Tcnicas electroforticas

Electroforesis de cidos nucleicos (secuenciacin)

Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en funcin de su tamao,
visualizarlos mediante una sencilla tincin, y de esta forma determinar el contenido de cidos
nucleicos de una muestra, teniendo una estimacin de su concentracin y grado de entereza.
Podemos adems extraer del gel los fragmentos de ADN que sean de inters, para
posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.
La electroforesis en geles de agarosa es el mtodo estndar para separar y purificar fragmentos
de ADN cuando no requerimos un alto poder de resolucin. Por su parte, la electroforesis en
geles de poliacrilamida, aunque tiene una mayor limitacin en cuanto al tamao de los
fragmentos que podemos separar (5-600 pb), posee un poder de resolucin mucho mayor.
-gel de agarosa: para molculas grandes (100 pb a 60000 pb, que en realidad es hasta 30000
pb). Se hace horizontal.
-gel de poliacrilamida: molculas pequeas(6 a 2000 pb). Se hace vertical. Permite ver cada 1
base.
Pulse fiel : Electroforesis de campo cruzado Para separar DNA cromosmico (millones pares
de bases). Como hay mucha masa se deforman los fragmentos puestos en el gel siendo intil su
visualizacin. Entonces se utiliza esta tcnica, donde el campo tiene 24 electrodos (no dos como
la electroforesis bsica) y un microprocesador que va cambiando la direccin de carga entre los
electrodos.
Gel shift: retraso en gel el ensayo de cambio en la corrida electrofortica o EMSA por sus
iniciales en ingls (electrophoretic mobility shift assay) es una tcnica utilizada para investigar
interacciones entre protenas y ADN o ARN. La tcnica se basa en una corrida
electrofortica entre fragmentos de DNA o RNA marcados y la presencia de extractos celulares.
El ensayo bsico para el ADN consiste en un carril solo con el fragmento de ADN de inters
marcado, un segundo carril con el mismo ADN ms protenas que, en las condiciones dadas, no
interaccionan con el mismo, y el tercer carril conteniendo el mismo fragmento de ADN ms las
protenas con supuesta interaccin con esa secuencia. Dependiendo del resultado del tercer
carril se puede determinar si existi o no interaccin. Un fragmento de ADN interaccionando con
protenas tiende a recorrer menos distancia a travs del gel en el mismo tiempo que en los
carriles 1 o 2, y por lo tanto se debera ver retrasado.
Hibridacin de cidos nucleicos:
La hibridacin es la construccin artificial de cidos nucleicos bicatenarios a partir de dos
monocatenarios usando la complementariedad de bases.
Cuando una solucin de DNA que ha sido calentada se enfra lentamente se produce la
rehibridacin dando lugar a la estructura inicial. Tal reasociacin ocurre slo si las secuencias de
bases son complementarias. Por lo tanto, la hibridacin permite la formacin de complejos
bicatenarios no naturales de DNA:DNA y ADN:ARN.
Este es un mtodo muy verstil que permite estudiar el grado de relacin gentica entre dos
cidos nucleicos. Tambin permite la deteccin de fragmentos de DNA que son complementarios
a fragmentos monocatenarios de secuencia conocida (sondas). Por ejemplo, se puede utilizar

una sonda radioactiva para saber si en una mezcla desconocida existe algn fragmento
complementario a la sonda. Para ello se usan membranas de nitrato de celulosa o de niln.
Sondas de hibridacin
Con los conocimientos que existen de los genomas de los organismos, cada vez es ms sencillo
generar pequeos fragmentos de DNA (oligonucletidos) que sean complementarios de regiones
que nos interesan, por ejemplo de genes especficos de una especie bacteriana. De esta forma,
si en una muestra problema se produce la hibridacin entre el oligonucletido y el DNA presente
en la muestra, se puede concluir que la bacteria de inters estaba presente en esa muestra. A
estos fragmentos de DNA se les denomina sondas.
Marcaje de los cidos nucleicos. (sondas)
La radioactividad se usa en la investigacin de cidos nucleicos porque puede ser detectada en
cantidades muy pequeas. Los cidos nucleicos radioactivos pueden detectarse directamente en
un contador de radioactividad o bien indirectamente sobre una placa fotogrfica
(autoradiografa).
Un cido nucleico puede hacerse radioactivo simplemente por la adicin de fosfato radioactivo
(fsforo 32) durante su sntesis. As, si se aade fosfato radioactivo al medio de cultivo cuando
est teniendo lugar la sntesis de DNA, el nuevo DNA ser radioactivo.
32P3 -------> 32P-nucletido -------> 32P-cido nucleico
Alternativamente, se puede marcar radioactivamente el extremo 5' de una cadena de DNA
usando ATP radioactivo marcado en el tercer fosfato.
El enzima polinucletido quinasa quita especficamente el tercer fosfato del ATP y lo une al grupo
hidroxilo 5' del ADN (El fosfato 5 ' es quitado por un fosfatasa).
32P -P-P-adenosina + HO-desoxiribosa-DNA -------> ADP + 32P -O-desoxiribosa-DNA
Actualmente existen diversas alternativas no radiactivas para marcar las sondas, como puede
ser el uso de enzimas (peroxidasa o fosfatasa, que llevan a cabo una reaccin detectable),
marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que se van a unir posteriormente a otra
molcula) o molculas quimioluminiscentes (que producen luz y puede excitar una pelcula
fotogrfica).
La molcula marcadora se puede incorporar a la sonda mediante distintas tcnicas:
-Unin al azar ("random priming"). Consiste en copiar un fragmento de DNA utilizando una DNA
polimerasa y aadiendo a la reaccin algunos nucletidos marcados; se incorpora un nucletido
marcado cada 20-25 bases.
-Marcado por relleno ("nick translation"). Se realizan cortes enzimticos ("nicks") en el DNA y
despus se reparan con una DNA polimerasa utilizando nucletidos marcados.
-Marcado en 3'. Se aade un nico nucletido marcado en el extremo 3' empleando una
transferasa terminal.
-Marcado extendido en 3' ("3' tailing"). Similar a la tcnica anterior, pero se aade una cadena
sencilla de 10-50 bases en el extremo 3'.

-Marcado en 5'. Se pueden marcar las sondas en el extremo 5' durante su sntesis qumica.
-Marcado de RNA. Se usan una RNA polimerasa y nucletidos marcados para que se transcriba
un fragmento de DNA, dando lugar a un RNA marcado.
-Marcado por PCR. Se lleva a cabo una PCR (ver ms adelante) empleando nucletidos marcados
para amplificar un fragmento de DNA.
-Marcado por fotoactivacin. Se une un marcador covalentemente al DNA mediante exposicin a
la luz UV.

Concepto de Tm y cot
La temperatura de fusin: Tm
Cuando la temperatura alcanza el punto de fusin del ADN, la agitacin trmica es capaz de
separar las dos hebras y producir una desnaturalizacin. Este es un proceso reversible, ya que al
bajar la temperatura se puede producir una renaturalizacin. En ste proceso se rompen los
puentes de hidrgeno que unen las cadenas y se produce la separacin de las mismas, pero no
se rompen los enlaces fosfodister covalentes que forman la secuencia de la cadena.
Las molculas bicatenarias absorben menos que las monocatenarias en el ultravioleta. Por tanto,
si se va observando la absorcin a medida que se calienta un ADN bicatenario, el incremento en
absorbancia cuando el ADN bicatenario se convierte en monocatenario nos indicar la
temperatura de fusin (Tm; del ingls melting temperature). Tm, est en funcin del contenido
en GC del ADN en cuestin, ya que los pares de bases GC se unen por 3 puentes de hidrgeno,
mientras que AT slo por dos. Cuanto mayor sea el contenido en GC mayor ser la temperatura
de fusin. Si el ADN calentado se enfra lentamente, la doble cadena vuelve a formarse (el ADN
se renaturaliza). Esto permite realizar hibridaciones con cadenas de DNA procedentes de fuentes
distintas.
Curvas Cot: sirven para estimar la complejidad de los genomas. Se entiende por complejidad a
la composicin, con respecto a la frecuencia de secuencias de ADN repetitivas. La tcnica se
basa en el calentamiento y post enfriado de la hebras de adn. Durante este proceso la doble
hlice se separa al alcanzar una determinada Tm. Al enfriarse se vuelven a unir. La velocidad con
la que esto ocurra, se relaciona con la mayor o menor complejidad de la secuencia.
TRANSFERENCIA (BLOTTING)
La tcnica de transferencia (blotting) se basa en el mismo fundamento que la autorradiografa, y
permite identificar la presencia de una banda concreta en un gel de electroforesis, bien sea de protenas o
de cidos nucleicos:

Si se trata de DNA, la tcnica se llama Southern blot. Se utilizan sondas de DNA (molculas de
DNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del
gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda. Es una tcnica empleada para
detectar secuencias especficas de ADN. Para llevar a cabo hibridaciones de este tipo, se asla el
ADN de un tejido o lnea celular, luego se purifica, y se digiere con enzimas de restriccin
especficas. Los fragmentos generados se separan mediante electroforesis y despus son
transferidos a la membrana que sirve de soporte (gel de agarosa). Este proceso se lleva a cabo
colocando el gel de agarosa sobre papel filtro previamente remojado en una solucin llamada de

transferencia (solucin salina concentrada). A continuacin se sita la membrana sobre el gel y

encima de esta una pila de papel filtro seca, y por capilaridad la solucin de transferencia es
atrada a la pila de papel filtro, arrastrando consigo al ADN hacia la membrana, donde queda
inmovilizado conservando la misma posicin relativa que ocupaba en el gel. Luego, el ADN puede
ser hibridado en la membrana con una sonda.

Si se trata de RNA, la tcnica se llama Northern blot. Se utilizan sondas de RNA (molculas de
RNA marcadas con radioactividad y con una secuencia conocida) para identificar qu bandas del
gel contienen secuencias complementarias a la de la sonda

Si se trata de protenas, la tcnica se llama Western blot. Se utilizan anticuerpos marcados con
radioactividad para identificar cul es la banda que presenta la protena que me interesa localizar.

Dot blot y slot blot: Son procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es
sometido a electroforesis sino que se sita directamente sobre la membrana. Este tipo de anlisis
requiere de un molde asociado a succin con vaco para colocar el ARN que puede producir crculos
o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este tipo de prueba es muy til cuando se quieren
estudiar gran nmero de muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer informacin sobre el
tamao de las bandas del ARN hibridado
MTODOS CLSICOS DE SECUENCIACIN
Los dos protocolos clsicos de secuenciacin (mtodo qumico y enzimtico) comparten etapas
comunes.
Pasos: marcaje, tratamiento (secuenciar, fragmentos que se cortan dependiendo de las bases),
ruptura, separacin, visualizacin y anlisis.

Marcado: Es necesario marcar las molculas a secuenciar radiactiva o fluorescentemente

Separacin: Cada protocolo genera una serie de cadenas sencillas de ADN marcadas cuyos
tamaos se diferencian en una nica base. Estas cadenas de distintas longitudes pueden separarse
por electroforesis en geles desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida-urea, donde aparecen
como una escalera de bandas cuya longitud vara en un nico nucletido.
Para obtener estas cadenas se emplean dos procedimientos:

Mtodo qumico de Maxam y Gilbert

Esta tcnica consiste en romper cadenas de ADN de cadena sencilla marcadas radiactivamente con
reacciones qumicas especficas para cada una de las cuatro bases. Los productos de estas cuatro
reacciones se resuelven, por electroforsis, en funcin de su tamao en geles de poliacrilamida
donde la secuencia puede leerse en base al patrn de bandas radiactivas obtenidas. Solo se usa
con ADN simple cadena. No se puede secuenciar con RNA.

Mtodo enzimtico de Sanger

Este mtodo de secuenciacin de ADN fue diseado por Sanger, Nicklen y Coulson tambin en 1977
y se conoce como mtodo de los terminadores de cadena o didesoxi.
Para este mtodo resulta esencial disponer de un ADN de cadena simple (molde) y un
iniciador, cebador (se puede marcar o no) o "primer" complementario de una regin del ADN molde

anterior a donde va a iniciarse la secuencia. Este cebador se utiliza como sustrato de la enzima
ADN polimerasa I que va a extender la cadena copiando de forma complementaria el molde de
ADN. Se necesitan 4 tubos con A C G T y el deoxinucleotido trifosfato marcado con florocromo.

SECUENCIACIN AUTOMTICA EMPLEANDO EL METODO ENZIMTICO

Es una alternativa al mtodo de Sanger. Consiste en marcar el oligo cebador o los terminadores con
un compuesto fluorescente y activar la reaccin de secuencia. Los productos de la reaccin se
detectan directamente durante la electroforsis al pasar por delante de un lser que al excitar los
fluorforos permite detectar la fluorescencia emitida.

Secuenciacin empleando cebadores fluorescentes

Se realizan cuatro reacciones de secuencia distintas en cada una de las cuales se aade el
oligonucletido o cebador marcado con una sonda fluorescente distinta y un ddNTP diferente en
cada una de ellas. Al finalizar las cuatro reacciones se mezclan en un nico tubo.

Secuenciacin empleando terminadores fluorescentes

Se realiza una nica reaccin de secuencia en presencia de los cuatro ddNTPs, cada uno de ellos
marcados con una sonda fluorescente distinta.

Hibridacion de molculas y sus variantes

Marcadores moleculares. (RFLP, MAAPs, AFLP)
RFLP (Polimorfismo en el tamao de los fragmentos de restriccin).
Esta tcnica, desarrollada a finales de los 70, se basa en la deteccin de fragmentos de DNA de
distinto peso molecular (por digestin con la misma enzima de restriccin) en diferentes
organismos. Los fragmentos ms fciles de analizar son los pequeos derivados de la digestin del
genoma de las mitocondrias o los cloroplastos, puesto que delecciones, sustituciones o mutaciones
pueden alterar significativamente el patrn de bandas identificable por electroforesis en geles de
agarosa, donde migran de acuerdo con su peso molecular. En cambio, para molculas de DNA de
mayor tamao, como el DNA cromosmico, el patrn de bandas es tan complejo que es necesario
utilizar sondas especficas para visualizar slo ciertos fragmentos mediante la tcnica de Southern
Blot. Las sondas de DNA para esta tcnica suelen corresponder a genes previamente conocidos,
aunque a veces se usan DNA preparados a partir de amplificaciones inespecficas. Aunque la RFLP
evala slo un tipo de polimorfismo en cada ensayo, el resultado es muy preciso. Los primeros
mapas genmicos basados en la distribucin fsica de los genes en vez de la frecuencia de
entrecruzamiento se hicieron utilizando esta tcnica. Cuando se emplea la PCR en lugar de sondas
radiactivas para visualizar los polimorfismos, se le denomina PCR-RFLP
MAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin )
Trmino genrico acuado en 1994 con el que se designan las tcnicas que emplean
oligonucletidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. Entre estas tcnicas caben
destacar:

AFLP (Polimorfismo de la longitud de los fragmentos amplificados): Combinacion dde RFLP Y

PCR.Esta tcnica se desarroll en 1995 y combina el uso de enzimas de restriccin y
oligonucletidos para PCR, de manera que se obtienen marcadores moleculares muy especficos sin

necesidad de conocer la secuencia con anterioridad. El DNA se corta con dos enzimas de
restriccin, una de corte muy frecuente, y otra de corte poco frecuente. A los fragmentos se les
ligan oligonucletidos de extremos compatibles con las enzimas usadas.y se amplifica por PCR.
Jugando con la complementariedad del oligonucletido con el sitio de restriccin se puede disminuir
o aumentar el nmero de bandas amplificadas. Una ventaja especial de esta tcnica es que es
capaz de generar muchos marcadores moleculares en una sola reaccin. Por eso el resultado debe
resolverse en un gel de poliacrilamida de alta resolucin, puesto que no se resolveran en agarosa.
Esta tcnica ya se ha usado con xito en patatas y cebada.

RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar) 13 a 15 nucleotidos, DAF 5 a 8 nucleot., AP-PCR 25

a 30 nucleot.
Estas usan primers al azar y PCR. Se diferencian por el largo de los

oligonucletidos.

PCR

COMPONENTES DE LA PCR

-Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi nucletidos que sirve de sustrato
para la sntesis de nuevo ADN.
-Iniciadores (primers). Dos oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las
dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30 nucletidos, que son reconocidos por
la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del
ADN), para delimitar el fragmento a amplificar).
-ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una ADN polimerasa extrada
de la bacteria termfila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80
C), elimin los grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a
altas temperaturas, permaneciendo activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN
-ADN molde. Molcula que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

ETAPAS DE LA PCR

La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Por lo
general el nmero de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres cambios de temperatura.
Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de algunos parmetros
en los que se incluye, la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones
divalentes y dNTPs en la reaccin as como la temperatura de unin de los iniciadores
DESNATURALIZACIN DEL ADN: En la primera etapa, la reaccin es llevada a una temperatura de
94-96C y se mantiene entre 30 segundos y un minuto. A estas temperaturas el ADN se
desnaturaliza (se separan las dos hebras que lo constituyen). La temperatura a la cual se decide
llevar a cabo esta etapa va a depender de la proporcin de Guanina-Citocina (G-C) que tenga la
hebra, as como tambin del largo de la misma.
ALINEAMIENTO/UNIN DEL INICIADOR A LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA: En la segunda etapa
tambin conocida como hibridacin, los iniciadores se unen a las regiones 3`complementarias
que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Para ello, es necesario bajar la temperatura
a 50-65C durante 20-40 segundos, permitiendo as el alineamiento. La polimerasa se une

entonces al hibrido formado por la cadena molde y el iniciador y empieza la sntesis del ADN. Los
iniciadores actan como lmite de la regin de la molcula que va a ser amplificada.
EXTENSIN/ELONGACIN DE LA CADENA: En la tercera etapa, la polimerasa sintetiza una nueva
hebra de ADN complementario a la hebra molde, aadiendo los dNTPs complementarios en
direccin 5` 3` uniendo el grupo 5`-fosfato de los dNTPs con el grupo 3`-hidroxilo del final de la
hebra de ADN creciente. La temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa que se
utilice. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est entre 74-80C, aunque
por lo general se usa 74C. El tiempo de elongacin va a depender del tipo de polimerasa
empleado, as como tambin del tamao del fragmento de ADN que se requiere amplificar.
ELONGACIN FINAL: En la cuarta etapa, la temperatura es regulada de 70-74C durante 5-15
minutos tras el ltimo ciclo de PCR, con el objeto de asegurar que cualquier ADN de cadena
simple restante sea totalmente amplificado.
Por ltimo, el producto amplificado es mantenido a una temperatura de 4C por un periodo
indefinido lo cual permite conservar el producto de la reaccinPara comprobar que la PCR ha
generado el fragmento de ADN esperado, se emplean tcnicas como la electroforesis, que
permite separar los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su tamao. Por lo general se
emplea la electroforesis en gel de agarosa para fragmentos grandes, en acrilamida para
fragmentos ms pequeos y asociada a marcaje fluorescente as como la electroforesis capilar 3, 4
La deteccin del producto de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente
mediante una corrida electrofortica. Dependiendo del tamao del producto de la amplificacin y
la resolucin que se desea, se utilizan diferentes matrices de separacin (agarosa,
poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualizacin se puede realizar con
bromuro de etidio con una lmpara de luz UV, tincin de plata, fluorescencia o radioactividad.
De igual forma, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin (unin
complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases est
contenida en el fragmento de inters.
Los tamaos de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores
que contienen fragmentos de ADN de tamao conocido los cuales se corren en el gel junto a los
productos de PCR.

VARIANTES:
PCR TIEMPO REAL: Es una reaccin de PRC cuya principal caracterstica es que permite
cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original(ES CUANTITATIVA). Se
puede dividir en:
a-Tcnica basada en fluorocromos no especficos.
b-Tcnica basada en sondas especficas.
En las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos, el ADN se une al fluorocromo (por lo
general SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por un termociclador apto para
PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin, pero tiene la ventaja de

utilizar iniciadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la PCR que utiliza
sondas especficas.
Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que
hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse). Cuando la
sonda esta intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia
(FRET). Dicha fluorescencia no se produce cuando la sonda esta daada y los dos fluorocromos
estn distantes, producto de la actividad 5`3`exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite
monitorizar el cambio de patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.
HOT START: la reaccin incia cuando se alcanza una determinada temperatura. Suele estar
mediada por la interaccion de un anticuerpo sobre la polimerasa.
L PCR: long pcr se agrega enzima con actividad correctora.
PCR ANIDADA: se realiza una segunda reaccin de PCR con primers que hibriden dentro del
fragmento ya amplificado por el primer par.
PCR INVERSA: en lugar de amplificar la regin interna, se amplifica la regin externa a los
primers no conocidos, primero se corta el DNA con extremos cohesivos, luego de la
circularizacion se liga y se procede a la PCR normal.
PCR con ADAPTADORES: para amplificar secuencias desconocidas se corta un fragmento de ADN
con extremos pegajosos, se agregan los adaptadores, se ligan y luego se aaden primers que se
unen a los extremos 3de los adaptadores.
PCR ASIMETRICA: se generan copias de una de las hebras, se aaden cantidades diferentes de
ambos primers. En el tiempo uno de ellos se agota, asi solo una de las hebras sigue
amplificndose.
Mutagnesis de sitio dirigido
La mutagnesis de sitio dirigido, tambin llamada mutagnesis dirigida, es una tcnica
de biologa molecular utilizada para crear mutaciones puntuales en una cadena deADN.
La tcnica fue desarrollada por primera vez en 1978 por el cientfico Michael Smith, al cual le
concedieron el Premio Nobel de Qumica en octubre de 1993 junto a Kary B. Mullis, el creador de
la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, acrnimo del ingls polimerase chain reaction). Un
requisito indispensable para el uso de esta tcnica es que se debe conocer la secuencia de ADN
que se quiere mutar.
El proceso, en primer lugar, requiere sintetizar un fragmento corto de ADN, el cebador, que
contenga la mutacin. El cebador debe hibridar con la molcula simple (unicatenatenaria) de
ADN que contiene el gen de inters. Utilizando una ADN polimerasa, se elonga la cadena (el
fragmento unicatenario ms el cebador) incorporando la mutacin al ADN y formando una
molcula de ADN completa bicatenaria. Dicha doble cadena de ADN puede ser introducida en
una clula hospedadora y clonada. Tras esto, se escogen los mutantes.
Esta tcnica no solo hace posible crear mutaciones puntuales en una molcula de ADN, sino que
tambin se pueden producir deleciones e inserciones. Se consigue controlar el tipo de mutacin
que se pretende realizar en el ADN modificando el cebador. Para las deleciones se utilizan
cebadores que contengan la delecin pero que tengan la capacidad de hibridacin en la cadena

de ADN en el sitio correcto; por el contrario, para una insercin el cebador deber llevar el
fragmento extra de ADN adems de hibridar correctamente con la cadena molde.
Mtodos del Mutagnesis de sitio dirigido
Mutagnesis de sitio dirigido por PCR
Para realizar mutagnesis de sitio dirigido, tambin se puede utilizar la PCR obteniendo el mismo
resultado. Generalmente, se suelen utilizar 4 cebadores: dos de ellos presentan la mutacin; y
los otros dos nicamente se utilizan para amplificar la cadena. Puesto que con la PCR
obtendremos una amplificacin exponencial, el fragmento mutado se amplificar de tal manera
que superar mayoritariamente al nmero de cadenas silvestres sin la mutacin. Tras la PCR,
podemos despreciar el nmero de cadenas de ADN silvestre en comparacin con las que han
sido mutadas.
Mutagnesis de sitio dirigido por PCR inversa en un plsmido
La PCR inversa utiliza cebadores orientados al revs (el forward hacia la izquierda y
el reverse hacia la derecha, saliendo del mismo punto para que amplifican el plasmido entero)
para amplificar el plsmido con un insercin, delecin o sustitucin. El tipo de mutacin depende
en el diseo de los cebadores. En el caso de insercin los cebadores estn ubicados a ambos
lados del sitio de mutacin y uno de los cebadores contiene el pedazo de secuencia para
insertar. Se realiza sustituciones por el uso de un cebador con la sustitucin en el medio. Los
cebadores para los delaciones estn ubicados en ambos lados del sitio de delecin en tal manera
que tal region no est incluido en el amplicn.
Los cebadores vienen fosforilado en los extremos 5para facilitar la ligacion del amplicn.
Mutagenesis dirigida por oligonucletidos.

Mtodo Smith at all

Mtodo kunkel
Mtodo Lewis at all. (mas importante) utiliza plasmido 1

Ventajas: se puede planificar el lugar y tipo de mutacion

Desventajas: se requiere conocimiento previo de propiedades de la protena, purificacin de la
enzima mutada y determinacin de propiedades.