Guia

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOTECNOLOGICAS
UNIVERSIDAD DE SAN MARTIN
BIOTECNOLOGIA DE
MEDICAMENTOS Y ALIMENTOS
GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS
Biotecnologa de Alimentos y Mmentos
CLASES
Clases Tericas: Mircoles de 14 a 16.30; Viernes de 17.30 a 19.30
Trabajos Prcticos: Mircoles de 8.30 a 13
Docentes:
Dr. Pablo Nikel
JTP: Dra. Marcela Brocco
Silvina Rosa
Virginia Tribulatti
Juan Burdiso
Claudia Hermann
Mara Ana Meira
Soledad Guidoln
Ral Cosentino
Biotenologa de Medicamentos y Alimentos
Biotecnologa de Alimentos y Medicamentos

Cronograma de clases tericas 2010
Fecha
Marzo
Docente
Mircoles 10
Viernes 12
Pablo I. Nikel
Mircoles 17
Viernes 19
Mircoles 24
Viernes 26
Mircoles 31
Pablo I. Nikel
Abril
Pablo I. Nikel
Mircoles 14
Viernes 16
Mircoles 21
Viernes 23
Mircoles 28
Viernes 30
Silvina M. Rosa
Pablo I. Nikel
Nancy I. Lpez
Pablo I. Nikel
Mayo
Pablo I. Nikel
Viernes 14
Mircoles 19
Viernes 21
Mircoles 26
Viernes 28
Formulacin de medios de cultivo industriales.

Fuentes de carbono utilizadas en medios de cultivo
industriales. Aditivos de bajo costo. Inculos.
Transferencia de masa y energa en biorreactores.
Ciclo de seminarios I.
Utilizacin industrial de algas. Aceite unicelular y
otras aplicaciones. Fotobiorreactores.
Herramientas para la optimizacin racional de
bioprocesos: produccin heterloga de polihidroxialcanoatos bacterianos como ejemplo.
Enzimas y microorganismos extremfilos.
Ciclo de seminarios II.
Primer examen parcial
Mircoles 5
Viernes 7
Mircoles 12
Introduccin. Definiciones y conceptos importantes.

Historia e hitos en Biotecnologa. Impacto de la
Biotecnologa en la sociedad.
Revisin de conceptos bsicos de metabolismo
microbiano. Metabolismo primario y secundario.
Cintica del crecimiento microbiano. Sistemas de
cultivo: en lote, lote alimentado y continuo.
Relaciones
estequiomtricas,
rendimiento
y
productividad.
Termodinmica del crecimiento microbiano. Modelos
metablicos sencillos y balances. Nociones de
Ingeniera metablica.
Feriado
Libre
Diseo de fermentadores. Concepto de escala.
Descripcin matemtica y aplicaciones.
Feriado
Viernes 2
Mircoles 7
Viernes 9
Tema
Sergio Angel
M. Julia Pettinari
Pablo I. Nikel
Produccin industrial de cidos orgnicos.

Produccin industrial de bioetanol. Produccin
industrial de biomasa de levadura.
Obtencin de antibiticos.
Utilizacin de sistemas recombinantes para la
produccin de protenas recombinantes.
Obtencin de bioproductos reducidos utilizando
mutantes regulatorias de Escherichia coli.
Anlisis de flujos metablicos como herramienta
relevante en Biotecnologa. Metodologas.
Anlisis de flujos metablicos. Aplicaciones.
Biotenologa de Medicamentos y Alimentos
Junio
Mircoles 2
Viernes 5
Mircoles 9
Viernes 12
Mircoles 16
Viernes 19
Mircoles 23
Edgardo O.
Albert
Fermentacin en estado slido.
Cultivo de hongos comestibles.

Pablo I. Nikel
Ciclo de seminarios III y IV.
Gustavo Curutchet Biorremediacin y tratamiento de efluentes.
Pablo I. Nikel
Procesamiento industrial aguas abajo. Escalado.
Gustavo Curutchet Biorremediacin y tratamiento de efluentes.
Segundo examen parcial

Programa terico 2010
___________________________________________________________________________
Unidad I. Biotecnologa: definiciones bsicas e hitos histricos en el desarrollo de
las disciplinas asociadas a la Biotecnologa. Disciplinas y campos de actividad. Tecnologas
concurrentes y vinculacin con disciplinas bsicas. Impacto econmico (mercados, productos
y perspectivas regionales de desarrollo). Estado actual en el mundo, la regin y el pas.
Prioridades en Biotecnologa.
Unidad II. Metabolismo, cintica y termodinmica del crecimiento microbiano.
Anabolismo y catabolismo. Metabolismo microbiano primario y secundario. Conversin del
sustrato en biomasa, energa y productos del metabolismo celular. Fases en la curva de
crecimiento y velocidad especfica de crecimiento. Cintica de formacin de productos y
utilizacin de sustrato. Productividad y rendimiento. Ecuacin de Monod y cintica
enzimtica. Sistemas de cultivo: en lote, lote alimentado y continuo. Ecuaciones de balance
de masa. Anlisis energtico y termodinmico del crecimiento microbiano. Anlisis de
consistencia. El modelo metablico de caja negra. Balances estequiomtricos y de grado de
oxidacin/reduccin. Balance de generacin de calor. Sistemas sobre-determinados.
Nociones de Ingeniera metablica y su aplicacin para el diseo racional de bioprocesos.
Unidad III. Fermentadores y sistemas de cultivo. Caractersticas generales de las
fermentaciones confinadas. Condiciones fsico-qumicas necesarias para el crecimiento
microbiano. Fermentaciones sumergidas y utilizando sustratos slidos. Fermentadores:
diseo, operacin y control. Modos operacionales y sus aplicaciones. Cultivos de alta
densidad celular. Requerimientos en los biorreactores utilizados para el cultivo de clulas de
mamfero y clulas vegetales. Operaciones unitarias. Operaciones monospticas:
esterilizacin y limpieza in situ de biorreactores. Condiciones tcnico-econmicas para el
desarrollo de fermentaciones industriales. Sistemas de control y bioseguridad. Sensores y
monitoreo en lnea. Formulacin de medios de cultivo compatibles con la produccin a escala
industrial. Seleccin de componentes y aditivos de bajo costo. Requerimientos especiales
para el cultivo de clulas de mamfero. Preparacin de inculos.
Unidad IV. Transferencia de masa y energa. Mezclado y heterogeneidad en
fermentaciones industriales. Fuerzas de corte. Adicin de oxgeno y eliminacin de dixido
de carbono en fermentaciones aerbicas. Coeficientes de difusin. Transferencia de masa
gas-lquido: el concepto de kLa. Metodologas para la determinacin de la velocidad de
transferencia de oxgeno. Generacin de sub-productos. Sistemas no ideales: comportamiento
de las dispersiones. Disipacin de calor y control de la temperatura.
Unidad V. Aplicaciones biotecnolgicas de las algas. Caractersticas generales de la
fisiologa, bioqumica y filogenia de algas relevantes en la industria. Cultivo masivo de algas.
Fotobiorreactores: caractersticas generales, ventajas y desventajas de su utilizacin.
Productos de inters a partir de algas: aceite unicelular como ejemplo. Produccin industrial
de cido docosa-4:7:10:13:16:19-hexaenoico (DHA) utilizando microalgas del gnero
Auriantiochytrium. Optimizacin de las condiciones de crecimiento y acumulacin de DHA.
Unidad VI. Metodologas para el diseo racional y mejoramiento cuantitativo de

bioprocesos. Estrategias clsicas, de Ingeniera Gentica y de Ingeniera Metablica para la
manipulacin y mejora de bioprocesos. Obtencin y utilizacin de mutantes con propiedades
modificadas para su aplicacin industrial. Mutantes regulatorias. Manipulacin del
metabolismo redox y catabolismo de carbono. Estrategias del tipo un factor a la vez.
Metodologas de optimizacin evolutiva. Diseos experimentales estadsticos, metodologa
de superficies de respuesta y redes neuronales artificiales.
Unidad VII. Tecnologa enzimtica y aplicaciones industriales de las enzimas.
Enzimas: generalidades. Microorganismos como fuentes de enzimas. Utilizacin de enzimas
aisladas como biocatalizadores: amilasas, proteasas y lipasas. Otras enzimas bacterianas.
Utilizacin industrial de las enzimas. Campos de aplicacin, mercados e importancia
econmica. Enzimas inmovilizadas. Mtodos para la inmovilizacin de enzimas y sus
ventajas. Organismos extremfilos y Biotecnologa. Caractersticas de algunos
microorganismos extremfilos: termfilos, acidfilos, alcalfilos, etc. Enzimas provenientes
de organismos extremfilos y sus aplicaciones.
Unidad VIII. cidos orgnicos. Produccin industrial de cidos orgnicos.
Aplicaciones y estado del mercado mundial. Microorganismos productores y secretores de
cidos orgnicos. Produccin biotecnolgica de cido ctrico. Caractersticas fisiolgicas,
bioqumicas y morfolgicas de algunos microorganismos productores de cido ctrico:
Aspergillus niger como ejemplo. Factores que afectan la produccin en cultivos industriales.
Eleccin del sistema de cultivo. Caractersticas fsico-qumicas y nutricionales del medio de
cultivo e influencia de cationes metlicos divalentes. Tratamiento de sustratos complejos para
la produccin biotecnolgica. Metodologas para separacin y purificacin del producto.
Unidad IX. Aplicaciones de las levaduras en Biotecnologa. Levaduras de inters
industrial: Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y levaduras no convencionales. Cepas
industriales y de laboratorio: obtencin utilizando metodologas clsicas y de ADN
recombinante. Estabilidad genotpica y fenotpica. Procesos y materias primas utilizados para
la obtencin de biomasa de levadura para panificacin. Propiedades metablicas durante la
fermentacin aerbica y anaerbica: el efecto Crabtree y el efecto Pasteur. Sub-productos y
procesamiento aguas abajo . Osmotolerancia, tolerancia a etanol y cidos orgnicos.
Resistencia al estrs. Aplicaciones de levaduras en la industria enolgica.
Unidad X. Antibiticos. Revisin del metabolismo microbiano primario y
secundario. Cintica de formacin de productos. Tipos de antibiticos y sus mecanismos de
accin. Regulacin de la biosntesis y su impacto en las tecnologas de produccin.
Biosntesis de antibiticos en Streptomyces y Penicillium. Manipulacin de cepas en el
laboratorio y su aplicacin en procesos industriales: sistemas de cultivo y utilizacin de
materias primas de bajo costo. Purificacin. Clonado de genes que dirigen la sntesis de
antibiticos. Nuevos antibiticos.
Unidad XI. Produccin de protenas recombinantes en distintos sistemas de

expresin. Vectores de expresin en procariotas. Caractersticas de diferentes cepas
bacterianas para optimizar la produccin de protenas recombinantes. Protocolos para
resolver algunos de los problemas comunes encontrados durante la expresin y purificacin
de protenas recombinantes. Clonado y vectores de levaduras. Transformacin de
Saccharomyces cerevisiae. Expresin y purificacin de protenas recombinantes en
levaduras. Expresin de protenas heterlogas en plantas. Mtodos de transformacin.
Vectores virales y amplicones. Expresin de protenas en clulas de mamferos. Vectores y
clonado. Aplicaciones biotecnolgicas.
Unidad XII. Anlisis de flujos metablicos como herramienta relevante en
Biotecnologa. Integracin de los conceptos de genmica, transcriptmica, protemica y
metabolmica. Anlisis de flujos metablicos estequiomtrico (balance de flujos). Modelos
metablicos matemticos. Alcances y limitaciones. Funciones de ajuste: crecimiento y
generacin de energa. Anlisis de flujos metablicos basados en marcacin isotpica.
Solucin a las limitaciones impuestas por el modelo estequiomtrico. Metodologas para la
marcacin. Marcacin radioactiva: experimentos de pulso. Marcacin isotpica no radiactiva:
sustratos conteniendo 13C. Isotopmeros posicionales y de enriquecimiento. Matrices de
mapeo atmico. Metodologas de derivatizacin de metabolitos y deteccin (cromatografa de
gases acoplada a espectrometra de masas y resonancia magntica nuclear). Integracin de los
datos experimentales in silico. Funciones de ajuste y criterios de convergencia. Interpretacin
fisiolgica de los resultados.
Unidad XIII. Fermentacin en estado slido y cultivo de hongos comestibles.
Fermentacin slida (FES): sustratos empleados, pre-tratamientos y microorganismos
involucrados. Propiedades de los hongos que favorecen el uso de FES. Biorreactores,
clasificacin y tipos. Medicin de biomasa. Aplicaciones de FES. Ventajas y desventajas.
Comparaciones entre FES y fermentacin lquida. Cultivo de hongos comestibles: produccin
de alimentos en FES. Especies mundialmente cultivadas. Propiedades nutritivas y
medicinales de los hongos comestibles. Etapas del cultivo. Obtencin de cepas. Factores a
considerar para la seleccin y evaluacin de cepas. Sustratos no compostados y compostados:
formulacin, tratamiento trmico, siembra, incubacin y produccin. Mecanismos de
induccin. Salas de produccin y control del medio ambiente. Ventilacin y control de CO2.
Cultivo de Pleurotus en sustrato no compostado y de Agaricus bisporus en sustrato
compostado. Principales diferencias en las metodologas. Produccin de Lentinula edodes en
troncos.
Unidad XIV. Procesamiento industrial aguas abajo y escalado. Separaciones
slido-lquido. Centrifugacin. Filtracin: filtros de presin reducida (o vaco), micro- y
ultra-filtracin. Ruptura celular y recuperacin de productos. Precipitacin. Separaciones
lquido-lquido. Aplicacin de tcnicas cromatogrficas para separacin y purificacin de
productos de inters biotecnolgico. Metodologas para el secado y formulacin de productos
slidos. Tratamiento de efluentes y biorremediacin. Ejemplos prcticos. Factores limitantes
para el escalado de bioprocesos. Criterios para el salto de escala: igualdad en el consumo de
energa, en la transferencia de oxgeno, en el tiempo de mezclado y en la velocidad de los
agitadores.
Bibliografa bsica de Biotecnologa
Bains W. (1993). Biotechnology from A to Z. IRL Press, Oxford.

Baltz RH, Hegeman G, Skratud PL (1993). Industrial Microorganism, Basic and
Applied Molecular Genetics. ASM Press.
Debergh P, Zimmerman R (Eds.) (1991). Micropropagation: Technology and
Application. Kluwer Acad. Press, The Nederlands.
Demain A (1984). Biology of Industrial Microorganisms. Addison-Wesley, USA.
Demain A, Solomon N (1986). Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology. ASM Press, Washington DC, USA.
Demain A, Davies J (Eds. in chief) (1999). ). Manual of Industrial Microbiology and
Biotechnology 2nd Ed. ASM Press, Washington DC, USA.
Franks F (1993). Protein Biotechnology. Isolation, Characterization and
Stabilization. Human Press Inc., NY, USA.
Glazer A, Nikaido H (Eds.) (1995). Microbial Biotechnology. WH Freeman & Co.,
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Glick B, Pasternak J (1994). Molecular Biotechnology. ASM Press, Washington DC,
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Hui Y, Kachaturian G (Eds.) (1994). Food Biotechnology Microorganisms. VCH
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Moses V, Moses Sh (1995). Exploiting Biotechnology. Harwood Acad. Publichers
GmbH.
Peters JH, Baumgarten H (Eds.) (1992). Monoclonal Antibodies. Springer Verlag,
USA.
Sheehan D (Ed.) (1997). Bioremedaition Protocols. Humana Press, NJ, USA.
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Wang D (Ed. in chief) (1979). Fermentation and Enzyme Technology. Wiley &
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White M, Reuveny S, Shaferman A (Eds.) (1991). Biology from Recombinant
Microorganisms and Animal Cells: Production and Recovery. Verlag Chemie.
Woodward J (Ed.) (1985). Inmobilized Cells and Enzymes. A Practical Approach.
IRL Press, Oxford.
Publicaciones en Biotecnologa
Applied Microbiology & Biotechnology. Springer Verlag.

Bio-Biotechnology. Nature Publishing Co. NY, USA.
Biotechnology & Bioengineering
Biotechnology Progress
Biotechnology Newswatch. McGraw Hill Inc. NY, USA.
Critical Reviews in Biotechnology
Genetic Engineering and Biotechnology. Emerging Technology Series. United
Nations Industrial Development Organization.
4
Trends in Biotechnology
Trends in Food Science & Technology. Elsevier Science Publ. Ltd. NY USA.
Journal of Agricultural and Food Chemistry
Journal of Food Science
Journal of Pharmaceutical Science
Journal of th Science fo Food and Agricultural
Nature Biotechnology
Algunas de estas publicaciones pueden ser consultadas en la biblioteca del INTI.
PREPARACIN DE INFORMES
Por qu preparar informes?
El proceso de descubrimiento cientfico depende de una correcta y eficiente
comunicacin entre los actores involucrados, es decir los investigadores. Este flujo de
informacin ocurre en su mayor parte mediante los peridicos cientficos (journals) y
forma parte integral del proceso que mencionamos anteriormente. Es por ello muy
importante aprender las reglas y costumbres que se utilizan en la comunicacin escrita
entre cientficos. La elaboracin de informes es una etapa importante en el aprendizaje
de la comunicacin escrita que ocurre no slo en la ciencia bsica, sino tambin en la
ciencia aplicada donde es habitual la elaboracin de informes dentro de las compaas o
como resultado de anlisis.
Por tanto, no slo el contenido de los informes, sino tambin la claridad,
gramtica, ortografa como as tambin la estructura, el formato y la presentacin del
texto sern evaluados en cada informe.
A continuacin se detallan algunas normas que sirven como referencia para
escribir informes. Esta lista no pretende ser extensiva sino slo una gua de ayuda.
Estructura de un informe
Cuando hablamos de estructura podemos mencionar dos conceptos diferentes, la
estructura formal, que consta de las secciones en que se divide el informe y la estructura
lgica que es la manera en que organizaremos la presentacin de los datos siguiendo una
secuencia lgica. La primera es relativamente fcil conocerla y no tenemos ms que
seguir las instrucciones para autores que nos brindan todos los peridicos cientficos. La
segunda es ms difcil, es donde no existen reglas especficas sino ms bien generales:
como claridad, precisin lgica y orden. All es donde ms esfuerzo y trabajo debemos
invertir para que el informe sea legible. Puesto que por ms que sigamos las reglas de la
estructura formal pero sin contenido, el informe es absolutamente irrelevante.
A continuacin y a modo de instrucciones para autores se describe la estructura
formal que debe contener al informe a presentar.
A. El informe se debe presentar en forma claramente legible, con informacin muy
precisa y ordenada, utilizando tercera persona (en algunas ocasiones se puede utilizar
la primera persona del plural). No debe extenderse en temas irrelevantes. Tendr un
mnimo de 2 pginas y un mximo 4 pginas. Todas las pginas deben estar
numeradas.
B. El informe (que constar de grficos y/o figuras) tiene que ser editado con un
procesador de texto, corregido (la mayora de los procesadores tiene corrector
ortogrfico, selo!) e impreso con calidad y tamao de letra aceptable. Es decir usar
letra de 10 a 12 puntos.
C. El informe debe contener las siguientes partes:
1- Encabezamiento: Este incluye el ttulo del T. Prctico y nombre del alumno,
asi como el ao y nombre de la materia.
6
2- Introduccin: Debe contestar la siguiente pregunta: cul es el tema?

Consiste en una explicacin del trabajo a realizar y una presentacin de los principales
antecedentes bibliogrficos. La intencin de escribir la introduccin es situar el tema en
perspectiva y permitir la comprensin de los resultados y discusin que se escriben a
continuacin. Es fundamental comprender que no debe incluir temas no relacionados
con el objetivo del trabajo, para facilitar la compresin de los resultados y la discusin.
Debe incluir citas bibliogrficas y debe indicarse el fundamento del/los mtodo(s)
empleado(s) Qu se mide? Cmo se mide?. La extensin debe ser alrededor de una
pgina.
3- Objetivo: Corresponde la definicin de las metas y logros a alcanzar en el
proyecto, especificando el marco del tema y las consideraciones simplificaciones a
realizar.
4- Metodologa: Debe indicarse los distintos tipos de materiales y
procedimientos experimentales utilizados. Esta seccin constituye una enumeracin de
los pasos del procedimiento o un esquema del mismo.
5- Resultados: Se deben presentar los resultados resumidos. Por un lado, se
exponen los datos experimentales (cuadros, tablas, etc.) y se realiza un breve
comentario, si fuera necesario, de las observaciones cualitativas de los ensayos
realizados. La segunda parte se conforma con los clculos de resultados (reglas de tres
explicitadas). En caso de instrumentos controlados por computadora inserte las imgenes
o datos en el informe.
Los resultados debern estar indicados con las unidades correspondientes y el
correcto nmero de cifras significativas. Cuando se crea conveniente, indicar los
principales errores y confiabilidad de los resultados reportados.
Tablas: es la forma ms habitual de presentar los datos, permite describir datos
paralelos en forma concisa. La tabla no debe estar sobrecargadas de lneas y debe estar
contenida en una pgina. Lo ptimo es presentar los datos es en forma de columnas. Se
debe incluir las unidades utilizadas en la medicin, el lugar ms habitual es a
continuacin del ttulo de la columna de datos, entre parntesis. Todos los datos de la
tabla deben estar completos, en caso de carecer del dato correspondiente se debe incluir
el texto NR (no realizado) o NA (no aplicable) o ND (no detectado). Al pie de tabla se
debe aclarar el significado de esta abreviatura. La tabla debe tener un titulo acorde asi
como un nmero de acuerdo al orden de aparicin en el informe. Este nmero sirve para
hacer referencia en el texto. Al pie de tabla se debe incluir una leyenda conteniendo las
abreviaturas utilizadas, as como una corta referencia metodolgica que permita
comprender la misma.
Grficos: Existen, bsicamente, tres tipos de grficos: de lnea, de barra y tortas;
los ltimos no son utilizados con frecuencia en la literatura de bioqumica y biologa
molecular. En tanto que los dos primeros son muy comunes. El grfico de lnea es
7
utlizado para presentar una lnea de tendencia, o cambio de estado, en funcin de una
variable continua. Tambin se lo utiliza para mostrar la dependencia entre dos variables.
Debe incluir un ttulo y un nmero de grfico que permita referirlo cuando se escribe.
Siempre debe incluir los ttulos de los ejes, asi como las unidades de medicin a
continuacin del mismo, entre parntesis. Incluir los errores de los datos mediante barras
asociadas a cada punto. La leyenda debe incluirse en el texto al pie de la figura, as como
una breve referencia metodolgica que permita su interpretacin. Los grficos de barras
se utilizan para mostrar datos groseros o cambios de estado en funcin de variables
discontnuas, las reglas son las mismas que para el grfico de lneas.
Decidir la forma de presentacin de los datos, barras, lineas o tablas, es parte del
trabajo de elaboracin de un informe. Para elegir entre las tres formas hay que utilizar
criterios de claridad y lgica.
6- Discusin: Consiste en un anlisis crtico del trabajo realizado, incluyendo un
anlisis de los errores cometidos durante la experiencia. Comparar los valores de las
variables de operacin, coeficientes, rendimientos, etc., con los antecedentes obtenidos
de la literatura. Tambin se pueden incluir recomendaciones o sugerencias para futuras
experiencias. Se suelen incluir referencias bibliogrfias que situan los resultados en el
contexto del conocimiento actual. Es muy importante aprender a distinguir cuando se
menciona un resultado, dato objetivo obtenido por mediciones o clculos, y la discusin
correspondiente, elaboracin personal que brinda una interpretacin del resultado. Esta
diferencia debe estar reflejada en las secciones resultados y discusin.
7- Conclusiones: En esta seccin se presentan en forma resumida las diversas
deducciones que se originan del trabajo realizado, respaldadas por los resultados
obtenidos y en concordancia con los objetivos planteados. Lo ptimo es enumerar las
distintas conclusiones mediante una lista de puntos o tems.
8- Bibliografa: Las referencias a la bibliografa se anotan en el texto del
informe con un nmero entre parntesis, el que corresponde al orden indicado en la
seccin de bibliografa.Las referencias bibliogrficas son de dos tipos: las de revistas
cientficas y las de libros.
Revistas: autores (ao) titulo del artculo. Journal, volumen, pginas. Ejemplo:
Tugendreich, S., Bassett, D.E.,Jr, McKusick, V.A., Boguski, M.S. and Hieter,P. (1994)
Genes conserved in yeast and humans. Hum. Mol. Genet., 3, 1509-1517.
Libros: autores (ao) ttulo del captulo editor, ttulo del libro. nombre y
direccin de la editorial, volumen, pginas. Ejemplos:
Gehring, W. (1994) A history of the homeobox. In Duboule, D. (ed.), Guidebook to the
Homeobox Genes. Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 1-10.
Lewin, B. (1994) Genes V. Oxford University Press, Oxford, UK.
La produccin de un texto cientfico

En un texto cientfico, buscamos informacin, no belleza literaria por lo que los datos
tienen que ser claramente expuestos. Sin embargo, es importante que haya un hilo
conductor a lo largo de todo el texto para poder contar una historia. Pese a tratarse de
textos cientficos, el texto tiene que ser entendido por personas que no manejan el tema.
Adems, quines leen los textos no son necesariamente expertos en el tema pero s
necesitan comprender lo que queremos comunicarle.
He aqu una lista de los principales tems a tener en cuenta al momento de producir un
texto cientfico (informes, papers, exmenes, etc.).
Optar por la voz activa. Es ms directa y vigorosa, adems las oraciones en voz
activa son ms breves que las escritas en voz pasiva.
Para compensar la concentracin de sales en el agua, los sulfatos fueron
adicionados 24 h despus del tratamiento.
Para compensar la concentracin de sales en el agua,
sulfatos 24 h despus del tratamiento.
adicionamos los
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de

corriente. La descarga de corriente fue asociada con estmulos diversos (por los
animales).
En este experimento, las ratas fueron entrenadas para evitar la descarga de
corriente. Los animales asociaron la descarga de corriente con estmulos diversos.
Sin embargo, la voz pasiva tiene su lugar y es adecuado usarla cuando corresponde:
Cuando se sobrentiende quin es el sujeto a partir del contexto:
Para este experimento, las ratas fueron entrenadas para evita la descarga de corriente.
[El contexto deja claro que los investigadores entrenaron a las ratas.]
Cuando el sujeto es desconocido:
La galaxia fue mencionada por primera vez en la antigedad.
[No sabemos quin mencion la galaxia.]
Cuando el sujeto es menos importante que la accin:
El paciente fue llevado rpidamente al hospital por la polica.
Cuando mencionar al sujeto puede resultar inconveniente, peligroso o

inapropiado.
Su contrato no ha sido renovado
[Podra no ser apropiado decirle quin no le renov el contrato.]
Limitar el uso del verbo ser. Cuando un texto abunda en este verbo resulta
dbil. Las oraciones que no lo incluyen genera un texto ms directo y preciso.
Este mecanismo es un factor importante para el entendimiento de las infecciones
citomegalovirales en el cerebro.
Este mecanismo explica cmo el citomegalovirus infecta el cerebro.
EPO es el principal factor de crecimiento para el crecimiento, proliferacin
diferenciacin y supervivencia de los precursores de glbulos rojos.
El factor de crecimiento EPO permite que los precursores de glbulos rojos
crezcan, proliferen, se desarrollen y sobrevivan.
La amgdala es la principal estructura del sistema lmbico y funciona en la
regulacin de la memoria emocional.
La amgdala, la principal estructura del sistema lmbico, regula la memoria
emocional.
Evitar el uso de sustantivos derivados de verbos, tales como los terminados en
in (regulacin, formacin), -miento (funcionamiento, requerimiento), -encia
(dependencia, resistencia). En su lugar, usar los verbos correspondientes para
obtener una escritura ms clara y precisa.
Este estudio es el resultado de la investigacin de estos fenmenos usando
movimientos pasivos.
Investigamos estos fenmenos usando movimientos pasivos.
Concluimos que el interfern gamma produce la activacin microglial y podra
tener un papel significativo en los cambios en la plasticidad sinptica relacionados con la
edad.
Concluimos que el interfern gamma activa la microgla y...
Comenzar las oraciones con la informacin conocida. Finalizarlas con lo
novedoso, con la informacin que los lectores no podran anticipar.
Estos factores derivados del rgano blanco contribuiran a la formacin de rboles
de neuronas pontinas complejos en la corteza cerebelar.
En la corteza cerebelar, estos factores derivados del rgano blanco
contribuiran...
La idea de reemplazar las neuronas colinrgicas daadas en la enfermedad de
Alzheimer con terapia de neuroreemplazo con clulas madre es atractiva.
10
En pacientes con enfermedad de Alzheimer, la terapia con clulas madre

permitira reemplazar las neuronas colinrgicas daadas.
Evitar las frases con demasiados sustantivos y adjetivos seguidos, confunde y
hace que el texto sea aburrido. El lector se pierde antes de llegar al verbo que le
dar la idea de lo que se quiere expresar.
La disfuncin cognitiva post-operativa es comn en pacientes ancianos y ha sido
atribuida a la anestesia general.
Frecuentemente, pacientes ancianos sometidos a anestesia general
experimentan disfuncin cognitiva.
Una activacin talmica ipsilateral significativa fue observada con la estimulacin
dolorosa en estudios previos de PET.
Los estmulos dolorosos activan el tlamo ipsilateralmente en forma
significativa.
11
LIDIANDO CON EL SAA EN SCIENCE
William D. Romey. East Orleans, MA USA.

Science (1999) 293: 1067
Por ms de treinta aos, he ledo regularmente la revista Science y finalmente he

decidido protestar contra el sndrome de abuso de abreviaturas (SAA). Como la mayora
de mis ocupados colegas, dispongo de poco tiempo para leer artculos por lo que tengo
un sistema de lectura acelerada que consiste en una mirada rpida (MR) inicial al
artculo en el siguiente orden: ttulo, resumen, primer prrafo (PP), ttulos destacados en
negritas (TDN), figuras y leyendas (FL) y el ltimo prrafo (UP), con algunos vistazos
al cuerpo del artculo (CA) para ver si hay algo que me llame la atencin. Si esta lectura
rpida atenta (HRA) me indica que puede haber algo de inters, leo el trabajo ms en
detalle.
Das atrs, lea un artculo y un TDN me llam la atencin: El LGS y la deglaciacin.
No record inmediatamente qu significaba LGS y tuve que leer el resumen para
decodificar la abreviatura. Lneas ms abajo, le sobre concentraciones Cl- y NO3- en el
LGM. Es esperable que -si estoy leyendo Science, sin importar mi rea- recuerde los
smbolos de los elementos de la tabla peridica (TP). Sin embargo en el CA, me top
con la DCR, el YD y el GISP. El artculo era de un rea de la geologa, muy relacionada
con mi propio trabajo, sin embargo me sent muy molesto pues el SAA me haba
forzado a salirme de mi habitual HRA y a leer varios prrafos en busca de los
significados de estas abreviaturas. De igual manera, las FL me llevaron al texto para
decodificarlas.
Preguntndome si el SAA era un problema particular de AG, mir artculos de otras
reas. All tambin el SAA impidi que llevara a cabo mi HRA. Aunque se habla mucho
por estos das de la literatura cientfica (LC), el problema del SAA parece ser aceptado,
aceptando textos de aquellos especialistas que continan expresndose con sus colegas
mediante cdigos oscuros...
Moraleja:
No incluir abreviaturas en ttulos y resmenes.
Usar solo las necesarias y aclararlas en el texto la primera vez que aparecen.
Si el texto excede las 2-3 carillas, incluir una lista de las abreviaturas al pie de la
primera carilla.
12
PREPARANDO UN RESUMEN
Existe cada vez ms bibliografa disponible, con lo cual no es posible leer todos los
artculos de una disciplina particular, y por supuesto, es imposible escuchar todas las
conferencias de un congreso multitudinario. Por eso, usamos los resmenes para
decidirnos acerca de cul artculo leer o cul conferencia escuchar. La bsqueda
bibliogrfica se ha facilitado desde la aparicin de PubMed y de los libros de resmenes
de los congresos, por ello la confeccin de los resmenes es de crucial importancia. El
resumen es la unidad bsica de comunicacin. Se usa como carta de presentacin para
la mayora de las actividades: manuscritos, pedidos de subsidios, congresos, tesis,
informes, etc.
Por qu es esencial que los resmenes sean fciles de entender? Porque eso incrementa
las posibilidades de ser ledos (o que alguien escuche la conferencia de uno). En unas
cuantas oraciones, los resmenes deben indicar explcitamente el objetivo del
trabajo, cmo se hicieron los experimentos, los resultados ms importantes y su
importancia. Un ttulo especfico e informativo tambin resulta un incentivo para el
potencial lector y/o oyente. El resumen es para el xito de un manuscrito desde el
momento que es enviado a la revista. Muchas veces, la primera impresin que causa el
resumen en el editor le sirve para tomar la decisin de enviarlo a revisin o no. De
manera similar, un revisor puede decidir revisarlo o no, dependiendo del resumen. Este
tipo de impresiones no siempre son correctas, pero un resumen mal escrito, usualmente,
es indicativo de un artculo deficiente. Por otro lado, un muy buen artculo puede pasar
desapercibido, si el resumen no est bien escrito.
A continuacin, una gua para la escritura de un resumen:
Usar un ttulo especfico e informativo pero que sea llamativo.
Informar solo uno o dos resultados por resumen.
Usar oraciones en voz activa y limitar el uso del verbo estar.
Evitar detalles innecesarios en materiales y mtodos y resultados.
Limitar el uso de la estadstica.
Evitar el uso de abreviaturas (excepto para los trminos comunes).
Excluir las referencias.
Respetar el lmite del nmero de palabras (usualmente 200-300).
Pedirle a alguien que trabaje fuera del tema que lea el borrador.
13
Problemas
1.
Cul ser el % p/v de una solucin que presenta 45 g de triptona disueltos en
240 ml de solucin?
2.
Cuntos gramos de solucin al 15 % p/p de glucosa se necesita para tener 39 g
de glucosa?
3.
Cuntos gramos de agua debern usarse para disolver 150 g de NaCl de modo
de obtener una solucin al 20% p/p?
4.
Cuntos ml de acetona se deben agregar a 250 ml de agua para que la solucin
resulte al 10 % v/v?
5.
p/v?
Cuntos gramos de Ca(NO3)2 estn contenidos en 75 ml de solucin al 25 %
6.
Cuntos ml de acetona se debe agregar a 300 ml de agua para que la solucin
resulte al 5 % v/v?
7.
Cuntos ml de metanol se debe agregar a 250 ml de agua para que la solucin
resulte al 15 % v/v?
8.
Calcular el % p/p de una solucin que contiene 7,5 g de NaNO3 en 150 g de
agua.
9.
Cul es la cantidad de Na2HPO4 necesaria para preparar 130 ml de solucin al
3 % p/v.
10.
Un frasco de laboratorio tiene escrito un rtulo con 10,0 M NaOH. (PM 40)
Cuntos gramos de NaOH hay contenidos en 0.2 l de solucin?
11.
Cul es la molaridad de una solucin que se prepara disolviendo 18,56 g de
KOH (PM 56) en 100 ml de solucin?
12.
Cul es la molaridad de una solucin preparada por solucin de 20 g de
Na2CO3 (PM 106) en cantidad suficiente de agua para hacer 600 ml de solucin?
13.
Se prepara una solucin disolviendo 15 g de Al(OH)3 en agua suficiente para
completar 300 ml de solucin. Cul es la molaridad de la solucin?
14.
Tenemos una solucin de HCl (PM 36) 0,70 N. Para una determinada reaccin
necesitamos 0,0525 moles de HCl. Qu volumen de la solucin debemos tomar?
14
15.
Cul es la molaridad de una solucin que contiene 25 g de K2CrO4 (PM 194)
disueltos en cantidad de agua suficiente para tener 300 ml de solucin?
16.
Se mezclan 25 ml de propanol con 55 ml de CCl4. Calcular el % v/v para cada
compuesto.
17.
Se disponen de 0,05 l de etanol. Calcular el volumen de solucin al 30 % v/v que
podra preparar.
18.
Se disuelven 7 g de CuSO4 en 53 g de agua. Calcular la concentracin en % p/p.
19.
Se disuelven 45 g de NaNO3 en 300 ml de agua, obtenindose 321 ml de
solucin. Cul es la concentracin en % p/p y % p/v?
20.
Cuntos gramos de NaNO3 son necesarios para preparar 50 ml de una solucin
al 7 % p/v?
21.
Cuntos gramos de BaCl2 son necesarios para preparar 125 g de solucin al 12
% p/p?
22.
Cuntos gramos de una sal deber disolverse en 315 g de agua para darnos una
solucin al 25 % p/p?
23.
El etanol es esterilizante en soluciones al 70 % v/v. Teniendo en cuenta que el
alcohol comn se comercializa al 95 %, calcule cuanta agua deber agregar a 0,5 l de
alcohol para obtener la solucin esterilizante.
24.
Un cido sulfrico concentrado tiene una densidad de 1,81 g/cc y una riqueza del
91,6% en masa de cido puro. Calcule el volumen de esta solucin concentrada que se
debe tomar para preparar 500 cc de solucin de cido 0.5M.
25.
Qu volumen (ml) de una solucin de etanol (C2H6O) que tiene 94 % de pureza
en masa, contiene 0,2 moles de etanol? La densidad de la solucin es 0,807 g/ml
26.
Cuntos gramos de sosa (NaOH) hmeda se necesitan pesar para preparar 250
ml de una solucin 1,5 M? (La sosa contiene 10 % en masa de agua).
27.
Se quiere preparar un volumen de 8 l de una solucin de KNO3 al 20% en masa
y una densidad de 1,1326 g/ml a 20 C. Qu volumen de agua (densidad del agua para
este problema: 1 g/ml) y qu masa de nitrato de potasio se deben mezclar?
28.
Calcule el volumen de H2SO4 que se necesita para preparar 300 ml de una
solucin 0,75N. Considere que el H2SO4 tiene una densidad de 1,4 g/ml y 80 % de
pureza.
15
29.
Se tomaron 5 ml de H2SO4 cuya densidad es de 1,8 g/ml y 90 % de pureza, y se
aforaron hasta un volumen final de 500 ml, calcule la concentracin de la solucin en %
m/m, molaridad y normalidad.
30.
Para preparar la solucin A se pesa 1 g de NaOH y se afora hasta un volumen
final de 20 ml.
Para preparar la solucin B se toman 10 ml de la solucin A y se llevan a un volumen
final de 25 ml.
Para preparar la solucin C se toman 10 ml de la solucin B y se llevan a un volumen
final de 25 ml.
Calcule la concentracin de las soluciones A, B y C.
31.
En el laboratorio se prepara una solucin (a la que llamaremos solucin A)
pesando 5 g de cromato de potasio y agregndole agua hasta llegar a 1 l de solucin. De
esta solucin A, se toma una alcuota de 100 ml y se coloca en un matraz aforado de 250
ml, agregndole agua hasta la marca de aforo (solucin B). Finalmente, de la solucin B
se toma una alcuota de 25 ml y se coloca en un vaso de precipitado.
a) Cul es la concentracin molar de la solucin A?
b) Cul es la concentracin normal de la solucin B?
c) Cul es la concentracin en porcentaje en peso de la solucin A?
d) Cuntos moles de cromato de potasio hay en la solucin A, en la solucin B y en el
vaso de precipitado donde se coloc la alcuota final?
e) Cul es la concentracin molar de la solucin que se encuentra en el vaso de
precipitado que contiene la alcuota final?
32.
Se desean preparar 3 l de una solucin de glucosa 2,5 mM. Explique cmo debe
prepararse esta solucin.
33.
Qu concentracin final tiene una solucin de permanganato de potasio que se
prepara diluyendo 1 ml de solucin 0,1M a un volumen final de 1l? Si de la solucin
anterior si se toma una alcuota de 10 ml y se afora con agua a 100 ml. Qu
concentracin obtendr?
34.
Se desea preparar una solucin 0,2 M de NaOH, pero slo se tienen dos matraces
aforados de 50 ml, una pipeta graduada de 10 ml, 2 g de NaOH previamente pesado. No
se cuenta con una balanza para pesar una menor cantidad de NaOH. Diga cmo preparar
la solucin 0,1 M de NaOH en las condiciones anteriores.
35.
Las diluciones 10:100; 2,5:25,0; 50:500 son:
a) Todas de la misma molaridad
b) Todas diluciones 1:10
c) Todas de la misma estequiometra
Justifique.
16
36.
La soda (Na2CO3) se vende en dos formas: como sal anhidra Na2CO3 y como
sal decahidratada. Considerando que el constituyente activo es el Na2CO3, cul forma
resulta ms barata al consumidor, la sal anhidra a 20 centavos por kilo o la sal
decahidratada a 10 centavos por kilo?
37.
Se hicieron varios recuentos celulares. Complete la siguiente tabla calculando el
nmero de clulas en la muestra original:
Recuento
45
100
88
155
Dilucin y vol analizado

1/250; 1 l
1/1000; 0,1 l
1/300; 0,5 l
1/500; 0,2 l
Volumen original
100 ml
50 ml
1l
250 ml
Nmero de clulas
38.
Complete la siguiente tabla, calculando el volumen de agua necesario para
resuspender los siguientes oligonucletidos, de modo de obtener soluciones madre 100
M. Luego indique los volmenes de solucin madre y de agua necesarios para
preparar las soluciones de trabajo indicadas. Finalmente, indique el volumen de solucin
de trabajo necesario para cada reaccin.
NCAM F
381,85 g
(5485,6 g /mol)
Actina
155, 21 g
(7058,6 g /mol)
IIB R
56,1 nmoles
(6888,6 g /mol)
IIB F
69,6 nmoles
(8098,6 g /mol)
Volumen
de Volmenes para
agua
para preparar la sol de
solucin madre trabajo
100 M.
10 M, 50 l
Volmenes
solucin de
para la PCR
de
trabajo
mix 5x, conc en la

PCR: 0,3 M.
20 g/l, 100 l
mix 18x, conc en la

PCR: 0,25 M.
10 g/l, 150 l
mix 10x, conc. final

en la PCR: 0,45 M
20 M, 200 l
mix 35x, conc en la

PCR: 0,2 M.
39.
De acuerdo a la frmula indicada, calcule las cantidades necesarias para preparar
las siguientes soluciones, teniendo en cuenta las soluciones madre que se enumeran.
17
a.
b.
c.
d.
e.
f.
1 l de medio ABC
50 ml de buffer borato
100 ml de medio XYZ
20 ml de buffer MOPS
500 ml de medio IIB agar
15 ml de solucin UNSAM
Medio ABC
triptona
extracto de levadura
NaCl
PO43Agua c.s.p.
5g
10 g
80 g
1 mM
1l
Buffer borato
borato de sodio
cido brico
NaCl
50 mM
75 mM
145 mM
2,5 g
1,5 g
0.15 M
100 ml
4,3 % p/v
25 moles
50 ml
Medio XYZ
Compuesto X
Compuesto Y
Compuesto Z
Agua c.s.p.
100 M
0,75 g
500 ml
Buffer MOPS
MOPS
Na2HPO4
NaCl
agua c.s.p.
Medio IIB agar

IIB
Agar
Agua c.s.p.
3g
1,5 g
250 ml
Solucin UNSAM
UN
SAM
Etanol 95 % c.s.p.
Soluciones stock
NaCl (PM 58)
Na2HPO4 (PM 119)
Borato de sodio
cido brico
Compuesto X
Compuesto Y (PM 200)
MOPS
IIB
SAM
Etanol absoluto
1,38 M
1M
0,5 M
0,5 M
50x
20 % p/v
10 % p/v
30 %v/v
2,5 M
40.
En un laboratorio se crecen bacterias en medio ABC-agar. Se usan alrededor de
10 placas/da. Tenga en cuenta que el componente A no es estable en solucin y que el
componente B precipita a 4 C. Indique cmo preparar las soluciones stock para 1 mes
de trabajo, especificando cunto debe pesar de cada droga, en qu volumen diluir las
mismas. Diga cunto medio debe preparar por da e indique los volmenes de cada
solucin stock qu debe agregar. (Una placa lleva 15-20 ml de medio).
18
Medio ABC
A
10 mg
B (PM 100) 50 Mm
C
2g
NaCl
Agua c.s.p.
280 mM
1l
19
TRABAJO PRACTICO N 1
Aislamiento y seleccin de microorganismos
Objetivo
Seleccionar microrganismos por sus caractersticas metablicas.
Introduccin
Los microorganismos, como los seres vivos, pueden modificar su entorno y
utilizar los compuestos presentes en l, como fuente de carbono y energa para su
crecimiento y reproduccin. En todas estas actividades celulares intervienen enzimas
que actan en forma aislada o secuencial. Se puede determinar la dotacin enzimtica de
un tipo de microorganismo dado, determinando la aparicin de los productos finales de
una reaccin enzimtica o bien la desaparicin del sustrato del medio. A su vez, es
posible identificarlo, diferencindolo de otras especies relacionadas.
Se denomina METABOLISMO al conjunto de reacciones qumicas que tienen
lugar en la clula viva. Participan numerosos sistemas enzimticos y abarca tanto
reacciones de degradacin de nutrientes, o CATABOLISMO, como de sntesis, o
ANABOLISMO. Los intermediarios que se forman en estas reacciones reciben el
nombre de metabolitos y la secuencia de reacciones en s va o ruta metablica.
Dado que los microorganismos permiten reemplazar procesos qumicos o
mejorar bioprocesos ya existentes, se hace necesario seleccionar y mejorar las cepas de
inters. En la siguiente tabla se sealan algunos criterios a tener en cuenta al momento
de seleccionar y mejorar cepas.
TABLA I: Criterios generales para la seleccin de microorganismos aplicables a
fines determinados
El diseo del procedimiento de seleccin debe tener en cuenta tanto al tipo de
actividad requerido como las condiciones del proceso a escala comercial.
La seleccin y el mejoramiento del agente biolgico deben considerarse actividades
permanentes y en contnua evolucin, ya que la competitividad del mercado as lo exige.
Produccin en cantidad elevada en tiempo relativamente corto y preferentemente en
cultivo sumergido (resistencia a estrs hidrodinmico).
Alta velocidad de crecimiento a gran escala con mxima utilizacin de nutrientes.
Produccin constitutiva de enzimas, preferiblemente termoflicas y en forma
exocelular; resistencia a represin catablica.
Utilizacin de nutrientes de bajo costo y disponibles a gran escala.
Los procesos de separacin de clulas y/o productos deben ser sencillos y de bajo
costo.
El agente biolgico no debe ser patgeno ni estar relacionados filogenticamente con
un patgeno.
El agente biolgico no debe producir compuestos indeseables (alergenos,
carcingenos, antibiticos, ciertas enzimas, sustancias odorferas o de fuerte sabor, etc.).
20
El agente biolgico debe ser gentica y fisiolgicamente estable y no susceptible a

virus.
Las metodologas de obtencin y mejoramiento de cepas de microorganismos y
de lneas aplicables a fines biotecnolgicos requieren su insercin en un proceso global
de optimizacin. Para ello se deben tener en cuenta las caractersticas generales de dicho
proceso y evaluar el agente biolgico obtenido en la condicin ms aproximada posible
a la de utilizacion. Esto permitir efectuar una estimacin prctica de factibildad de
implementacin que involucra aspectos tcnicos, econmicos y legales de muy diversa
ndole. Si bien el investigador de laboratorio en general no interviene en todas estas
facetas, es de suma importancia que no pierda de vista el proceso global, ya que el xito
del mismo depender de la integracin e interaccin de todas y cada una de las
disciplinas y etapas que lo componen. En la fig. 1 se muestran las ms importantes
operaciones de obtencin y mejoramiento de cepas aplicables a fines biotecnolgicos.
21
DEFINIR PROPIEDADES DEL

AGENTE BIOLOGICO BUSCADO
Diseo y ejecucin del

aislamiento selectivo
Mejoramiento del
procedimiento
Aislar positivos o
eliminar negativos
Seleccin secundaria
(propiedades adicionales)
Mutagnesis, manipulacin
gentica, seleccin adaptativa,
fusin de protoplastos
Cultivos positivos
Evaluacin del catalizador

Controles: productos, cepas de referencia
Caracterizacin
Scale-up
Patentes
Estudios econmicos
y legales
PRODUCCION
Figura 1: Diagrama de flujo de las operaciones ms importantes de seleccin y mejoramiento de cepas

aplicables a fines industriales. La definicin de las caractersticas deseables del biocatalizador est
generalmente fijada a priori por el proceso productivo.
22
PARTE PRCTICA
A continuacin se detallan tres experiencias sencillas (pruebas metablicas) que
permiten seleccionar microorganismos con determinadas caractersticas metablicas, y
una vez obtenidas las cepas, podrn ser utilizadas posteriormente en procesos
biotecnolgicos.
LOS ALUMNOS DEBERN TRAER:
* Anzas
* Granos de maz, porotos, garbanzos, semillas, arroz, cebada, etc.
* Papeles de envoltorios de alimentos y medicamentos.
1. Seleccin de microorganismos amilolticos
Se tomar en este caso como sustrato al ALMIDON, que es un polisacrido,
polmero de glucosa. Para que los microorganismos lo asimilen, debe ser
hidrolizado, y para ello deben contar en su metabolismo con las enzimas apropiadas,
denominadas AMILASAS. En ese caso se dice que el organismo posee poder
amiloltico.
Materiales y mtodos:
Caja de Petri con agar almidn (almidn soluble 0,2 %)
Anzas estriles.
Solucin de Lugol.
Muestra a analizar.
Se siembra a partir de las muestras una anzada para formar una colonia
gigante en la caja de Petri que contiene agar almidn.
Se incuba a 37C y 28C durante 48 horas.
Una vez visibles las colonias de microorganismos se agrega a la caja la
solucin de lugol.
Si se produce un halo incoloro que rodea la colonia gigante, el cultivo es
amiloltico.
Cepas a ensayar: Bacillus subtilis y Bacillus megaterium.
Tratamiento de muestras: granos de maz (u otro) partidos, salvado de trigo,
suspendidos en agua estril y agitados a 28 C durante 1 h.
2. Seleccin de microorganismos proteolticos

Las protenas son molculas demasiado grandes para penetrar en la clula
microbiana, sta debe degradarlas para poder utilizarlas como elementos nutritivos.
El proceso de degradacin de protenas se denomina PROTEOLISIS y se lleva a
cabo mediante enzimas extracelulares segregadas por los microorganismos,
PROTEASAS. La capacidad de elaborar enzimas proteolticas se limita a pocas
especies bacterianas.
La protelisis puede ocurrir en dos etapas:
protenas + H2O
polipptidos
23
proteinasas
polipptidos + H2O
aminocidos
peptidasas
Materiales y mtodos:
Tubos de ensayo con caldo carne - gelatina bacteriolgica.
Extracto de carne
3g
Peptona (o triptona)
5g
150 g
Gelatina bacteriolgica
Agua c.s.p.
1 l.
Agujas estriles.
Muestra a analizar.
A partir de una muestra dada, se siembra por puncin en un medio de gelatina
(caldo carne adicionado con 15% de gelatina bacteriolgica).
Se lo incuba a 37C durante 24 a 48 horas.
La gelatina funde a ms de 20C, por lo tanto, cuando se saque el tubo de la
estufa de 37C deber ser llevado a temperaturas de refrigeracin.
Si la gelatina permanece lquida, el cultivo es proteoltico (el sustrato fue
degradado).
Cepas a ensayar: Bacillus cereus y Bacillus megaterium.
3. Seleccin de microorganismos celulolticos
La metodologa descripta a continuacin es utilizada para establecer la
resistencia fngica de papeles, en particular de aquellos que han sido sometidos a
tratamientos para evitar el deterioro causado por hongos. Este es el mtodo aprobado por
la Asociacin Tcnica de la Industria de la Pulpa y el Papel (Technical Association of
the Pulp and Papers Industry TAPPI, ver documento anexo).
Se usan las siguientes cepas de hongos para esta prueba: Aspergillus niger y
Aspergillus terreus. Otras especies pueden ser incluidas, pero deben ser aisladas de
papeles que hayan sido atacados por las mismas. Los stocks de hongos se mantienen en
un medio agar-dextrosa-papa. En tanto que el medio de cultivo para las pruebas es un
medio agar-sales minerales, en donde la nica fuente de hidratos de carbono es la
celulosa del papel en anlisis.
Medio agar-sales minerales
NH4NO3
K2HPO4
KCl
MgSO47H20
Agar
Agua dest. c.s.p.
3,0 g
1,4 g
0,25 g
0,25 g
10,0 g
1l
24
Procedimiento
Piezas de papel de 5 cm de lado se incuban en placas de Petri de 100 mm con
medio agar-sales minerales (una placa por cada cepa de prueba para cada muestra de
papel). Si el papel es grueso, es conveniente utilizar placas ms grandes con mayor
cantidad de medio.
Las placas son inoculadas con una solucin de esporas y micelios de cada uno de
los microorganismos.
La incubacin se lleva a cabo durante 2 semanas a 28 C, preferiblemente en
atmsfera hmeda.
La lectura de los resultados consiste en la examinacin visual de las placas. Es
necesario examinar las placas varias veces durante la primera semana para controlar que
no se produzca el crecimiento de otros hongos.
Un papel se considera resistente al deterioro fngico cuando no hay crecimiento
al cabo de dos semanas, en comparacin con controles positivos. Si hay crecimiento
durante los primeros 7 das, se dice que el papel no tiene resistencia fngica. Si al cabo
de una semana, no se observa desarrollo de hongos, se contina la incubacin por una
semana adicional. Durante esta segunda semana puede existir un desarrollo leve, en
cuyo caso, se considera que el papel es moderadamente resistente.
25
TRABAJO PRACTICO N2
Levaduras - Obtencin de Biomasa
Objetivo
Valorar el desarrollo de biomasa trabajando con un cultivo de S. cerevisiae.
Introduccin
Las levaduras son hongos unicelulares que intervienen en distintos procesos
productivos: elaboracin de pan, vino, cerveza, bebidas destiladas; sntesis de protenas
y vitaminas; son fuente de protena microbiana y de vitaminas del grupo B; sus
subproductos se usan como resaltadores de sabores en alimentos, se utilizan para
producir pigmentos, etc. Algunas son agentes de deterioro (jugos de frutas, dulces,
encurtidos), pero no se los considera peligrosos para la salud del consumidor al ser
ingeridos.
Desde el punto de vista tecnolgico, las levaduras tienen sus ventajas en relacin
con otros microorganismos por la capacidad de asimilar gran variedad de sustratos,
velocidades de crecimiento altas y su biomasa es fcilmente separable.
Estn difundidas ampliamente en frutos, granos, suelos, aire, etc. Inicialmente los
procesos fermentativos se realizaban con levaduras naturales, pero con la aparicin de
un mercado cada vez ms exigente en cuanto a la constancia de la calidad de los
productos, se fueron seleccionando cepas, por lo tanto es importante poder identificarlas.
Para ello se estudian las siguientes caractersticas:
1) Morfologa de las clulas y de las colonias
Se observa la forma de las clulas: esfrica, ovoide, cilndrica o elipsoidales
(por ej: Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus).
Las colonias se identifican en medio slido por su aspecto, borde, consistencia y
color (ver TP N 1). Adems se estudia, en medio de malta lquido, la capacidad de
formar pelcula (crecimiento superficial) y anillo (crecimiento por las paredes del
frasco).
2) Fisiologa (bioqumica y metabolismo).
Se utilizan ciertas caractersticas del metabolismo de las levaduras para su clasificacin:
por ejemplo fermentacin de azcares determinados (a concentraciones 2% p/v en el
medio) con produccin de cido (viraje de un indicador en el medio de cultivo) y gas
(tubo de Durham). Tambin se investiga la asimilacin aerbica de los mismos azcares
( < 2% ).
3) Mtodos actuales de clasificacin: Adems de las caractersticas mencionadas arriba
entre las tcnicas de la biologa molecular utilizadas para identificar levaduras podemos
citar: contenido de bases (G-C) del ADN, hibridizacin DNA-DNA, DNA-RNA,
patrones de isoenzimas, ultraestructura de la pared celular, etc.
4) Reproduccin
Algunas especies de levaduras presentan reproduccin asexual y sexual y se las
incluye dentro de la Clase Ascomycetes, otras tienen solamente reproduccin asexual y
se las clasifica como Deuteromycetes u hongos imperfectos. Las levaduras que
presentan reproduccin sexual forman ascos con ascosporas y el nmero (2-8) y forma
30
(esfricas, cilndricas, como sombreros, etc) de las ascosporas son tiles para la
clasificacin. Las levaduras imperfectas se llaman as porque solo se les conoce la
reproduccin asexual por gemacin (o por fisin como ocurre con
Schizosaccharomyces). Muchas formas levaduriformes (con reproduccin asexual por
gemacin) forman parte del ciclo de vida de hongos filamentosos de la Clase
Basidiomycetes.
Existen aproximadamente 33 gneros con ms 350 especies reconocidas de
levaduras de Ascomycetes.
Ciclos de vida: (Figura 1) Si bien tpicamente S. cerevisiae presenta alternancia
de generaciones haploides (n), producto de la meiosis y diploides (2n, producto de la
unin de ncleos (n) cada generacin se propaga asexualmente por gemacin).
Aunque las levaduras son predominantemente unicelulares, en algunas especies
(v.g. S.cerevisiae), se produce un seudomicelio (fase 2n) o un micelio invasivo (fase n) ,
como respuesta a alguna deficiencia nutricional. Adems, la formacin de seudomicelio
es una caracteristica diferencial entre especies.
Figura 1. Ciclo de vida de levaduras con reproduccin por gemacin y por fisin.
Las levaduras crecen mejor en medios a una temperatura ptima est entre 25 y
30C (mesoflicas) y a un pH entre 4.5 - 5.5.
31
Desde el punto de vista de su metabolismo las levaduras son microorganismos

hetertrofos (no fijan CO2)y quimiorganotrofos (la fuente de energa proviene de la
oxidacin de compuestos qumicos de naturaleza orgnica) como por ejemplo azcares .
S. cerevisiae es capaz de utilizar monosacridos como glucosa, manosa y fructosa;
disacridos: sacarosa, maltosa (pero no lactosa) y no utiliza polisacridos
eficientemente.
La degradacin de los azcares la hacen en forma anaerbica (fermentacin), o
aerbica (respiracin). Las ecuaciones globales correspondientes son:
En anaerobiosis:
a) va gliclisis (EMP): ms del 95% del metabolismo de la glucosa
C6 H12 O6
2 C2 H5 OH + 2 CO2 + 2 NADH2
ATP/mol glucosa
hexosa
etanol
b) va de la pentosa-fosfato (o hexosa-fosfato):
1 Glucosa P
6 CO2 + 12 NADPH2
Ambos caminos ocurren en el citoplasma y ocurren an en condiciones aerbicas.
En aerobiosis:
C6 H12 O6 + 6 O2
6 CO2 + 6 H2O
36 ATP/mol glucosa
hexosa
Las reacciones aerbicas se llevan a cabo por el ciclo de Krebs y se forma CO2,
H2O y NADH2. Este ltimo (al igual que el proveniente de gluclisis) se oxida por la
cadena de transporte de electrones generando ATP. Ambos procesos ocurren en la
mitocondria (matriz y crestas respectivamente).
Ambos procesos, aerbico y anaerbico, no tienen el 100% de rendimiento, ya
que se forman productos secundarios (glicerina, aldehdos, cidos orgnicos) a expensas
del azcar.
Las levaduras pueden usar alternativamente una u otra ruta metablica. Por
ejemplo, en la elaboracin de cerveza y durante la panificacin con S. cerevisiae, se
utiliza un proceso fermentativo (produccin de etanol y CO2 ), en el cual no hay
aireacin, pero para la generacin de biomasa (levadura para panadera), resulta un
mayor rendimiento/ Sustrato utilizado (5 veces mayor) si se realiza con aporte de
oxgeno (Efecto Pasteur).
En el proceso de produccin de biomasa de levadura el requerimiento de oxgeno
es alto como lo indica la siguiente ecuacin de balance de masa (aproximado):
Sacarosa + NH4 + O2 + minerales
Levadura + CO2 + H2O
200 g
10 g 102 g 8 g
100 g
145 g 77 g
Propagacin de la Levadura
De la ecuacin anterior se puede ver que S. cerevisiae, adems de una fuente de
azcar fermentescible y O2, necesita de una fuente de nitrgeno en forma reducida
(generalmente NH3, NH4.OH, urea, sulfato de amonio u otra) y de determinados
minerales (PO4-3, SO4-2, K+, Mg+2), micronutrientes (Ca, Zn, Cu, Mo, Fe, Mn, etc.)
adems de vitaminas del grupo B. En general los medios de propagacin industrial,
32
generalmente melaza de caa o de remolacha, representan una buena fuente de azcares

utilizables, micronutrientes y de varias vitaminas pero son deficientes en N, P y Mg
como para satisfacer los requerimientos para producir biomasa de levadura (basndose
en la composicin elemental de la misma)
Para evaluar la biomasa, se determina el nmero de microorganismos totales y
viables mediante distintas tcnicas de dosaje habituales:
1- Recuento microscpico
Ventajas:
barato, rpido, sencillo.
no requiere material estril.
posibilita la diferenciacin de algunos microorganismos y la deteccin precoz de
contaminaciones.
Desventajas:
Se emplea poca muestra en relacin al volmen a cuantificar.
el mtodo resulta inseguro a concentraciones celulares < 104/ml y > 109/ml.
las clulas vivas pueden no diferenciarse de las muertas o pueden hacerlo
dificultosamente.
el mtodo puede resultar tedioso a altas concentraciones microbianas o con
microorganismos muy pequeos.
resulta muy dificultoso el recuento cuando las clulas se aglutinan o forman cadenas.
Error del mtodo: 10%.
Recuento en cmara de Neubauer
cuadrante
1 cuadrado de 25 del
reticulado central
Figura 3. Reticulado de la cmara de Neubauer
33
Atencin: Para contar clulas que estn

sobre las lneas, adoptar el mismo criterio en
todos los casos para no contar dos veces una
misma clula (Ej. Siempre contar las clulas
que estn sobre las lneas derecha e inferior
como pertenecientes a ese cuadrado. Fig. 4).
En el caso de las levaduras, tener en cuenta
que al dividirse pueden permanecer unidas.
Se cuenta como 2 clulas si las hijas tienen el
mismo tamao y se cuenta como una clula,
2 clulas
1 clula
si la hija es de menor tamao que la clula
madre (fig. 4).
Figura 4. Recuento de clulas en divisin y
clulas que caen sobre las lneas divisorias
Para suspensiones de clulas diluidas, se cuenta en los cuadrantes de 16 cuadrados.
Volumen de 1 cudrante = lado x lado x altura = 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm3
Ejemplo: Para contar clulas de un frasco agitado de 50 ml, se diluy la muestra 1/10 y
se cont lo siguiente:
25 clulas por cuadrante
20
"
32
"
35
"
112 clulas
- El promedio = 112 / 4 = 28 clulas por cada cuadrante en 0,1 mm3 0,1 l.
28 clulas
0,1 l
1000 l 1 ml
X cl/ml = 280000
- Corregir por la dilucin si se hubiere contado una muestra diluida. En este caso
multiplcar x 10 = 2800000 = 2,8 x 106 cl/ml.
- Finalmente, se calcula el nmero total de clulas de la suspensin:
2,8 x 106 cl
1 ml
X cl = 140 x 106 cl
50 ml
Para suspensiones de clulas concentradas, se cuenta en el cuadrante central de 25
cuadrados. Se cuentan por lo menos 5 cuadrados
Volumen de 1 de los 25 cuadrados = 0,2 mm x 0,2 mm x 0,1 mm = 0,004 mm3
34
Ejemplo: Para contar clulas de un frasco agitado de 50 ml, se diluy la muestra 1/10 y
se cont lo siguiente:
17 clulas por cuadrado
23
"
23
"
18
"
19
"
100 clulas
- El promedio = 100/5= 20 clulas por cada cuadrado en 0,004 mm3 0,004 l.
20 clulas
0,004 l
1000 l 1 ml
X cl/ml = 5000000
- Corregir por la dilucin, en este caso multiplcar x 10 = 50000000 = 5 x 107 cl/ml.
- Finalmente, se calcula el nmero total de clulas de la suspensin:
5 x 107 cl
1 ml
50 ml
X cl = 250 x 107 cl
Por lo tanto, para calcular el nmero por ml deben aplicarse las siguientes frmulas:
- Suspensiones diluidas
cl./ml = N x 10000
donde N es el promedio de clulas por cuadrante.
- Suspensiones concentradas
cl./ml = N x 0,25 x 106
donde N es el promedio de clulas por cuadrado del retculo central.
2- Recuento en placa
Ventajas:
Permite la determinacin de microorganismos viables en un amplio rango de
concentraciones.
Desventajas:
como se determinan las unidades formadoras de colonias (U.F.C.), las clulas
aglutinadas se contarn como una sola unidad (error por defecto).
por inadecuada composicin del medio o inadecuadas condiciones de incubacin,
algunos microorganismos potencialmente viables pueden resultar incapaces de
formar colonias.
errores sistemticos en las diluciones.
Error del mtodo: 100% o ms.
3- Centrifugacin
En estos mtodos se requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas. Por ser un
mtodo gravimtrico (por pesada) conlleva bastantes errores: es difcil pesar menos de 1
mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio y 1 mg de peso seco equivale
a unas 5 x 10 9 bacterias.
35
Peso hmedo:
Ventaja: es rpido y sencillo
Desventaja: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, que depende a su
vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.
Peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado
(105C, toda la noche).
Ventaja: ms preciso que el anterior
Desventaja: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo).
4- Absorcin o turbidimetra:
Ventajas:
Da informacin sobre el peso seco. Muy tiles y poderosos. La absorbancia es
directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del
microorganismo.
Desventajas:
cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes se encuentran
absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de
Colonia).
debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo,
microorganismos totales o con UFC para establecer el rango de linearidad.
PARTE PRCTICA
1- Se trabaja con frascos agitados de 250 ml de capacidad conteniendo 50 ml de caldo
Sabouraud (pH 5.5). Es un medio semi-sinttico que contiene los nutrientes necesarios
para el crecimiento de S. cerevisiae.
2- Se prepara un inculo de S. cerevisiae, sembrando un caldo Sabouraud a partir de una
estra joven. El caldo as sembrado se incuba a 28C durante 24 horas, con agitacin.
3- Se inocula el frasco, se homogeiniza y se toma una muestra estrilmente (Muestra
Inicial o tiempo 0). Se inoculan adems 4 frascos ms que se crecern aproximadamente
por 8; 12; 24 y 48 hs
4- Se incubarn los frascos en un bao termostatizado a 28-30 C con agitacin y
abundante aireacin.
Sobre alcuotas de todas las Muestras (T0, T8, T12, T24 y T48), se efectuar:
1. Recuento microscpico directo: se cuentan las levaduras en la Cmara de Neubauer
(nmero de levaduras/ml). Contar de manera directa (sin preparar diluciones), las
muestras T0 y T8. Realizar diluciones para el resto de las muestras.
36
2. Recuento en placa: se harn

diluciones seriadas para sembrar en cajas
de Petri con agar Sabouraud. Las cajas se
incubarn de 3 a 5 das a 28C. Se
contarn aquellas diluciones que tengan
entre 20 y 200 colonias. Realizar
diluciones seriadas partiendo de 100 l
de cada cultivo (ver fig.2).
Figura 2. Esquema de diluciones seriadas

3. Densidad ptica: Leer por duplicado cada muestra (2 alcuotas) a 600 nm. El rango
de absorbancia donde la medicin es lineal es 0,150 a 0,500. Por lo tanto, las muestras
que tengan una absorbancia mayor, debern ser diluidas y medidas nuevamente.
4. Peso hmedo por centrifugacin: a 5000 rpm durante 15 minutos. Con este mtodo
se determinar:
I. Rendimiento al final de la fermentacin, expresado como gramos de levadura
obtenida en funcin de g de azcar utilizado : Y X/C
II. Velocidad de crecimiento especfico de la fermentacin ( total):
i)
Tomar dos tubos de 1,5 ml para cada muestra. Pesar el tubo vaco, anotar.
Agregar 1 ml de cultivo previamente homogeneizado. Centrifugar 1 ml de la suspensin
de clulas a 5000 rpm x 10 min. Descartar el sobrenadante. Pesar nuevamente el tubo,
sacar el peso hmedo por diferencia.
ii)
Teniendo en cuenta el volumen del frasco, calcular la biomasa (X) de la levadura
como: x (g/l). Vol (ml). Obtenindose X (en g). Mediante la diferencia XT48 XT0 =
X neta [biomasa neta de la levadura producida (g)].
iii)
Calcule el YX/C: [X neto (g) /azcar en el fermentador (g) x 100] = Rendimiento
de biomasa de levadura en funcin del azcar consumida expresado como gramos de
levadura obtenida vs. g de azcar utilizado (se presume que la levadura utiliz todo el
azucar presente en el medio Sabouraud al final de la fermentacin).
iv)
Calcule el: total = ln X final ln X inicial
tiempo
37
Produccin de cido ctrico
Objetivos:
Comparar el efecto de la agitacin y de la adicin de Mn2+ sobre el rendimiento de cido
ctrico en cultivos de Aspergillus niger
Introduccin
El cido 3 - carboxi - 3 hidroxipentanodioico o cido ctrico es el cido
orgnico ms producido mediante fermentaciones. Es ampliamente usado en varias
ramas de la industria, particularmente en la industria alimenticia (alimentos y bebidas,
70 % de la produccin); en la fabricacin de detergentes y limpiadores (18 %); en la
industria farmacutica y cosmtica (6 %) y en la produccin qumica e industrial (6 %).
Sus ventajas son alta solubilidad, poder quelante, sabor agradable y baja toxicidad,
clasificado como GRAS (generally recognized as safe) por la Administracin de Drogas
y Alimentos de EE.UU. (FDA). Se utiliza como condimento, conservante (en bebidas y
dulces), antioxidante en conjunto con cido ascrbico y para ajustar el pH (en conservas
de frutas enlatadas). En la industria farmactica es usado en la formulacin de tabletas
efervescentes y como anticoagulante en transfusiones sanguneas. Adicionalmente, el
cido ctrico en combinacin con otros principios activos elimina bacterias, mohos y
hongos patognicos causantes de olor, remueve la espuma de jabn, herrumbre, limos y
depsitos de calcio; por lo que es incluido en la formulacin de desinfectantes,
fungicidas y otros pesticidas. Estos productos son usados en baos y en la limpieza de
equipos de procesamiento de lcteos y carnes. En ciertos detergentes reemplaza el
tripolifosfato de sodio, un contaminante ambiental.
El cido ctrico se encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza, en
diversas frutas y en animales, en hueso, msculo y sangre. Puede ser extraido de ctricos,
pero a escala industrial se produce por mtodos microbiolgicos a partir de materias
primas que contengan azcares. Si bien se han empleado un gran nmero de
microorganismos para producir este cido, el hongo Aspergillus niger contina siendo el
principal productor industrial, existiendo cepas capaces de exceder el rendimiento
terico sobre la fuente carbonada del 70%. Bajo una condicin de gliclisis activa, tal
como sucede en medios ricos en azcares, los hongos filamentosos son capaces de
acumular cidos orgnicos en el medio. La composicin del medio de fermentacin tiene
una muy fuerte influencia en la produccin de cido ctrico, ya que slo se acumula
cuando ciertos nutrientes estn presentes en altas concentraciones (i.e. azcar, acidez,
oxgeno disuelto) y otros en cantidades limitadas (i.e fsforo, nitrgeno y cationes
divalentes como Fe2+ y Mn2+). Dado que son varios los eventos bioqumicos que
contribuyen conjuntamente a la sobreproduccin, muchas veces no es posible estudiar el
efecto de factores individuales sin afectar los otros.
Metodologa
38
1- Cultivo
i- Preparacin de medio de cultivo: Se preparan Erlenmeyers de 250 ml conteniendo 50
ml de medio de cultivo definido (Shu & Johnson, 1947):
Componentes principales (g/l)
Glucosa:
100,00
(NH4)2NO3:
2,50
KH2PO4:
1,00
Mg2SO4.7H2O:
0,25
Micronutrientes (mg/l)
Cu2+:
2,4
Zn2+:
0.34
0.8
Fe2+:
A la mitad se le adicionan 9 mg/l de Mn2+.
ii- Obtencin de esporas: Se agregan 5 ml de agua destilada con una gota de Tween-20 a
un cultivo de Aspergillus niger en pico de flauta agar papa-dextrosa. Se agita hasta
obtener una suspensin de esporas
iii- Inoculacin: Los Erlenmeyers se inoculan con 0,5 ml de la suspensin de esporas.
iv- Cultivo: Los cultivos se incuban durante 10 das a 28 C a 200 rpm y en condiciones
estticas. Antes de cosechar, se observa y registra la morfologa del hongo en las
diferentes condiciones ensayadas (forma de pellet o filamentosa, presencia de esporas,
etc); se pueden observar estructuras reproductivas y vegetativas al microscopio ptico.
v- Cosecha: Los cultivos se filtran sobre un papel de filtro pesado previamente
(TRABAJAR CON CUIDADO, EVITANDO ESPARCIR LAS ESPORAS). El filtrado
se lava dos veces con 50 ml de agua destilada. Se centrifuga 1 ml del filtrado para
realizar las determinaciones de glucosa y cido ctrico.
2- Determinaciones
i- Peso seco: Retirar el papel de filtro del embudo y colocarlo en una placa de Petri
(pesar previamente la base); dejar secar en estufa a 80 C durante 24 h. Volver a pesar y
obtener el peso neto del micelio.
ii- Determinacin enzimtica de glucosa: Diluir la muestra aproximadamente 1:10
1:100. Agregar 1 ml de solucin de glucosa oxidasa (1000 U/ml) y peroxidasa (120
U/ml) a 10 l de la muestra y agitar. Incubar a 37 C durante 10 minutos. Leer
absorbancia a 505 nm. Realizar una curva de calibracin con 5, 10 y 20 l de una
solucin de glucosa 1g/l. Se utilizar el test para la determinacin de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de anlisis clnicos (ver anexo).
ii- Determinacin de cido ctrico: TRABAJAR BAJO CAMPANA! Agregar 0,7 ml de
anhdrido actico a 125 l de la muestra (sin diluir o a diluciones 1:10 a 1:100) y agitar.
A continuacin, agregar 0,160 ml de piridina y mezclar cuidadosamente. Incubar a 30 C
durante 20 minutos. Leer absorbancia a 435 nm (cubrir las cubetas con parafilm).
Realizar una curva de calibracin con 10, 30 y 70 l de una solucin de cido ctrico
1g/l.
39
Clculos
Calcular el rendimiento de cido ctrico respecto al azcar consumido y la biomasa.
Discutir el efecto de los distintos tratamientos ensayados.
Referencias
Shu, P; Johnson, MJ. Effect of the Composition of the Sporulation Medium on Citric
Acid Production by Aspergillus niger in Submerged Culture. 1947. J Bacteriol. 54
(2):161167
Papagianni, M. 2007. Advances in citric acid fermentation by Aspergillus niger:
biochemical aspects, membrane transport and modeling. Biotechnol. Adv. 25(3):244263.
Soccol, C; Vandenberghe, L; Rondriques, C. & Pandey, A. 2006. New perspectives for
citric acid production and application, Food Technol. Biotechnol. 44, 141149.
40
TRABAJO PRCTICO N 4
Fermentacin alcohlica
Objetivo
Obtener alcohol por fermentacin de harina de maz.
Introduccin
Una de las fermentaciones industriales ms importante y mejor conocida es la
que da lugar al alcohol etlico al actuar las levaduras sobre los azcares.
El alcohol etlico puede obtenerse a partir de cualquier azcar fermentescible, por
accin de las levaduras, en condiciones favorables. Puesto que el almidn y otros
hidratos de carbono pueden ser hidrolizados a azcares fermentescibles por mtodos
biolgicos o qumicos, se puede disponer de muchas fuentes de azcar.
La materia prima puede clasificarse en tres tipos principales:
a) materias sacaroideas: azcar de caa, remolacha, melazas y jugos de frutas.
b) materias que contienen almidn: comprenden los cereales (maz, malta, cebada,
avena, centeno, trigo, arroz, sorgo y otros), papas, batatas.
c) materias celulsicas: madera y los residuos de fabricacin de la pasta de papel.
Las materias sacaroideas requieren por lo general poco o ningn tratamiento
preliminar aparte de la dilucin; las materias amilceas y las celulsicas deben ser
hidrolizadas a azcares fermentescibles antes que acten sobre ellas las levaduras.
En todos los casos el xito depende de la eficacia del tratamiento preliminar (si lo
hubiera), del empleo de una concentracin ptima de azcar, de un pH y temperatura
ptimos, del empleo de una variedad fuerte de levadura con alta tolerancia alcohlica,
capaz por lo tanto de producir grandes cantidades de alcohol.
Concentracin de azcar: 10-18%. Valor ms corriente: 12%.
Sustancias nutritivas: en algunos casos, para suplir la posible deficiencia en P o
N, puede aadirse PO43- SO42- amnico.
pH del mosto: 4- 4.5. Este favorece a la levadura y es lo suficientemente bajo
para inhibir el desarrollo de muchos tipos de bacterias. Para alcanzar este pH se emplean
SO4H2 y cido lctico.
Tensin de O2: en los primeros momentos es necesaria una alta concentracin de
este gas para la reproduccin de las clulas de levadura. Durante la fermentacin se
desprende CO2 y se establecen pronto condiciones anaerobias.
Obtencin del alcohol a partir de harina de maz
Por ser la harina de maz una materia prima de naturaleza amilcea, debe
efectuarse un tratamiento preliminar para transformar el almidn en azcares
fermentescibles.
El almidn es un polisacrido que desempea funciones de reserva en tejidos
vegetales, y est compuesto por dos tipos de polmeros: la amilosa y la amilopectina.
La amilosa es una cadena lineal formada por unidades de glucosa (en nmero
elevado), unidas entre s por uniones -1-4 (uniones entre el grupo aldehdo de cada
molcula con el OH del C4 de la molcula siguiente).
43
La amilopectina tiene una estructura ramificada en la que las unidades de glucosa se

unen por enlaces glucosdicos -1-4 y -1-6. En cada C6 que participa de una unin se
produce un punto de ramificacin.
En su estado natural en el tejido vegetal, el almidn se encuentra formando
grnulos. El tamao de los grnulos vara entre los 5 y 100 m y poseen una estructura
interna consistente en capas concntricas. En ellos coexisten regiones internas cristalinas
y amorfas. Las regiones amorfas representan el 70% de la estructura y contienen la
mayor parte de la amilosa. Un comportamiento particular de los grnulos de almidn es
su capacidad de gelificar al ser calentados en presencia de agua. La gelificacin del
almidn implica la ruptura de los puentes hidrgeno intercatenarios especialmente en las
regiones cristalizadas del grnulo.
Los mtodos para sacarificar materiales amilceos implican el uso de
preparaciones enzimticas, cidos diludos o una combinacin de ambos.
Entre las preparaciones enzimticas se incluyen la malta y otras de origen
microbiolgico derivados de hongos y bacterias. Estas preparaciones contienen amilasas,
enzimas capaces de hidrolizar el almidn y el glucgeno a diversos productos.
Las distintas amilasas se pueden clasificar de la siguiente manera:
AMILASAS
Endoamilasas amilasas (enzima licuante)

Ataca las uniones - 1-4 de la amilosa y la
amilopectina a ambos lados de la unin - 1-6.
Produce maltosa, glucosa, oligosacridos.
Exoamilasas amilasas (enzima sacarificante)
Ataca las uniones - 1-4. Produce matosa y dextrinas
lmites.
amiloglucosidasa (enzima sacarificante)
Ataca las uniones - 1-6 y - 1-4. Produce glucosa.
La designacin de y amilasas no se refiere a la configuracin del enlace

glucosdico que hidrolizan, ya que ambos grupos de enzimas hidrolizan los enlaces -14.
La -amilasa hidroliza rpidamente la fraccin amilosa a maltosa, a partir de los
extremos no reductores de la molcula. Esta conversin es prcticamente cuantitativa sin
que se formen cantidades apreciables de dextrinas (oligosacridos superiores).
Cuando la -amilasa acta sobre la amilopectina, la hidrlisis se realiza en un 5060% aproximadamente de la mxima terica (calculada como maltosa). Este efecto
puede ser prcticamente completo en la amilosa de cadena lineal, sin ramificar; en
cambio en la amilopectina la accin enzimtica cesa en los puntos de ramificacin de la
cadena, es decir en los enlaces -1-6 glicosdicos (dejando dextrinas lmites).
En contraste con las amilasas, las -amilasas hacen muy lento el ritmo de
aparicin de la maltosa. En este caso la hidrlisis del polisacrido tiene lugar en los
enlaces glicosdicos del interior de la cadena, formndose oligosacridos que se escinden
lentamente en maltosa y glucosa.
44
Otra diferencia que presentan las amilasas con respecto a las amilasas, es que
las primeras pueden hidrolizar los enlaces -1-4 de las amilopectinas a uno y otro lado
de las ramificaciones formando oligosacridos del orden de los pentasacridos, unidos
por enlaces -1-6. Este acortamiento tan grande de la cadena lleva a una disminucin
rpida de la viscosidad. De ah que a las amilasas se las llame tambin enzimas
licuantes. Preparan as el camino para la amilasa a la que se llama sacarificante. En
la malta existen y amilasas. Trabajando a alta temperatura se favorece la accin de la
(70-75C) con lo cual tiene lugar la licuefaccin, mientras que a temperaturas ms
bajas (60C) trabaja la amilasa producindose la sacarificacin.
La amiloglucosidasa (enzima sacarificante) es otra amilasa que ataca las uniones
-1-6 y 1-4 a partir de los extremos no reductores de la molcula de almidn,
produciendo glucosa. La velocidad de hidrlisis de la amiloglucosidasa aumenta con el
peso molecular del sustrato. La velocidad de hidrlisis de los enlaces -1-6 es un orden
de magnitud menor que para las uniones -1-4.
Estructura del almidn:
45
PARTE PRACTICA
La prctica tiene por objeto preparar el mosto a partir de harina de maz,
mediante dos enzimas ( amilasa y amiloglucosidasa), y la posterior fermentacin del
mosto por la accin de levaduras, en condiciones anaerbicas.
El rendimiento de la fermentacin se calcula en base al peso de etanol obtenido.
Microorganismo utilizado: Saccharomyces cerevisiae (levadura de alta).
1- Preparacin del inculo: en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, se colocan 50 ml
de caldo Sabouraud y 0.5% p/v de macerado de maz.
Se esteriliza 30 minutos a 110C. Se enfra y se siembra con un cultivo de 24
horas de la levadura. Se incuba durante 24 horas, a 28C, en agitador rotatorio.
2- Preparacin del mosto: en un Erlenmeyer de 500 ml de capacidad previamente tarado
(incluyendo el tapn de algodn), se colocan 45 g de harina de maz y 200 ml de agua
destilada.
a) Gelificacin: el Erlenmeyer se coloca en el autoclave a 121C durante media
hora, a fin de liberar el almidn contenido en la harina de maz.
b) El Erlenmeyer se enfra a 70C, y se le agrega 2 ml de amilasa bacteriana. El
contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 15 minutos, mantenindolo
sumergido en un bao termostatizado a 70C.
c) El Erlenmeyer se retira del bao termostatizado y se coloca durante 5 minutos
en un bao de agua hirviente. Este paso tiene por objeto inactivar la amilasa.
d) Se enfra el Erlenmeyer a 55C y se le agrega 4 ml de amiloglucosidasa.
El contenido del Erlenmeyer se agita con una varilla durante 30 minutos, en un
bao termostatizado a 55C.
Se prepararn 4 fermentaciones:
Fermentacin 1: sin enzimas
Fermentacin 2: con ambas enzimas
Fermentacin 3: solo con -amilasa
Fermentacin 4: solo con amiloglucosidasa.
3- Siembra del inculo: el mosto se enfra a 28C y se siembra con 5 ml del inculo,
preparado segn 1. Luego se incuba en forma esttica a 28C, durante 72 a 96 horas,
hasta que la fermentacin haya terminado.
4- Destilacin: finalizada la fermentacin, se pesa el Erlenmeyer. Se miden 100 ml y se
pasan a un baln de destilacin de 500 ml y se vuelve a pesar el Erlenmeyer, para
conocer el peso de la fraccin que se va a destilar.
Se agregan al baln 100 ml de agua destilada, lavando la probeta en que se han
medido los 100 ml. Se destila lentamente, hasta asegurarse que la temperatura haya
llegado a 100C. El destilado se recoge en un matraz aforado de 100 ml, se lleva a
volumen con agua destilada, y se determina su densidad por medio del densmetro
(alcoholmetro), ajustando la temperatura al valor indicado en las tablas de
concentracin adjuntas.
Obtenida la densidad, se busca la concentracin de alcohol en % p/v.
46
5- Clculo del rendimiento:

a) Rendimiento terico
Ecuacin de Gay-Loussac:
C6H12O6
2 C2H5OH + 2 CO2
PM 180
PM 2 x 46
PM 2 x 44
180 g glucosa
92 g alcohol
100 g glucosa
51.1 g alcohol
(C6H10O5)n + n H2O
n C6H12O6
almidn
glucosa
PM (162)n
n 180
n 162 g
n 180 g glucosa
100 g
111 g glucosa
100 g almidn
111 g glucosa
56.7 g alcohol
b) Rendimiento prctico
Se calcula el rendimiento de etanol por 100 g de harina integral de maz
por 100 g de almidn, considerando que el contenido de almidn de la harina de
maz es de 60% p/p.
El rendimiento en la prctica industrial, en la que se prepara el mosto con
enzimas de la malta, es de 59 litros de alcohol por 100 kg de almidn.
Esto corresponde aproximadamente a 82% del valor terico.
c) Eficiencia de la fermentacin
rendimiento prctico
Eficiencia =
x 100
rendimiento terico
47
Biotecnologa de Medicamentos y Alimentos
Purificacin de - amilasa de Aspergillus niger
Objetivos del trabajo prctico

Purificar la enzima -amilasa.
Introduccin
Las enzimas industriales se emplean en una variada gama de procesos relacionados con:
industria alimenticia, produccin de detergentes, industria textil, curtiembre, diagnstico
mdico, farmacologa e ingeniera gentica. El mercado ms importante corresponde a la
industria agroalimentaria que produce la transformacin de alimentos utilizando
proteasas y amilasas para la degradacin de distintos polmeros.
Las amilasas, en particular, se utilizan en los procesos de sacarificacin para la
produccin de jarabes de glucosa y fructosa, en la panificacin y en los procesos de
fermentacin alcohlica, como suplemento de amilasa de cereales en la produccin de
cerveza, licores y alcoholes. A veces, la obtencin de enzimas de origen animal o vegetal
resulta inconveniente, debido a que su produccin y precio dependen de la disponibilidad
local y estacional.
Por razones tcnicas y econmicas, los microorganismos constituyen una fuente
apropiada para la obtencin de enzimas. Las enzimas microbianas se producen por
mtodos sencillos denominados "procesos fermentativos". Las amilasas bacterianas se
obtienen a partir de cultivos sumergidos, tcnica que a nivel industrial implica costos
muy altos.
Los hongos, debido a sus caractersticas fisiolgicas, son capaces de crecer en ausencia
de agua libre en un proceso denominado fermentacin en estado slido, razn por la
cual actualmente se producen enzimas a gran escala utilizando distintas cepas salvajes y
mutantes de Aspergillus, Penicillium, Mucor y Rhizopus.
Como se describi en el TP N 4, las amilasas son enzimas que catalizan o aceleran la
hidrlisis del almidn. Todas las -amilasas son metaloenzimas con gran afinidad por el
calcio. En presencia de este catin, las enzimas adquieren mayor estabilidad frente a T y
pH extremos, proteasas y agentes desnaturalizantes como la urea.
Las -amilasas fngicas son obtenidas principalmente de Aspergillus oryzae y niger,
especies no productoras de micotoxinas.
PARTE PRCTICA
*Cultivo, condiciones de crecimiento y preparacin del extracto enzimtico.
Los conidios de A. oryzae se obtienen a partir de una estra en medio salvado 5% (5 g
salvado, 1,5 g agar-agar en 100 ml de agua) incubada a 37 C durante 48 hs y
posteriormente a 28 C durante 7 das.
48
A la estra se le agregan 2-3 ml de agua estril adicionada con 0,01 % de Tween 80;
se raspa la superficie con una varilla estril, y se filtra la suspensin de conidios a
travs de un embudo con gasa estril.
Se toman 1-1,5 ml del inculo con pipeta estril y se agregan al sustrato (ver
Preparacin del sustrato).
Se incuba a 37 C. La mxima actividad enzimtica se obtiene a partir de las 36 hs.
Luego del perodo de incubacin, se agrega 30 - 40 ml de buffer y se disgrega el
micelio que ha crecido con una varilla de vidrio y se agita durante 30 min a 28 C
para obtener la enzima disuelta en agua.
Se pasa la suspensin obtenida a traves de un embudo con gasa para separar el
slido del lquido con la enzima disuelta.
Se centrifuga 10 min a 11000 rpm en tubos para centrfuga Sorvall.
Se filtra por membrana de 45 m de dimetro de poro.
*Preparacin del sustrato
Se autoclavan 10 g de salvado en 10 ml de agua durante 20 min a 121 C.
Se deja enfriar y luego se agrega el inculo.
*Purificacin
Se concentra una alcuota del extracto (ej. 10-20 ml) utilizando una membrana de
dilisis que permite un corte en 3500 Da y polietilenglicol 8000 (PEG 8000) durante
1 h a 4 C, reduciendo el volumen a la mitad. Tomar nota del volumen y una
pequea alcuota (ej 1 ml) para medir protenas y actividad.
El concentrado se lleva a 20 mM de buffer acetato pH 5.
Se siembra una alcuota (ej. 5-10 ml) de esta solucin en una columna de DEAESepharose de 1 ml de volumen de lecho previamente equilibrada con 4 ml de buffer
acetato 20 mM pH 5.
Se lava la columna con 4 ml de buffer acetato 20 mM pH 5.
Se eluye con 5 ml de NaCl 0,3 M en el mismo buffer y se recolectan 3 fracciones de
1 ml cada una. Luego lavar la columna con 5 ml de NaCl 0,5 M y luego guardar en
etanol 20 %.
Se toma una muestra para realizar un ensayo de actividad enzimtica y otra para
determinar protenas totales.
Determinacin de la actividad enzimtica por mtodo colorimtrico indirecto de
punto final (Mtodo Lugol)
Se mezclan 0,4 ml de agua con 0,5 ml de almidn soluble 0,05 % en 20 mM de
buffer acetato pH 5 y se agregan 100 l de muestra (extracto inicial y fracciones
purificadas) en un volumen final de la reaccin de 1 ml. Se incuba a 37 durante 7,5
min.
Se detiene la reaccin con el agregado de 10 l de reactivo de Lugol acidificado.
El volumen de la muestra se lleva a 5 ml con agua y se mide la absorbancia a 640
nm.
49
Agua
Almidn 0,05 %
Muestra
Lugol
Vol. final
Blanco (almidn)
Muestra
0,5 ml
0,4 ml
0,5 ml
0,5 ml
------100 l
Incubar 7,5 min a 37 C
10 l
10 l
1 ml
1 ml
Se define como una unidad de -amilasa a la cantidad dde enzima que, en las
condiciones del ensayo, hidroliza 10 mg de almidn en 30 min a un estado en el cual
no hay desarrollo dde color en presencia del reactivo de Lugol.
Determinacin de actividad enzimtica por mtodo colorimtico cintico (Kit

comercial - Wiener Lab)
Para ver el fundamento del mtodo referirse al protocolo adjunto a la gua de TP.
Para medir actividad en la muestra se sigue el protocolo a 37 C. Brevemente, se
preincuba 1 ml de reactivo a 37 C durante 3 min y luego se agrega 20 a 100 l de
muestra y se registra la absorbancia al min 1 y min 2 a 405 nm.
Determinacin de protenas (Mtodo de Bradford)
Se va a determinar el contenido de protenas totales de una alcuota del extracto y de
las fracciones eludas de la columna de DEAE-Sepharose. En paralelo se construye
una curva de calibrado con Albmina srica bovina (1mg/ml).
Blanco
10
Muestra
Agua
800 l
798 l
795 l
790 l
BSA
(1mg/ml)
Muestra
-------
2 l
5 l
10 l
-------
-------
-------
-------
-------
10 20 l
Reactivo
Bradford
Vol. Final
200 l
200 l
200 l
200 l
200 l
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
El reactivo de Bradford se agrega siempre al final, mezclando bien y se incuba 5 min

a temperatura ambiente antes de leer la absorbancia a 595 nm.
50
Actividades:
Grafique la curva de calibracin que realiz para poder determinar la concentracin

de protena de las fracciones provenientes de las distintas etapas de purificacin.
Realice una tabla de purificacin y calcule el rendimiento (%).
Resee brevemente los fundamentos de las distintas tcnicas de purificacin

utilizadas durante la prctica de laboratorio y, en cada caso, el por qu de su eleccin.
Comente los resultados obtenidos.

Tabla de Purificacin
Muestra
Volumen
Masa de
protenas
()
Actividad
enzimtica (A )
Actividad especfica
Ae = A/
Ind. de purificacin
(IP) = Aen /Ae1
Extracto
fraccin 1
fraccin 2
fraccin 3
fraccin 4
Rendimiento (%) = (A en volumen total de la fraccin/ A en el volumen extracto) x 100
51
LINEA LIQUIDA
Amilasa 405
AA
Mtodo cintico a 405 nm para la determinacin de
amilasa en suero, plasma u orina. Sustrato CNPG3
SIGNIFICACION CLINICA
La amilasa, producida principalmente en el pncreas excrino y en las glndulas salivales, escinde los enlaces -1-4
glucosdicos de los polisacridos (almidn y glucgeno). Se
encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda alcanzando los valores ms elevados entre las
24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para
volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. Tambin se ve aumentada en este caso la excrecin urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3
a 5 das, luego de que la actividad srica ha alcanzado los
niveles normales. Tambin es posible encontrar valores
aumentados en cualquier caso de "abdomen agudo" o intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas.
La parotiditis bacteriana y paperas se asocian tambin con
elevaciones en los niveles de amilasa srica.
FUNDAMENTOS DEL METODO
La -amilasa hidroliza el sustrato definido 2-cloro-p-nitrofenil-D-maltotrisido (CNP-G3) para liberar 2-cloro-p-nitrofenol
(CNP), formndose 2-cloro-nitrofenil--D-maltsido (CNPG2), maltotriosa (G3) y glucosa. El CNP absorbe a 405 nm y
la velocidad de aparicin del color es directamente proporcional a la actividad enzimtica.
El uso de este sustrato definido, sustancia de estructura y
peso molecular conocido, posibilita la expresin de los resultados en U/l y no requiere enzimas auxiliares.
REACTIVOS PROVISTOS
Reactivo: solucin conteniendo CNP-G3 2,25 mmol/l, acetato de calcio 6 mmol/l, cloruro de sodio 70 mmol/l, tiocianato
de potasio 900 mmol/l y buffer MES pH 6, 100 mmol/l.
INSTRUCCIONES PARA SU USO
Reactivo Provisto: listo para usar.
PRECAUCIONES
El Reactivo es para uso diagnstico "in vitro".
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE
ALMACENAMIENTO
Reactivo Provisto: estable en refrigerador (2-10oC) hasta la fecha de vencimiento indicada en la caja.
Cuando el espectrofotmetro ha sido llevado a cero con agua

destilada, las lecturas de absorbancia del Reactivo superiores
a 0,500 D.O. (a 405 nm) son indicio de deterioro del mismo.
MUESTRA
Suero, plasma heparinizado u orina
a) Recoleccin: si se utiliza suero, obtener de la manera
usual. Separar el suero del cogulo lo ms rpidamente posible. En caso de usar plasma ste debe ser heparinizado.
Si se emplea orina, la determinacin puede efectuarse en
una muestra de orina ocasional.
b) Aditivos: en caso de usar plasma, debe utilizarse
heparina para su obtencin. Si se usa orina ver d).
c) Sustancias interferentes conocidas: no se observan interferencias por bilirrubina hasta 200 mg/l, hemoglobina hasta 0,5 g/dl, ni triglicridos hasta 13 g/l.
En el caso de orina no debe agregarse cido clorhdrico
como conservador.
Referirse a la bibliografa de Young para los efectos de las
drogas en el presente mtodo.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento:
en suero la amilasa es estable durante una semana a temperatura ambiente (si se evita la contaminacin bacteriana)
o varios meses refrigerada.
En orina, si la muestra no se procesa en el da, es conveniente
ajustar el pH aproximadamente a 7 (con hidrxido de sodio)
dado que el pH cido inactiva la enzima irreversiblemente. A pH
7 puede conservarse refrigerada por lo menos 10 das sin
prdida de actividad, si no existe contaminacin bacteriana.
MATERIAL REQUERIDO (no provisto)
- Espectrofotmetro.
- Micropipetas y pipetas para medir los volmenes indicados.
- Cubetas espectrofotomtricas de caras paralelas.
- Bao de agua a la temperatura de reaccin seleccionada.
- Cronmetro.
CONDICIONES DE REACCION
- Longitud de onda: 405 nm
- Temperatura de reaccin: 25, 30 37oC
- Tiempo de reaccin: 2 minutos
PROCEDIMIENTO
INDICIOS DE INESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS
REACTIVOS
El Reactivo puede presentar una coloracin amarillenta que
no afecta su funcionamiento.
A) 25-30oC
En una cubeta mantenida a la temperatura seleccionada, colocar:
861261000 / 01 Pg. 1 de 4
Reactivo
2 ml
Preincubar 3-4 minutos. Luego agregar:

Muestra
100 ul
Mezclar inmediatamente y leer absorbancia luego de 1 y

2 minutos. Determinar la diferencia entre la segunda y la
primera lectura. Utilizar este valor para los clculos.
Se pueden disminuir proporcionalmente los volmenes
usando 1 ml de Reactivo y 50 ul de Muestra.
B) 37oC
Como la actividad a esta temperatura es mayor, emplear
50 ul de Muestra. Seguir el procedimiento segn A).
Se pueden disminuir los volmenes usando 1 ml de Reactivo y 20 ul de Muestra.
CALCULO DE LOS RESULTADOS

Amilasa (U/l) = A/min x factor
Temperatura
Reactivo
Muestra
Factor
25-30oC
2 ml
1 ml
100 ul
50 ul
1.628
1.628
37oC
2 ml
1 ml
50 ul
20 ul
3.178
3.953
VALORES DE REFERENCIA
Temperatura
Suero hasta
Orina ocasional hasta
25oC*
84 U/l
455 U/l
30oC*
100 U/l
540 U/l
37oC
125 U/l
680 U/l
* Calculados
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
hasta 0,250 D.O.. Para valores superiores se debe utilizar

muestra diluida con solucin fisiolgica (en caso de orina
diluir 1/10) y corregir consecuentemente los resultados.
PARAMETROS PARA ANALIZADORES AUTOMATICOS
Longitud de onda primaria ...................................... 405 nm
Longitud de onda secundaria (bicromtica) .......... 600 nm
Tipo de reaccin ..................................................... cintica
Direccin de la reaccin ...................................... aumenta
Temperatura de reaccin ............................................ 37oC
Relacin muestra/reactivo .......................................... 1:40
Tiempo de equilibrio ......................................... 3 segundos
Tiempo de retardo ......................................... 40 segundos
Tiempo de lectura .......................................... 30 segundos
Absorbancia de Blanco .................................. < 0,800 D.O.
Lmite de absorbancia ....................................... 2,000 D.O.
Valor normal inferior .................................................... 0 U/l
Valor normal superior .............................................. 125 U/l
Linealidad ............................................................... 2000 U/l
Factor (paso de luz 1 cm) ......................................... 3.178
Coef. extincin molar (405) .............. 12,9 [l x mmol-1 x cm-1]
Para las instrucciones de programacin consulte el manual
del usuario del analizador en uso.
PRESENTACION
- 3 x 10 ml (Cd. 1021404)
- 3 x 10 ml (Cd. 1009326)
BIBLIOGRAFIA
- Rauscher, E. et al - Clin. Chem. 31/1:14, 1985.
- Tietz, N. - Clinical Guide to Laboratory Tests - W.B. Saunders
Co., 1983.
- Lorenzo, L.; Demara, I.; Setta, F.; Taborda, M. - 44th National
Meeting, AACC, 19-23 julio, 1992, Chicago, Illinois. Clin.
Chem. 38/6:935, Abs. 3, 1992.
- Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular - Qumica Clnica 15/1:51, 1996.
- Young, D.S. - "Effects of Drugs on Clinical Laboratory
Tests", AACC Press, 3rd ed., 1990.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

Ver Sustancias interferentes conocidas en MUESTRA.
No pipetear con la boca.
Evitar el contacto con elementos de goma (tapones, contratapas) que deterioran el Reactivo.
PERFORMANCE
a) Reproducibilidad: procesando simultneamente replicados de una misma muestra en un mismo da se obtienen
los siguientes valores:
Nivel
51 U/l
467 U/l
D.S.
0,978 U/l
2,139 U/l
C.V.
1,9 %
0,46 %
b) Sensibilidad: depende del fotmetro empleado. En espectrofotmetro a 405 nm con cubetas de caras paralelas
de 1 cm de espesor, para un A/min de 0,001 el mnimo
cambio de actividad detectable ser de 4 U/l (a 37oC).
c) Rango dinmico: el rango til de lectura se extiende
861261000 / 01 Pg. 2 de 4
Elaborado por:
Wiener Laboratorios S.A.I.C.
Riobamba 2944
2000 - Rosario - Argentina
http://www.wiener-lab.com.ar
Dir. Tc.: Viviana E. Ctola
Bioqumica
Producto Inscripto M.S.
Disp. N: 154/02
Cert. N: 4484/02
Wiener lab.
2000 Rosario - Argentina
TRABAJO PRACTICO N6
Accin de la invertasa de clulas inmovilizadas de Saccharomyces cerevisiae
Objetivo:
Inmovilizar clulas de S. cerevisiae y evaluar la actividad invertasa.
Introduccin
El uso de biocatalizadores para llevar a cabo biotransformaciones es un rea en
continua expansin. Un aspecto clave del proceso es el uso del catalizador (clula o
enzima) en un sistema continuo que permite extender el uso del mismo en el tiempo
dando como resultado una disminucin de los costos del proceso y otras ventajas como
una mayor pureza del producto, mayor productividad, etc. Para lograr este objetivo, es
posible inmovilizar el biocatalizador. La inmovilizacin consiste en prevenir el
movimiento celular libre por mtodos naturales o artificiales.
La inmovilizacin de clulas (fig. 1) o enzimas tiene numerosas aplicaciones en
biomedicina, farmacologa (produccin de antibiticos), produccin de bebidas y
alimentos
(produccin
exopolisacrido),
de
agricultura
cerveza,
ganadera
(produccin de esperma para mejoramiento

animal), biorremediacin (decoloracin de
colorantes
textiles,
remocin
de
metales
pesados), etc.
La
Federacin
Europea
de
Biotecnologa (1983) define el concepto de

inmovilizacin de la siguiente manera: Los
biocatalizadores inmovilizados son enzimas o
clulas u organelas localizados en cierta regin
Fig. 1. Clulas de levadura

inmovilizadas
definida del espacio, con retencin de su

actividad cataltica y, si es necesario, de su viabilidad, y que pueden ser usados de modo
repetido y continuo. A continuacin se aclaran algunos aspectos de esta definicin:
Localizados: esto quiere decir que el biocatalizador est compartimentalizado.
Hay una fase slida que tiene la actividad cataltica y est en contacto con un medio
reactivo lquido libre de catalizador.
Retencin de la actividad cataltica (y/o viabilidad): los tratamientos para lograr
la inmovilizacin reducen la actividad cataltica. Esta reduccin no puede superar el 75
% de prdida de actividad, para que el proceso sea rentable.
54
Uso repetido y continuo: aqu reside la gran ventaja de la inmovilizacin, esto se

relaciona con la fcil separacin del catalizador del medio sin prdida de actividad y por
consecuencia directa, con su reutilizacin.
Existen distintos mtodos de inmovilizacin:

Unin a soportes
Adsorcin: sencilla, no daa las clulas,
pero como la fuerza de unin es baja, se produce elusin
de las clulas, lo cual produce prdidas importantes de
clulas en los procesos continuos.
Uniones
inicas:
los
soportes
son
intercambiadores inicos, es una metodologa sencilla,

pero cambios en el pH o la concentracin de sales, puede
separar las clulas del soporte.
Uniones
covalentes:
estas
uniones son ms fuertes, hay que modificar

protenas de las clulas o regiones de la
enzima. Hay que verificar que no haya
prdida de la actividad cataltica. Es ms
costoso.
Entrecruzamiento:
entre
aminocidos de la protena y agentes

polimerizantes como el glutaraldehdo.
Encapsulacin/
Microencapsulacin en polmeros: se rodean
clulas o enzimas fsicamente en geles,
microcpsulas o polmeros fibrosos como la
celulosa.
Los
geles
son
polmeros
entrecruzados insolubles en agua, como la

poliacrilamida.
En
el
caso
de
las
Fig. 2: Imgenes de microscopa de barrido de C.

guillermondi inmovilizdas en una cpsula de gel de
alginato, con BaCl2 como agente polimerizante. Las
colonias se distribuyen sobre la superficie (flecha en A) y
en el interior de la cpsula (B)
microcpsulas, las clulas o enzimas se rodean

de una membrana semipermeable del polmero.
55
Las clulas pueden inmovilizarse sin soportes, y este proceso se llama

floculacin. Son clulas unidas entre ellas. El ejemplo tpico es la floculacin de cepas
de Zymomonas mobilis empleadas en la produccin de etanol a partir de glucosa.
La unin a soportes constituye el mtodo ms antiguo. Para esto debe tenerse en
cuenta:
Estructura del soporte
Tipo de unin
Relacin entre grupos hidroflicos e hidrofbicos
Tamao de la partcula
Relacin superficie/volumen
Se pueden usar soportes preformados, ampliamente usados para inmovilizar

enzimas, y menos para clulas ya que hay que encontrar condiciones y materiales que
permitan la adhesin celular.
Para la inmovilizacin de clulas, se usa la prepara el soporte durante el proceso
de inmovilizacin. Son soportes porosos que garantizan la completa retencin de las
clulas.
Tipos de soportes:
Inorgnicos
Naturales: arena, silicatos, arcillas
Sintticos: cermicas, vidrios de porosidad controlada.
Orgnicos
Naturales: virutas de madera, colgeno, celulosa, alginatos, carragenatos,
albmina.
Sintticos: PVC, polipropileno, poliacrilamida, resinas de intercambio
inico, epxidos, poliuretanos.
La seleccin del material se realiza teniendo en cuenta:
Materiales de alta disponibilidad y bajo costo.
Materiales que permitan un proceso de inmovilizacin simple y
efectivo respecto de la retencin de la actividad.
Materiales con alta capacidad y eficiencia
Materiales que permitan un diseo de reactores sencillo.
56
Los dos primeros criterios apuntan al uso de materiales naturales que permitan
tcnicas de inmovilizacin por adsorcin. En tanto que los dos ltimos, apuntan la
eleccin hacia soportes orgnicos complejos. De todos modos, la eleccin final va a
depender del biocatalizador, del proceso en el que va a participar, y del producto que se
desea obtener.
En el caso de inmovilizacin de clulas, uno de los mayores problemas es la

resistencia a ala transferencia de masas, impuesta por el hecho de que el sustrato tiene
que difundir hasta el sitio de reaccin y los productos de inters del proceso y las
sustancias txicas y/o inhibidoras de la reaccin deben ser removidos. La transferencia
de oxgeno es tambin un problema a la hora de disear la inmovilizacin de un tipo
celular. Por esto, en lneas generales, las tcnicas de inmovilizacin han sido aplicadas
principalmente a procesos anaerbicos con organismos anaerbicos estrictos o con los
componentes anaerbicos de microorganismos facultativos.
El azcar invertido es una mezcla de glucosa y fructosa en cantidades

equivalentes que se obtiene a partir de sacarosa. La conversin de un dmero de
sacarosa en monmeros se produce por la siguiente reaccin:
glucosa-fructosa + H2O
sacarosa
glucosa + fructosa
azcar invertido
Este proceso requiere una molcula de agua que se incorpora qumicamente a los
monmeros. Esto es importante ya que el agua libre es removida y el peso del azcar se
incrementa. Este incremento es significativo en la produccin de grandes cantidades de
golosinas, que son comercializadas por peso. Otra caracterstica importante es que el
azcar invertido es higroscpico, por lo cual, por ej. es incluido en la fabricacin de
chicles, para evitar que se resequen y tornen quebradizos; o en la elaboracin confituras
baadas en chocolate para prevenir una excesiva cristalizacin.
La reaccin de conversin est catalizada por cidos o por la enzima invertasa.
Parte Prctica
Materiales
Agar-agar 1,2 % en agua;
clulas de Saccharomyces cerevisiae en pan;
aceite vegetal;
57
sacarosa 20 % p/v;
buffer acetato 0,1 N, pH 5; agua para lavados.
Esquema de trabajo
Agar-agar 1,2 % p/v
clulas de Saccharomyces cerevisiae
esterilizacin
Mezcla a 50 C 25 % p/p
fase hidrofbica
(aceite vegetal)
agitacin
(formacin de esferas)
enfriamiento a 0 C
lavado, filtracin, recoleccin de esferas
llenado de la columna
sacarosa 20 % p/v
contacto, 15 min. t. amb.
Dosaje de glucosa por test de glicemia

En el caso del TP, se utilizar el test para la determinacin de glucosa en sangre,
de uso habitual en los laboratorios de anlisis clnicos, ya usado en el TP N 3.
58
59

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Bains W. (1993). Biotechnology from A to Z. IRL Press, Oxford.

Applied Microbiology & Biotechnology. Springer Verlag.

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Algunas de estas publicaciones pueden ser consultadas en la biblioteca del INTI.

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