Biotecnologa 2015

PCR
(Polymerase chain reaction)
Reaccin en cadena de la polimerasa

Joan Mir i Ferr

(1893-1983 )

2da parte

PCR CUANTITATIVO
PCR en tiempo real / Real-Time PCR / qRT-PCR
Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., and Griffith, R. (1992).
"Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences"
Biotechnology 10:413417

PCR cuantitativo de alta precisin y

reproducibilidad.

Sistemas de deteccin fluorescente.

La cantidad de fluorescencia emitida es

proporcional a la cantidad de producto
amplificado en cada ciclo.

Los termocicladores poseen un detector que

mide la emisin de luz de las muestras.

Taqman

Reportero

Quencher

R
Sonda

AT CGG

oligonucleotido diseado para

hibridizar con la secuencia del DNA a
amplificar que contiene dos
fluorocromos:
Ubicado a 5(disponibles varios para permitir

R reacciones mltiples. Ej: 6-carboxilfluorescena)

Q

Ubicado a 3 (6-carboxi-tetrametil-rodamina)

Cuantificacin de DNA mediante la

unin de sustancias fluorescentes.

Tipos de unin al DNA:

INTERCALADORES

BROMURO DE ETIDIO

MINOR GROOVE BINDERS

SYBR GREEN

Rn: fluorescencia
Threshold: umbral sobre la lnea de base
CT: ciclo en el cual la Rn esta por encima de la lnea de base

(NTC: no template control)

Gran variacin en la cantidad de producto

Muy poca variacin en la cantidad de producto

Diluciones sucesivas (1/5)

del templado inicial

CT

Log C0
C0: cantidad inicial de DNA genmico

Algunas consideraciones sobre

lmites de deteccin de la PCR

Ethidium bromide fluorescence

(Gen copia nica)

( 0.1 0.05 g )
( 1 - 10 pg ) ----

Southern blot --------------------PCR

--------------------------------------------A260 : 1

50 g/ml DNA

(~10 g DNA humano)

(~ 0.1 g DNA humano)

(0.01: 500 ng/ml)

10

Am. J. Trop. Med. Hyg., 72(4), 2005, pp. 423-429

Copyright 2005 by The American Society of Tropical Medicine and Hygiene

AMPLIFICATION OF HUMAN DNA BY PRIMERS TARGETED TO LEISHMANIA KINETOPLAST DNA AND POSTGENOME CONSIDERATIONS IN THE DETECTION OF PARASITES BY A POLYMERASE CHAIN REACTION
Carolina Vergel, John Walker, and Nancy G. Saravia
Centro Internacional de Entrenamiento e Investigaciones Mdicas, Cali, Colombia

3 g

3 ng

3 pg

0.3 pg 30 fg 3 fg 0.3 fg

FIGURE 5.
Titration curve to estimate threshold of detection of target kinetoplast DNA by the LV-B1 polymerase chain
reaction (PCR) and Southern hybridization using serial dilutions of Leishmania panamensis total DNA. A,
Agarose electrophoresis of PCR products. B, Southern hybridization analysis of the products. Lane 1, molecular
mass marker (1-kb DNA ladder); lanes 28, PCR products generated from the following amounts of L.
panamensis DNA: 3 g, 3 ng, 3 pg, 0.3 pg, 30 fg, 3 fg, and 0.3 fg; lane 9, monocyte DNA (0.6 g) from a
healthy control donor; lane 10, negative PCR control (minus DNA). The lower limit of detection was 3 fg of
DNA in the PCR and 0.3 fg in the Southern hybridization. bp = basepairs.

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1n 100p 10p 1p 100f 10f 1f 0.1f

1n 100p 10p 1p 100f

10f 1f 0.1f

Se plantea que el contenido de ADN de una clula humana es de aproximadamente 5 pg, pudindose
inferir que en 100 ng de ADN de placenta existen cerca de 20 000 clulas. Tambin se conoce que en 1 pg
de ADN de PVH hay involucrados unos 70 000 genomas virales. La relacin que se establece entre los
planteamientos anteriores y los resultados del ensayo de sensibilidad (70 000/20 000) permiten concluir
que nuestro sistema es capaz de detectar 3,5 partculas virales por cada genoma diploide celular.
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Southern blot ~10 ug DNA / PCR ~ 0.1 ug (100 ng) DNA ----- PCR ~ 100 veces mas sensible