacenamiento. El ajuste de pH

debe hacerse siempre a temperatura ambiente.
Una vez preparados, los medios se esterilizan generalmente en autoclave a unos 120 C
durante 15 20 minutos, para volmenes de hasta 500 ml. Para volmenes mayores se
requieren tiempos superiores.
Si el medio no resiste las altas temperaturas se puede esterilizar a vapor fluente o
tyndalizacin.
Una vez preparados, los medios no necesitan ser filtrados.
En ningn caso conviene sobrepasar la temperatura de esterilizacin.
Los medios slidos se reparten cuando todava estn fundidos y se dejan
solidificar en su envase definitivo (placa, tubo).
Si hay que aadir al medio sustancias de enriquecimiento termolbiles, se hace
despus de la esterilizacin, y con el medio refrigerado, pero an fundido. La adicin
debe ser asptica y lenta, para conseguir una homogeneidad sin grumos ni burbujas.
Los medios deshidratados son muy higroscpicos; es indispensable que los
frascos permanezcan abiertos solo durante el tiempo necesario para la obtencin del
producto. No deben utilizarse medios rehidratados ambientalmente. Por eso su
conservacin y almacenamiento debe hacerse lejos de la luz y de fuentes de calor,
en lugar fresco y seco.
Los medios preparados deben conservarse en buenas condiciones tras su
esterilizacin. Si han de ser almacenados deben ser etiquetados con su nombre y fecha
de fabricacin; han de protegerse contra la desecacin y la luz, para lo que es
conveniente introducirlos en bolsas estriles y hermticas. Un refrigerador a
4C es un buen lugar para almacenar las placas preparadas.
Los medios solidificados deben ser puestos a temperatura ambiente y despojados
de la humedad que pudiesen tener antes de su utilizacin.
Los medios deben someterse a un control de calidad que abarcar diferentes
aspectos:

Control de esterilidad:
Se efecta incubando algunas placas del lote escogidas al azar y verificando la
ausencia de crecimiento bacteriano.
Control de composicin:
Se realiza para comprobar que el medio posee los componentes que lo
caracterizan de manera que permita el crecimiento de determinados grmenes.
Control de caducidad:
Se realiza para utilizar las placas durante el tiempo que garantice su correcta
utilizacin. Por trmino medio las placas preparadas pueden conservarse entre 15 das y
dos meses.

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VI.

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Medios de cultivo utilizados para deteccin de microorganismos

especficos:

Microorganismo

Medios de cultivo

Staphylococcus spp.

Placa de agar Columbia + 5% SC

Streptococcus spp.

Placa de agar Columbia + 5% SC

Streptococcus agalactiae (SGB)

Placa de agar Granada, New GBS o

Islam

Enterobacterias

Placa de agar MacConkey

Salmonella

Hektoen o SS
Tubo de caldo Selenito F

Campylobacter

Placa de agar CIN, Skirrow o

Campylosel

Pseudomonas

Placa de agar cetrimida

Placa de agar MacConkey

Neisseria

Placa de agar Chocolate VCAT

Placa de agar Chocolate Polivitex

Haemophilus

Placa de agar Chocolate Polivitex

Mycobacterium

Tubo de Lowenstein-Jensen

Gardnerella

Placa de agar Gardnerella

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Legionella

Placa de agar BCYE

Mycoplasmas y Ureaplasmas

Galera de Mycoplasma IST 2

Anaerobios

Placa de agar Schaedler

Levaduras

Placa de agar Albicans ID

Hongos dermatofitos

Tubo de agar-dermatofitos