UN ANLISIS DE LA BIOLOGA DE SISTEMAS DE LOS CAMBIOS EN LA EXPRESIN

GNICA A TRAVS DE SILENCIAMIENTO DE HPV-18 E1 EXPRESIN EN CLULAS HELA:

Abstracto
Estudios previos han informado de la deteccin de un mRNA E1 truncada genera a partir de
HPV-18 en clulas HeLa. Aunque no est claro si una protena E1 truncada podra funcionar
como una helicasa replicativa para la replicacin viral, todava sera retener sitios de unin para
interacciones potenciales con diferentes protenas de la clula husped. Adems, en este
estudio, encontramos pruebas en apoyo de expresin de larga duracin contra el VPH-18 E1
mRNA en clulas HeLa. Para determinar si las interacciones entre E1 y protenas celulares
desempean un papel importante en los procesos celulares distintas de la replicacin viral, los
perfiles de expresin de todo el genoma de las clulas HeLa positivas HPV-18 se compararon
antes y despus de la cada siRNA de expresin E1. Expresin diferencial de genes y el
anlisis de enriquecimiento descubrieron cuatro conjuntos relacionados funcionalmente de los
genes implicados en los mecanismos de defensa del husped contra la infeccin viral. Estos
incluyen los receptores de, interfern y la apoptosis vas toll-like, junto con el conjunto de genes
antivirales interfern-estimulado. Adems, se encontr que los coactivador p300 de unin a
E1A-protenas transcripcionales (EP300) se downregulated, que es interesante dado que
EP300 se cree que se requieren para la transcripcin de genes HPV-18 en clulas HeLa. Los
cambios observados en la expresin gnica producidos a travs del silenciamiento de la
expresin de HPV-18 E1 en clulas HeLa indican que, adems de su papel bien conocido en la
replicacin viral, la protena E1 puede tambin desempear un papel importante en la
mitigacin de la capacidad del husped para defenderse contra infeccin viral.
Palabras clave: virus del papiloma humano, la protena HPV E1, siRNAs, clulas HeLa, el
anlisis de microarrays, la protena EP300.
2. Introduccin
La Agencia Internacional para la Investigacin sobre el Cncer ha indicado que no hay pruebas
convincentes de que la infeccin con el virus del papiloma humano tipo 16 (HPV-16) y el VPH18 puede dar lugar a cncer de cuello uterino, as como en los cnceres de vulva, vagina, pene
y ano [1]. ADN de VPH tambin se ha encontrado en los cnceres de la cavidad oral,
orofaringe, laringe, esfago y pulmn, y por lo tanto su asociacin con cnceres del tracto
aerodigestivo superior tambin se ha sospechado [2 - cinco]. Adems, el ADN de HPV se ha
detectado en lneas celulares derivadas de cnceres de cuello uterino: HPV-16 ADN en las
lneas celulares SiHa y CaSki, y HPV-18 ADN en las clulas HeLa [6 - nueve]. Debido a la
dificultad de establecer sistemas de cultivo de tejidos, que son susceptibles a la transformacin
por el VPH, estas lneas celulares proporcionan sistemas nicos para estudiar la expresin de
HPV-16 y HPV-18 genes en clulas derivadas de tumores humanos.
En clulas HeLa, una lnea celular de adenocarcinoma derivado de cuello uterino que contiene
mltiples copias de integrar ADN del VPH-18 [10 - 14], el VPH-18 primeros ARNm se
transcriben como ARN policistrnico [10], que dan lugar a tres especies de ARNm
diferencialmente empalmados [ 11, 12]. Estos primeros ARNm contienen informacin para la
traduccin de tres posibles VPH-18 protenas: E1, E6 y E7.Seedorf et al. [11] detectaron dos
protenas tempranas-E7 (12 kDa) y una E1 truncada (70 kDa) -en clulas HeLa, tal como se
evalu utilizando geles de poliacrilamida, despus de seleccin de hbridos y anlisis por

transferencia Western, en el que los tamaos fueron consistentes con los tamaos predichos
de la secuencia de ADN de VPH-18.
Abundante informacin est disponible en la protena E7 y su papel tanto en el ciclo de
infeccin por el virus y la carcinognesis. El E7 protena viral puede inducir la inmortalizacin
de clulas mediante la unin a la pRb, una protena supresora de tumores, que se une a e
inactiva el factor de transcripcin E2F. E2F se libera de la pRb, lo que resulta en la transcripcin
de genes implicados en la replicacin del ADN y la divisin celular [15]. Adems, E1 es una
protena helicasa replicativa, que se une al host ADN polimerasa alfa-primasa [16], protena de
replicacin A [17] y de la topoisomerasa I de realizar la replicacin viral [18].Adems, E1
tambin interacta con los chaperones moleculares, Hsp40 y Hsp70 [19], celular de protenasWD de repeticin 80, que mantiene el genoma viral en los queratinocitos [20], E / cdk2
complejo ciclina[21], y con las protenas celulares implicados en remodelacin de la cromatina y
la activacin co-transcripcin, tales como histona H1 [22] y Ini1 / hSNF5, una subunidad de la
cromatina SWI / SNF remodelacin complejo [23]. Sin embargo, todava no se sabe si estas
interacciones juegan un papel en los procesos celulares distintas de la replicacin viral.
Para determinar si estas posibles interacciones juegan un papel importante en los procesos
celulares distintas de la replicacin viral, HPV-18 E1 mRNA, que se expresa de forma
endgena en las clulas HeLa, se silenciar utilizando secuencias de ARN corto de interferencia
(siRNAs). Posteriormente, se examinaron los cambios en la expresin de genes celulares
mediante el anlisis de microarrays. Genes expresados diferencialmente se analizaron
mediante el enriquecimiento conjunto de genes con el fin de buscar conjuntos relacionados
funcionalmente de genes que pueden ser cambiados de forma coordinada en la E1 cada
ARNm

Corto secuencias de ARN de interferencia (siRNA) dirigidos contra el VPH-18 E1 mRNA

expresin en clulas HeLa.
3. Material y mtodos
3.1. Lneas celulares
Tanto las clulas HeLa (ATCC: CCL-2), que son clulas VPH-18-positivas humanos cervical
adenocarcinoma, y clulas A549 (ATCC: CCL-185), que son clulas de adenocarcinoma de
pulmn humano-VPH negativo, se mantuvieron en medio esencial mnimo (MEM de Eagle,
Nissui Pharmaceutical Co., Tokio, Japn), suplementado con L (+) - glutamina (Wako, Japn) y
suero bovino fetal al 10%.
3.2. Cortas secuencias de ARN de interferencia
Seis siRNAs dirigidos contra el VPH-18 E1 ARNm (siE1.1-6) fueron seleccionados mediante un
algoritmo basado en las directrices elaboradas por Ui-Tei et al. [24] y el basado en la web
sistema de software en lnea SIDIRECT [25]. Las secuencias de molculas de siRNA fueron
diseados bajo las siguientes condiciones: A / U en el extremo 5 'de la hebra antisentido; G / C
en el extremo 5 'de la cadena con sentido; al menos cinco residuos de A / U en un tercio a partir
del extremo 5 'de la hebra antisentido; y la ausencia de ms de nueve alineaciones
GC (tabla1). Estos seis siRNAs y siRNA no director de control (siCONTROL: 5'-UAG CGA CUA
AAC ACA UCA A-3 ') fueron sintetizados por Sigma servicio GenosyssiRNA (Sigma-Aldrich
Japan KK, Tokyo, Japn).
3.3. La transfeccin de ARN de interferencia corto
ARN de interferencia corto fue entregado a HeLa o las clulas A549 utilizando el reactivo de
transfeccin

Oligofectamine

(Invitrogen),

de

acuerdo

con

las

instrucciones

del

fabricante. Brevemente, las clulas HeLa o A549 se sembraron a 10 clulas por pocillo en una
placa de 6 pocillos y se cultivaron durante 24 h en un 30-50% de confluencia. Para la
transfeccin, 4 l de Oligofectamine y 100 nM siRNA se diluyeron en Opti-MEM I medio reducido
de suero (Invitrogen) en un volumen final de 200 microlitros. Las clulas cultivadas en 0,8 ml de
Opti-MEM I se transfectaron con una solucin mixta de siRNA, y 4 h despus del cultivo se
suplement con 0,5 ml de MEM y

(+) - glutamina que contena suero bovino fetal 30%. Los

niveles de expresin de ARNm se examinaron despus de 48 h de la transfeccin. El estado de

las clulas se cuantific mediante tincin con azul de tripano (Gibco BRL) despus de 48, 72 y
96 h de la transfeccin. Las transfecciones siRNA se repitieron despus de 72 h con medios
cambiantes. El nmero de clulas de cada pocillo se cuantific tres veces usando un
hemocitmetro (Burker-Turk profundas 1/10 mm; Erma, Tokio, Japn).
3.4. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El ARN total se extrajo usando un kit de extraccin de ARN Isogen-LS (Nippon Gene, Tokio,
Japn). El ADN genmico fue retirado de preparaciones de ARN utilizando la DNasa I
recombinante libre de RNasa (Roche, Alemania) antes de la RT-PCR. Despus de la
cuantificacin de ARN utilizando el NanoDrop ND-1000 Espectrofotmetro (NanoDrop
Technologies), RNA de muestras fueron almacenadas a -20 C, hasta que se necesite para no
ms de 2 das. Single-strand cDNAs fueron sintetizados a partir de los ARNm y se cuantificaron
utilizando el Kit de QuantiTectTM SYBR Green RT-PCR (Qiagen) y ABI Prism 7000 Sequence

Detection System (Applied Biosystems). Deshidrogenasa gliceraldehdo 3-fosfato (GAPDH gen)

se

us

como

un

control

interno

para

normalizar

los

niveles

de

expresin

de

ADNc. GAPDH secuencias de los cebadores para avance y retroceso fueron 5'-TGA TGA CAT
CAA GAA GGT GGT GAA G-3 'y 5'-TCC TTG GAG GCC ATG TGG GCC AT-3 ',
respectivamente. Para cada gen diana, 1 l de cDNA se amplific en un volumen total de 20 l
que contienen 2 x mezclas de reaccin QuantiTect SYBR Green RT-PCR suplementado con
300 nM de cada cebador. Los datos se analizaron utilizando ABI

PRISMA

7000 software SDS

(Applied Biosystems). Para todas las muestras, los puntos de cruce (CP) la expresin
normalizada del gen diana frente GAPDH se calcularon para cada muestra de tratamiento o
control [26] utilizando la siguiente frmula: 2

- (muestra de tratamiento CP - muestra de control

CP). Cada muestra

se ensay tres veces.

3.5. Anlisis de ARN-Seq
Datos de ARN-ss de un anlisis del transcriptoma de clulas VPH-18 + HeLa [27] fueron
descargados de la Archivo de nucletidos Europea (ENA; adhesin ERP000959). Secuencia
lee de este conjunto de datos se asigna a la secuencia de referencia completa del genoma de
HPV-18 (NCBI Refseq adhesin NC_001357) utilizando el programa B

OWTIE

2 [28]. VPH-18

niveles de expresin gnica se cuantificaron con registro de 10 valores de cobertura de

secuencia transformado los (es decir, nmero de etiquetas asignadas por posicin) y asignan
lecturas se visualizaron lo largo de la secuencia del genoma del VPH-18 utilizando el
Integrativa Genmica Visor [29, 30].
3.6. Anlisis de microarrays
Cualidades de ARN fueron examinados por electroforesis capilar utilizando el Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.), y se confirmaron sus cualidades
(28S / 18S rRNA, E260 / E280 relacin> 1,8). Anlisis de microarrays (incluido el etiquetado, la
hibridacin, la exploracin de imagen y condiciones de la muestra) se llev a cabo por Takara
Bio dragn Genomix Center (Mie, Japn).Brevemente, los ADNc marcados con fluorescencia
se generaron a partir de 200 ng de ARN total en cada reaccin usando el kit de marcaje de
Agilent Amp rpida en dos colores. Los ADNc de cianina 5-etiquetados procedentes de las
clulas HeLa tratadas con siE1.6 se mezclaron con la misma cantidad de ADNc de color
inverso-cianina 3-etiquetados a partir de las clulas de control no tratadas y despus se aplican
a toda una microarray Kit oligonucletido genoma humano (Agilent Tecnologas), que contenan
41 000 genes humanos y transcripciones nicas. Estas transcripciones todos contenan
anotaciones de dominio pblico(http://www.chem.agilent.com/CAG/bsp/gene_lists.asp).
Tras la hibridacin y lavado, el Agilent de doble lser de microarrays de ADN escner escanea
los

arrays.Los

datos

fueron

F EATURE E XTRACTION v. 9.5

extrados

software

de

las

genes

imgenes
candidatos

utilizando
fueron

el

Agilent

seleccionados

utilizando GENESPRINGGX software (Agilent Technologies). Una normalizacin dependen de la

intensidad (LOWESS: regresin ponderada localmente) se aplic a corregir artefactos
causados por las tasas de incorporacin de colorante no lineales, as como las incoherencias
de la intensidad de fluorescencia relativa entre los colorantes rojos y verdes. Genes expresados
diferencialmente se identificaron mediante la comparacin del registro 2 relacin entre los
niveles de expresin entre las condiciones con las de registro general 2 seales de expresin
(logratio frente Iniciar Procesado de Seal, material complementario electrnico, figura S1).

3.7. Conjunto de genes de enriquecimiento de anlisis

El potencial importancia funcional de los genes expresados diferencialmente se analiz
mediante anlisis de enriquecimiento conjunto de genes mediante la combinacin de la
herramienta ingenio Pathway Anlisis(http://www.ingenuity.com/products/ipa) con anlisis de
conjuntos

de

genes

personalizados

tomados

de

la

literatura

(electrnico

material

complementario, figura S2) [31]. Para ello, el enriquecimiento de los genes expresados
diferencialmente en las vas, o conjuntos de genes funcionalmente coherentes, se determin
mediante la prueba exacta de Fisher con el p-valor determinado como:

donde N es el nmero total de genes en el microarray, n es el nmero total de genes

expresados diferencialmente, m es el nmero total de genes en la va y k es el nmero total de
genes expresados diferencialmente en la va.
3.8. Validacin de datos de microarrays
La validacin de los datos de microarrays se realiz con un tiempo real de ensayo RT-PCR
para EP300 y el inhibidor de quinasa 1A (dependientes de ciclina CDKN1A) ARNm utilizando
tiempo real RT-PCR. El primer secuencias para EP300 adelante y atrs fueron 5'-CTC CAA
CTT

TCT

GCC

ACA

ACA-3

'y

5'

CCA

GAA

TCC

CTT

CCC

TTT

CG-3

',

respectivamente. Para CDKN1A, las secuencias de los cebadores directo e inverso fueron 5'GGA CCT GGA GAC TCT CA-3 y 5'-CCT CTT GGA GAA GAT CAG-3, respectivamente. El
nivel de transcripcin de cada gen se determin utilizando el Kit QuantiTectTM SYBR Green
RT-PCR (Qiagen) y ABI

PRISMA

7000 SDS. GAPDH mRNA tambin se utiliz como control

interno para normalizar los niveles de expresin de ARNm.

4. Resultados
4.1. Expresin de un larga duracin E1 ARNm y protenas
Informes anteriores han mostrado evidencia que sugiere que los VPH-18 primeros genes E6,
E7 y E1 se transcriben como polycistron que termina dentro de la E1 ORF [10, 12]. Esto ha sido
tomado para indicar la produccin de una protena E1 truncada con atenuada actividad
replicacin viral [14]. Sin embargo, el anlisis de transferencia Western de HeLa extractos de
protenas de clulas revel una protena de 70 kDa E1[11], que es coherente con el peso
molecular calculado a partir de la secuencia de la protena E1 de longitud completa (73,75 kDa)
y sustancialmente mayor que el peso molecular calculado de la protena correspondiente a la
transcripcin E1 ms corto (58,55 kDa). Para hacer frente a esta aparente contradiccin, nos
re-evalu el VPH-18 los patrones de expresin de genes a partir de datos de ARN-ss de un
anlisis del transcriptoma ms recientemente publicado de clulas HeLa [27]. Estos datos de
ARN-ss apoyan la expresin de una larga duracin E1 ARNm transcrito, con la advertencia de
que, efectivamente, puede haber una mayor abundancia E6-E7-E1 polycistron que contiene
una secuencia ms corta E1 (material complementario electrnico, figura S3). Esta secuencia
E1 ms corto puede ser responsable de la retencin de la previamente observada de

cofactores necesarios para iniciar la replicacin de HPV-18 en clulas HeLa[14]. Sin embargo,
a la luz de los nuevos resultados sobre la expresin E1 mRNA y los resultados anteriores sobre
E1 expresin de la protena [11], llegamos a la conclusin de que las clulas HeLa son de
hecho capaz de producir de larga duracin E1 producto proteico.

Efectos de molculas de siRNA sobre la expresin endgena HPV18-E1 y el nmero de clulas

HeLa. (Un) Seis siRNAs dirigidos a mRNA HPV18-E1 endgena (siE1.1, siE1.2, siE1.3, siE1.4,
siE1.5 y siE1.6) se transfectaron en 100 nM durante 48 h. Los mRNAs fueron sintetizados a
partir de ADNc de una sola hebra y se cuantificaron utilizando el Kit de QuantiTectTM SYBR
Green RT-PCR (Qiagen) y ABI PRISMA 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems)
segn las instrucciones de los fabricantes. GAPDH se utiliz como control interno para
normalizar los niveles de expresin de ADNc. siRNA siE1.2 y molculas siE1.6 mostraron
silenciamiento fuerte y especfica de la expresin endgena HPV18-E1 en clulas
HeLa. Adems,

el

siCONTROL

no

mostr

ningn

efecto

sobre

la

expresin

E1

endgeno. (B) En las clulas HeLa, el nmero de clulas se redujo despus de la transfeccin
de ARNsi siE1.2 y siE1.6 comparacin con las clulas HeLa sin siRNA transfeccin. (C) En las
clulas A549-VPH negativo, el nmero de clulas no mostraron ningn efecto despus de
transfecciones siRNA. Adems, la siCONTROL mostr un efecto negativo en el nmero de
clulas en ambas lneas celulares. El nmero de clulas se cuantific mediante tincin con azul
de tripano (Gibco BRL) despus de 48, 72 y 96 h. El nmero de clulas en cada pocillo se
cuantific tres veces usando un hemocitmetro (Burker-Turk profundas 1/10 mm; Erma, Tokio,
Japn). NTC, los controles sin tratamiento.
4.2. Tanto siE1.2 y siE1.6 molculas silenciados especficamente el VPH-18 E1 endgeno
expresin de mRNA en clulas HeLa
En primer lugar, HPV-18 E1 expresin de ARNm en clulas HeLa se cuantific utilizando en
tiempo real de RT-PCR (Figura 1 una). GAPDH expresin se utiliz como control interno para
normalizar E1 mRNA expresin. A continuacin, E1 expresin de ARNm se cuantific despus
de 48 h de transfeccin para cada siRNA. Como se muestra en la figura 2 una, E1 mRNA
expresin fue fuertemente suprimida por siE1.2 y siE1.6 molculas, y los efectos de siE1.1,
siE1.3, siE1.4 y siE1.5 molculas eran moderados en clulas HeLa. La transfeccin de la
molcula siCONTROL no afect a la E1 expresin del ARNm. Adems, el nmero de clulas
HeLa se redujo despus de la transfeccin de siE1.2 y siE1.6 molculas en comparacin con el
control no tratado (clulas sin siRNA transfeccin) (figura 1 b). Por el contrario, el nmero de
clulas A549 no se redujo despus de la transfeccin de siE1.2 y molculas siE1.6

siRNA (figura 1 c). La transfeccin de la molcula siCONTROL disminuy el nmero de clulas

en ambas lneas celulares.Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la transfeccin
de ambas molculas siE1.2 y siE1.6 podra silenciar E1 expresin de ARNm en clulas HeLa y
disminuir el nmero de clulas por una dcima parte.

El enriquecimiento de los genes expresados diferencialmente en cuatro conjuntos de genes

estrechamente relacionados, incluyendo tres vas cannicas y un grupo funcional: la va de
sealizacin TLR, va de sealizacin IFN, ISG antiviral y la va de la apoptosis. El nmero de
genes upregulated y downregulated en clulas HeLa silenciadas-E1 se muestran en la misma
escala que la racin de upregulated / genes downregulated y-registro normalizado p-valores
para el anlisis conjunto de enriquecimiento de genes.
4.3. Anlisis de datos de expresin identificado 2669 genes celulares expresados
diferencialmente despus de silenciar E1 ARNm endgenos en clulas HeLa
El perfil de expresin gnica celular de clulas HeLa se compar antes y despus siE1.6
transfeccin mediante el anlisis de microarrays Agilent oligonucletido humana, que contena
41 000 nicas transcripciones de genes humanos. Los datos de microarrays se normalizaron y
la calidad de los datos se evalu. A nivel mundial, 2669 genes expresados diferencialmente con
registro de 2 se identificaron 1, que comprende 1718 genes downregulated upregulated y
951. El potencial importancia biolgica de estos genes expresados diferencialmente se evalu
mediante el anlisis conjunto de enriquecimiento de genes. Tras el VPH-18 E1 silenciamiento,
encontramos un enriquecimiento significativo (p <0.05, de la prueba exacta de Fisher) de los
genes expresados diferencialmente en cuatro conjuntos de genes estrechamente relacionados,
incluyendo tres vas cannicas y un grupo funcional: el receptor de tipo Toll (TLR) va de
sealizacin , el interfern (IFN) va de sealizacin, los genes antivirales de interfernestimulado (ISG) y la va de la apoptosis (figura 2 y tabla2). Adems, la mayora de los genes
en estos conjuntos se upregulated despus de silenciamiento E1 (figuras 2 y y3).

Nuestros resultados tambin mostraron una supresin significativa de la EP300 expresin

(cambio

-2,20

veces). Por

otra

parte,

un

conjunto

como E2 (CCNE2), A2 (CCNA2) y B2(CCNB2), mostr

de

menor

genes

de

ciclina,

expresin. Otros

tales
genes

reprimidos relacionados con el ciclo celular incluyen retinoblastoma 1 (RB1), inhibidor de la

quinasa dependiente de ciclina 1B (CDKN1B), Polo-quinasa 1(Plk1), ciclo de divisin celular 25
homlogo C (Cdc25C), ciclo de divisin celular 2 (CDC2 ), miembros de la familia y Smad
2 (SMAD2) y 4 (SMAD4). Por el contrario, la CDKN1A gen mostraron una puntuacin ms alta
de

la

sobreexpresin

(modificar

2,14

veces). La

ciclina

D3 (CCND3), protenas

5-

monooxigenasa-activacin de la tirosina 3-monooxigenasa / triptfano, polipptido beta (ywhab)

y la divisin celular ciclo de 25 homlogo B (CDC25B) fueron tambin sobreexpresa. Los
resultados de microarrays de EP300 yCDKN1A expresiones fueron validados utilizando en
tiempo

real

de

RT-PCR. La

transfeccin

de

molculas

siE1.6

disminuy EP300 y

aument CDKN1A expresin, que fue consistente con los resultados de los anlisis de
microarrays (Figura4). Adems, se obtuvieron resultados similares usando siE1.2 transfeccin
molcula.
5. Discusin
Este estudio revel que el silenciamiento de los 18 VPH-E1 expresiones de ARNm endgenos
en HeLa por las molculas de siRNA inducidas cambios en la expresin de genes celulares,
especficamente con alta expresin en tres vas cannicas y un grupo funcional: la va de

sealizacin de TLR, el IFN va de sealizacin , el ISG antiviral y la va apopttica

(figuras 2 y y3).

Targeting la va de sealizacin de TLR en la aclaracin de los mecanismos celulares y

moleculares de cncer de cuello uterino se ha ganado una gran importancia [32]. TLR-4 se
sobreexpresa en el cncer de cuello uterino, y su activacin por LPS promueve la proliferacin
y anti-apoptosis en clulas HeLa in vitro[33]. Sin embargo, los miembros del factor regulador de
interfern (IRF) de la familia de factores de transcripcin de unin al ADN han jugado un papel
en la regulacin del crecimiento, las respuestas antivirales y la induccin transcripcional de
activado-IFN genes tempranos de respuesta [34] y mediadores crticos de la induccin de
principios viral la transcripcin y replicacin en varios virus del papiloma humano de la mucosa,
que

requieren

IRF-1

de

unin

un

elemento

de

respuesta

de

interfern

conservadas [35].Infecciones por VPH alteran la expresin de citoquinas y la sealizacin con

las oncoprotenas E6 y E7, y en particular se dirigen a la va de IFN de tipo I [36]. Sin embargo,
el mecanismo exacto en el que los actos complejos IFN sobre los tumores sigue siendo
desconocida, aunque su uso en la prctica clnica ha sido ampliamente recomendado,
especialmente en tumores que son resistentes a los tratamientos convencionales[37]. El TLRs
pertenecen a la familia de receptores de reconocimiento de patrones asociado a patgenos
(PRR). Tras la infeccin viral, TLRs puede detectar patrones moleculares especficos en los
virus y activar los FIR, lo que resulta en la induccin transcripcional de IFN. Activado por la va
de sealizacin de TLR, IFNs seal a travs de la va JAK / STAT para inducir la produccin de
ISGs. La activacin de la va de sealizacin de IFN resulta directamente en la produccin de
ISGs. Varios ISGs funcionan para bloquear la replicacin del virus, tales como IFIT1. Otros
ISGs upregulated, tales como EIF2AK2, que codifica la dsRNA dependiente de la protena
quinasa R, pueden iniciar una respuesta antiviral adicional en la clula husped, que finalmente
resulta en la apoptosis. La muerte celular es un componente esencial de la maquinaria de la
clula husped inmune. Puede ser inducida por ISGs especficos. Nuestros datos de expresin
indicaron que la va apopttica podra ser suprimida antes de silenciamiento de la protena E1
viral.
Cmo puede el VPH-18 E1 expresin afecta a un gran nmero de genes? Mientras que las
clulas HeLa son capaces de producir protenas E1 de longitud completa, el producto
dominante puede ser el observado previamente E6-E7-E1 polycistron que codifica una protena
truncada E1 (material complementario electrnico, figura S3). Esta protena ms corta HeLa
derivada de clulas HPV-18 E1 se trunca en el carboxilo terminal, pero todava conserva
dominios de unin a protenas terminales carboxilo que puede asociarse con factores celulares
husped, tales como la ciclina E / CDK2 [14] y Ini1 / hSNF5, una subunidad de la cromatina
SWI / SNF remodelacin compleja [23]. El reclutamiento del complejo SWI / SNF por E1 puede
alterar la disposicin local de factores de transcripcin, factores de replicacin y las
histonas. Este reordenamiento puede reprogramar el estado de la transcripcin y replicacin
del ADN. Tambin se encontr una regulacin a la baja de la transcripcin y traduccin de
EP300 (figura 4), una histona acetiltransferasa que regula epigenetically remodelacin de la
cromatina a travs de la acetilacin de histonas, que permite el acceso a varios factores de
transcripcin, activando con ello la expresin de genes [38]. Sin embargo, el mecanismo de
regulacin de EP300 expresin no se entiende bien. De acuerdo con un informe de Yu et al.
[39], la respuesta de crecimiento temprano 1 (Egr-1), que se une a los elementos ricos en GC
en los promotores, acta aguas arriba de p300 / CBP. Egr-1, un factor de transcripcin de dedo
de zinc, se acumula en el ncleo de la clula tras la estimulacin por mitgenos y una variedad
de citoquinas, as como los efectos extracelulares, incluyendo la hipoxia y la 17--

estradiol [40, 41]. Recientemente,

Saegusa et al. [42] inform

de

que EP300 la

expresin

gnica est regulada positivamente por Egr-1 de unin a la regin promotora delEP300 de
genes en clulas de carcinoma de endometrio. Aunque no hubo evidencia de Egr-1 regulacin
por protenas del VPH-codificada, los niveles de mRNA de Egr-1 en el cncer cervical fueron
significativamente mayor en comparacin con el tejido normal [43]. En este estudio, se observ
una disminucin de Egr-1 de expresin despus de la silenciamiento de HPV-18 E1 ARNm, lo
que sugiere que Egr-1 puede ser estimulada por E1. Sin embargo, el voto negativo de EP300
de

Egr-1

de

expresin

se

sugiri [treinta y

nueve- cuarenta

y dos]. Por

otra

parte,

Bouallaga et al. [44] inform de que EP300 es reclutado por el VPH-18 enhanceosome y se
requiere para la transcripcin HPV18 en clulas HeLa. Adems, el techo confluencia celular
durante los experimentos siRNA antes de la recoleccin fue de al menos 50%, y en los cultivos
de control fue casi 90%. Lo anterior es importante porque demuestra que el cambio en la
expresin de genes del ciclo celular como RB1, Cdc25C, CDC2 y CDKN1A tiene la
consecuencia de que la proliferacin celular es detenido.
Una pregunta importante es si el siRNA dirigidos de E1 tambin afecta a la estabilidad (y por lo
tanto la expresin) de los E1-E6-E7 ARNm policistrnicos. Para hacer frente a este punto, se
realizaron otros dos anlisis qPCR. Evaluamos cuidadosamente tanto E6 y E7 expresin de
mRNA despus de los tratamientos siRNA en clulas HeLa, y no encontramos ningn efecto
significativo en la expresin de E6 y E7 despus del tratamiento con siRNAs. Nuestra
explicacin para estos resultados se basa en el hecho de que el proceso de maduracin de E1E6-E7 mRNAs

policistrnicos

se

produce

en

el

ncleo,

luego

cada

una

de

ellas (E1,E6 y E7 mRNAs) se exportan al citosol. Por otro lado, muchos estudios han
demostrado que el proceso de la inhibicin de siRNA se lleva a cabo principalmente en el
citosol. Por lo tanto, consideramos que haya pocas posibilidades de que el siRNA dirigidos
de E1 puede afectar a la estabilidad y la expresin de los E1-E6-E7ARNm policistrnicos, ya
que pueden estar en diferentes lugares de la clula.

Genes expresados diferencialmente en los cuatro conjuntos de genes

enriquecido siguientes E1 silenciamiento. Log 2 veces cambiar los valores de
expresin de genes entre las condiciones son de color como se muestra en
la tecla.

EP300 regulacin a la baja despus de silenciamiento del VPH-18 E1. La

confirmacin de los datos micro-array utilizando en tiempo real RTPCR. Niveles de transcripcin de EP300 y CDKN1Ase cuantificaron utilizando.
RT-PCR EP300 y CDKN1A expresiones de genes se vieron afectados despus
siE1.6 y siE1.2 transfecciones, a 100 nM durante 48 h, pero no despus de
siCONTROL
transfeccin. Disminucin EP300 y
el
aumento
de CDKN1A expresin fueron consistentes con los resultados obtenidos del
anlisis de microarrays. Las expresiones logartmicas relativas se
normalizaron contra el control sin tratamiento (NTC). GAPDH se utiliz21
como control del gen de referencia.

Esquemtica de los mecanismos por los que la protena E1 viral puede

mitigar la capacidad del husped para defenderse contra la infeccin
viral. E1 expresin de la protena induce represores transcripcionales que
regulan negativamente de forma coordinada la actividad de las vas
implicadas tanto en la deteccin de la infeccin viral y la iniciacin de
respuestas inmunes a la infeccin, incluyendo la apoptosis. E1 expresin de
la protena induce activadores de la transcripcin que participan en la
replicacin viral.
6. Conclusin
Tomados en conjunto, nuestros datos indican un patrn de supresin consistente en el nivel
transcripcional inducido por el HPV-18 E1 protena a travs de cuatro componentes
intensamente colaboradoras de la maquinaria inmune de la clula husped (Figura5), lo que
sugiere que, adems de su papel bien entendido en viral replicacin, la protena E1 viral
tambin puede jugar un papel importante en la mitigacin de la capacidad del anfitrin para
defenderse de la infeccin.