Investigacion Inmunologia 6BM1

INSTITUTO POLITECNICO
NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL
INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERIAS CAMPUS
GUANAJUATO
INGENIERIA BIOTECNOLGICA
I. Evaluacin de la produccin de anticuerpos.
II. Produccin de lneas celulares y obtencin
de clulas
III. Mantenimiento, seleccin y clonacin de
hibridomas
Francisco Garca Garca

Kevin Mata Villegas
Jessica del Roco Ramrez Casas
Profesor: Hilario Rocha Ramrez

Silao de la Victoria, Gto. A 28 de mayo de 2015
cnologa de la Respuesta
Inmune
I.
Evaluacin de produccin de Anticuerpos

Anticuerpos
Un anticuerpo se define como una inmunoglobulina (Ig) capaz de una
combinacin especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un

animal susceptible. Son producidos en respuesta a la invasin de molculas
forneas en el cuerpo. (Caldern, 2007)
Los anticuerpos existen como una o

ms unidades en forma de Y, compuesta por
cuatro
cadenas polipeptdicas. Cada Y
contiene dos copias idnticas de una cadena

pesada (HC, heavy chain), y dos copias
idnticas entre s de una cadena ligera (LC,
light chain), llamadas as por sus pesos
moleculares
relativos
que
son
de
aproximadamente 50kDa la cadena pesada

y de cerca de 25kDa la cadena ligera. Estas
cadenas se mantienen unidas mediante
Figura 1. Estructura de un anticuerpo
enlaces disulfuros intercatenarios y pueden

separarse por reduccin de los enlaces S-S y acidificacin (Figura 1). (Caldern,
2007)
Un anticuerpo
monoclonal es una inmunoglobulina homognea,
secretada por un solo clon celular (clulas B y plasmticas), en la que todas sus
reacciones con un antgeno definido siempre son las mismas. Un anticuerpo
Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera campus Guanajuato
Inmune
policlonal es aquel que difiere en su eptopo de unin y complementariedad de la

secuencia de aminocidos, pero comparten especificidad por una diana general.
(Goyache, 2009)
Inmune
Figura 3. Estructura de un anticuerpo policlonal
Figura 2. Estructura de un anticuerpo monoclonal
Monoclonales
Tabla
1.
Caractersticas
de
los
anticuerpos monoclonales y policlonales
Policlonales
Qumicamente puros
Mezcla heterognea.
Invariable (predecibles)
Variacin entre los lotes (impredecibles)
Produccin limitada
Es preferible utilizar Ag puros para su

obtencin
No se necesitan Ag puros
Irrepetibles
Muy especficos
Reconocen varios eptopos
Un solo isotipo (pueden no reconocer

variantes antignicas)
Fcil produccin
Produccin compleja y larga
Baratos
Caros
Multitud de isotipos (plasticidad funcional y

efectora)
Inmune
OBTENCIN DE ANTICUERPOS PARA LAS TCNICAS INMUNOLGICA

1.
Policlonales (Sueros): por inmunizacin de animales de experimentacin

(conejos, cabras, quidos, etc.) con el antgeno deseado, siguiendo un
protocolo adecuado, tras el que se extrae sangre y se obtiene el suero
donde estarn los anticuerpos dirigidos frente al antgeno con el que se ha
realizado la inmunizacin (frente a todos sus determinantes antignicos) y
frente a otros antgenos a los que se haya enfrentado el animal.
2. Monoclonales (Khler y Milstein, P.N. Medicina 1984): Son los anticuerpos

producidos por un clon, es decir, por un grupo de clulas derivados de una
nica clula y, por lo tanto, con caractersticas idnticas (todas producen el
mismo anticuerpo).
Protocolo de produccin de un anticuerpo monoclonal
1. Inmunizar un ratn con el Ag deseado.
2. Tras un tiempo (varias semanas), extraer el bazo y disgregar para obtener

linfocitos B, que tienen una cortsima viabilidad en cultivo.
3. Fusionar los linfocitos B con clulas de mieloma, que tienen la caracterstica de

ser deficientes en la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa, HGPRT),
implicada en la sntesis exgena de ADN, por lo que slo pueden seguir la va
endgena.
4. Cultivar los productos de la fusin (hibridomas linfocito-mieloma), en medio

selectivo HAT (hipoxantina-aminopterina-timidina). La aminopterina bloquea la va
endgena, y slo las clulas que puedan sintetizar cidos nucleicos por la va
exgena (que sean HGPRT+) sobrevivirn.
Inmune
Los hibridomas formados por la fusin entre un linfocito y una clula de mieloma
son capaces de crecer en este medio.
5. Analizar los pocillos por ELISA.
6. Clonar los pocillos que contengan hbridos productores de anticuerpos de

inters, realizando diluciones para intentar tener una clula por pocillo, por lo que
todas las que se deriven de ella secretarn el mismo anticuerpo.
7. Caracterizar los AcMo
8. Producir en gran escala:
a. Cultivo in vitro: los clones se cultivan en botellas o en biorreactores,

encontrndose los AcMo en el medio de cultivo.
b. Produccin in vivo: los clones se inoculan en la cavidad abdominal de ratones

para producir ascitis en donde se encuentran los AcMo mucho ms concentrados
que en el caso anterior.
Inmune
Figura 4. Protocolo de obtencin de un anticuerpo monoclonal (Goyache,

2009)
Tabla2. Anticuerpo monoclonales y su mecanismos de accin
Inmune
Produccin de un anticuerpo policlonal
Para especies: conejo, cabra, cerdo, equino. Es te tipo de produccin es de

fcil mantenimiento.
Los anticuerpos
humanos contra protenas de conejo son menos
frecuentes que para otras especies. Los anticuerpos de conejo precipitan mejor
protenas humanas. Esto anticuerpos sirven para la purificacin de antisueros o
fracciones de inmunoglobulinas, es por vas y dosis de inoculacin.
Protocolo de obtencin
Para la produccin de anticuerpos policlonales se emple el pptido 1513 y los

pseudopptidos -437, -439, -440, -441 y -442 conjugados a albmina. Para
ello, se inmunizaron conejos hembra Nueva Zelanda de 5 libras de peso
mantenidos en cautiverio en las instalaciones de la FIDIC (Fundacin Instituto de
Inmunologa de Colombia). Los animales fueron inmunizados va intramuscular
(i.m) en la parte interna de la pierna, empleando un esquema de 6 inmunizaciones
en los das 1, 20, 50, 60, 75 y 80 con dosis de 0.5 mL con una concentracin entre
50 a 100 g de los conjugados a BSA (1mg/mL). La primera inoculacin se realiz
formulando los conjugados con adyuvante completo de Freund (v/v) y las
siguientes inmunizaciones con adyuvante incompleto de Freund. Los conejos
fueron sangrados antes de la primera inmunizacin y cada semana despus de las
inoculaciones. La sangra de los animales se realiz por la vena marginal de la
oreja obteniendo muestras de sangre entre 5 -10 mL. (Figura 5)
Figura 5. Protocolo de obtencin de un anticuerpo monoclonal (Lozano, 2011)

Inmune
Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales y policlonales

Monoclonales
Definicin de subpoblaciones celulares.
Tipificacin de antgenos de tejido y grupo sanguneo.
Diagnstico y tratamiento de enfermedades infecciosas y parasitarias.
Deteccin de los niveles circulantes de hormonas.
Demostracin de daos tisulares.
Deteccin de txicos, mutagnesis y drogas.
Fabricacin de anti venenos.
Purificacin Inmunoqumica de hormonas y protenas.
Diagnstico, seguimiento y tratamiento de tumores malignos.
Inmune
Policlonales: tiles en la deteccin de protenas que tienen niveles de

expresin ms bajos, pues ms de un anticuerpo puede unirse a una nica
protena, aumentando con ello, la seal producida.
EVALUACIN DE LOS ANTICUERPOS
Para la evaluacin de los anticuerpos monoclonales y policlonales se necesitan

de tcnicas basadas en la unin Ag-Ac.
1. Tcnicas de aglutinacin: Cuando el antgenos e encuentra unido o formando
parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y
cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado.
Figura 6. Inhibicin por aglutinacin de glbulos rojos con gonadotrofina

corinica (HCG) presente en suero.
2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo: Para la realizacin de estas

tcnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectndose la formacin del
complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida.
10
Inmune
Figura 8. Inmunofluorescencia directa (izquierda) e

indirecta (derecha)
Figura 7. Representaciones de un citmetro de flujo
y separacin.
3. Tcnicas de radioinmunoensayo: En estas tcnicas al anticuerpo se une un

istopo radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de
la radiactividad emitida.
Figura 9. Esquema del principio general de radioinmunoensayo para medir

hormonas
11
Inmune
4. Cromatografa de afinidad: La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse

para obtener Acs y Ags puros.
5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting: Permite detectar la presencia y
cantidad de antgenos y anticuerpos especficos.
6. Tcnica de enzimoinmunoensayo: Esta tcnica, tambin se conoce como
ensayo de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). La identificacin de los
complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al
antgeno, o bien unidas al anticuerpo. El ensayo de ELISA puede ser directo o no
competitivo.
Figura 10. Principio bsico de la tcnica de ELISA indirecta o competitiva y directa

o no competitivo
12
Inmune
II.
Produccin de lneas celulares y obtencin de

clulas
El cultivo celular se desarroll a partir de los ltimos aos del siglo XIX como
una continuacin de tcnicas de la embriologa. Wilhelm roux mantuvo en el ao
1885 clulas de embrin de pollo en solucin salina durante unos das. Se
considera al zologo americano R. G. Harrison como el iniciador de los cultivos de
tejidos animales.
En 1907, Harrison fue el primer cientfico que emple tcnicas in vitro para el
estudio de fenmenos in vivo, realizando cultivos de mdula espinal embrionaria
de anfibios.
En 1952, Gry y col. establecen la primera lnea celular continua, las clulas
HeLa. El medio empleado era extremadamente complejo y poco definido: plasma
de pollo, extracto de embrin bovino y suero de cordn umbilical humano.
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que

permiten el mantenimiento de las clulas 'in vitro', manteniendo al mximo sus
propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas.
Cultivo celular primario

Es el tipo de cultivo ms utilizado. Se puede obtener a partir de explantes
primarios o de suspensiones de clulas disgregadas. La disgregacin celular se
realiza por mtodos enzimticos o mecnicos. En estos cultivos se pierden las
interacciones clula-clula y las interacciones de la clula con la matriz
extracelular. Sin embargo, las clulas son capaces de proliferar y la poblacin
celular crece notablemente. Cuando las clulas ocupan toda la superficie
disponible se dice que han alcanzado la confluencia. En esta etapa, las clulas
establecen contactos entre ellas que inhiben su proliferacin y el crecimiento se
detiene. Por eso, al cabo de un tiempo hay que transplantar las clulas a un nuevo
soporte. Esta operacin se denomina subcultivo o pase.
13
Inmune
Existen 2 tipos de cultivos celulares primarios: en monocapa (las clulas

crecen adheridas sobre un soporte slido) y en suspensin (las clulas se
encuentran dispersas en el medio de cultivo).
Lneas celulares
Las clulas del cultivo primario en monocapa se dispersan por mtodos
enzimticos y se pasan a un nuevo frasco de cultivo. En el caso de clulas en
suspensin, sencillamente se diluyen en medio fresco. Los sucesivos cultivos as
formados se denominan una lnea celular. La formacin de una lnea celular a
partir de un cultivo primario implica que:
Aumenta el nmero de clulas obtenidas

Acaban predominando uno o dos tipos celulares: los que tienen mayor tasa
de crecimiento
La poblacin celular se hace uniforme y homognea
Sus caractersticas se conservan durante las sucesivas generaciones y, si
se conservan en nitrgeno lquido, de forma indefinida
Normalmente, las lneas celulares tienen una vida finita que, segn el tipo de
clula, se puede prolongar entre 20 y 100 generaciones. Superado ese lmite, las
clulas entran en una etapa que se denomina senescencia en la que pierden su
capacidad de proliferar, supuestamente por el acortamiento de los telmeros, y
mueren. Existen diferentes lneas celulares las ms importantes son:
Lnea celular CHO dhfr: Se obtiene del ovario del Hmster chino, es
utilizado para la expresin de glicoprotenas recombinantes humanas. Sus
caractersticas son; bien caracterizada, relativamente estable, capaz de
producir protenas heterlogas y es capaz de crecer en condiciones de
cultivo en suspensin o de adherencia. Una desventaja es que la muerte
celular puede ocurrir en el centro de grandes agregados.
14
Inmune
Lnea celular Sf9: Derivado de las clulas de ovario del insecto

Spodoptera frugiperda. Es utilizado en la produccin de enzimas
recombinantes (- lactoglobulina de bovino, antistasina y receptor
adrenrgico). Caractersticas; morfologa esfrica (permite que las clulas
sean ms resistentes a dao mecnico) y capacidad de crecer rpidamente
(reduce el tiempo de incubacin).

Lnea celular Schnneider-2: Derivada del estado embrionario tardo de
Drosophila melanogaster. Usada para la produccin de antitripsina-1
humano. Caractersticas; adaptables para cultivo a gran escala en
biorreactores.
Lnea celular HeLa: Derivada del adenocarcinoma de crvix humano. Se
utiliza en la expresin del antgeno de superficie de la hepatitis B y
superxido dismutasa humana. Caractersticas; tipo celular epitelial,
susceptibles al virus tipo 1 y adenovirus tipo 3.

Lnea celular NIH/3T3: Originada de los cultivos de embriones de ratn
NIH Swiss. Utilizado para estudios de transfeccin, es susceptible al virus
de sarcoma, y expresa protenas como el antgeno de superficie de la
hepatitis B.
Lnea celular Vero: derivada del rio de mono verde africano. Se utiliza
para
la
produccin
industrial
de
vacunas
virales.
Caractersticas;
susceptible al poli, rubeola, arbovirus y reovirus.
Figura 11.
Esquemas de
obtencin de una
lnea celular.
Obtencin de clulas
15
Inmune
El primer paso para aislar clulas de un mismo tipo a partir de un tejido,

consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas. Para lograrlo,
la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolticas (como tripsina y
colagenasas) que degradan las protenas de la matriz; y tambin se utilizan
agentes (como el EDTA -cido etilendiaminotetraactico) que secuestran al in
calcio, del cual depende la adherencia celular. De esta forma, y mediante una
suave agitacin, se obtiene una suspensin celular que contiene a todas las
clulas presentes en ese tejido.
Para separar los diferentes tipos celulares se

pueden utilizar varios mtodos:
1. La centrifugacin, que permite separar a

las clulas por tamao.
2. La capacidad de adherencia al vidrio o al
plstico que tienen algunos tipos celulares.
3. La unin a ciertos anticuerpos especficos
para determinados componentes celulares.
Estos
anticuerpos
se
usan
unidos
diferentes matrices (colgeno, bolitas de

polisacridos, de ltex o de plstico). Las
clulas unidas a la matriz (a travs de los
anticuerpos) se recuperan por agitacin,
tratamiento
Equipo para la separacin de clulas
marcadas por fluorescencia.
cFigura 12.
con
tripsina
(digiere
las
protenas que median la adhesin) o, en el

caso de una matriz digerible (como el
colgeno), degradando la propia matriz con enzimas (como la colagenasa).
16
Inmune
4. La unin a ciertos anticuerpos acoplados a colorantes fluorescentes. Las clulas

que contienen un determinado componente son reconocidas y marcadas por los
anticuerpos.
Las clulas marcadas son separadas de las no marcadas en un separador de
clulas activado por fluorescencia o cell sorter (Figura 12).
5. La diseccin de un grupo de clulas a partir de una seccin de tejido preparada

para microscopa. La regin que contiene las clulas de inters es irradiada con un
lser, que funde un pequeo crculo con las clulas que estn por debajo. Estas
clulas capturadas son luego removidas para un posterior anlisis. La tcnica,
denominada microdiseccin de captura por lser, puede utilizarse para aislar y
estudiar diferentes partes de un tumor, por ejemplo. Otra tcnica relacionada
emplea un lser para disectar un grupo de clulas y catapultarlas a un
contenedor apropiado para un posterior anlisis (Figura 13).
Figura 13. Tcnica de microdiseccin para aislar clulas a partir de

secciones de tejidos.
Las clulas transformadas se caracterizan porque:
Son inmortales: crecen indefinidamente
Su crecimiento es aberrante: se pierde la inhibicin por contacto, la

limitacin de la densidad celular durante la proliferacin y la dependencia
del anclaje
17
Inmune
Son malignas: invaden tejidos y dan lugar al crecimiento de tumores
Son genticamente inestables: son heteroploides (vara el nmero de

cromosomas) y presentan aberraciones cromosmicas
III.
Mantenimiento, seleccin y clonacin de hibridomas

Un hibridoma sale de la fusin de dos clulas formando un heterocarionte, es
decir, una clula con dos ncleos separados pero con los contenidos
citoplasmticos compartidos. Se trata de una suspensin de clulas con
compuestos que inducen la fusin de membranas (fusgenos), tales como el
polietilenglicol (PEG) o ciertos virus.
Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en mitosis, produciendo una
clula hbrida en la cual las envolturas de ambos ncleos se han disgregado,
permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un nico gran ncleo.
Las clulas hibridas pueden clonarse estableciendo una lnea celular, pero se
sabe que en muchos casos la lnea resultante es inestable genticamente, y
tiende a perder parte del material gentico.
Mantenimiento de hibridomas
1. Se expanden (se dejan proliferar en recipientes de mayor capacidad) y luego se

recogen.
2. Se concentran por centrifugacin.
3. Se suspenden en medio de cultivo suplementado con:
Suero fetal de ternera
18
Inmune
Dimetil sulfxido
4. Se Congelan a -70C con Nitrgeno lquido.
En cultivo en medios ricamente suplementados para la produccin inmediata de

anticuerpos. Se Inoculan en la cavidad abdominal de ratones histocompatibles.
Seleccin de los hibridomas

Los hibridomas pueden ser seleccionados inicialmente por su reaccin positiva
en ELISA frente a la protena recombinante (ejemplo CD29R) empleada como
inmungeno.
Se puede recurrir all inmunoblotting frente a la protena recombinante,
seleccionando cuatro hibridomas para su caracterizacin por su capacidad para
reconocer mediante esta tcnica la protena recombinante CD29R, de un peso
molecular aproximado de 30 kDa.
Los anticuerpos se pueden probar en inmunoblotting e inmunoprecipitacin
frente a lisados de plaquetas y PBMC porcinos, dos tipos celulares en los que ha
sido evidenciada en la especie humana la expresin de la 1 integrina. La
ausencia de reactividad en estas tcnicas, as como en citometra de flujo, podra
deberse a que, al proceder de una inmunizacin con una protena recombinante,
los anticuerpos no reconocen la conformacin nativa de la 1 integrina porcina
(ejemplo).
Clonacin de los hibridomas
Despus de seleccionar los hidromas a usar se realiza la clonacin, esta puede

ser efectuada por el mtodo de la dilucin lmite. Este procedimiento tiene como
fin que cada hibridoma seleccionado proceda de la una sola clula y que todas las
19
Inmune
clulas que lo conforman sean idnticas entre s. Para ello se cuentan las clulas
de una suspensin de hibridomas en hemocitmetro y se efectan las diluciones
necesarias para alcanzar una concentracin celular de entre 1.000 y 5.000 clulas
por ml.
1. Disoluciones seriadas: Se cuentan las clulas hibridadas y se colocan en la
concentracin adecuada.
2. Se espera a que el clon crezca para volver a analizar la presencia de
anticuerpo especfico en el sobrenadante de cultivo.
Si es positivo el clon se congela y se expande
Se debe de clonar al menos 2 o 3 veces para asegurar la monoclonalidad

del hibridoma y su estabilidad.
3. Para la expansin y crecimiento se usan frascos estriles
Vigilar diariamente la viabilidad celular y la presencia de contaminaciones.
Protocolo
de
obtencin
anticuerpos
uso
de
de
hibridomas:
1.-
Las
clulas
de
mieloma
inmortales a las cuales les falta la

enzima HGPRT (enzima requerida
para el crecimiento en el medio de
seleccin HAT) son fusionadas con
clulas
de
bazo
normales,
productoras de anticuerpos de un
animal inmunizado con el antgeno
X (estas clulas si generan la
enzima HGPRT).
20
Inmune
Figura 14. Protocolo de obtencin de anticuerpos y uso de
hibridomas
2.- Cuando se colocan en el medio HAT, las

clulas no fusionadas y las clulas del mieloma
no crecen, porque ellas no producen purinas a travs de la va metabolica

dependiente de HGTPR. Slo las clulas fusionadas (derivadas del mieloma y las
clulas del bazo productoras de Ac). Cada hibridoma produce un nico Ac.
3.- Probar los clones individuales e identificar aquellas que produzcan el antgeno
X. Despus el clon puede ser cultivado y obtener grandes cantidades del
Anticuerpo.
21
Inmune
Referencias
1. Goyache, J. (2009). TEMA 10. Tcnicas inmunolgicas I. Anticuerpos

monoclonales y sus aplicaciones. Reacciones antgeno-anticuerpo in vitro:
tipos de inmunorreacciones. Concepto de sensibilidad y especificidad.
Reacciones cruzadas. Ttulo srico.
2. Caldern R. (2007). Inmunoqumica. Universidad Autnoma de Mxico.
3. Lozano, J. (2011). Actividad funcional de anticuerpos policlonales inducidos
por pseudopptidos derivados del antgeno MSP-1 del Plasmodium
falciparum en conejos Nueva Zelanda.
4. Albadalejo, J. (2007). Cultivos celulares. Obtenido de: www.cultek.com
5. Segretn M. (2008). Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de
clulas animales). Argenbio: Consejo Argentino para la Informacin y el
Desarrollo de la Biotecnologa. INGEBI-CONICET.
6. Paos, G. (2003). Receptores porcinos celulares: aplicacin como
marcadores biolgicos. Tesis doctoral. Crdoba.
7. Roitt, I. (1998). Inmunologa.: fundamentos. Novena edicin. Buenos aires:
Editorial Mdica Panamericana.
22

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Francisco Garca Garca

Profesor: Hilario Rocha Ramrez

Evaluacin de produccin de Anticuerpos

combinacin especifica con el antgeno que ha causado su produccin en un

Los anticuerpos existen como una o

cadenas polipeptdicas. Cada Y

contiene dos copias idnticas de una cadena

aproximadamente 50kDa la cadena pesada

Figura 1. Estructura de un anticuerpo

enlaces disulfuros intercatenarios y pueden

monoclonal es una inmunoglobulina homognea,

Instituto Politcnico Nacional Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniera campus Guanajuato

policlonal es aquel que difiere en su eptopo de unin y complementariedad de la

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Figura 3. Estructura de un anticuerpo policlonal

Figura 2. Estructura de un anticuerpo monoclonal

Variacin entre los lotes (impredecibles)

Es preferible utilizar Ag puros para su

Reconocen varios eptopos

Un solo isotipo (pueden no reconocer

Produccin compleja y larga

Multitud de isotipos (plasticidad funcional y

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OBTENCIN DE ANTICUERPOS PARA LAS TCNICAS INMUNOLGICA

Policlonales (Sueros): por inmunizacin de animales de experimentacin

2. Monoclonales (Khler y Milstein, P.N. Medicina 1984): Son los anticuerpos

Protocolo de produccin de un anticuerpo monoclonal

1. Inmunizar un ratn con el Ag deseado.

2. Tras un tiempo (varias semanas), extraer el bazo y disgregar para obtener

3. Fusionar los linfocitos B con clulas de mieloma, que tienen la caracterstica de

4. Cultivar los productos de la fusin (hibridomas linfocito-mieloma), en medio

5. Analizar los pocillos por ELISA.

6. Clonar los pocillos que contengan hbridos productores de anticuerpos de

7. Caracterizar los AcMo

8. Producir en gran escala:

a. Cultivo in vitro: los clones se cultivan en botellas o en biorreactores,

b. Produccin in vivo: los clones se inoculan en la cavidad abdominal de ratones

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Figura 4. Protocolo de obtencin de un anticuerpo monoclonal (Goyache,

Tabla2. Anticuerpo monoclonales y su mecanismos de accin

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Produccin de un anticuerpo policlonal

Para especies: conejo, cabra, cerdo, equino. Es te tipo de produccin es de

humanos contra protenas de conejo son menos

Para la produccin de anticuerpos policlonales se emple el pptido 1513 y los

Figura 5. Protocolo de obtencin de un anticuerpo monoclonal (Lozano, 2011)

Aplicaciones de los anticuerpos monoclonales y policlonales

Definicin de subpoblaciones celulares.

Tipificacin de antgenos de tejido y grupo sanguneo.

Diagnstico y tratamiento de enfermedades infecciosas y parasitarias.

Deteccin de los niveles circulantes de hormonas.

Demostracin de daos tisulares.

Deteccin de txicos, mutagnesis y drogas.

Fabricacin de anti venenos.

Purificacin Inmunoqumica de hormonas y protenas.

Diagnstico, seguimiento y tratamiento de tumores malignos.

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Policlonales: tiles en la deteccin de protenas que tienen niveles de

EVALUACIN DE LOS ANTICUERPOS

Para la evaluacin de los anticuerpos monoclonales y policlonales se necesitan

Figura 6. Inhibicin por aglutinacin de glbulos rojos con gonadotrofina

2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo: Para la realizacin de estas

Figura 8. Inmunofluorescencia directa (izquierda) e