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Prctica No 6
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Tincin de Gram
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INTRODUCCIN
La tincin de Gram, tambin conocida como coloracin de Gram, es una tcnica
de laboratorio que se utiliza rutinariamente en los estudios microbiolgicos de
las bacterias. Fue diseada por Christian Gram, un cientfico dans, en el ao
1884. El objetivo de Gram era conseguir una prueba con la que fuera posible
diferenciar diferentes grupos de bacterias para as poder estudiarlas y
clasificarlas. La prueba result todo un xito y pronto se convirti en una tcnica
muy til no solo para el estudio de las bacterias, sino tambin para poder
identificarlas rpidamente en una infeccin y seleccionar el antibitico ms
adecuado para tratarla.
La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de
cualquier origen que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tien la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos,
se realiza un lavado del colorante. Despus de eso puede que el colorante
permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido. En el primer caso
permanecera el color morado, y se tratara de bacterias Gram positivas y, en el
segundo, la pared tendra un color rosado, y seran Gram negativas.
La tincin de Gram tambin tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no
tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrn identificar, al
igual que los virus. En esos casos la tincin no colorear ningn germen. Otro
aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de
bacteria responsable de la infeccin. Para ello es necesario realizar un cultivo
microbiolgico que se acompaa siempre de un antibiograma para estudiar de
forma exacta el antibitico ms efectivo.
Materiales y reactivos
Material
Microscopio.

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Portaobjetos y cubreobjetos.
Asa bacteriolgica.
Mechero.
Reactivos
Colorantes de Gram.
Cultivo de la prctica anterior.
Aceite de inmersin.
Metodologa
Preparacin del portaobjeto

Limpiar y desengrasar los portaobjetos.

Marcar cada portaobjetos para identificar la tincin, microorganismo y
autor: rotular (rotulador resistente al agua) por el lado opuesto al de la
preparacin; pasar lpiz graso sobre el rtulo.

Preparacin de la muestra

Disposicin de una alcuota de la muestra sobre el portaobjetos (manejar

los cultivos en condiciones de esterilidad.)

Si se parte de cultivos en medio slido, una pequea cantidad de

clulas ser suspendida en una gota de agua.

Extensin de las bacterias sobre la superficie del portaobjetos
(aproximadamente un centmetro cuadrado). La extensin no contendr

demasiadas clulas.
Desecacin de la muestra al aire o con un calentamiento suave
Fijacin: adhesin de las bacterias a la superficie del portaobjetos:
Ayudarse de unas pinzas para pasar la cara inferior del portaobjetos por
la llama del mechero. Son suficientes dos o tres pases rpidos.

Tincin de Gram
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PASOS
Colorante

GRANPOSITIVAS

GRAMNEGATIVAS

principal Violeta

Violeta

Violeta

Violeta

cristal violeta
Mordiente: lugol
Decolorante:

alcohol Violeta

Transparente

cetona
Colorante de contraste: Violeta

rojo

safranina

1. Hacer frotis de cada uno de los cultivos, dejar secar al aire.

2. Fijar el frotis al color.
3. Cubrir el frotis con cristal violeta, dejarlos 1 min. Escurrir el colorante y lavar
con agua.
4. Cubrir el frotis con lugol, dejarlo 1 min, escurrir y lavar con agua.
5. Decolorar el frotis con alcohol acetona, de 5 a 15 seg. Escurrir y lavar con
agua.
6. Cubrir con safranina y dejarlo por 30 seg, escurrir y lavar con agua.
7. Dejar secar el frotis al aire y observar.
Observacin microscpica de los frotis.
Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparacin con
el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. Para la observacin con el
objetivo de 100X, colocar previamente una pequea gota de aceite de
inmersin sobre la preparacin.

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Resultados, discusin y observaciones

Las bacterias Gram positivas se vern violetas debido al cristal violeta atrapado
en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se vern
rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuag a travs de las delgadas paredes
celulares y luego ingres a ellas el colorante secundario rosado.

E. coli (bacilos rosa) y S., aureus (cocos violeta).

Identifica bacterias Gram positivas por su forma. Las bacterias se clasifican
ms a fondo por su forma bajo el microscopio, ms comnmente como cocos
(esfricas) o varas (cilndricas). Estas son algunas bacterias Gram positivas
(teidas de violeta) comunes clasificadas por forma:
Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que
significa cocos en grupos) o estreptococos (que significa cocos en cadenas).
Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las bacterias Clostridium,
Corynebacterium y Listeria. Las varas de la especie Actinomyces a menudo
tienen ramas o filamentos.

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Identifica bacterias Gram negativas. Las bacterias Gram negativas (teidas

de rosado) a menudo se clasifican en tres grupos. Los cocos son las bacterias
esfricas, las varas son las bacterias largas y delgadas, y las varas cocoides
estn en un punto intermedio. Los cocos Gram negativos son ms
comnmente la especie Neisseria.
Las varas Gram negativas incluyen las bacterias E. coli, Enterobacter,
Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas y
muchas otras. La bacteria Vibrio cholerae puede aparecer como varas normales
o varas curvas
Las varas Gram negativas "cocoides" (o "cocobacilos") incluyen la Bordetella,
Brucella, Haemophilus y Pasteurella.

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CUESTIONARIO.
1. Por qu es importante fijar la flama?
Por qu lo que esta operacin pretende es que los microorganismos se
adhieran al portaobjetos por coagulacin de sus protenas plasmticas
mediante calor.
2. Investiga cules son las estructuras celulares o molculas responsables de la
tincin simple realizada. Da ejemplos de otros colorantes que podran utilizarse.
Las estructuras responsables de la tincin simple son: Cloroplastos colorantes:
Clorofila a y c, Carotenos, Xantfilas, (fucoxantina), Ficobilinas
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien
con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de
lactofenol).
3. Qu es el aceite de inmersin? Por qu se utiliza?
La funcin del aceite de inmersin es restringir el movimiento de la muestra,
adems de evitar el rozamiento entre el cubreobjetos y el objetivo,
generalmente se utiliza cuando se observa con el objetivo de 100X. otra funcin
del aceite de inmersin es evitar que la luz se desvi, al contrario lo que se
pretende es que la luz llegue concentrada hacia la muestra.

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4. Cules son las desventajas o limitaciones de la tincin simple?

La tincin de Gram tambin tiene ciertas limitaciones. Algunas bacterias no
tienen pared, como por ejemplo las Chlamidias, y no se podrn identificar, al
igual que los virus. En esos casos la tincin no colorear ningn germen. Otro
aspecto negativo de la prueba es que no puede identificar el tipo exacto de
bacteria responsable de la infeccin.
5. En que se basa la tincin de Gram?
La tcnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de
cualquier origen que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tien la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos,
se realiza un lavado del colorante. Despus de eso puede que el colorante
permanezca en la pared bacteriana o que se haya ido.
6. De qu color se tien los Gram positivos y los Gram negativos?
Las bacterias Gram positivas se vern violetas debido al cristal violeta atrapado
en sus gruesas paredes celulares. Las bacterias Gram negativas se vern
rosadas o rojas, ya que el violeta se enjuag a travs de las delgadas paredes
celulares y luego ingres a ellas el colorante secundario rosado.

CONCLUSIONES:

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REFERENCIAS:
Microbiologa clnica aplicada; Pedro Garca Martos, Mara Teresa Fernndez
del Barrio, et al.,1996.
Pruebas mdicas tincin de Gram

(http://www.webconsultas.com/pruebas-

medicas/tincion-de-gram-13399)
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/tinciones/metodos_tinci
on#__doku_preparacion_del_portaobjetos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8385/
http://amrita.vlab.co.in/?sub=3&brch=73&sim=208&cnt=2

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