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DIRECTORIO INSTITUCIONAL
SECRETARA DE AGRICULTURA, GANADERA DESARROLLO RURAL PESCA Y
ALIMENTACIN
Lic. Enrique Martnez Martnez
Secretario
Lic. Jess Alberto Aguilar Padilla
Subsecretario de Agricultura
Prof. Arturo Osorio Snchez
Subsecretario de Desarrollo Rural
Lic. Ricardo Aguilar Castillo
Subsecretario de Alimentacin y Competitividad
Lic. Marcos Augusto Bucio Mjica
Oficial Mayor
INSTITUTO NACIONAL DE INVESTIGACIONES FORESTALES, AGRCOLAS Y
PECUARIAS
Dr. Pedro Brajcich Gallegos
Director General
Dr. Salvador Fernndez Rivera
Coordinador de Investigacin, Innovacin y Vinculacin
M. Sc. Arturo Cruz Vzquez
Coordinador de Planeacin y Desarrollo
Lic. Marcial A. Garca Morteo
Coordinador de Administracin y Sistemas
CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIN DISCIPLINARIA EN CONSERVACIN Y
MEJORAMIENTO DE ECOSISTEMAS FORESTALES
Dr. Fabin Islas Gutirrez
Director

Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba

(Swietenia macrophylla King)
a partir de explantes vegetativos

CRDITOS EDITORIALES
Edicin Tcnica:
Dr. Alejandro Ponce Mendoza
M.C. Claudia Mndez Espinoza
Edicin:
Dra. Mara Cecilia del Carmen Nieto de Pascual Pola
Cuidado de la Edicin:
M. C. Marisela C. Zamora-Martnez
Diseo
Silvia Onodera Hamano
Fotografa:
Pas. Bil. Luis Barba-Escoto
MVZ. Jess Prez Santacruz
Dra. Ana Wegier Briuolo
La cita correcta es:
Wegier, A., L. Barba-Escoto, F. Garca-Campusano, J. Prez S. y A. Flores G.
2013. Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba (Swietenia macrophylla
King) a partir de explantes vegetativos. Manual Tcnico Nm. 10 . CENID-COMEF,
INIFAP. Mxico, D.F. Mxico. 84 p.
No se permitir la reproduccin total o parcial de esta obra, ni la transmisin de
ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico, fotocopia,
por registro u otros medios, sin el permiso previo y por escrito a la Institucin.
Derechos Reservados 2013
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrcolas y Pecuarias
Progreso No. 5, Barrio de Santa Catarina, delegacin Coyoacn. 04010. Mxico
D.F. Telfono (55) 3626 8700 ext. 608
Primera edicin 2013
1 000 ejemplares
Impreso en: Graphx, S.A. de C.V. Tacuba 40, Desp. 205. colonia Centro,
Mxico, D.F. 06010
La edicin se termin de imprimir en julio de 2013
ISBN 978-607-37-0052-8
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Mtodo para el establecimiento in vitro de caoba

(Swietenia macrophylla King)
a partir de explantes vegetativos
Dra. Ana Laura Wegier Briuolo
Investigadora Titular. Programa de Biotecnologa. CENID-COMEF, INIFAP
Pas. Bil. Luis Barba Escoto
Tcnico externo del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del
CENID-COMEF, INIFAP
Dra. Florencia Tiberia Aucn Garca Campusano
Investigadora Titular. Programa de Biotecnologa
CENID COMEF, INIFAP
M.V.Z. Jess Prez Santacruz
Auxiliar del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del CENID COMEF, INIFAP
M. C. Andrs Flores Garca
Investigador Titular Programa de Plantaciones y Sistemas Agroforestales,
CENID-COMEF, INIFAP
Instituto Nacional de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias
Centro Nacional de Investigacin Disciplinaria
en Conservacin y Mejoramiento de Ecosistemas Forestales
Distrito Federal, Mxico julio 2013.

AGRADECIMIENTOS
Los autores desean hacer patente su agradecimiento al Fondo
CONAFOR-CONACYT por el financiamiento otorgado mediante el
Proyecto Generacin de lneas celulares de Swietenia macrophylla King
resistentes al barrenador de las meliceas (Hypsipyla grandella Zeller)
mediante la integracin del gen Bt (Nm. 148409) para llevar a cabo
este manual, as como a la comunidad del CENID COMEF por las
facilidades otorgadas.
Igualmente, a diversas personas que con su importantes aportaciones,
contribuyeron a lograr este objetivo.
Al M. en C. Xavier Garca Cuevas, Investigador Titular del Programa
de Plantaciones Forestales y Sistemas Agroforestales del Campo
Experimental Chetumal. CIR-Sureste y al personal del Vivero Forestal
La Unidad (Localidad Tolom, Km 1 Col. Los Amigos, Municipio Paso de
Ovejas, Veracruz) por haber proporcionado el material vegetal para la
realizacin del proyecto.
Al personal del rea de Adquisiciones del CENID-COMEF y en particular a
Nancy Corona y a Abigail Coln lvarez por su ayuda en diversas gestiones.
Al Sr. Joel Reyna Flores, Tcnico adscrito al Laboratorio de Biotecnologa
Forestal del CENID COMEF, por su apoyo en la operacin de varios
procedimientos y a la Pas. de Bil. Alejandra Cervantes por haber
desempeado distintas actividades para efectos de su Servicio Social.
Al Dr. Alejandro Ponce Mendoza y a la M. en C. Claudia Mndez Espinoza,
investigadores del CENID-COMEF, por sus comentarios para enriquecer
el contenido del manual.
Este manual fue validado por personas con diferente experiencia en el
cultivo de tejidos, desde los que trabajan en laboratorio con la tcnica en
otras especies, los que trabajan en laboratorio en otras reas y los que
an no haban trabajado en un laboratorio. A todos ellos queremos expresar
nuestro agradecimiento para que esta obra resulte beneficiosa para el usuario.
4

CONTENIDO

INTRODUCCIN
1. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE
Clasificacin taxonmica
Nombre comn
Descripcin botnica
Aspectos fenolgicos, fisiolgicos y genticos
Distribucin natural y datos ecolgicos
Usos
Datos de vivero, cultivo y produccin
2. EL CULTIVO in vitro COMO UNA ALTERNATIVA PARA
LA SILVICULTURA
Generalidades del cultivo in vitro
Cultivo in vitro de la caoba
3. MATERIAL Y MTODOS
rea de cultivo
Desinfeccin del rea de siembra
Desinfeccin del material para sembrar
Tres vas para el establecimiento in vitro de caoba
- Germinacin in vitro
- Proliferacin de yemas axilares
- Formacin de callo
CONSIDERACIONES FINALES
BIBLIOGRAFA
ANEXOS

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INTRODUCCIN
La caoba (Swietenia macrophylla King) es una de las especies maderables
de las zonas tropicales con mayor importancia econmica. Sin embargo,
el aumento de la tasa de deforestacin, el sobre aprovechamiento de
sus poblaciones naturales y la tala de los mejores individuos para uso
comercial han afectado la diversidad gentica de las poblaciones
(Gillies, 1999; Novick et al., 2003; Lemes, 2000; Lemes et al., 2003; Basil,
2007). Con el propsito de regular el comercio ilegal de la especie, fue incluida
en el listado del Apndice II del CITES (Convencin sobre el Comercio
Internacional de Especies Amenazadas de Fauna y Flora Silvestres, por
sus siglas en Ingls) en 2002; esta medida contribuye a mantener un
comercio legal y sostenible de sus existencias (CITES, 2003). Para restaurar
las poblaciones silvestres es necesario disear estrategias para promover
su conservacin y regeneracin en toda la distribucin de la especie in situ
(Patio, 1998), aunado a sistemas de propagacin y manejo ex situ, como lo
son las plantaciones artificiales y los bancos de germoplasma.
Una alternativa para la regeneracin de la caoba es el cultivo in vitro,
ya sea para fines de conservacin, o como parte de los planes de
aprovechamiento. El cultivo in vitro es una herramienta biotecnolgica
orientada a la propagacin clonal de plantas (Bonga y von Aderkas,
1992; George, 1993) y que se ha explorado ampliamente durante las dos
ltimas dcadas. Es un recurso socorrido en los bancos de germoplasma
que requieren resguardar especies con semillas recalcitrantes; asimismo,
es indispensable para realizar mejoramiento gentico, ya que permite
probar el potencial de un mismo individuo en diferentes condiciones y con
validez estadstica porque se pueden producir muchos clones de un rbol
seleccionado (Thorpe et al., 1991).Con base en todo lo anterior, el objetivo
7

de este manual consisti en presentar de una manera clara y sencilla

tres protocolos para el cultivo in vitro de la caoba (Swietenia macrophylla), a
partir de diferentes tejidos, con el fin de obtener la formacin de brotes
adventicios y callos.
Aqu se describe el uso de tcnicas de cultivo in vitro encaminadas al
establecimiento masivo de la caoba (Swietenia macrophylla). Se destacan
aspectos fundamentales sobre cmo organizar un laboratorio; se
hacen recomendaciones para tener un rea de trabajo asptico; para
seleccionar y desinfectar el material vegetal que se utilizar como
explante, as como las especificaciones nutrimentales (medios de cultivo)
y ambientales necesarias. Se ofrece adems, una gua rpida para llevar
a cabo distintos protocolos de regeneracin, lo que supone la secuencia
temporal de pasos necesarios para lograr con xito el establecimiento in vitro.

1. CARACTERSTICAS DE LA ESPECIE
Clasificacin taxonmica
La especie Swietenia macrophylla fue descrita por George King en 1886
(King, 1886). Con base en los registros del Missouri Botanical Garden
(tropicos.org; theplantlist.org), la clasificacin taxonmica aceptada ms
reciente es:
clase: Equisetopsida
subclase: Magnoliidae
superorden:Rosanae
orden: Sapindales
familia: Meliaceae
gnero: Swietenia
especie: Swietenia macrophylla King
Nombre comn
Conocida comnmente como caoba en pases de habla hispana, tanto en
Amrica como en Europa (Pennington y Sarukhn, 2005).
Descripcin botnica
La caoba es una especie caducifolia, que mide de 35 a 50 m de altura (en
ocasiones hasta 70 m), con floracin anual y con dimetro a la altura
de pecho que vara entre 1 y 1.8 m (pero puede incluso llegar hasta 3.5 m).
Los rboles tienen un fuste recto de hasta 25 m, aunque es ligeramente
acanalado, con contrafuertes en la parte basal de hasta 2 a 3 m de altura.
9

La copa del rbol es abierta y redondeada con forma de sombrilla. Presenta

pocas ramas gruesas en la parte baja (ascendentes) y torcidas que se
localizan por arriba de los 25 m. Las hojas alternas son grandes y paripinnadas o
a veces imparipinadas, de 12 a 40 cm de largo; sus foliolos, lanceolados u
ovados, son de 3 a 5 pares, muy asimtricos. La corteza externa es profunda
y ampliamente fisurada con costillas escamosas (piezas alargadas), de color
pardo griscea a moreno griscea; el color interno de la corteza es de
rosa a rojo, de consistencia fibrosa; su sabor es amargo y astringente. El
grosor de ambas cortezas es de 10 a 25 mm. Las flores son pequeas,
actinomorfas, de 6 a 8 mm de dimetro, verde- amarillentas, agrupadas en
panculas axilares y subterminales, de hasta 15 cm de largo. La especie
rene flores de ambos sexos en un mismo individuo, generalmente las
flores masculinas son ms abundantes que las femeninas, y ambas son
dulcemente perfumadas; el cliz tiene forma de copa, la corola tiene
5 ptalos ovales y cncavos. El fruto es una cpsula leosa, ovoide u
oblonga con forma de cabeza de zopilote, comnmente de 6 a 25 cm
de largo y 2 a 12 cm de dimetro, de color pardo grisceo; es liso, con 4 y 5
valvas leosas de 6 a 8 mm de grosor; cada cpsula contiene de 45 a
70 semillas aladas y livianas, de 7.5 a 10.0 mm de largo por 2.0 a 3.0 mm de
ancho, de color canela o caf-rojizo; su sabor es amargo y estn provistas
de una prolongacin en forma de ala de 6 a 7 cm de largo (Pennington y
Sarukhn, 2005).
Aspectos fenolgicos, fisiolgicos y genticos
En Mxico, la caoba florece de julio a agosto y fructifica de noviembre
a enero. La fructificacin ocurre a los 15 aos y algunas veces antes; es
entonces cuando un rbol puede llegar a producir 250 frutos, aunque esta
cantidad aumenta a medida que los individuos maduran. Los aos de
fructificacin son frecuentes y la polinizacin es entomfila. Los rboles son
10

caducifolios en las zonas ms secas de su rea de distribucin; toleran

suelos con deficiencias nutrimentales, pero el crecimiento es lento en suelos
intensamente cultivados y con materia orgnica degradada (CONABIO, 2012).
La semilla de la caoba tiene un comportamiento recalcitrante cuando
es almacenada (Gmez et al., 2006). Es decir, que a diferencia de las
semillas ortodoxas, que desarrollan altos niveles de desecacin y alguna
forma de latencia, este tipo de semillas no experimentan deshidratacin
en la planta madre, por lo que conservan una importante actividad
metablica al ser liberadas, y pasan directamente a la germinacin
(Navarro et al., 1996; Magnitskiy y Plaza, 2007). Debido a que la
viabilidad de estas semillas decae pronto si no entran en contacto con
las condiciones adecuadas para germinar, su preservacin a largo plazo (por
ejemplo en bancos de germoplasma) es prcticamente imposible, e implica la
necesidad de contar con un ambiente muy especial para su mantenimiento.
El gnero Swietenia incluye a tres especies: S. macrophylla King, S.
mahagoni Jacq. y S. humilis Zucc. Los nmeros cromosmicos para las
tres especies son 2N = 48 (S. mahagoni), 2N = 54 (S. macrophylla)
y 2N = 56 (S. humilis). Aparentemente existe suficiente variabilidad en la
caoba para poder efectuar programas de mejoramiento con base en
seleccin de individuos y cruzamientos. Se ha determinado que hay
variacin fenotpica en el peso especfico de la madera entre rboles de
una misma plantacin y diferencia significativa entre fuentes geogrficas
y ecolgicas (Bauer y Francis, 1998).
Swietenia macrophylla muestra una gran diferenciacin gentica entre
las poblaciones Mesoamericanas en contraste con la evidente similitud
de las del Amazonas. Esto indica que ha tenido una historia muy compleja
y guardan cierto grado de aislamiento entre ellas (Novick et al., 2003).
11

La tala de esta especie en Mesoamrica ha tenido un efecto negativo sobre

su diversidad. En sus zonas de distribucin natural se ha sealado una
reduccin significativa de diversidad gentica en poblaciones que han
sido constantemente aprovechadas, en contraste con poblaciones que
han sufrido poco disturbio. Los trabajos en general sobre diversidad
gentica de la especie describen una alta estructuracin, con mayor
diversidad intrapoblacional que interpoblacional (Gillies, 1999, Novick et
al., 2003; Lemes, 2000; Lemes et al., 2003 y Basil, 2007), al parecer
ocasionado por la baja dispersin de los polinizadores y la fragmentacin
de las poblaciones (Gillies, 1999).
Un estudio realizado en Centroamrica (Navarro et al., 1996) determin
que los patrones de variacin estn asociados fuertemente con las
condiciones ecolgicas en las cuales las poblaciones evolucionaron; se
encontr gran variacin morfolgica entre poblaciones de reas inundables y
de zonas de laderas. Estas diferencias entre procedencias requieren de
mayor estudio as como otros aspectos de inters: diferencias en crecimiento
y rendimiento y resistencia al ataque del barrenador de las meliceas
(Hypsipyla grandella Zeller).
Distribucin natural y datos ecolgicos
Swietenia macrophylla es una especie originaria de Amrica. Se
distribuye desde el sur de Mxico y la vertiente del Atlntico en Amrica
Central, desde Belice, Honduras, Guatemala, Nicaragua, Costa Rica y
Panam. En Amrica del Sur, es nativa de Venezuela, Colombia, Ecuador
y hasta el Valle del Amazonas de Brasil, Per y Bolivia (Pennington y
Sarukhn, 2005; Aguilar et al., 1992). En Mxico, en los estados de
Oaxaca, Veracruz, Tabasco y en la Pennsula de Yucatn.

12

Forma parte del bosque tropical y subtropical y se desarrolla en altitudes

de 50-500 m pero puede llegar hasta los 1,400; las temperaturas varan de
22-28C (con extremas de 11 a 37C); en climas secos, hmedos o muy
hmedos; precipitaciones entre 1,000 y 2,500 mm. Tolera estaciones
secas. Se establece en una gran variedad de suelos, de arcillosos a
arenosos, pero prefiere suelos aluviales profundos, bien drenados y frtiles,
de alcalinos a neutros, aunque tambin puede crecer en suelos cidos
con pH de hasta 4.5. La especie es medianamente helifila y se regenera
en campos abandonados an bajo sombra. Se presenta aislada o en
grupos, pero rara vez se les encuentra en densidades mayores de 4 a 8
rboles/ha (Barrance et al., 2003; CONABIO, 2012).
Swietenia macrophylla se asocia con otras especies arbreas de gneros
como Quercus sp., Manilkara sp., Vitex sp., Swietenia sp., Metopium sp.,
Bursera sp., Pseudobombax sp., Calophyllum sp., Licania sp., Aspidosperma
sp., Lysiloma sp., Guettarda sp., Alseis sp., Esenbeckia sp., Lonchocarpus sp.,
Terminalia sp. y Dialium sp. (CONABIO, 2012).
Uno de los grandes problemas a los que se enfrentan las plantaciones de
caoba es al ataque de Hypsipyla grandella (Zeller, 1848), el Barrenador
de las Meliceas; es un lepidptero que se ha convertido en una plaga que
ocasiona graves problemas en el trpico. En la caoba, la larva causa daos
severos porque destruye el meristemo apical, barrena las puntas y hace
tneles en los tallos jvenes (Griffiths, 2001). Las plantaciones afectadas
por este insecto producen numerosas ramas laterales y rboles mal
formados, lo que propicia baja produccin de madera y prdidas econmicas.
No obstante, a pesar de que se han realizado investigaciones con
el objetivo de mejorar mtodos que disminuyan el efecto de los ataques
(Briceo-Vergara, 1997; Snchez-Soto et al., 2009), no se han obtenido
resultados alentadores. Algunos autores han sugerido que una solucin
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es la bsqueda y seleccin de individuos resistentes al barrenador para

la proliferacin de estos por medios como la domesticacin (Wightman
et al., 2005). Sin embargo, es necesario desarrollar estudios sobre
mejoramiento gentico de las poblaciones, as como mtodos para
propagar dichos individuos por medios vegetativos (Newton et al., 1994),
como los que se describen en este manual.
Usos
En la actualidad, la caoba se cultiva en plantaciones con fines maderables,
ya que se utiliza para la elaboracin de muebles y ebanistera fina de
interior y exterior as como molduras, ventanas y puertas adems
de chapas decorativas. Debido a la facilidad para trabajarla y su alta
resistencia a la flexin esttica y a la compresin, es apta para otros usos
tales como: construccin ligera, embarcaciones, instrumentos musicales
y cientficos y maquetas. Con menor frecuencia se le incorpora como
ingrediente en la elaboracin de medicinas, tintes y para cosmticos;
as como rbol en huertos familiares (Yucatn) o para dar sombra en
cafetales (CONAFOR, 2012; CONABIO, 2012).
Datos de vivero, cultivo y produccin
Es una especie de crecimiento moderadamente rpido (en el primer ao
alcanza 1.8 m de altura) con caractersticas favorables para plantaciones,
que puede producir madera de aserro en turnos de rotacin de 30 a
40 aos (Cordero, 2003). Se estima que en esta forma de cultivo, los
intervalos de crecimiento en dimetro y altura son de 1.2-1.4 cm y 1-2 m
por ao, respectivamente. En bosques naturales los rboles requieren de 60 a 100
aos para alcanzar un tamao comercial, mientras que en plantaciones
entre 30 y 50 aos (Barrance, 2003).
14

La propagacin se hace por semilla, la cual se recolecta durante enero

y febrero. Un kilogramo puede contener de 1,800 a 1,950 unidades, con
un 87% de germinacin aproximadamente, aunque se deben sembrar
dentro de los primeros cinco das despus de haberla obtenido, ya que su
viabilidad se pierde con rapidez (Santiago et al., 2007). Como tratamiento
pregerminativo, se corta la mitad del ala y se remoja en agua durante 24
horas; despus se coloca directamente en el sustrato (2 a 5 cm de
profundidad) con el ala hacia arriba. El sustrato puede estar compuesto
de una mezcla en proporcin 3:7 de cachaza de caa composteada y el
cascabillo producto del despulpado en seco del caf. Se debe proporcionar
sombreado durante los 25 das posteriores a la siembra. Se recomienda
llevar un programa de control de plagas y enfermedades, aunque el
control de la humedad y la sombra pueden prevenir la incidencia de las
ltimas. El tiempo de produccin en vivero es de cuatro meses y medio
(Santiago et al., 2007).
Para su conservacin, se han establecido plantaciones para recuperar el
nivel de produccin que la industria forestal tena hace algunas dcadas y
disminuir la presin sobre las reas naturales. La caoba se transplanta al
campo cuando el ejemplar cultivado ha alcanzado una altura de 20 a 25 cm (6
a 8 meses). La distancia de plantacin es de 3 x 3 m; cuando se siembra
con cultivos agrcolas perenes o anuales se recomiendan distancias
de 15 x 15 m. Es conveniente que cada individuo est bajo sombra
lateral de otros rboles durante los primeros tres aos para no recibir
radiacin solar directa. Se pueden aplicar podas sanitarios ante el ataque
del barrenador de las meliceas que consiste en eliminar el brote daado
y tres meses despus, cuando ya haya un brote dominante, remover los
otros brotes para evitar bifurcaciones. Los primeros aclareos se deben
realizar entre los 6 y los 10 aos, hasta llegar a una densidad de 120-150
rboles/ha (Barrance et al., 2003).
15

Como la caoba es helifila, es decir que necesita de grandes cantidades

de luz para desarrollarse en estado natural, es una especie pionera de
claros que se producen por la cada de rboles o incendios en el piso de las
selvas. Dicha caracterstica ha sido aprovechada como la principal
tcnica silvcola por los productores ya que as pueden obtener mayor
cantidad de individuos por hectrea. Sin embargo, el uso excesivo de
sta tcnica puede actuar en detrimento del ecosistema y por lo tanto de la
produccin misma (Snook et al., 2003 y Snook et al., 2005).
En cuanto a su comercializacin, la caoba est considerada dentro del
grupo de especies tropicales preciosas de mayor aprovechamiento en
Mxico. La SEMARNAT (2010) reporta que este grupo aporta 51,460 m3 de
madera aprovechable con un valor total de $136,455,006.00. Los estados
que contribuyen ms a este respecto son Veracruz (36.67 %), Quintana
Roo (23.08 %) y Chiapas (16.38 %).
2. EL CULTIVO IN VITRO COMO UNA ALTERNATIVA PARA LA
SILVICULTURA
Generalidades del cultivo in vitro
En este manual se describen tres protocolos que permiten el establecimiento
de un sistema in vitro (en vidrio) para establecer y mantener explantes
libres de contaminacin. Estos mtodos representan sistemas de cultivo
artificiales, que se realizan en condiciones de asepsia, en los cuales se
busca controlar la mayor cantidad de variables, tanto del ambiente fsico
(luz, temperatura, fotoperiodo), qumico (nutrientes minerales y orgnicos,
hormonas), como biolgico (presencia de patgenos o simbiontes), a las
que estarn expuestas las plantas para optimizar su desarrollo.

16

El cultivo in vitro aprovecha el principio de la totipotencialidad celular, el

cual plantea que todas las clulas tienen la capacidad de regenerar
a un individuo completo (o a partes de l), si se les proporcionan las
condiciones apropiadas, ya que contienen toda la informacin gentica
necesaria para ello (Bonga y von Aderkas, 1992). La propagacin de
plantas por este sistema se conoce tambin como propagacin clonal, ya
que se obtiene la regeneracin de un nmero indeterminado de plantas
genticamente idnticas a partir de una porcin muy pequea de la planta
madre o individuo (embrin). A cualquier parte de la planta (hoja, tallo,
pice, raz, etc.) que se tome para este tipo cultivos se le conoce como
explante (George, 1993).
Esta alternativa biotecnolgica para la propagacin de plantas es
ampliamente utilizada a nivel mundial, para especies de inters agrcola,
ornamental y silvcola. De acuerdo a Thorpe et al. (1991), ofrece ventajas
importantes sobre los mtodos tradicionales (Cuadro1), tales como:
(1) Propagar especies que por su edad no pueden reproducirse o no
responden a las tcnicas tradicionales;
(2) La multiplicacin de genotipos seleccionados, as como de plantas
exticas o en peligro de extincin, en un perodo relativamente corto;
(3) Se puede utilizar como base del mejoramiento gentico de
las especies, ya que permite seleccionar y propagar individuos
resistentes a patgenos o a condiciones ambientales adversas;
(4) Es posible obtener, mantener y propagar masivamente plantas
libres de patgenos;
(5) La produccin ocurre independientemente de la estacin del ao
y del ciclo de vida de la planta, adems de que acorta los ciclos

17

productivos, lo cual es muy deseable para especies de vida larga,

como muchas especies forestales.
La aplicacin del cultivo in vitro como herramienta es muy poderosa
para la propagacin de especies con genotipos selectos o para su conservacin,
y constituye la base de la mayora de los estudios actuales acerca del mejoramiento
gentico. Sin embargo, hay varios aspectos que merecen consideracin antes
de plantear su uso para una planta en particular, principalmente debido a que
el costo durante las fases iniciales de estandarizacin es ms alto que a travs
del uso de tcnicas convencionales; por ello, antes de empezar, siempre
es conveniente hacer una evaluacin costo-beneficio para establecer la
viabilidad y rentabilidad de su implementacin (Bonga y von Aderkas,
1992) (Cuadro 1).
Cuadro 1.Ventajas y desventajas del cultivo in vitro.
Ventajas
Propagacin de individuos que
no han alcanzado la madurez
sexual.
Propagacin
clonal
de
genotipos seleccionados.

Desventajas
Tcnica
sensible
a
contaminacin por hongos y
bacterias.
Necesidad de acceso a
instrumental e infraestructura
especializada

Propagacin de
especies
exticas o en peligro de extincin,
en tiempos relativamente cortos

Capacitacin para aprender

las tcnicas in vitro.

contina Cuadro 1...

18

continuacin Cuadro 1...

Constituye
la
base
del
mejoramiento
gentico,
a
travs de propagar individuos
resistentes a patgenos o
condiciones adversas.

Necesidad del desarrollo

Obtencin y propagacin de
individuos libres de patgenos.

Propensin del tejido a

Reduce
el
tiempo
de
generacin lo que es posible
aplicar a especies forestales.

Existencia de prdidas

Debido a las condiciones

controladas de laboratorio la
produccin no depende de la
poca del ao.

Necesidad de hacer una

emprico de las tcnicas

y protocolos que se van a
utilizar para cada especie
o tejido.

oxidacin y crecimiento
anmalo.
durante los trasplantes.

evaluacin
del
costo
beneficio de las tcnicas
que se van a utilizar.

Se han descrito cuatro aplicaciones de estas tcnicas para la propagacin

de plantas (Kirakayosan et al., 2011):
1. La micropropagacin, en la que se promueve la elongacin de
brotes axilares preexistentes que estn asociados a una yema
apical, los cuales deben ser enraizados posteriormente;
2. La organognesis, que se refiere a la formacin de novo de
yemas o de races a partir de un tejido, que es directa si se forma
sobre el explante o indirecta si los rganos se forman a partir
del cultivo de masas de clulas indiferenciadas conocidas
como callo;

19

3. La embriognesis, que implica la formacin de embriones a partir

de tejido somtico, es decir, sin que haya ocurrido un proceso
de fertilizacin y
4. El cultivo y fusin de protoplastos, en el que se usan clulas
a las que se les ha eliminado la pared celular, lo cual facilita la
produccin de hbridos y la manipulacin gentica (Loyola-Vargas
y Vzquez-Flota, 2006).
Existen varios aspectos que deben ser considerados para el
establecimiento de cualquier tipo de cultivo:
(a) caractersticas del explante;
(b) medio nutritivo y
(c) condiciones ambientales.
(a) Los explantes que se utilizan para el cultivo in vitro pueden ser
de tejido vegetativo como hojas jvenes, pices de tallos, etc.,
o a travs del cultivo de estructuras reproductivas como las
anteras, polen, vulos o embriones, segn los objetivos que
se persigan. El comportamiento de los explantes puede estar
influenciado por diferentes factores, tales como por el rgano que
servir como fuente del explante; la edad fisiolgica u ontognica
del mismo; la estacin del ao durante la cual es recolectado;
el tamao del explante y la calidad general de la planta madre
(Thorpe y Patel, 1984).
(b) El medio de cultivo proporciona los nutrimentos bsicos para el
crecimiento continuo de los explantes aislados y de los propgulos
que se obtengan, y dirige su crecimiento y desarrollo por medio del
control que ejercen sustancias reguladoras del crecimiento (hormonas
vegetales) (George, 1993). En la literatura se pueden encontrar una
20

gran variedad de medios propuestos para el desarrollo de plantas

leosas; sin embargo, todos presentan los mismos constituyentes
bsicos (Slater et al., 2008; Lloyd y McCown, 1980): (a)Nutrimentos
inorgnicos o elementos minerales, tanto macronutrimentos como
micronutrimentos; (b) compuestos nitrogenados orgnicos
como vitaminas y aminocidos; (c) una fuente de carbono,
generalmente sacarosa; (d) reguladores de crecimiento, los cuales
son sustancias que a bajas concentraciones estimulan, inhiben
o modifican de alguna manera los procesos fisiolgicos (los que
se usan con mayor frecuencia son las auxinas y las citocininas); y
(e) un sustrato o soporte fsico para el explante, que puede ser
un agente gelificante para el medio como el agar o Phytagel (de
Sigma-Aldrich), por ejemplo.
(c) Otros factores relevantes son el pH, la iluminacin (tanto la intensidad,
la calidad y tiempo de luz) y la temperatura. El primero afecta la
disponibilidad de los nutrimentos minerales y las propiedades de
los geles como solidificantes (Slater et al., 2008). La luz es
indispensable para el crecimiento y desarrollo de las plantas y
se recomienda una fuente luminosa de amplio espectro, como
por ejemplo la luz blanca fluorescente y fra (Ellis y Webb, 1993). La
temperatura influye sobre las reacciones qumicas que ocurren en
las plantas y es comn que se ajuste a un intervalo de las plantas
en su ambiente natural.
Cultivo in vitro de la caoba
Los primeros ensayos de propagacin in vitro de Swietenia macrophylla
comenzaron a finales de la dcada de los aos ochenta y durante mucho

21

tiempo se alcanz cierto xito utilizando como tejido original el que se

obtiene a partir de la germinacin de semillas en condiciones aspticas y
una combinacin de hormonas (Lee y Rao, 1988; Maruyama et al., 1989;
Sotolongo y Medina, 1998).
Posteriormente han habido esfuerzos por propagar individuos de 3,
10 u 11 aos de edad mediante la proliferacin de callo, o a partir de
brotes obtenidos de estacas (Medina y Sotolongo, 2004). Con una
combinacin de hipoclorito de sodio (NaClO) y un biocida (PPM)
aplicados externa y directamente en el medio se han alcanzado altos
porcentajes de establecimiento sin contaminacin y, en conjunto con el uso de
N6-bencilaminopurina (BAP), se obtuvieron porcentajes altos de generacin
de brotes, a pesar de que la defoliacin no ha podido ser superada (Prez
et al., 2012).
El mantenimiento de los explantes mediante cualquiera de las tcnicas
mencionadas y a partir de cualquier tejido como se ha intentado
previamente, ha probado ser bastante difcil, ya que se presentan
altos grados de senescencia de los tejidos, absicin de las hojas y
marchitamiento por oxidacin fenlica (Prez et al., 2012; Lee y Rao 1988).
Para superar estos problemas se ha intentado el uso de embriognesis
somtica directa e indirecta a partir de cigotos y clulas de los cotiledones,
respectivamente (Collado et al., 2006; Collado et al., 2010). Tambin se ha
logrado la formacin de callo a partir de inflorescencias de rboles de 40
aos de edad de caoba hbrida (Daquinta et al., 2004).
Otro problema que dificulta el establecimiento in vitro consiste en
la contaminacin por agentes endfitos (Maruyama, 2006). Existe
evidencia contrastante de intentos anteriores a partir de individuos
que crecen en condiciones de campo y de invernadero. Maruyama (2006)
describe que el tratamiento de explantes de plantas de 3 aos de edad, con
22

agentes desinfectantes como alcohol etlico, perxido de hidrgeno, cloruro

de mercurio, hipoclorito de sodio o calcio, fungicidas y antibiticos
utilizados solos o en sucesin, en diferentes concentraciones en
diferentes tiempos de aplicacin, resultaron intiles para generar cultivos
totalmente limpios. Incluso en algunos cultivos, estos organismos parecan
estar ausentes en los establecimientos iniciales, pero aparecan en los
trasplantes subsecuentes. Ni siquiera el uso de ramas colocadas en agua
para producir brotes permiti obtener cultivos libres de patgenos, lo que
sugiere que la contaminacin se debe a la presencia de agentes internos.
En contraste, Medina y Sotolongo (2004), con ejemplares de 11 aos y
Prez et al. (2012) con otros de 10 aos en condiciones de campo logran
establecimientos exitosos libres de patgenos, a partir de brotes de estacas y
ramas colocadas en agua. Collado et al. (2004) obtienen altos porcentajes
de establecimiento de individuos de campo con solo el manejo de
concentraciones de hipoclorito de sodio y variando tiempos de exposicin.
La tcnica propuesta en este manual enfatiza la importancia de utilizar
tejido no lignificado para el establecimiento in vitro de caoba. Durante
el desarrollo de los experimentos realizados en este sentido para los
protocolos que se incluyen aqu, se identific un hongo endfito del
gnero Xylaria como el principal agente contaminante de los cultivos. Es
por esto que se propone a la edad del tejido como el principal factor que
determina el xito de un protocolo, ya que si el tejido es muy joven, escapa a
la infestacin del hongo por contacto vertical (Bayman et al., 1998).
3. MATERIAL Y MTODOS
El cultivo in vitro requiere medidas especiales para establecer un sistema
asptico y condiciones de crecimiento controladas, los cuales se detallan
en esta seccin.
23

rea de cultivo
Para el cultivo in vitro es necesario habilitar varias reas para controlar las
condiciones de asepsia, as como el ambiente donde se desarrollarn
las plantas: (a) rea de lavado, (b) rea de preparacin de medios, (c) cuarto
de siembra y (d) cuarto de incubacin (o cultivo).
a)

rea de lavado. Es el espacio donde se lava la cristalera e

instrumental antes y despus de las actividades de cultivo. Aqu
tambin se procesan en un inicio los tejidos vegetales para eliminar
agentes contaminantes, restos de la planta madre o del sustrato
del que proceden. Consiste de una tarja con agua potable para
lavar el material, as como un rea de secado (Figura 1).

b)

rea de preparacin de medios. Aqu se preparan y esterilizan

los medios de cultivo, as como el resto de los reactivos o
materiales para el manejo de los tejidos. Incluye espacios para
el almacenamiento de reactivos (anaqueles y refrigeradores),
mesa de trabajo e instrumentos necesarios para la elaboracin
de los medios: balanzas, potencimetro, agitadores magnticos
calentadores, horno de microondas, etc. Se debe contar con una
autoclave para la esterilizacin (Figura 2).

c)

Cuarto de siembra. Es el sitio en el que se llevar a cabo la

transferencia y manipulacin del tejido para el cultivo (Figura 3).
Es un rea que debe adaptarse para trabajar en condiciones
aspticas. Es de acceso restringido, libre de polvo, con corrientes
de aire limitadas. En este se ingresa solo material que ha sido
previamente esterilizado. En general, cuenta con una campana
de flujo laminar horizontal (vertical si se trabaja con bacterias u

24

hongos) (Figura 4), mesa de trabajo de acero inoxidable o vidrio,

mecheros de alcohol o de gas (tipo Bunsen), iluminacin para
trabajar, y focos de luz ultravioleta para desinfectar el rea.
En este espacio, el personal debe limitar al mximo el ingreso de
contaminantes, por lo cual se recomienda el uso de bata, cubre bocas y
(de preferencia) cofia para cubrir el cabello (Figura 5). No deben de usarse
relojes, pulseras ni anillos, ya que las manos deben lavarse bien con agua y
jabn antes de comenzar a trabajar y frecuentemente desinfectarse con
etanol al 70 % durante el proceso.
Si no es posible contar con un cuarto de siembra, es importante adaptar
las condiciones que permitan minimizar el riesgo de contaminacin;
se sugiere:
Buscar un sitio para colocar una mesa, que quede fuera del paso de
corrientes de aire.
De preferencia, colocar sobre la mesa un vidrio, u otro material de
superficie lisa que se pueda limpiar y desinfectar con facilidad.
Antes de comenzar a trabajar, lavar bien la superficie antes
mencionada con agua y detergente, luego con alcohol al 70 % al
menos 3 veces.
Crear una zona estril. Para ello, se encienden dos mecheros y se
colocan a una distancia de 20 a 30 cm entre ellos (Figuras 6 y 7).

25

Figura 1. rea de lavado. (a)Tarja y rea de secado. (b) El rea puede ser
utilizada para los tratamientos de desinfeccin ya que muchas
veces se puede derramar las soluciones.

Figura 2. (a) rea de preparacin de medios de cultivo y (b) autoclaves.

26

Figura 3. Cuarto de siembra e incubacin. Se muestran las instalaciones

del Laboratorio de Biotecnologa Forestal del INIFAP CENID-COMEF.
La entrada principal posee dos puertas, lo que evita la entrada de
corrientes de aire y adems cuenta con un sistema de extraccin
de aire para todo el cuarto. Al interior estn las campanas de flujo
laminar y los cuartos de incubacin.

Figura 4. Campanas de cultivo con flujo laminar. Se recomienda el uso de

mesas a los lados para colocar material mientras se trabaja en la
campana ya que esto evita entorpecer el trabajo y disminuye
la probabilidad de contaminacin.
27

Figura 5. Vestimenta adecuada para el uso del cuarto de cultivo e incubacin.

28

a)

Cuarto de incubacin. Este se puede obtener comercialmente o se

puede acondicionar. Es una rea con iluminacin, fotoperiodo (horas
luz), temperatura y humedad relativa controlada, donde se
depositan los explantes y plntulas para su desarrollo. Debe contar
con anaqueles para acomodar los frascos de cultivo, adems de
incluir sistemas de aire acondicionado y calefaccin para regular la
temperatura, focos fluorescentes para la iluminacin (que no emiten
demasiado calor) y un temporizador para fijar las horas de luz y
oscuridad (Figura 8). Una vez que las plntulas hayan adquirido el
tamao esperado y el vigor suficiente para sobrevivir fuera del frasco,
se recomienda transplantarlos e ingresarlos a cuartos adaptados para
este fin. Para ello se utilizan mbitos cerrados que excluyan insectos y
cualquier otra fauna nociva y que a su vez, mantengan una humedad,
luz y temperatura sin cambios a lo largo del da, lo que protege a las
plantas de cambios ambientales bruscos, de una manera similar a
los cuartos de cultivo. Esto permite sostener una poblacin constante
para obtener explantes con regularidad.

En el Laboratorio de Biotecnologa del CENID COMEF, el cuarto contiene

iluminacin natural suplementada con tubos fluorescentes Phillips Alto
de 32 watts a razn de 8 tubos en un rea de 14 m2 (por el cuarto mide
4 x 3.5 m) (Figura 9). Sin embargo, un vivero expuesto a la luz natural,
aunque completamente cerrado, es una buena opcin.
Desinfeccin del rea de siembra
Este procedimiento se debe aplicar siempre antes y cada vez que se
utilice el rea, independientemente de la actividad que se lleve a cabo.
Consiste en lo siguiente:
1. Limpiar todas las paredes del interior de la campana de flujo
laminar y la mesa, con alcohol al 70 % y algodn estril, comenzar
29

con las partes ms internas y terminar con las orillas exteriores. Esta
operacin debe hacerse al menos 2 veces (la mesa no debe de tener
ningn instrumento en su superficie al momento de la desinfeccin).
2. Encender el motor de la campana de flujo laminar al menos 15
minutos antes de empezar a trabajar.
3. Encender una lmpara de luz ultravioleta durante 15 minutos
para eliminar microorganismos.

Figura 6. Organizacin del campo estril. El campo estril se establece en

el espacio entre dos mecheros Bunsen o lmparas de alcohol de
96. Los mecheros sirven a su vez para esterilizar las puntas
de pinzas y bistures. La superficie de la mesa y las paredes de
la campana deben de limpiarse con algodn y alcohol al 70%.

30

Figura 7. Forma de trabajar en un campo estril. Se aprovecha el calor

generado por las flamas de los mecheros para producir el
campo estril. Por este motivo, los mecheros se deben ubicar
a una distancia tal que permita el trabajo entre ellos, evitando
quemarse. Todo el material debe mantenerse cerca de los
mecheros y flamearse antes de su uso.

Figura 8. Cuarto de incubacin. Dispone de tubos fluorescentes en las

cuatro paredes, aire acondicionado, termmetros y un
higrmetro para monitoreo de temperatura y humedad. Para
la caoba se recomienda una temperatura de 28-30 C y 30%
de humedad.
31

Figura 9. Plntulas de caoba en cuartos cerrados. Se puede habilitar un

cuarto con luz natural y con lmparas para as controlar las
horas luz con ayuda de un temporizador y la humedad con un
calentador de aceite. Esto asegura un mejor control de plagas
y de variables ambientales.
No se debe entrar al cuarto de cultivo mientras la lmpara de luz
ultravioleta est encendida, pues la luz ultravioleta es el factor principal
que desencadena el cncer de piel.
Ninguna persona o muestra de tejido debe permanecer al interior del
cuarto al momento de encender la lmpara ni durante los 15 minutos
de exposicin. Se sugiere cerrar el cuarto con llave mientras la luz
ultravioleta est encendida.

32

Desinfeccin del material para sembrar

Todo el material que se va a utilizar para el cultivo debi ser esterilizado
previamente en una autoclave; esto incluye al instrumental metlico (pinzas,
bistur, etc.) as como la cristalera.
Antes de introducir a la campana de flujo laminar los frascos y el resto
del material con el cual se va a trabajar es decir, bistures y pinzas se
rocan con etanol al 70 % , que se deja evaporar antes de ser utilizado.
Para desinfectar las pinzas y bistur mientras se trabaja, se introducen
en un esterilizador de perlitas de vidrio (Germinator 500). Una vez que
se han calentado, se dejan enfriar dentro del rea estril antes de usarse.
Es conveniente tener varios juegos de pinzas, de modo que mientras
unos se esterilizan o se enfran, se puede seguir operando con otro juego.
Si no se cuenta con un esterilizador de perlitas, se pueden sumergir las
pinzas y el bistur en etanol al 70 % y luego flamear con el mechero.

Vas para el establecimiento in vitro de caoba

En este manual se describen protocolos para la germinacin in vitro, as
como para la proliferacin de yemas axilares y la obtencin de callo. Para
cada uno se detallan los criterios para la seleccin de explantes as como
las condiciones de cultivo.
En los anexos de este manual se incluye un resumen que puede servir
como gua rpida para el cultivo de yemas axilares.
En el anexo 1 se describe la lista de material y equipo necesario, as
como la composicin de los medios y la preparacin de soluciones.
33

Germinacin in vitro
Es una alternativa para la propagacin cuando se tienen lotes de semillas
viables. Permite reducir y eliminar la presencia de la mayora de los
organismos contaminantes (bacterias y hongos), para la produccin de
plntulas de alta calidad que incluso pueden ser transportadas a otras
zonas del pas. Por lo mismo, pueden tambin ser utilizadas como fuente
de explantes para el cultivo.
A) Preparacin de medio de cultivo
1) Se requiere medio de cultivo PDA (papa-dextrosa-agar) 6 g/l, que ya
se vende comercialmente.
2) Verter 30 ml por frasco, tapar y esterilizar durante 15 minutos, a 15
lb y 121C.
3) Si el medio no se va a usar inmediatamente, se puede guardar en
refrigeracin a 4C, hasta por 1 mes.

B) Limpieza de la semilla y desinfeccin

1. Remover la cubierta de la semilla (smara) que comprende el
ala (recubrimiento caf o testa). En este paso la semilla descubierta
muestra una apariencia de color blanco la cual debe eliminarse (Figura 10).
2. Lavar las semillas con agua y jabn tallando ligeramente con un
escobilln o cepillo pequeo hasta que la semilla muestre un color caf.
3. Sumergir las semillas en alcohol al 70 % durante un minuto en agitacin, a
razn de 5 semillas por cada 30 ml de alcohol y desechar el alcohol; esto
se puede realizar en frascos Gerber estriles.

34

4. En el mismo frasco enjuagar con agua destilada y estril agitando

durante un minuto, desechar el agua y repetir el enjuague tres veces.
5. Sumergir las semillas en cloro al 10 % en agitacin durante 5 minutos.
6. Enjuagar con solucin de antioxidante para evitar exceso de oxidacin
(1g cido ascrbico + 1 g cido ctrico por cada litro de solucin).

b)

a)

c)
Figura 10. Semilla de caoba. (a) Smaras. (b) Aspecto de la semilla y
la cubierta blanca que presenta. (c) Remocin de cubierta
blanca con escobilln y agua.

35

a)

b)
Figura 11. (a) Colocacin de semilla en medio PDA. (b) germinacin de
semilla (15 das de incubacin).

36

C) Condiciones de cultivo
1. En condiciones de esterilidad, se colocan las semillas sobre el medio.
2. El frasco se tapa y se sella con pelcula plstica autoadherible
(EgaPac) o Parafilm.
3. Los cultivos se mantienen en oscuridad a una temperatura de 30C
durante al menos 7 das. Sin embargo, esto depender de la edad de
las semillas y de las condiciones en las que fueron almacenadas,
pues entre ms tiempo permanezcan as, requerirn mayor tiempo en
oscuridad. Se debe monitorear a los 7 das y posteriormente cada dos
das. En el momento en que se observe el crecimiento de hojas se inicia
la incubacin con luz (Figura 11).
Proliferacin de yemas axilares
Es una alternativa para la propagacin clonal de especies forestales, ya
que permite la regeneracin de individuos de caractersticas ya probadas
o de genotipos selectos. Consiste en cultivar lo pices de los tallos y
promover el desarrollo y alargamiento de las yemas axilares, mismas que
posteriormente son separadas del tallo y enraizadas, para dar lugar a
plntulas individuales. Es la va ms deseable cuando no se tiene acceso
a semillas, o cuando se cuenta con muy pocos individuos (Figura 12).
En general, la regeneracin in vitro de especies forestales a partir de
tejidos maduros ha resultado ms complicada que a partir de tejidos
jvenes debido a que su capacidad de respuesta disminuye con la edad.
Se recomienda utilizar los tejidos ms jvenes que se puedan encontrar en
la planta adulta: yemas apicales y axilares, hojas muy jvenes, etc. (Figura 12).
Para usar explantes a partir de plantas maduras es conveniente que:
(1) provengan de rboles vigorosos y con buena hidratacin aparente
37

del follaje; (2) no muestren sntomas de contaminacin por patgenos

como bacterias, hongos o ataque de insectos; o (3) no se obtenga el
tejido a partir de brotes de tallos jvenes (un mes de desarrollo), en los
que sea evidente la dominancia apical.
Por otra parte, la utilizacin de tejido ya lignificado tiene una mayor
probabilidad que el tejido joven de contener asociaciones con organismos
saprobios que en la planta completa pueden no afectar el desarrollo de la
misma pero que in vitro resultan dainos para el tejido vegetal, como es
el caso de hongos endfitos del gnero Xylaria.
A) Seleccin del material vegetal
La caoba tiene tallos principales con hojas paripinnadas o imparipinnadas
(Figura 13). Las hojas son compuestas, es decir se componen de
varios foliolos que crecen en pares opuestos (paripinnadas) o a veces
alternos (imparipinnadas) sobre un mismo raquis, el cual a su vez,
se inserta en el tallo principal. Una de las ventajas de la caoba es su
capacidad de generar una nueva yema apical despus de cortar el pice,
lo cual puede ser aprovechado en el cultivo in vitro ya que permite obtener
mltiples explantes a partir de un solo individuo o plntula, a razn de dos
explantes por mes, con tres yemas al menos, cada uno.
Para la propagacin in vitro de la caoba se han probado el cultivo de
yemas apicales de los tallos, yemas de los foliolos y foliolos. Los extremos
terminales de los tallos, es decir las yemas axilares terminales que
con un color verde o verde rojizo, sin lignificacin (Figura 14), son las
estructuras que se considera ofrecen los mejores resultados en cuanto
a la supervivencia, as como por la ausencia de agentes contaminantes.
Tambin se ha observado que si se utilizan las yemas axilares (las cuales
se encuentran inmediatamente por debajo de la yema apical) sobreviven
38

mejor a los tratamientos qumicos de desinfeccin que el pice; sin embargo,

se corre el riesgo de que estn contaminados por su proximidad de la
yema axilar a la rama principal de la planta. La obtencin de brotes
a partir de los foliolos no ha resultado fcil; no obstante, han sido
empleados con xito en otras especies y en particular en caoba para la
generacin de callo (Tacoronte et al., 2004).

Figura 12. Procedimiento para la proliferacin de yemas auxiliares y su

propagacin masiva.

39

Figura 13. Estructura de las hojas de Swietenia macrophylla.

40

Figura 14. Caractersticas del tejido ideal para la propagacin in vitro

de caoba. (a) Plntula de caoba a partir de la cual se pueden
obtener explantes .( b) pice de una plntula de caoba, el
tejido joven originado en estas yemas es el ideal para cultivo
in vitro.

B) Preparacin de medios
El medio ideal para la proliferacin de yemas axilares en la caoba es el
de Murashigue-Skoog (MS), as como el medio WPM (Lloyd & McCown,
Woody Plant Medium). Consultar el Anexo 1 para detalles acerca de su
composicin y preparacin.

41

Procedimiento para generar un litro de medio para cultivo in vitro.

1. En un vaso de precipitado de 1 litro agregar 500 ml de agua
destilada. En agitacin adicionar el peso o volumen correspondiente de
macronutrimentos, micronutrimentos, vitaminas, aminocidos y sacarosa
(ver Anexos 1 y 2). Si se usa medio nutritivo comercial, agregar el peso
en gramos correspondiente, de acuerdo con las instrucciones de los
fabricantes. Por ejemplo, el medio MS puede ser de la marca de
Phytotechnology Laboratories, y se agregan 4.33 g por litro; si es WPM
se agregan 2.3 g por litro.
2. Mezclar y disolver 30 g de D-Sacarosa (Figuras 15 y 16).
3. Ajustar el pH a 5.7 (Recuadro 1 y Figura 17 para indicaciones)
4. Agregar el resto de agua hasta completar un litro de volumen final,
usando una probeta.
5. Adicionar el agar y calentar hasta la ebullicin (Recuadro 2). Mezclar bien.
6. Una vez que el medio alcance la ebullicin, se deja enfriar hasta que
sea tolerable su manipulacin pero evitando que se enfre al punto
de comenzar a solidificarse. Se vierte en los tubos o frascos con tapa
con una pipeta o con ayuda de un dispensador (Figura 18). Se
necesitan 7 ml de medio de cultivo por cada tubo de cultivo y 30 ml para
frascos tipo Gerber. Aunque se realice el clculo del volumen requerido
de medio de cultivo, se sugiere preparar un 10 % adicional a la cantidad
calculada ya que siempre se pierde un poco durante este proceso.

42

RECUADRO 1
Ajuste de pH
El pH es una medida del nmero de iones de hidrgeno que existen libres
en una solucin. Esta medida es una escala que va del 0 al 14, siendo 0,
lo ms cido, 7 lo neutro y 14 lo bsico. El mediode cultivo necesita un pH
de 5.7, en el cual se asegura una asimilacin ptima de los nutrientes por
el tejido vegetal.
El ajuste de pH se hace una vez que se han agregado todos los reactivos
al medio excepto el agar.
Con ayuda de un agitador magntico se mantiene en circulacin todo
el lquido en el vaso de precipitado y al mismo tiempo se sumerge el
electrodo del potencimetro a una altura suficiente que cubra por completo
al electrodo. Se debe esperar a que la lectura del pH se estabilice en
la pantalla de aparato y se ajusta al valor deseado de una solucin de
hidrxido de sodio 1N (para subir), o de cido clorhdrico 1N (para bajar).
Por ejemplo, si en pantalla se observa un pH de 6, se agrega cido, si al
contrario se observa un pH de 4, se adiciona hidrxido de sodio.
La cantidad de cido o hidrxido que se ha de agregar depende mucho de
que tan alejado este el pH inicial del pH de 5.7 que se busca. Se sugiere
agregar por goteo, de una en una a la solucin, siempre en agitacin,
y esperando el tiempo suficiente para que se estabilice la lectura en la
pantalla del potencimetro.
NOTAS:
Asegrese que el potencimetro est calibrado, existen sustancias buffer
que son soluciones con un PH conocido y con el cual se ajusta el aparato.
Tome en cuenta que el magneto del agitador debe estar a una distancia
suficiente para no entrar en contacto con el electrodo del potencimetro ya
que por el movimiento puede averiarlo. El electrodo debe ser manejado con
sumo cuidado y permanecer en todo momento hidratado.

43

C) Esterilizacin
Una vez terminada la preparacin del medio, se debe esterilizar para
destruir cualquier organismo (hongos y bacterias) contaminante.
Los tubos con el medio de cultivo se colocan en una gradilla o bien se
pueden hacer paquetes de peridico y cinta adhesiva de tal manera que no
se volteen y as evitar escurrimientos (Figura 19).

Si utiliza una autoclave, debe someter el material a:

Temperatura: 120 C
Presin: 15 lb
Tiempo: 15 minutos
MUY IMPORTANTE:

Siempre cuidar que los tubos permanezcan en posicin vertical

antes y despus de introducirlos a la autoclave.

Una vez pasados los 20 minutos, es recomendable dejar enfriar la

autoclave con todos sus contenidos por al menos 2 horas lo que
permite que los medios solidifiquen, evitando que se derramen.

Una prueba de la correcta preparacin del medio consiste en que una

vez que los tubos se han enfriado, debe ser posible ponerlos de
cabeza y agitarlos sin que el medio de cultivo se deslice. El medio
una vez en los frascos o tubos debe de cambiar de translcido a
opaco (Figura 20).

44

RECUADRO 2
Disolucin del Agar.
El agar es una sustancia que permite que el medio de cultivo se solidifique con
una consistencia gelatinosa, generando as un soporte para el tejido, adems
de mantener una presin de agua favorable para la asimilacin de nutrientes.
Para que el agar solidifique de forma homognea, debe calentarse hasta la
ebullicin.
La manera ms eficiente de disolver el agar es calentar la solucin a la que y se
ha ajustado el pH, y agregar el agar, despus se contina con la agitacin y
el calentamiento hasta alcanzar su completa disolucin que se obtiene con la
ebullicin.
NOTA: la formacin de burbujas por la ebullicin al interior del contenedor
donde se prepare el medio de cultivo puede ser repentina e incotrolable al
momento de calentarla, lo que puede provocar accidentes por el derrame
del lquido. Por esto se recomienda manipular los recipientes siempre con
guantes de tela y, de ser posible, utilizar un vaso de mayor capacidad, es
decir, de un litro si se preparan 500 ml.

Figura 15. (a) Balanza analtica. Se hacen recipientes de papel o papel

aluminio para pesar por separado las sustancias. Asegrese
que una vez colocado el papel y antes de agregar sustancias,
haya presionado el botn de tara (tare), el cual ajusta el
peso a cero.(b) Se extraen las sustancias con ayuda de una
esptula o cuchara seca.
45

Figura 16. Agitador magntico y vaso de precipitados de 1 litro. Antes

de agregar el agar, se ajusta el pH y se disuelve por completo
el medio de cultivo y la sacarosa.

46

Figura 17. Ajuste de pH. (a) Potencimetro. Se muestra el buffer con el

cual se calibra el aparato para un pH de 7 y frascos con HCl y
NaOH 1 N. (b) Se ajusta el pH a 5.7 agregando gotas de HCl
o NaOH y posteriormente se lleva al volumen deseado.
47

Figura 18. Llenado de tubos de cultivo. (a) Se utiliza un dispensador

que facilita el trabajo y lo hace ms preciso ya que vaca una
cantidad fija de medio por cada tubo. (b) Por un extremo se
absorbe el medio y (c) se descarga por completo en un tubo
presionando hacia abajo el mbolo.

Figura 19. Esterilizacin. (a) Se utiliza una autoclave en la cual se

colocan los tubos de forma vertical, para facilitar su manejo y
evitar que se derrame su contenido durante la esterilizacin;
se pueden hacer paquetes con ligas o peridico. (b) Hay que
asegurarse que la autoclave quede bien cerrada para evitar
una mala esterilizacin e, incluso, accidentes. Las condiciones
de esterilizacin son 120 C, 20 min, 15 lb de presin.
48

Figura 20. Caja y tubos de cultivo in vitro con medio de cultivo.

D) Obtencin del explante a partir de plntulas
1) Con tijeras estriles se hace un slo corte en la base de la rama
seleccionada (Figura 21a).
2) Se eliminan los peciolos de las hojas (Figura 21 b).
3) Si el tallo es muy largo y la distancia internodal impide colocarlo
entero en el frasco para su desinfeccin, se recomienda hacer cortes
transversales cuidando que conserven las estructuras (Figura 22).

E) Lavado y desinfeccin del explante

El material vegetal debe ser sometido a un tratamiento de desinfeccin
para evitar el crecimiento de bacterias y hongos que pudieran interferir
con el crecimiento del tejido. El procedimiento implica el uso
49

de distintos desinfectantes de manera secuencial, para lo cual todas

las soluciones deben ser preparadas con agua estril y realizarse en
condiciones de asepsia. Debido a que los tejidos deben sumergirse
totalmente en las soluciones, se recomienda medir la cantidad necesaria
que se va a utilizar para preparar suficiente solucin desinfectante y no
interrumpir el procedimiento. El uso de un agitador mecnico tambin
puede ser til en esta fase.

F) Lavado del material vegetal

Se sugiere lavar con jabn abundante los segmentos de tallo con
movimientos suaves del escobilln o cepillo y repetir al menos 3 veces
para cada trozo. Finalmente, se debe enjuagar con agua corriente entre
cada lavado (Figura 23).

Figura 21. (a) Obtencin de tallo de plntulas de caoba, no se utiliza n

estructuras lignificadas. (b) Explantes. Se indican los cortes
pertinentes de los peciolos para poder procesar el material en
la desinfeccin.
50

Figura 22. Tallo principal indicando la posicin de las yemas favorables

para cultivo in vitro.
51

G) Tratamiento con antioxidante

Despus del lavado, el tejido se sumerge en una solucin de
antioxidante en un frasco nuevo, ya que el tejido debe permanecer
hidratado todo el tiempo (Figura 23).
H) Desinfeccin
Consiste en una serie de pasos secuenciales, los cuales se
realizan en condiciones de esterilidad (Figura 24) (Ver anexos
para preparacin de soluciones).
I) Desinfeccin con etanol al 70 %.
1. Desechar el antioxidante.
2. Agregar etanol al 70 %
3. Agitar durante 1 minuto
4. Desechar el etanol
5. Agregar antioxidante cubriendo bien el tejido
J) Desinfeccin con hipoclorito de sodio comercial (cloro) al 15%.
1. Desechar el antioxidante
2. Agregar el cloro al 15%
3. Agitar durante 10 minutos
4. Desechar el cloro
5. Agregar antioxidante hasta cubrir por completo el tejido

52

K) Tratamiento con fungicida (Captn)

1.Desechar el antioxidante
2.Agregar Captn (2g/l)
3.Agitar durante una hora

Figura 23. (a) y (b) Lavado de explantes. Se utiliza agua corriente

para enjuagar el jabn; (c) los explantes deben sumergirse en una
cantidad suficiente de lquido para asegurar un efecto uniforme
de las soluciones.
53

Figura 24. Desinfeccin. (a) Se vierte el desinfectante (cloro alcohol o

Captn) y comienza a tomarse el tiempo de agitacin una
vez que se ha llenado el ltimo frasco. (b) Se muestra como
se puede agitar varios frascos a la vez con ayuda de
una charola. (c) Un agitador mecnico, que puede ser til para
periodos prolongados de agitacin.
Una vez terminado el tiempo de agitacin se mantienen los tallos en
esta solucin mientras se procede a la siembra.

De ser posible no procesar ms de 5 plantas simultneamente por

persona, ya que los tiempos de agitacin pueden prolongarse
demasiado lo que expone en exceso al tejido a la accin de los
desinfectantes, pudiendo daarlo significativamente.

54

El alcohol ya utilizado puede conservarse para otros usos (por ejemplo

para llenar las lmparas de alcohol), excepto como desinfectante.

L) Siembra de los explantes

Precauciones previas al momento de sembrar:
1. Una vez que se tienen los tallos ya limpios se llevan todos los frascos al
cuarto de cultivo para evitar salir durante la siembra y se asegura de tener
todo el material dispuesto dentro de la campana de cultivo (Figura 25).
2. Se identifica cada frasco o tubo que se utilizar para la siembra con
fecha y origen del tejido. Debe indicar el nombre de la planta de donde
se extrajo el tejido, as como la parte de la planta, ya sea pice, yema
1, yema 2 o yema 3 (Figura 31 y 22). Los frascos se pueden marcar
con plumn indeleble, las leyendas deben de ocupar el menor espacio
posible y colocarse en un solo lado del frasco para poder revisar los tejidos
con facilidad.

M) Procesamiento de los explantes

Dentro de un rea estril, y una vez desinfectado el material vegetal,
se disectan las yemas. Se sugiere cortarlas en orden descendente y
sembrarlas inmediatamente cada una para no perder el origen de cada
tejido, es decir primero el pice y sucesivamente las yemas 1, 2, y 3
(Figura 22). Para cada explante se sigue la siguiente secuencia:
1. Se extrae el tallo desinfectado del frasco con Captn y se coloca
en una caja de Petri (Figura 26).

55

2. Se cortan las bases de las hojas que permanecen unidas al tallo

principal sin afectar a ste con los cortes (Figura 27).
3. Se corta la yema apical y subsecuentemente trozos de tallo de 2 cm,
que incluyan al nudo y las yemas axilares (Figura 28).
4. Se procede a sembrar.
N) Siembra
1. Se toma el explante con las pinzas estriles y se coloca en forma
vertical cuidando siempre colocar la porcin apical del tallo por encima
del nivel del medio de cultivo (Figura 29).
2. El explante se coloca sobre el medio de cultivo, ejerciendo una ligera
presin y procurando no tocar el medio con las pinzas.
3. El explante debe de penetrar en el medio al menos la mitad de su
extensin (Figura 30).
4. Se sellan los frascos con Egapac o Parafilm y se llevan al cuarto de
cultivo (Figura 31).
O) Condiciones de incubacin
La temperatura recomendada es de 30C, con una humedad relativa de
30% y un fotoperodo de 12 horas luz. El desarrollo de yemas axilares
que se pueden obtener por esta tcnica tarda entre 3 y 4 semanas.
P) Resiembras, individualizacin de brotes y enraizamiento
Los medios de cultivo con el tiempo se van deshidratando y los explantes
consumen los nutrimentos. Por ello, es importante realizar resiembras
56

peridicas de los explantes en medio nuevo. Asimismo, a medida que se

alarguen las yemas axilares, estas deben ser individualizadas y sembradas
en el medio para promover su enraizamiento. Es comn que el medio
de resiembras tenga un contenido nutrimental y hormonal diferente al
medio inicial. Para caoba, el medio que se utiliza para las resiembras es
el mismo que para la fase anterior (MS+ sacarosa 30g/l) y se realiza cada
30 das. Algunas veces las yemas enrazan espontneamente bajo estas
condiciones (Figura 32).

Figura 25. Sugerencia de la disposicin de material al interior de la

campana de cultivo.

57

Figura 26. Obtencin de explantes. Los fragmentos de tallo se sacan del Captn
y se colocan en una caja Petri estril para su procesamiento.

Figura 27. Obtencin de yemas. Remocin de restos de bases de hojas

sin llegar a cortar el tallo principal. El tallo debe insertarse en
los tubos de cultivo sin tocar las paredes.
58

yema

Figura 28. Se ajusta la altura del tallo, por encima y por debajo de la
yema debe de mantenerse al menos un centmetro de tallo
principal para conservar las propiedades de proliferacin de
la yema.

Figura 29. Se toma el tallo ya preparado, se destapa el tubo y se inserta

el tejido en el medio. El tubo solamente debe de ser abierto en este
momento y cerrarse inmediatamente despus de haber introducido
el tejido. Se muestra un pice a punto de introducirse al medio.
59

Figura 30. Se introduce la mitad del explante en el medio de cultivo. Se

debe de considerar la posicin vertical de la yema para no
introducir de cabeza el tejido.

Figura 31. Tejidos ya sembrados en sus tubos debidamente identificados

con: fecha de siembra, tipo de medio, nombre del individuo del
que se extrajo el tejido, origen y tipo de tejido (pice o yemas
axilares). Se muestra de izquierda a derecha: el pice, yema1,
yema 2 y yema 3 (ver Figura 22).
60

Figura 32. Desarrollo de una plntula completa de S. macrophylla en medio

de cultivo MS. Esta planta se obtuvo a partir del trasplante de
tejido generado in vitro con la tecnologa aqu propuesta.
Q) Monitoreo
Se recomienda llevar una bitcora con las anotaciones de seguimiento
del desarrollo in vitro. Durante la primera semana despus de iniciado el
cultivo se debe tener cuidado en revisarlos diariamente para detectar de forma
oportuna la presencia de agentes contaminantes. Ms adelante, se pueden
61

realizar revisiones quincenales o mensuales para evaluar supervivencia y

contaminacin, as como para detectar los individuos y tratamientos con
los mejores resultados. Se anexa una tabla sugerida para llevar el control
de estos parmetros donde se puede registrar la fecha, el tratamiento,
el desempeo de cada individuo y de cada yema (Anexo 2).
Es conveniente identificar cada una de las partes del explante, con el
fin de establecer el origen de cada tejido a la hora de sembrar, para su
seguimiento durante la incubacin (Figura 31).
La Figura 32 muestra un individuo con races obtenido mediante la
tcnica descrita.

Formacin de callo
El callo se refiere a la proliferacin desorganizada de clulas de
parnquima. Se origina en zonas en las que han ocurrido lesiones, y
evita la entrada de agentes patgenos. Sin embargo, tambin se genera
como consecuencia del cultivo in vitro y su desarrollo tiene importantes
aplicaciones biotecnolgicas (George, 1993).
Los callos varan considerablemente en su apariencia y textura, desde
masas de clulas nodulares compactas o muy suaves. Suelen ser
blancos o de color crema, anaranjados o verdes, dependiendo si contienen
o no cloroplastos, e incluso algunos callos tienen clulas con distintas
coloraciones como distinta forma y diferente estado de diferenciacin
(Robledo-Paz et al., 2006).
La formacin de callo in vitro a partir de un explante se divide en tres
etapas: (1) la induccin de divisiones celulares, por lo general inicia
en los sitios donde ocurri la lesin al producir el explante; (2) perodo
de divisin muy activa, en el que las clulas del explante pierden las
62

caractersticas que tenan antes del cultivo (se desdiferencan) como

consecuencia de la influencia de hormonas vegetales (auxinas y citocininas);
y (3) perodo en el que disminuyen e incluso cesan las divisiones celulares e
inicia la diferenciacin.
Con el callo es factible producir yemas, races o embriones somticos
(se forman a partir de tejido vegetativo, sin que haya habido fecundacin).
Asimismo, funciona para obtener cultivos de clulas en suspensin y
protoplastos, o para la sntesis in vitro de compuestos qumicos vegetales
(metabolitos secundarios). Finalmente, se les puede almacenar a largo
plazo en bancos de germoplasma.
Los callos se producen a partir del cultivo de casi cualquier tipo de
explante. A continuacin se describe un protocolo para la obtencin de callos
a partir del cultivo de hojas jvenes de caoba.

A) Preparacin de medios
1. El medio ideal para la proliferacin de callo de caoba es el MS. (Consultar el
Anexo 1 para detalles acerca de su composicin).
2. Para 1 litro de medio, se agregan 500 ml de agua destilada a un vaso
de precipitado. En agitacin, se adicionan los macronutrimentos,
micronutrimentos, vitaminas, aminocidos y sacarosa en las
cantidades correspondientes (Anexo 1). Si se usa medio nutritivo
comercial, agregar el peso en gramos indicado por el proveedor
(stos ya contienen todos los nutrimentos necesarios). Agitar hasta
disolverlo todo.
3. Adicionar10mg/ldelaauxinasinttica2,4-D(cido2,4-Diclorofenoxiactico).
4. Ajustar el pH a 5.7
63

5. Aforar a 1 litro y agregar el agar.

6. Calentar para disolver el agar y verter en frascos tipo Gerber (30 ml).
7. Esterilizar a 121C, 115 lb, durante 20 minutos.
8. Esterilizar tambin papel secante (envolver en papel aluminio antes
de meter en la autoclave).

B) Lavado y desinfeccin del explante

1. Con una tijera, separar foliolos del peciolo de hojas jvenes de caoba
(Figura 13) (las ms cercanas al pice o punta de crecimiento).
2. Sumergir y agitar durante 5 minutos en una solucin de detergente lquido.
Posteriormente con la ayuda de un escobilln y abundante agua lavar
los foliolos y enjuagar .
3. En la campana de flujo laminar, y en condiciones de esterilidad,
colocar los foliolos en un vaso de precipitados y sumergirlos durante
1 minuto en alcohol al 70%. Se elimina el alcohol.
4. Agregar cloro al 15% durante 1 minuto, despus de lo cul se desecha
y los foliolos se enjuagan 3 veces con agua destilada estril.

C) Siembra de los explantes

Una vez enjuagadas, los foliolos se procesan uno por uno como se
describe a continuacin:
1. Se extraen los foliolos uno por uno y se elimina el exceso de humedad sobre
una sanita (o toalla de papel) previamente esterilizada.

64

2. Se colocan en una caja Petri y con ayuda de un bistur y pinzas de

diseccin estriles se cortan trozos de aproximadamente 1 cm2. El
tamao es importante ya que se ha observado que los explantes mas
pequeos no sobreviven.
3. Se colocan de 4 a 5 explantes en cada frasco con medio de cultivo, con el
envs de la hoja en contacto con el medio. Se sellan los frascos con
Parafilm o Egapack y se ponen a incubar.

D) Condiciones de incubacin y resiembras.

Los frascos con explantes se colocan a 28C, a la luz, con un fotoperodo
de 16 horas luz, 8 de oscuridad. Los explantes se resiembran cada 30 das y
se colocan sobre el mismo medio.

E) Monitoreo
Durante la primera semana despus de iniciado el cultivo es conveniente
realizar revisiones diarias para detectar a tiempo la presencia
de agentes contaminantes. Despus se pueden realizar monitoreos
quincenales o mensuales para evaluar supervivencia, y contaminacin,
para eventualmente evaluar que individuos nos han dado los mejores
resultados. Se anexa una tabla sugerida para llevar las anotaciones
(Anexo 2).

65

CONSIDERACIONES FINALES.
Los mtodos presentados en este manual constituyen la base para el
desarrollo de ulteriores investigaciones en la fisiologa y gentica de
la caoba. An existen profundas lagunas en el conocimiento de esta
especie, desde la misma manutencin a largo plazo de cultivos in vitro,
la regeneracin de plantas adultas a partir de estas tcnicas, hasta el
desarrollo de investigacin sobre sus rutas bioqumicas y la produccin
de metabolitos naturales con potencial de defensa en contra de plagas.
Las tcnicas que se han utilizado para el establecimiento de la caoba
in vitro en el Laboratorio de Biotecnologa del INIFAP CENID-COMEF
pueden ser transmitidos de manera personal y prctica a cualquier
persona interesada ya sean silvicultores, estudiantes o investigadores de
otras instituciones.
Toda correspondencia relacionada con esta publicacin o las tcnicas
aqu descritas, favor de dirigirla a:
Dra. Ana Laura Wegier Briuolo
Laboratorio de Biotecnologa Forestal,
CENID COMEF, INIFAP.
Av. Progreso No. 5
Barrio de Santa Catarina
C.P. 04010 Mxico D.F.
Correo-e: wegier.ana@inifap.gob.mx
Telfono (01 55) 3626 8700 ext. 608

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and somatic cell genetics in plants, Vol. 1. Academic Press, Inc. New York, NY USA. pp. 49-60.
Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. http://www.tropicos.org 1(6 Jan 2013)
Wightman, K., B. Rodrguez Santiago, S. Ward, and J. Cornelius. 2005. Domestication of Spanish
cedar and mahogany in the Yucatan Peninsula of Mexico: experiences in forest tree
germplasm improvement. Recursos Naturales y Ambiente 44: 119-128.

70

ANEXOS

71

72

Resumen del protocolo para la proliferacin de yemas axilares de caoba

Preparacin de un litro de medio cultivo MS.
1.

En un vaso de precipitados de 1 litro se vierten 500 ml de agua destilada.

2.

Se agregan 30 g de D-sacarosa y los componentes del medio MS(4.33 g), se agita hasta que
se disuelva.

3.

Se ajusta el pH a 5.7.

4.

Se afora a 1 litro.

5.

Se agrega el agar y se calienta con agitacin hasta disolver, permitir la ebullicin al menos
dos veces.

6.

Se vierten 7 ml de medio cultivo por cada tubo, o 30 ml por cada frasco tipo Gerber.

7.

Se esterilizan los tubos tapados durante 15 minutos, a 15 lb t 121C.

Obtencin de Explantes.
1.

Con tijeras estriles se corta una rama desde la base, la rama debe de contar con un tallo
principal no lignificado y dos yemas auxiliares y un pice.

2.

Se separan las hojas sin eliminar la base del peciolo para no maltratar las yemas.

3.

Se recortan los tallos de forma que no se afecten las yemas pero que se puedan sumergir en
frascos con antioxidante.

4.

Se sumergen en un frasco con antioxidante para proceder al lavado.

Lavado.
1.

Se elimina el antioxidante.

2.

Lavar con jabn lquido y con un cepillo o escobilln. Con movimientos suaves se talla toda la
superficie del tallo. Repetir 3 veces.

3.

Se coloca el tejido en un frasco estril para continuar con la desifeccin.

Desinfeccin.
1.

Sumergir el tejido en alcohol al 70% durante 1 minuto con agitacin contnua. Eliminar el
alcohol.

2.

Se decanta el antioxidante y se sumerge en Captn con agitacin constante y durante una

hora.

3.

Se mantiene el tejido en captan hasta la siembra.

Siembra.
Se desinfecta la mesa o campana de cultivo tallando con algodn y alcohol al 70%. Se desinfecta
el cuarto de siembra con luz UV durante 15 minutos.
El tejido se extrae del captan y se coloca en cajas de Petri estriles.
Se cortan secciones del tallo, de tal forma que cada una contenga un nudo con las yemas auxiliares
en la parte media del explante.

73

1.-Material y equipo
Cristalera
Matraces Erlenmeyer de 1000 ml
Probetas de 1000 ml
Vasos de precipitado de 1000 ml
Matraz aforado 100 ml
Frascos tipo Gerber o ISO para cultivo in vitro
Tubos para cultivo in vitro
Tapas de plstico esterilizables para frascos o tubos
Equipo

Campana de flujo laminar

Autoclave
Balanza analtica
Agitador magntico con plancha calefactora (o bien un microondas
o mechero)
pH-metro.
Pipeta dispensadora de medio (o una pipeta normal)

Material
Guantes de cocina de tela o para sujetar objetos calientes.
Papel de Aluminio
Plstico Egapac o Parafilm
Servitoallas o sanitas
Tijeras estriles
Reloj o cronmetro
Cepillo pequeo o escobilln de preferencia estril.
Guantes de plstico
Otros
Detergente lquido

74

2.- Preparacin de medios y soluciones

Medio Murashigue y Skoog (MS) (Gamborg y Phillips, 1995)
mg/l

Stock

ml/l

(g/100 ml)
Macronutimentos

(100X)

NH4NO3

1650

165

K NO3

1900

190

CaCl22H2O

440

44

MgSO47H2O

370

37

KH2PO4

170

10 ml

17

Micronutrimentos

(1000X)

H3BO3

6.2

6.2

ZnSO4H2O

8.6

8.6

CuSO45H2O

0.025

0.025

KI

0.83

0.83

CoCl26H2O

0.025

0.025

MnSO44H2O

22.3

22.3

NaMoO42H2O

0.25

0.25

Fe/EDTA

1 ml

(100X)

FeSO47H2O

27.8

2.78

Na2EDTA2H2O

37.3

3.73

10 ml

Compuestos orgnicos
Myo-inositol

100

Niacina

0.5

0.05

PiridoxinaHCl

0.5

0.05

TiaminaHCl

0.1

0.01

Glicina
Sacarosa
Agar

Se pesa y adiciona al momento

2
30000 (30g/l)

10 ml

0.2
Se pesa y adiciona al momento

8000 (8g/l)

pH: 5.7-5. 8 se ajusta antes de agregar el agar.

Componente: Frmula qumica del compuesto.
mg/l: indica cuntos miligramos del compuesto debe tener el medio una vez preparado.
Stock (g/100 ml): son soluciones concentradas de los compuestos. Se agrupan en Macronutrimentos, Micronutrimentos, Fe-EDTA,
Compuestos orgnicos. Facilita el pesado y manejo. Una vez preparados almacenar en refrigeracin.
ml/l: indica cuntos ml de las soluciones stock se usan para preparar 1 l de medio, para que tengan las concentraciones adecuadas
de los nutrimentos.
La sacarosa, el Myo-inositol y el agar se agregan al momento de usarse.

75

Medio Woody Plant Medium (WPM) (Lloyd y McCown, 1980)

mg/l

Stock (g/100ml)

Macronutimentos
NH4NO3

400

40

Ca(NO3)2

386

38.6

CaCl22H2O

72.5

7.25

MgSO4, Anhidro

180.7

18.7

KH2PO4

170

10 ml

17

Micronutrimentos
H3BO3

ml/l

(100X)

(1000X)
6.2

6.2

ZnSO4H2O

8.6

8.6

CuSO45H2O

0.25

0.25

KI

0.83

0.83

CoCl26H2O

0.025

0.025

MnSO44H2O

22.3

22.3

NaMoO42H2O

0.25

0.25

Fe/EDTA

1 ml

(100X)

FeSO47H2O

27.8

2.78

Na2EDTA2H2O

37.3

3.73

10 ml

Compuestos orgnicos
Myo-inositol

100

Niacina

0.5

0.05

PiridoxinaHCl

0.5

0.05

TiaminaHCl

0.1

Glicina

0.2

Sacarosa
Agar

30000
(30g/l)

Se pesa y adiciona al momento

10ml

Se pesa y adiciona al momento

8000 (8g/l)

pH: 5.7-5. 8 se ajusta antes de agregar el agar.

Componente: Frmula qumica del compuesto.
mg/l: indica cuntos miligramos del compuesto debe tener el medio una vez preparado.
Stock (g/100 ml): son soluciones concentradas de los compuestos. Se agrupan en Macronutrimentos, Micronutrimentos, Fe-EDTA,
Compuestos orgnicos. Facilita el pesado y manejo. Una vez preparados almacenar en refrigeracin.
ml/l: indica cuntos ml de las soluciones stock se usan para preparar 1 l de medio, para que tengan las concentraciones adecuadas
de los nutrimentos.
La sacarosa, el Myo-inositol y el agar se agregan al momento de usarse.

76

3.- Soluciones desinfectantes

Nota: Todas las soluciones se preparan en condiciones aspticas,
es decir tanto los recipientes como el agua que se utilice debieron
haber sido esterilizados previamente.
Alcohol 70% (1l)
730 ml de etanol al 96%
Agua destilada estril.
Medir el volumen de etanol deseado en una probeta y aforar a 1L
con el agua destilada. SI no se usa en el mismo da, se recomienda
guardar en un frasco con tapa de rosca previamente esterilizado, en
refrigeracin.
Nota: el alcohol NO SE ESTERILIZA
Cloro 15% (1 l)
150 ml de cloro comercial
Agua destilada estril
Medir el volumen de cloro deseado en una probeta y aforar a 1L con
el agua destilada. Verter en matraces Erlenmeyer o frascos con tapa
y almacenar.
Nota: el cloro NO SE ESTERILIZA
Solucin fungicida (1 l)
2 g de Captn
Agua destilada estril
Se pesan los 2 g de Captn y se disuelven en 1 litro de agua destilada
estril. La mezcla se puede hacer en un vaso de precipitado o en
un matraz Erlenmeyer, previamente esterilizados. Para facilitar el
mezclado, se puede agitar en un agitador magntico por 2 minutos (el
magneto debi haber sido esterilizado junto con el matraz).
77

Nota: El Captn es un fungicida de amplio espectro que es utilizado

comnmente para el control de hongos por aspersin en campos de
cultivo. Se recomienda usar cubre boca cuando se pesa y manipula
para evitar su inhalacin.
4.- Solucin antioxidante (1 litro)
1 g de cido ascrbico
1 g de cido ctrico
Agua destilada estril
Pesar el cido ascrbico y ctrico y disolver en el volumen de agua
con la ayuda de un agitador magntico.
5.- Soluciones para ajustar pH
cido clorhdrico (HCl) 1N (100 ml)
Colocar 50 ml de agua bidestilada en un matraz aforado.
Agregar 6.85 ml de HCl concentrado con mucho cuidado.
Aforar a 100ml.
NOTA: MUCHO CUIDADO siempre al trabajar con el HCl, ya que
puede causar quemaduras severas. Al reaccionar con el agua, la
solucin puede calentarse, as que tomar precauciones. Si entra en
contacto con la piel, enjuagar con abundante agua corriente hasta que
la sensacin de quemado desaparezca (dependiendo de la gravedad
de la quemadura, esto puede durar de un par de minutos a mas de
15 minutos).
Hidrxido de Sodio (NaOH) 5N (100 ml)
Pesar 4 g de NaOH

78

 Disolver en 50 ml de agua destilada.

Una vez disuelto, aforar a 100ml en un matraz aforado
NOTA: Al entrar en contacto con el agua, ste se calienta. Tomar precauciones.

79

4.-Formato sugerido para el monitoreo de los cultivos.

80

ABREVIATURAS
gramos
miligramos
metro
centmetro
milmetro
litro
mililitro
hectrea
libras
Medio Papa Dextrosa Agar
Medio Murashigue y Skoog
Medio Woody Plant Medium
cido 2,4-Diclorofenoxiactico

g
mg
m
cm
mm
l
ml
ha
lb
PDA
MS
WPM
2,4-D

81

Esta publicacin fue financiada por el Fondo CONAFOR-CONACYT dentro

del proyecto Generacin de lneas celulares de Swietenia macrophylla King
resistentes al Barrenador de las Meliceas (Hypsipyla grandella Zeller)
mediante la integracin del gen Bt, cuyo nmero de registro es 148409.

82

La presente publicacin indica las condiciones y procedimientos ideales

para el establecimiento de la caoba in vitro como son:

preparacin de medios de cultivo

germinacin de semilla in vitro

el origen y caractersticas del tejido para evitar

hongos endfitos y asegurar el desarrollo vegetativo

desinfeccin del tejido

condiciones de incubacin de los cultivos

generacin de callo

83

84

COMIT EDITORIAL DEL CENID-COMEF

Dr. Fabin Islas Gutirrez

Presidente

M.C. Toms Hernndez Tejeda

Secretario Tcnico

Bil. Francisco Resndiz Martnez

Dra. Cecilia Nieto de Pascual Pola
M.C. Marisela C. Zamora Martnez
Vocales

Toda correspondencia relacionada a esta publicacin, favor de dirigirla a:

Dra. Ana Laura Wegier Briuolo

Av. Progreso No. 5
Barrio de Santa Catarina
C.P. 04010 Mxico D.F.
Correo-e: wegier.ana@inifap.gob.mx
Telfono (01 55) 3626 8700 ext. 608

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