CRECIMIENTO MICROBIANO (O DE MICROORGANISMOS) EN

NUTRIENTES LIMITANTES MULTIPLES, ESPECIALMENTE LA LIMITACIN

DOBLE POR SUSTRATOS DE CARBONO Y NITROGENO

Palabras clave: Quimiostato, el rendimiento del crecimiento, la limitacin del

crecimiento, la limitacin de nutrientes mltiples, carbono, nitrgeno
Resumen
La Limitacin simultnea del crecimiento microbiano por dos o ms nutrientes
es discutida por la limitacin dual (carbono / nitrgeno) en cultivo continuo. Los
lmites de la zona en la que se produce un crecimiento de dos limitantes puede
ser claramente definida a partir de datos de cultivo y la composicin celular, y
ellos tambin pueden ser predichos a partir de los datos de rendimiento de
crecimiento medidos en condiciones usando slo un sustrato limitante. Se ha
demostrado que para los dos nutrientes Carbono y nitrogeno la zona de
limitacin de doble nutriente depende de la relacin C:N en el medio de
crecimiento y la (dilucion) tasa de crecimiento. El concepto de Doble (Carbono
y nitrogeno) crecimiento limitado que aqu se presenta se puede extender a
otras combinaciones binarias y mltiples de nutrientes.
Introduccin:
El uso de medios minerales definidos para el crecimiento de microrganismos
fue un desarrollo importante en la microbiologa. En combinacin con los
avances en las tcnicas de cultivo, como por ejemplo el cultivo en quimiostato,
que permiti la reproduccin continua
(crecimiento continuo) de
microrganismo en ambientes seleccionados bajo condiciones definidas para
estudiar el efecto de nutrientes especficos sobre diversos fenmenos
fisiolgicos celulares. Como regla general, los medios minerales definidos se
han formulado con el fin de permitir a los microbios sintetizar sus componentes
celulares a partir de fuentes individuales de carbono, nitrgeno, fosforo, etc.
Adicionalmente, esto se convirti en una prctica comn para concentraciones
relativas de nutrientes individuales para ser ajustadas de tal manera que, tal
como se formula en la Ley del minimopor justus von Liebig (1840), solo uno
de ellos, por lo general la fuente de carbono, limite la cantidad mxima de
biomasa que pueda ser producida, con el resto de nutrientes en exceso.
(Monod 1942; Stephnson).
En contraste con las condiciones en que los microbios estn expuestos en los
cultivos de laboratorio, los entornos encontrados en la naturaleza son
totalmente diferentes. All, los microbios tienen que hacer frente a tanto a la
presencia simultnea como a las bajas concentraciones de una multiplicidad de
nutrientes homlogas, es decir, compuestos que pueden satisfacer la misma
funcin fisiolgica. Esto es especialmente cierto para las fuentes de carbono,
nitrgeno y fsforo. De hecho, se ha sealado que la presuncin de que la
limitacin de crecimiento en la Naturaleza est limitada por un nico sustrato o
nutriente es probablemente una suposicin errnea ( Veldkamp y Jannasch

1972; Perla 1977 ) . Aunque se han logrado avances considerables en los

ltimos aos con respecto a la comprensin del crecimiento simultneo en
cualquiera de las dos fuentes de carbono o los dos receptores de electrones
( Harder y Dijkhuizen 1976 ; Harder & Dijkhuizen 1982 ; Egli et al , 1986; .
Robertson & Kuenen 1990 ), ha habido pocos informes relativos a la limitacin
simultnea de mltiples nutrientes no homlogas , como comenta Harrison
(1972) y Baltzis y Fredrickson (1988).
En consecuencia, la mayora de los microbilogos todava apoyan la opinin de
que slo un compuesto puede ser que limita el crecimiento en un momento
determinado.
En este trabajo (contribucin) se evaluara la existencia de regmenes de
crecimiento con mltiple-sustrato limitante bien definido. Debido a la escasez
de datos, ejemplos de la limitacin simultnea de crecimiento por dos macronutrientes, carbono y nitrgeno, se har hincapi, pero quedar claro que el
principio de crecimiento microbiano con medios con nutrientes limitantes
mltiples es igualmente aplicable a una amplia gama de otras limitaciones de
nutrientes. Se examinara la influencia que tiene el carbono y nitrgeno en la
limitacin simultanea del crecimiento microbiano, composicin y fisiologa
celular; se presentara una hiptesis de trabajo para el crecimiento de
microrganismos en medios con mltiples nutrientes limitantes.
El fenmeno del crecimiento en nutrientes limitantes mltiples
Los Primeros indicios de que el crecimiento del fitoplancton debe ser limitado
por varios factores al mismo tiempo fue informado por los sistemas de agua
dulce oligotrficos (que se resumen en Pearl 1977 ) . Con respecto a los
microorganismos, los datos preliminares experimentales sugirieron la aparicin
de una limitacin simultnea de crecimiento por dos nutrientes heterlogos,
informados por Cooney et al . ( 1976 ) para el nitrgeno y el fsforo , Hueting y
Tempest ( 1979 ) para el carbono y el nitrgeno y para el carbono y potasio ,
Harrison ( 1972 ) y Hamer et al . ( 1975 ) para nutrientes gaseosos , y por Egli (
1982 ) para el carbono y el nitrgeno .
Sin embargo, fue slo recientemente, que la existencia de una doble limitacin
del crecimiento por carbono/nitrgeno
se demostr claramente bajo el
rgimen de cultivo en quimiostato tanto para bacterias y levaduras, sobre la
base tanto de los parmetros del cultivo y las caractersticas fisiolgicas de las
clulas en crecimiento ( Egli y Quayle , 1984; Egli y Quayle , 1986; Gr ~ izer Lampert et al , 1986; . . Minkevich et al 1988 ; Duchars y Attwood 1989 ; .
Rutgers et al 1990) .
Un ejemplo tpico de la respuesta observada en general como una funcin de la
relacin C: N en el medio de alimentacin se ilustra en la figura. 1 para un
cultivo de Hyphomicrobium ZV620 creciendo a una tasa de dilucin constante
de 0.054 h -1 en un quimiostato con metanol / NH4 como las fuentes de
carbono / nitrgeno. En este experimento la concentracin de la fuente de
nitrgeno (NH4 +) en el depsito de medio se mantuvo constante a 223 mgL(1)de NH4 + - N, mientras que la concentracin de metanol aument por etapas

de 0.95gl -1 (C: N = 1,6) a 12,4 g de 1-L (C: N = 20,85). A juzgar por las
concentraciones residuales de metanol y NH4+ la composicin celular y la
sntesis de enzimas NH4 +, se reconocieron tres regmenes de crecimiento
diferentes:
- LA Limitacin de metanol con presencia de amoniaco superior (C: N <7.1)
- La Limitacin de amonaco con presencia de metanol superior (C: N> 12.6)
- Un rgimen de transicin en la que tanto el metanol y NH4 + se encontraban
por debajo del lmite de deteccin (7,1 <C: N <12,6)
Llama la atencin que, aunque aparentemente el crecimiento limitado por el
nitrgeno en C: N> 7.1 , donde ningn residuo de nitrogeno fue detectado, el
peso seco del cultivo an aument linealmente cuando se aadi el sustrato de
carbono adicional al medio de cultivo (Fig. 1A ) . Cuando el crecimiento fue
limitado por un solo nutriente, las clulas mostraron esencialmente una
composicin celular en general constante con respecto a N, protenas y
productos de almacenamiento de contenido ( fig. 1B ) . Dentro de la transicin
el rgimen de crecimiento y composicin de clulas eran muy dependientes de
la relacin de los dos sustratos limitantes y se ajust de acuerdo con la
disponibilidad real de los dos nutrientes que restringan la sntesis de material
celular. Se calcul que el poli - 13 - hidroxibutirato material de almacenamiento
( PHB ) sintetizado en estas condiciones represento hasta el 90 % de la
biomasa adicional producida ( Grfizer - Lampert et al . 1986 ) . Generalizando,
se puede concluir a partir de los datos que durante el crecimiento limitado por
el carbono , el contenido de protena y probablemente tambin de los cidos
nucleicos es alta y el contenido de los productos de almacenamiento es bajo ,
mientras que lo contrario es cierto para las clulas cultivadas bajo limitacin de
nitrgeno . Este hallazgo no es nuevo y ha sido reportado para muchos
microbios, aunque , por lo que el autor es consciente , la composicin general
de la clula fue siempre implcita

Fig 1: Composicin celular y enzimtica del Hyphomicrobium ZV620 crecido con

metanol y NH4 + en un quimiostato a una tasa de dilucin constante, D = 0,054 h -1,
como una funcin de la relacin carbono: nitrgeno en la alimentacin [S0 (NH4 + - N)
se llev a cabo constante, S0 (metanol) se increment]. Abreviaturas: GS, la glutamina
sintetasa, GOGAT, glutamato sintasa; GDH, glutamato deshidrogenasa; PHB, poli-[~ hidroxibutirato. Los datos de Grazer-Lampert et al. (1986).

Este hallazgo no es nuevo y se ha informado de muchos microbios, aunque, en

lo que el autor es consciente, la composicin general de la celula estara
siempre implicada ms aunque se demuestre que es independiente del medio
de la relacin C: N.
Como respuesta a las condiciones de crecimiento descritas anteriormente, la
composicin de protenas de las clulas de Hyphomicrobium ZV620 no fueron
solo afectadas cuantitativamente, sino tambin cualitativamente. Los datos de
la figura. 1C demuestran que en esta bacteria, el amoniaco fue asimilado
principalmente a travs del sistema de baja afinidad del glutamato
deshidrogenasa bajo una atmosfera de crecimiento con nitrgeno en exceso,
mientras que, tan pronto como la disponibilidad de amoniaco se restringio, el
sistema de glutamina sintetasa / glutamato sintasa alta afinidad se hizo cargo.
Fue sorprendente ver lo diferente que fue regulada la sntesis de las tres

enzimas implicadas. Gdizer-Lampert et al. (1986) tambin mostr que no slo

la concentracin de la protena total de la glutamina sintetasa aument
durante el cambio de las condiciones de C a N-limitados, sino tambin la
fraccin de deadenylated, es decir, la glutamina sintetasa activa aument.
Un comportamiento muy similar con respecto a la composicin celular y la
regulacin de la enzima ha sido reportado.

Fig8. Zona de prediccin del triple nutriente limitante(carbono,

nitrgeno y magnesio) de crecimiento de klebsiella pneumoniae en
cultivo de quimiostato como una funcin de velocidad de dilucin. El
clculo de limites es basado en datos de Strange y Hunter(1967),
Tempest y Dicks (1967) y Tempest y Neijssel (1978).

Ejemplo, la terica posicin de la zona de crecimiento del triple sustrato limitante

por carbono, nitrgeno y magnesio para las diferentes velocidades de dilucin han
sido calculadas por K. aerogenes de datos de literatura (Fig.8). Los datos
claramente predijeron una amplia zona de limitacin simultnea por los tres
nutrientes como baja velocidad de crecimiento.
El concepto presentado aqu en crecimiento del doble sustrato limitante permite
distintas conclusiones para ser elaborado en relacin de crecimiento de
microorganismos bajo ambos laboratorios y condiciones ambientales. Primero, con
respecto al crecimiento con carbono y fuentes de nitrgeno, uno puede predecir
que estudios en crecimiento de nitrgeno-limitante a velocidad baja de crecimiento
deben requerir altas relaciones de C:N en el medio que son cmodamente usados,
i.e., la ms baja la velocidad de dilucin, la mas alta la relacin del medio C:N que
necesit para asegurar distintamente las condiciones de crecimiento nitrgeno-

limitante. Adicionalmente, esto puede ser concluido que la prueba para confirmar
que el crecimiento es carbono-limitante debe ser realizada para altas velocidades
de dilucin, mientras bajas velocidades de dilucin deben ser empleadas cuando
se prueben por limitacin de nitrgeno. Tambin, las razones que el ejemplo
presentada en la Fig. 1 A el peso seco en el cultivo todava incrementa linealmente
en la zona del carbono/nitrgeno limitante indica que el procedimiento tradicional
de evaluar el factor limitante en una va de mediano crecimiento de biomasa
producida puede llevar a resultados ambiguos.
Del punto de vista de un ecologista microbiano, la forma de las zonas limitantes
en Fig.4 indica la crucial importancia del coeficiente del rendimiento en el rgimen
de limitacin de crecimiento bajo naturales condiciones ambientales.
Considerando que la velocidad de crecimiento de bacterias en ecosistemas es
bajo, i.e., frecuentemente en el rango de 0.001 0.01 h -1, por grandes periodos de
tiempo (Moriarty 1986), luego en el caso de dos macro nutrientes carbono y
nitrgeno, ndice ambiental C: N a sido bastante alta antes del crecimiento
microbiano llegue a ser completamente nitrgeno-limitado.
Con respecto a los tratamientos de aguas residuales, la existencia de una zona
doble substrato limitante provoca la especulacin que la extraccin simultanea de,
e.g., compuestos carbono y nitrgeno en la zona doble limitante debe ser posible.
Como una aplicacin pude ser concebido por el tratamiento de aguas residuales
industriales donde son ocasionalmente posibles para ajustar el ndice de
diferentes nutrientes por mezclar aguas residuales de diferentes procesos.
Aunque el concepto de doble nutriente limitante an necesita examinarse ms a
fondo, es esperado que esta contribucin se agregara a sombra de gris para
nuestro negro y blanco pensando con respecto al crecimiento del nutriente
limitante de microbios.
Reconocimientos:
El autor est agradecido a G. Hamer por su continuo inters en este trabajo y las
muchas estimulantes discusiones, a C.A. Mason por su ayuda durante la
preparacin de los manuscritos y a H. Bolliger por dibujar las figuras. Una
preliminar versin de este artculo fue publicado recientemente (Egly & Schmidt
1990).