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Tema:
Determinacin de coliformes totales y fecales presentes en jugos de
Bares, ubicados en la Unidad Acadmica de Ciencias Empresariales de la
Universidad Tcnica de Machala.
Integrantes:
Lady Rivera
Mishel Howard
Stephany Illescas
Katherine Zambrano
Pamela Aguilar
Karina Paltn
Katherine Macas
Jairo Guerrero
Jonathan Mian
Docente:
Dra. Carmen Silverio
Curso:
3ero Bioqumica y Farmacia A
Periodo lectivo:
2014-2015
OBJETIVOS
FUNDAMENTO:
Con esta prctica se pretende aprender las tcnicas de preparacin de diferentes
medios de cultivo, su esterilizacin y su almacenaje, as como la importancia de
los diferentes medios de cultivo y su uso.
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros
componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de
los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso re
hidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la
cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del
crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles
se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave.
MATERIALES PARA LA OBTENCION DE LAS MUESTRAS
1. LUGAR DE LA OBTENCION DE LA MUESTRA
Las muestras se obtendrn de los bares, ubicado en la Facultad de Ciencias
Empresariales de la Universidad Tcnica de Machala
2. MATERIALES NECESARIOS PARA TOMAR MUESTRA
Frascos esterilizados
Termmetro
Ph
Guantes
Mascarilla
Bata de laboratorio
3. MATERIALES PARA TRANSPORTE DE MUESTRA
Caja de plumafn
Hielo
4. MATERIALES PARA CONSERVAR LA MUESTRA
Nevera
MATERIALES DE LABORATORIO
-
3 matraz Erlenmeyer.
3 vasos de precipitacin de 250ml.
3 agitadores.
3 pipetas de 10ml.
asas de platino de punta redonda.
gradilla.
5 tubos de ensayo del mismo tamao.
Pipetas de 1 ml
EQUIPOS:
-
Autoclave.
Balanza.
Incubadora.
SUSTANCIAS:
-
Caldo Lactosado
Agra Nutritivo
Bilis Verde Brillante
Muestra:
-
Jugo de mora
Jugo de maracuy
Jugo de limn
PARTE 1
CARACTERIZARIZACIN DE LAS MUESTRAS
1. MUESTRA # 1
- Nombre de muestra:
Jugo de Mora (bar de empresariales)
-
Caractersticas:
Color: Morado
Olor: Mora
Turbiedad: +
PH: 4
Temperatura: 19 C
CARACTERIZAR LA MUESTRA 2:
2. MUESTRA # 2
Jugo de Maracuy (bar de empresariales)
-
Caractersticas:
Color: Naranja
Olor: Maracuy
Turbiedad: Negativo
PH: 4
Temperatura: 23 C
3. MUESTRA # 3:
-
Nombre de muestra:
Caractersticas:
Color: Translucido
Olor: Limn
Turbiedad: Negativo
PH: 3
Temperatura: 26 C
PARTE 2
Extracto de carne
Peptona
Lactosa
pH: 6.9 +- 0.2
3.0
5.0
5.0
PREPARACION:
Constatamos que en la etiqueta del envase, la cual
contiene los
componentes necesarios para preparar caldo Lactosado sea la correcta as
como su pH, el cual es muy fundamental.
Para poder preparar 200 ml de caldo Lactosado, calculamos los gramos
necesarios.
Hacemos el siguiente clculo
13 gr de polvo
X gr
1000ml de caldo
200 ml de caldo
X=2.6 gr de polvo
Pesamos en la balanza analtica 2.6 gr, y lo trasvasamos a un vaso de
precipitacin de capacidad 250 ml, y diluimos con agua destilada de pH 7
Trasvasamos a un matraz Erlenmeyer de capacidad 200 ml y enrasamos
hasta 200 ml con agua destilada.
Agitamos la solucin, aplicamos calor en la cocineta hasta observar que se
vuelva translucido y que la solucin burbujea, a partir de all se deja hervir
por 5 minutos.
Retiramos y dejamos enfriar
Llevamos a la autoclave a una temperatura de 1210c por 15 minutos.
Retiramos de la autoclave y dejamos enfriar para luego almacenar en una
temperatura de 10 a 35oC.
AGAR NUTRITIVO
FUNDAMENTO:
Es un medio de cultivo no selectivo, en el cual la pluripeptona y el extracto de
carne constituyen la fuente de carbn, nitrgeno y aportan nutrientes para el
desarrollo bacteriano.
COMPOSICIN:
Pluripeptona
Extracto de carne
Cloruro de sodio
Agar
pH: 6.8 +- 0.2
5.0
3.0
8.0
15.0
PREPARACION:
1000ml
X gr
200 ml
COMPOSICION:
Tejido animal pptico digerido 10 gr/lt
Lactosa 10 g/lt
Oxgal 20 gr/lt BILIS DE BUEY
Verde brillante 0.0133 gr/lt
Tcnica
Suspender 40 gr en 1 lt de agua destilado. Calentar si es necesario hasta disolver
el medio completamente distribuir en tubos de fermentacin que contienen tubos
Durham metido y esterilizar por autoclave 15lb de presin ( 121C ) por 15
minutos.
No se recomienda autoclavar si no se va a utilizar como medio para continuar el
proceso.
Calentar hasta punto de ebullicin y disolver el medio completamente.
Ajustar el Ph final de 25C ; 7,2
0.2
Almacenamiento:
Sustancia hidroscopia .mantener cerrado fuera del alcance de la luz.
Usos:
Recomendados para la deteccin y confirmacin de bacterias coliformes en agua,
agua contaminada; comida, leche y productos de uso diario.
COMPOSICIN:
Agar
Gelatina peptona
Lactosa
Fosfato di potasio
Eosin y
Azul de metileno
15.0 gr
10.0 gr
10.0
2.0 gr
0.4 gr
65.0 mg
1000ml
200 ml
PARTE 3
DISPENSACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO E INOCULACIN DE LAS
MUESTRAS EN TUBOS DE ENSAYO
CALDO LACTOSADO
ROTULACION DE TUBOS DE ENSAYO (10 cm)
Para la rotulacin de los tubos de ensayo primero debemos darnos cuenta si los
tubos miden 10 cm o ms cm ya que si son pequeos no podremos realizar la
practica porque se nos regara la siembra.
Despus debemos flamear el tubo para que as ase mas fcil de rotularlos con el
lpiz graso, y lo hacemos de esta forma:
Tubo 1: 1/10
Tubo 2: 1/100
Tubo 3:1/1000
Tubo 4:1/10000
Tubo 5: 1/100000
NOTA:
Prender los mecheros y colocarlo cerca de los tubos y del caldo Lactosado
con el fin de que no se contamine.
Pasar la boca del erlenmeyer en el cual est contenido el caldo de lactosa
por el mechero.
Con una pipeta graduada medir 9 ml de caldo Lactosado y colocar en cada
tubo (9ml).
2. Tubo 1/100
Procedemos a homogenizar el caldo Lactosado 1/10 una vez realizado
eso, pipeteamos 1ml y lo traspasamos al tubo de 1/100, cabe recalcar
que debemos tener mucho cuidado cuando pipeteamos ya que contiene
la muestra que vamos analizar y no debemos asentar la pipeta en la
muestra que se encuentra en el tubo de ensayo.
3. Tubo 1/1000
Procedemos a homogenizar el caldo Lactosado 1/100 una vez hecho eso
pipeteamos 1ml y lo traspasamos al tubo de 1/1000
4. Tubo 1/10000
Coger una pipeta y con ella homogenizar la muestra contenida en el
tubo 1/1000, despus coger 1ml de muestra y traspasarlo al tubo
1/10000.
5. Tubo 1/100000
Una vez colocado 1 ml en el tubo de 1/10.000 cogemos una nueva
pipeta previamente esterilizada, homogenizamos en el tubo de 1/10.000
y luego tomamos 1 ml para agregar en el tubo de 1/ 100.000 y
finalmente tapamos en tubo con papel aluminio para homogenizar el
tubo de 1/100.000.
INCUBACION DE BACTERIAS
Para la incubacin bacteriana debemos tener la incubadora a una temperatura de
37 C, una vez que est en la temperatura correcta colocar los tubos dentro de la
incubadora, este proceso durara 48 horas en el cual cada 24 horas debemos
hacer una revisin.
Prender los mecheros y colocarlo cerca de los tubos y del caldo de bilis
verde brillante con el fin de que no se contamine.
Pasar la boca del erlenmeyer en el cual est contenido el caldo de
lactosa por el mechero.
Con una pipeta graduada medir 9 ml de caldo de VBV y colocar en cada
tubo de ensayo.
Lo tapamos con el tapn
Una vez que los tubos de ensayo estn llenos con 9 cm de caldo
procedemos a introducir los tubos Durham con la boca hacia abajo en
cada uno de ellos, asegurando que el gas que queda adentro sea
liberado mediante una leve agitacin aplicando una lmina pequea de
papel aluminio en la boca del tubo tapndolo. Realizar las veces que sea
necesaria hasta que el gas sea eliminado en su totalidad.
TUBO 1 /10
TUBO 1/100
TUBO 1/1000
TUBO 1/10.000
TUBO 1/100000
INCUBACION DE BACTERIAS
Para la incubacin bacteriana debemos tener la incubadora a una
temperatura de 37 C, una vez que est en la temperatura correcta colocar
los tubos dentro de la incubadora, este proceso durara 48 horas en el cual
cada 24 horas debemos hacer una revisin.
NOTA
AGAR NUTRITIVO
ROTULACION DE CAJAS PETRI
Realizado por: Stephany Illescas
1 CAJAS 1/10, 1/100, 1/1000,1/10.000, 1/100.000
Las cajas Petri esterilizadas se debe rotular con sus respectivos cdigos para
evitar confusiones esto se hace de la siguiente manera: se las debe coger de
debajo de la caja Petri y con un lpiz graso procedemos a realizar la respectiva
rotulacin, esto siempre se debe realizar con un mechero a lado para evitar
contaminacin:
Estriado
Fecha
Grupo
Curso
Nombre
DISPENSACION
Realizado por: Mishel Howard
Al medio de cultivo como en este caso es el Agar Nutritivo y se encuentra en
medio slido, procedemos a llevarlo a la cocineta por casi 30 minutos para que se
disuelva completamente.
Una vez listo el Agar se lo coloca en el mesn cerca de un mechero, para poder
flamear la boca del Erlenmeyer y verter el medio de cultivo a las cajas Petri, solo
hasta una tercera parte.
Por ltimo debemos esperar hasta que el agar se gelifique y guardarlo en una
refrigeradora.
NOTA:
1 ESTRIADO 1/10
Realizado por: Stephany Illescas
Para realizar la siembra en la caja petri procedemos a encender los mecheros, y
esterilizamos el asa de punta redonda hasta el rojo vivo para evitar contaminacin
en el medio, el tubo de ensayo con la muestra 1/10, la flameamos a la llama e
introducimos el asa, tomamos la muestra y seguidamente procedemos a realizar el
estriado en la caja petri semi abierta para evitar contaminacin, luego llevamos a
la incubadora.
2 ESTRIADO 1/100
Realizado por: Karina Paltin
Para el estriado en la caja petri debemos evitar cualquier contaminacin, para ello
debemos tener un mechero prendido y esterilizar el asa de platino de punta
redonda hasta que se forme un color rojo vivo, luego dejar enfriar el asa a un lado
del mechero.
Una vez lista el asa procedemos a coger el tubo 1/100, lo destapamos y
flameamos su boca con el fin de esterilizar.
Con el asa de platino homogenizamos el tubo y cogemos un poco de muestra para
proceder hacer el estriado en un solo plano en forma de Zigzag, debemos tomar
en cuenta que al abrir la caja debemos hacerlo cerca de un mechero y no abrir
mucho para que la siembra no se contamine con el ambiente.
Cuando terminamos el estriado cerrar la caja
3 ESTRIADO 1/1000
Realizado por: Mishel Howard
Procedemos a encender los mecheros, y esterilizamos el asa de punta redonda
hasta el rojo vivo para evitar contaminacin en el medio, el tubo de ensayo con la
muestra 1/1000, flameamos a la llama e introducimos el asa, tomamos la muestra
y seguidamente procedemos a realizar el estriado en la caja petri semi abierta
para evitar contaminacin, luego llevamos a la incubadora.
4 ESTRIADO 1/10000
Realizado por: Stephany Illescas
INCUBACIN DE BACTERIAS
Una vez terminada toda la siembra en las cajas petri mediante el estriado, las
llevamos a la incubadora por un tiempo de 48 horas a una temperatura adecuada,
para el crecimiento de los microorganismos.
1. ESTRIADO 1/10
Para realizar la siembra en la caja Petri procedemos a encender los mecheros, y
esterilizamos el asa de punta redonda hasta el rojo vivo para evitar
contaminacin en el medio, el tubo de ensayo con la muestra 1/10, la
flameamos a la llama e introducimos el asa, tomamos la muestra y
seguidamente procedemos a realizar el estriado en la caja Petri semi-abierta
para evitar contaminacin, luego llevamos a la incubadora.
2. ESTRIADO 1/100
Una vez lista el asa procedemos a coger el tubo 1/100, lo destapamos y
flameamos su boca con el fin de esterilizar.
Con el asa de platino homogenizamos el tubo y cogemos un poco de muestra
para proceder hacer el estriado
3. ESTRIADO 1/1000
Cogemos el tubo de ensayo con la muestra 1/1000, flameamos a la llama e
introducimos el asa, tomamos la muestra y seguidamente procedemos a
realizar el estriado en la caja petri semi abierta para evitar contaminacin,
luego llevamos a la incubadora.
4. ESTRIADO 1/10000
INCUBACIN DE BACTERIAS
Una vez terminada toda la siembra en las cajas petri mediante el estriado, las
llevamos a la incubadora por un tiempo de 48 horas a una temperatura
adecuada de 37 C, para el crecimiento de los microorganismos (coliformes
totales).
PARTE 4
RESULTADOS DE LA SIEMBRA BACTERIANA
CALDO LACTOSADO
Muestra #1: Jugo de mora
24 horas
Turbidez
Gas
48 horas
Turbidez
Gas
1/10
++
++
1/100
++
++
1/1000
1/10.000
1/100.00
0
Tubo 1/10
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/100
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/1000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
+
-
Tubo 1/10.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/100.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/10
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/100
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/1000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/10.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
+
-
Tubo 1/100.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
CARACTERSTICAS DE INCUBACIN EN
CALDO BILIS VERDE BRILLANTE
Tubo
48 horas
Turbidez
Gas
1/10
++
+++
1/100
++
++
1/1000
1/10.000
1/100.000
Tubo 1/10
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/100
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
+
-
Tubo 1/1000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
++
-
Tubo 1/10.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/100.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/10
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/100
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/1000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/10.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
Tubo 1/100.000
Presencia de turbiedad
Presencia de gas
AGAR NUTRIENTE
Muestra # 1: Jugo de mora
Caja
1/10
1/100
1/1000
1/10.000
1/100.000
468
Ameboidea
Puntiforme
filamentosa
Lobulado
Ondulado
filamentoso
Umbonada
432
circulares
puntiforme
ameboide
filamentosa
Lobulado
Ondulado
Filamentoso
umbonada
Lobulado
Ondulado
Filamentoso
umbonada
351
puntiforme
ameboide
filamentosa
Entero
Lobulado
ondulado
umbonada
333
circulares
puntiforme
ameboide
puntiforme
ameboide
Entero
Lobulado
ondulado
umbonada
216
Caja 1/10
Cantidad
47 x 9 = 423 UCF
Forma
Puntiforme, ameboidea
Elevacin
Umbinada pulvinada
Borde
Entero, lobulado
Color
Blanca amarillenta
Caja 1/100
Cantidad
42 x 9 = 378 UCF
Forma
Puntiformes, circular
Elevacin
Umbinada pulvinada
Borde
Ondulado, entero
Color
Blanco amarillento
Caja 1/1000
Cantidad
Forma
Puntiformes, filamentosa
Elevacin
elevada
Borde
Lobulado, umbonada
Color
amarillento
Caja 1/10.000
Cantidad
37 x 9= 333 UCF
Forma
Circular, fusiforme
Elevacin
Pulvinada, convexa
Borde
Entero
Color
Blanco amarillento
Caja 1/100.000
Cantidad
35 x 9 = 315 UFC
Forma
Circular, puntiforme
Elevacin
Convexa, pulvinada
Borde
Entero
Color
Amarillento
Caja 1/10
Cantidad
44 x 9 = 396 UCF
Forma
Puntiforme, filamentosa
Elevacin
convexa
Borde
Color
Blanca amarillenta
Caja 1/100
Cantidad
39 x 9 = 351 UCF
Forma
Puntiformes, ameboides
Elevacin
umbunada
Borde
Ondulado, entero
Color
Blanco amarillento
Cantidad
33 x 9 = 297 UFC
Forma
Puntiformes, circular
Caja 1/1000
Elevacin
elevada
Borde
Lobulado, entero
Color
amarillento
Caja 1/10.000
Cantidad
28 x 9= 252 UCF
Forma
Circular, puntiforme
Elevacin
plana
Borde
Entero
Color
amarillenta
Caja 1/100.000
Cantidad
16 x 9 = 144 UFC
Forma
Circular, puntiforme
Elevacin
elevada
Borde
Entero
Color
Amarillento
324
circular
filamentosa
Lobulado
Ondulado
Umbonada
279
circular
filamentosa
Lobulado
Ondulado
umbonada
Lobulado
Ondulado
umbonada
234
circular
filamentosa
circular
filamentosa
circular
filamentosa
Lobulado
ondulado
Lobulado
ondulado
umbonada
216
180
umbonada
NOTA:
OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
Debido a los resultados obtenidos tanto en los tubos (Caldo lactosado muestra)
y en las cajas Petri (Agar-muestra) no hay presencia de bacterias. Pero si
preparamos el BVB para una confirmacin exacta, pero los resultados fueron
negativos lo cual no fue necesario cultivar en EMB ya que este medio selectivo
que confirmara si hay coliformes fecales o totales.
Entonces podemos decir que nuestra muestra (JUGO DE LIMN) no est
contaminada de dichas bacterias pero asumimos que si tiene otro tipo.
Esta prctica nos sirvi de mucha ayuda ya que hemos obtenido buenos
resultados y demostramos los conocimientos adquiridos en la hora clase.
Obtenidos a los resultados tanto en los tubos (Caldo lactosado muestra) y en las
cajas Petri (Agar-muestra) no hay presencia de bacterias. Procedimos ver los
resultados con el BVB para una confirmacin exacta, pero los resultados fueron
negativos en la cual no fue necesario cultivar en EMB ya que este medio selectivo
que confirmara si hay coliformes fecales o totales.
Podemos decir la muestra #2 (JUGO DE NARANJA) no est contaminada de
dichas bacterias pero se asumi que tiene otra clase de bacterias.