MTODOS DE ESTUDIO EN

BIOLOGA CELULAR
Profesora Carla Maturana Valdivia

BIOLOGA CELULAR

CLASE 05

Identifica mtodos de estudio de las

clulas y sus fundamentos.

Microscopia ptica: Partes de un

microscopio ptico, sistema ptico y
mecnico.

Microscopa electrnica de transmisin

y barrido.

Cultivo celular y/o de tejidos.

Centrifugacin
gradiente.

Electroforesis de DNA y protenas.

fraccionada

en

Microscopio

Instrumento que permite la observacin de objetos, organismos,

tejidos o clulas de un tamao inferior al que se puede reconocer a
simple vista por el ojo humano.

Tipos de microscopios
Microscopios pticos

Microscopio Electrnico

De Campo Claro

De Transmisin

De Campo Oscuro

De Barrido

De Contraste de Fases

De Interferencia

De Luz Polarizada

De Fluorescencia

Lser Confocal

Microscopio ptico

Instrumento que permite aumentar la imagen utilizando uno o ms

lentes.

Dos principios estn involucrados en el uso del microscopio:

la magnificacin (capacidad de aumentar el tamao de una
imagen) y la resolucin (capacidad de producir imgenes bien
definidas de puntos situados muy cerca uno del otro).

Se pueden utilizar aceites de alta viscosidad para aumentar el

ndice de refraccin (en comparacin con la refraccin del aire = 1)
y mejor la resolucin de la imagen formada.

Ventajas:

Permite el estudio de microorganismos vivos.

Limitantes:

Poder de resolucin (debido a que existe un lmite de resolucin

correspondiente a 0,2 micrmetros.

Microscopio ptico: Simple y Compuesto

Microscopio de
Zaccarias y Hans
Jenssen (1595)

Microscopio
de Gallileo Galilei
(1609)

Aumento: 9x

Microscopio
de Hooke
(1665)

Aumento: 8x

Aumento: 30x

Giovanni Faber adoptado el trmino microscopio para

describir la invencin de Galileo en (1625)

Microscopio de van
Leeuwenhoek
(1668)
Aumento: 275x

Componentes del Microscopio ptico

Partes del Microscopio ptico

Tubo
Revlver

Sistema ptico del microscopio

Sistema de Amplificacin

Sistema de Iluminacin

Lente ocular

Fuente Luminosa

Lentes objetivos

Condensador

Diafragma

Anillo Porta Filtro

Sistema mecnico del microscopio

Tubo o caon

Revlver

Columna o brazo

Pie

Platina

Tornillos de focalizacin:

Macromtrico

Micromtrico

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Campo Claro: la muestra se

observa ms oscura que el campo que la
rodea.

Microscopio de Campo Oscuro: se bloquea la

luz que no atraviesa por la muestra y solo
atraviesan los haces de luz refractados y
alcanzan al lente objetivo (La muestra aparece
iluminada en un fondo oscuro).

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Contraste de Fases: utiliza

las diferencias de densidad de las
estructuras celulares (diferente ndice de
reaccin). Las estructuras ms densas se
observan ms oscuras mientras que las
menos densas (densidad cercana al agua) se
observan ms claras.

Microscopio Diferencial de Contraste de

Interferencia de Nomarski (DIC): utiliza un
prisma refrigente que divide la luz en dos
rayos polarizados que interfieren entre s
proporcional una imagen tridimensional.

Tipos de microscopios pticos

Microscopio de Fluorescencia: se utilizan sustancias

fluorescentes llamadas fluorocromos para teir ciertas
estructuras subcelulares de inters. El microscopio posee una
lmpara que que emiten las radiaciones en el espectro UV de
las longitudes de onda necesarias para que el compuesto
brille en la oscuridad (fluoresca).
_

Tipos de microscopios pticos

Microscopio Lser Confocal: Emplea un sistema de iluminacin con

rayo lser que es muy convergente y, en consecuencia produce un
punto de barrido muy poco profundo, iluminando un solo punto por
vez.

Se registran los datos de cada punto de la muestra recorrida con

este rayo mvil y se guardan en una computadora. Luego se puede
llevar la imagen a un monitor de alta resolucin.

Las regiones fuera de foco se restan de la imagen mediante

un programa para dar una definicin mxima a la imagen. Es posible
tambin crear imgenes mltiples a diferentes profundidades dentro
del espcimen y realizar reconstrucciones tridimensionales. _

Microscopio electrnico

Microscopio que usa electrones para iluminar el objeto que se

desea observar y lo refleja en una pantalla fluorescente,
obtenindose imgenes ms amplificadas que en un microscopio
convencional.

Consta fundamentalmente de un tubo de rayos catdicos, en el cual

debe mantenerse el vaco.

Ventajas:

La resolucin y el aumento son mayores.

Los virus, y los objetos ms pequeos, como las macromolculas solamente

pueden verse a travs del microscopio electrnico.

Limitaciones:

No se pueden observar microorganismos vivos.

Microscopio Electrnico de Transmisin

(MET)

Es un instrumento que aprovecha los fenmenos fsico-atmicos que se

producen cuando un haz de electrones suficientemente acelerado colisiona
con una muestra delgada convenientemente preparada (requiere que se
aumente el contraste utilizando metales pesados como el osmio).

Cuando los electrones colisionan con la muestra, en funcin de su grosor y

del tipo de tomos que la forman, parte de ellos son dispersados
selectivamente, es decir, hay una gradacin entre los electrones que la
atraviesan directamente y los que son totalmente desviados.

Se obtienen imgenes bidimensionales.

Se pueden observar detalles finos de estructuras subcelulares.

Componentes del Microscopio

electrnico de Transmisin

Un filamento de tungsteno (ctodo) que emite electrones.

Condensador o lente electromagntica, que concentra el haz de electrones.

Objetivo o lente electromagntica, que ampla el cono de proyeccin del haz de luz.

Ocular o lente electromagntica,

que aumenta la imagen.

Proyector o lente proyectora que

ampla la imagen.

Pantalla fluorescente, que recoge

la imagen para hacerla visible al
ojo humano.

Microscopio Electrnico de Barrido

(MEB o SEM)

Su funcionamiento se basa en el recorrido de la muestra con un haz muy

concentrado de electrones.

Los electrones del haz pueden dispersarse de la muestra o provocar la

aparicin de electrones secundarios. Los electrones perdidos y los
secundarios son recogidos y contados por un dispositivo electrnico
situado a los lados del espcimen. Cada punto ledo de la muestra
corresponde a un pixel en la pantalla. A medida que el haz de electrones
barre la muestra, se presenta toda la imagen de la misma en el monitor.

No es necesario cortar el objeto en capas para observarlo

con un SEM si no que puede colocarse en
el microscopio con muy pocos preparativos.

Produce imgenes tridimensionales realistas de la superficie

del objeto.

Microscopio Electrnico de Barrido

(MEB o SEM)

Funcionamiento de los diferentes Microscopios

Cultivo celular

Conjunto de tcnicas de aislamiento y obtencin de clulas, con la

obtencin de poblaciones celulares in vitro manteniendo al mximo
sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.

Cultivo celular

Aplicaciones:

Estudios de Investigacin:

Comprender la fisiologa celular, toxicologa y

virologa.

Ingeniera de Tejidos:

Trasplantes

Injertos (piel, hueso, cartlagos, piel, etc)

Cultivo celular

Aplicaciones:

Produccin de compuestos qumicos de importancia:

Enzimas
Vacunas
Hormonas

Citogentica:
Estudios

cromosmicos

Agronoma:
Transgnicos
Organismos genticamente modificados

Cultivo tisular

Cultivo de rganos:
mantenimiento de rganos o
parte de rganos in vitro

Cultivo de tejidos y explantes:

Mantenimiento de tejidos in vitro

Cultivo de clulas madres

Centrifugacin

Tcnica que permita la separacin de slidos de lquidos

a partir de la densidad que posean, utilizando la fuerza
giratoria (centrifuga).

Se puede utilizar como una tcnica de tipo:

Preparativo: Se utiliza
aprovechamiento posterior.

para

aislar

partculas

Analtico: permite determinar propiedades fsicas

velocidad de sedimentacin o el peso molecular.

para

su

como la

Centrifugacin fraccionada

Se utiliza para separar partculas segn la velocidad de sedimentacin

(centrifugacin diferencial).

Centrifugacin en gradiente

Se obtienen partculas que se distribuyen en

fracciones de diferentes densidades de un
fluido lquido.
Puede ser de dos tipos:

Centrifugacin zona: Separacin debido a la

masa.

Centrifugacin
isopcnica:
debido la densidad.

Separacin

Centrifugacin en gradiente

Electroforesis

Mtodo de separacin de molculas con

carga elctrica que se desplazan al
exponerse
a
un
campo
electromagntico.

La migracin de produce desde el nodo

(-) al ctodo (+) y depende del pH del
medio(buffer).

Electroforesis

El desplazamiento de las muestras

electrofortica), est determinada por:

La carga de la molcula.

Tamao y forma

en

el

medio

(movilidad

Friccin (porosidad del soporte)

Velocidad del desplazamiento
Potencial elctrico

Aplicaciones de la electroforesis :

Determinacin de la masa molecular de protenas (kDa) y de ADN (pb),

Determinacin del punto isoelctrico de las protenas.

Diferenciacin de isoenzimas.

Diseo de mapas de restriccin.

Secuenciacin de ADN.

Electroforesis: Componentes

Fuente de voltaje
Cubetas de Electroforesis, electrodos
y peine

Marcador

Revelador
Tampn

Escalera

Micropipetas

Medios de Soporte
Soporte

Macromolculas

Naturaleza y
disposicin

cidos
Nucleicos

Agarosa
(horizontal)

Protenas

Poliacrilamida
(vertical)

Geles

Medios de alta porosidad

Medios de baja porosidad

Papel
Acetato de celulosa
Separacin principalmente
por carga

Gel de almidn
Gel de poliacrilamida
Gel de agarosa
Gel de agarosa+poliacrilamida
Separacin por carga, tamao y forma

Reveladores
Naturaleza

Compuesto
intercalante
Bromuro de
Etidio

Necesitan instrumento
revelador UV

ADN
GelRed

Reveladores
Protenas

Azul de
Coomasie
Transluminador UV

Electroforesis de ADN

Electroforesis de Protenas

Cromatografa

Mtodo fsico-qumico de separacin

relacionados en mezclas complejas.

de

componentes

estrechamente

Existen distintos tipos de mtodos cromatogrficos.

Algunas de las ventajas que poseen las tcnicas cromatogrficas son:

Rapidez

Simplicidad

Moderado coste que poseen (dependiendo del tipo de tcnica),

Una gran aplicacin como mtodo de separacin

Permite proporcionar tambin resultados cuantitativos de los compuestos ya

separadas.

Cromatografa: Componentes

Fase mvil (FM) La muestra se disuelve en ella para permitir

la separacin.

Fase estacionaria (FE) Es inmiscible.

Normalmente est formada por un gas, o un lquido.

La cual se mantiene fija en un soporte que puede ser una columna o

en una superficie slida.

Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la

muestra, se distribuyen de forma distinta entre ambas.

Cromatografa: Revelada
Afinidad con Fase Mvil

Afinidad con Fase

Estacionaria

Anlisis
Cualitativos

Anlisis
Cuantitativos

Tipos de Cromatografa: Plana

Tipos de Cromatografa: En columna