Universidad Nacional Autnoma de Mxico

Facultad de Estudios Superiores Cuautitln

Qumica
Bioqumica Metablica
Grupo: 1701

Reporte de la prctica No. 5 Cuantificacin de

colesterol en suero sanguneo

Equipo No. 8
Chvez Ramos Kenia
Hernndez Garca Luis Alberto
Len Len Donaldo Gamaliel

Fecha de realizacin de la prctica: 22 de octubre de

2012
Fecha de entrega del reporte: 29 de octubre de 2012
Asesoras:
Q. Karla Hernndez Prez
QFB Jessica Filisola Villaseor

INTRODUCCIN.
El colesterol es un lpido y pertenece al grupo de los esteroides, su frmula
molecular es C27H46O, presenta como estructura bsica al ciclopentano
perhidrofenantreno, sustituido por dos grupos metilo, un OH y una cadena lateral
en el carbono 17, tiene adems una doble ligadura.
Es un compuesto poco soluble en agua (0.2mg/100mL), pero soluble en solventes
como ter, cloroformo, benceno, etc. Se desplaza por la sangre mediante unas
molculas denominadas lipoprotenas. Principalmente se reconocen dos tipos de
lipoprotenas:
1.- Las lipoprotenas de baja densidad (LDL) o colesterol malo; se cree que
causan enfermedades arteriales. Las LDL transportan el colesterol desde el
hgado a las clulas y pueden causar una acumulacin nociva si hay ms de lo
que las clulas pueden usar.
2.- Las lipoprotenas de alta densidad (HDL) o colesterol bueno; se cree que
previenen las enfermedades arteriales. Las HDL se llevan el colesterol de las
clulas y lo devuelven al hgado donde se descompone y se elimina como residuo
corporal.

Figura 1. Estructura del colesterol

El colesterol es de gran importancia desde un enfoque bioqumico, ya que es
precursor de sales biliares, la vitamina D, de las hormonas esteroides que
controlan las caractersticas sexuales, adems se encuentra presente en la
membrana plasmtica (capa exterior) de todas las clulas del organismo
modulando la fluidez.
Se sintetiza en diversos tejidos a partir de acetil CoA y es eliminado del cuerpo
en la bilis, como colesterol o como sales biliares. Su sntesis se puede resumir en
los siguientes pasos:
1. Tres molculas de acetil-CoA se combinan entre s formando mevalonato, el
cual es fosforilado a 3-fosfomevalonato 5-pirofosfato.
2. El 3-fosfomevalonato-5-pirofosfato es descarboxilado y desfosforilado a
isopentilpirofosfato.

3-

3. Ensamblaje sucesivo de seis molculas de isopentil pirofosfato para

originar escualeno.
4. Ciclacin del escualeno a lanosterol.
5. El lanosterol se convierte en colesterol despus de numerosas reacciones
sucesivas, enzimticamente catalizadas, que implican la eliminacin de tres
grupos metilo, el desplazamiento de un doble enlace y reduccin del doble
enlace de la cadena lateral.
Los niveles de colesterol en sangre se relacionan directamente con el sexo, la
edad, el peso, la dieta y el ejercicio. De acuerdo a la edad, los niveles normales
de colesterol en sangre son los siguientes:

Hasta 30 aos: 120-215 mg/dL

30 a 39 aos: 135-240 mg/dL
40 a 49 aos: 140-280 mg/dL
Mayor de 50 aos: 145-295 mg/dL

Algunos factores relacionados con el estilo de vida pueden aumentar la

probabilidad de tener colesterol alto. Por ejemplo: una alimentacin poco
saludable que contiene muchas grasas saturadas, la falta de ejercicio fsico, ser
obeso, fumar y beber grandes cantidades de alcohol. Los alimentos con alto
contenido de grasas saturadas son: carne roja, salchichas, quesos curados,
manteca, masa pastelera, pasteles y galletas. El colesterol alto est relacionado
con enfermedades graves, como las cardiopatas, la angina de pecho y los
accidentes cerebrovasculares.
Normalmente, se hace un anlisis sanguneo para medir el nivel de colesterol, las
tcnicas de determinacin de colesterol se basan en la reaccin de Liebermann
Burchard (mezcla cida de cido sulfrico, anhdrido actico, cido actico y
sulfato de sodio) en la que se produce un complejo colorido que se cuantifica a
620 nm.

OBJETIVO:

Cuantificar colesterol en una muestra de suero sanguneo a travs del

mtodo de Liebermann Burchard con el fin de comparar el resultado con
los niveles normales de colesterol en sangre.

DIAGRAMA ECOLGICO:
Cuantificacin de colesterol en
suero sanguneo
Preparacin de la muestra
Tomar la muestra de sangre con ayuda del
sistema vacutainer

Colocar en un bao mara durante 10 min a 37C

y posteriormente centrifugar a 2500 rpm durante
10 min
Se separa el sobrenadante (suero) que es de color
amarillo plido.

R1

Cuantificacin de colesterol
Preparar al mismo tiempo la serie de tubos (en
material limpio y seco) para la curva estndar y
problema de acuerdo a la tabla de la pgina 59
del manual de bioqumica metablica.

Medicin de
absorbancia

Agitar vigorosamente cada uno de los tubos,

retirar los tubos del agua y dejar reposar durante
20 min
Leer la absorbancia y la transmitancia de cada
uno de los tubos a 620 nm utilizando el tubo 1
como blanco de reactivos

Manual
reporte
R2

Realizar el grfico de Absorbancia vs

concentracin en mg/100mL as como utilizando la
transmitancia. Interpolar en la grfica respectiva
el valor de absorbancia o transmitancia y obtener
la concentracin problema.
R1- Coagulo sanguneo se trata de un residuo biolgico, se le adiciona el doble de
volumen de cloro y se vierte a la tarja, no tiene ningn impacto nocivo en el
medio ambiente.
R2- Residuos de reactivo de Liebermann-Burchard

cido actico: Neutralizar con carbonato de sodio; mezclar con solvente

inflamable y quemar en incinerador con doble cmara.
cido p-toluensulfnico: Lavar con abundante agua y despus neutralizar
las aguas con una base dbil.
Anhdrido actico: Incinerar el material absorbido o los lquidos residuales
en incinerador de doble cmara.
cido sulfrico: Neutralizar la sustancia con carbonato de sodio y desechar
a la alcantarilla. La incineracin qumica en incinerador de doble cmara
de combustin, con dispositivo para tratamiento de gases de chimenea, es
otra alternativa.

METODOLOGIA:

La indicada en el manual de Bioqumica, correspondiente a la prctica No.

5, pginas 59 y 60. Se realizaron algunas modificaciones: no se dej
coagular durante 15-30 min la sangre ni se retir del tubo, en su lugar se
coloc en un bao mara a 37C durante 10 min, de la misma manera se

realiz la centrifugacin en el tubo del vacutainer en lugar de tubos de

centrifuga.
OBERVACIONES Y RESULTADOS:
Despus de centrifugar, la pastilla presentaba una coloracin roja que
perteneca al coagulo de sangre, mientras el sobrenadante (suero
sanguneo) present una coloracin amarilla plida.

Figura 2. Separacin del suero sanguneo

Cuando se termin de preparar la serie de tubos, en la muestra problema
se apreci un precipitado blanco, mientras que los tubos 5 y 7 adquirieron
una coloracin ligeramente azul. Despus de agitar vigorosamente el
precipitado desapareci. Transcurridos los 20 min todos los tubos
adquirieron una coloracin azul verdosa que se intensificaba del tubo 1 al
8.

Figura 3. Serie de tubos antes de transcurrir 20 min

Los resultados de absorbancia se localizan en la siguiente tabla.
Tabla 1. Resultados de absorbancia para curva estndar y problema
(=620 nm)
Tubo No.
1

[Colesterol] (mg/100mL)
-

Absorbancia
-

Transmitancia
-

2
3
4
5
6
7
8
P

1.25
2.5
3.75
5
6.25
10
12.5

0.013
0.034
0.084
0.120
0.148
0.223
0.298
0.118

96.9
92.5
82.4
75.7
71.1
59.7
50.3
76.0

CLCULOS Y GRFICOS.
Primeramente se calculara la concentracin de colesterol estndar en cada uno
de los tubos considerando que se parte de una solucin estndar de 100 mg/100
mL (100% p/v), por lo tanto el clculo se realizo empleando la siguiente ecuacin:

[ Colesterol ] tubo=

[ Colesterol ] STDV aadido

V total

Considerando los volmenes requeridos por la metodologa empleada y con el fin

de ejemplificar este clculo, se realizara este para el tubo 2 reportndose los
datos para cada tubo en la tabla 1 del apartado de resultados.

[ Colesterol ] tubo=

100 p/ v0.1 mL
=1.25 p /v 1.25 mg/100 mL
8 mL

Graficando los valores de absorbancia en funcin de la concentracin (tabla 1),

as como los valores de transmitancia vs concentracin se obtienen los siguientes
grficos, a cada uno se le aplico un ajuste por mnimos cuadrados obtenindose
una ecuacin de lnea recta reportada en los mismo graficos.
0.3

f(x) = 0.02x - 0.02

R = 0.99

0.25
0.2
0.15
A
0.1
0.05
0
0
-0.05

10 11 12 13

[Colesterol] (mg/100mL)

Grafico 1. Absorbancia en funcin de la Concentracin de colesterol en suero

sanguneo.

100
90

f(x) = - 4.09x + 99.59

R = 0.97

80
70
60
T

50
40
30
20
10
0
0

10

11

12

13

[Colesterol] (mg/100mL)

Grafico 2. Transmitancia en funcin de la Concentracin de colesterol en suero

sanguneo.
ANLISIS DE RESULTADOS:
El colesterol tiene la capacidad de reaccionar con diversos cidos fuertes tanto
de Brnsted como de Lewis para formar productos coloridos, este tipo de
reacciones han sido empleadas durante aos para la determinacin de colesterol
de manera cuantitativa y cualitativa. Una de las tcnicas ms ampliamente
utilizadas es la reaccin de Liebermann Burchard, esta es una prueba
colorimtrica con la cual se puede determinar colesterol empleando una mezcla
cida compuesta de cido actico, cido sulfrico y anhdrido actico, lo que da
un color de verde claro a verde intenso. El color se debe a que el grupo hidroxilo
(-OH) del colesterol reacciona con los reactivos y existe un aumento en la
conjugacin de la saturacin del anillo fusionado.
El mecanismo propuesto para esta reaccin es el siguiente:

Figura 4. Mecanismo propuesto para la reaccin de Liebermann Burchard.

De manera simplificada, la reaccin que sufre el grupo hidroxilo y el aumento en
la conjugacin del anillo es la siguiente:

Figura 5. Reaccin del grupo hidroxilo y aumento en la conjugacin del anillo

fusionado con el reactivo de Liebermann Burchard.
Aki vean si se ponen la figura 4 y 5 o solo una vale!!
El anillo formado es el precursor de la formacin del color el cual con anhdrido
actico y cido sulfrico se forma el cromoforo (catin penta enolico) que
propicia la coloracin azul-verdosa de los sistemas y a los cuales se les midi la
absorbancia.

Ahora bien, se calculara la concentracin de colesterol presente en el suero

sanguneo empleando la ecuacin de lnea recta de cada uno de los grficos
(grafico 1 y 2). Primeramente se realizara utilizando la obtenida en el grafico de
absorbancia en funcin de la concentracin (grfico 1), la cual es:

A=0.025 [ Colesterol ] 0.0157 R 2=0.9919

De acuerdo al valor de Absorbancia obtenido experimentalmente para la muestra
problema (suero sanguneo), cuyo valor es igual a 0.118, reportado en la tabla 1
de resultados; despejando la concentracin de colesterol y sustituyendo el valor
de absorbancia, se tiene:

[ Colesterol ] =

A +0.0157 0.118+ 0.0157

=
=5.348 mg/100 mL
0.025
0.025

Como se observa este valor es mal alto de lo esperado, ya que de acuerdo a la

tabla 1, para el sistema 5 se tiene un valor absorbancia de 0.120 a una
concentracin de 5 mg/100 mL, por lo tanto era de esperarse una concentracin
para la muestra problema un tanto menor a dicho valor y de acuerdo al clculo,
esto no es as. Esto se puede deber a que no se observa la linealidad esperada en
el grafico a pesar de contar con un valor de r 2 cercano a la unidad.
Retomando el clculo de la concentracin de colesterol en el suero, se toma en
cuenta que esto proviene de tomar 0.2 mL del suero y se diluyeron en 8 mL, por
lo tanto se tiene:

[ Colesterol ] =

5.348 p /v8 mL
=213.92 mg/ 100 mL 213.92 mg/dL
0.2 mL

Ahora, empleando una interpolacin del valor de absorbancia en el

correspondiente grafico (grafico 1) se obtuvo un valor de concentracin de 4.95
mg/100 mL, este valor cumple con lo esperado de una menor concentracin de
acuerdo a los valores de absorbancia en el tubo problema y el tubo 5, empleando
el valor por interpolacin se calculara la concentracin de colesterol en la
muestra de la siguiente manera:

[ Colesterol ] =

4.95 p/ v8 mL
=198 mg/100 mL 198 mg/dL
0.2 mL

Por otro lado, empleando la ecuacin de lnea recta del grafico de transmitancia
en funcin de la concentracin (grfico 2), la cual es:
2

T =4.0861 [ Colesterol ] + 99.593 R =0.9741

El valor de transmitancia experimental para la muestra problema es de 76,

reportado en la tabla 1, despejando la concentracin de colesterol y sustituyendo
el valor de transmitancia, se tiene:

[ Colesterol ] =

T 99.593 7699.593
=
=5.774 mg/100 mL
4.0861
4.0861

Como se observa, este valor es muy parecido al valor obtenido empleando la

ecuacin del grafico 1, pero a diferencia del valor anterior y de acuerdo tubo 5 el
cual presenta un valor de transmitancia de 75.7 a una concentracin de
5mg/100mL, se esperaba que el valor de concentracin para la muestra
problema de fuera mayor debido a una mayor transmitancia, el valor calculado
cumple con esto.
Considerando que esta concentracin proviene de tomar 0.2 mL de suero y
diluyendo en 8 mL, se tiene:

[ Colesterol ] =

5.774 p/ v8 mL
=230.96 mg/100 mL 230.96 mg/dL
0.2 mL

Ahora, empleando una interpolacin del valor de transmitancia en el

correspondiente grafico (grafico 2) se obtuvo un valor de concentracin de 5.05
mg/100 mL, un tanto diferente al valor de calculado de 5.775 mg /100 mL pero
ambos de mayor concentracin con respecto al tubo 5, empleando el valor por
interpolacin se calculara la concentracin de colesterol en la muestra de la
siguiente manera:

[ Colesterol ] =

5.05 p /v8 mL
=202 mg/100 mL 202 mg/dL
0.2 mL

A manera de resumen, se realizo la siguiente tabla para poder comparar los

valores de concentracin de colesterol en la muestra calculados por interpolacin
y empleando la ecuacin de la recta, as como absorbancia y transmitancia.
Tabla 2. Datos de concentracin de colesterol para cada uno de los mtodos
empleados.
Mtodo
Ecuacin de
Recta
Absorbancia
Transmitancia
Interpolacin
Absorbancia
Interpolacin

[Colesterol]
(mg/dL)

213.92
230.96
198
202

Primeramente, se descartara el valor obtenido por interpolacin del valor de

transmitancia o absorbancia en cada uno de los grficos ya que los datos
graficados no proporcionan una correcta lnea recta a pesar de tener valor de R 2
prximos a la unidad ya que como se observa en cada uno de ellos, se observan
ligeras inflexiones. As que se trabajara con los valores calculados mediante la
ecuacin de la lnea recta.
Los valores de concentracin de colesterol obtenidos, son ligeramente parecidos
entre s pero con el fin de corroborar el mtodo adecuado, transmitancia o
absorbancia, se compara con el resultado obtenido en un anlisis clnico
efectuado en el CUD, cuyo valor reportado para el paciente Donaldo Len fue de
202 mg/dL (dicho anlisis se anexara al final), por lo tanto se puede concluir que
el valor ms prximo al reportado en dicho anlisis, es el calculado empleando
medidas de absorbancia y la correspondiente ecuacin de lnea recta. Le saco
copia al analisis y se los doy el lunes vale
Por ltimo, el paciente Donaldo Len de 21 aos de edad presenta niveles de
colesterol alto, ya que el intervalo de acuerdo a la edad y sexo del paciente es de
120 a 215 mg/dL (reportado en la literatura 2) o menor a 200 mg/dL de acuerdo a
la referencia del anlisis reportado por el CUD, as que es recomendable que el
paciente tome medidas preventivas ya que es buen momento para hacerlo y as
evitar posibles enfermedades aun mayores.
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
1. BURKE, R.W. Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak Color
Reactions for Cholesterol [en lnea]. Recuperado el 26 de octubre de
2012, de http://www.clinchem.org/content/20/7/794.full.pdf
2. Perfil lipdico. [en lnea]. Recuperado el 26 de octubre de
http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioquimicabiolmol/pdfs/25%20
PERFIL%20LIP%C3%8DDICO.pdf
3. El colesterol. [en lnea]. Recuperado el 26 de octubre de 2012, de
http://www.nhs.uk/translationspanish/Documents/Cholesterol_Spanish_FINA
L.pdf
4. ABC de la salud. Colesterol. [en lnea]. Recuperado el 26 de octubre de
2012, de http://www.abcdelasalud.net/261/cardiologia/colesterol/