TCNICAS DE SEPARACIN- Grupo Andrs, Sebastin, Chica e Ivan

Precipitacin selectiva
La precipitacin fraccionada es una tcnica en la que dos o ms iones en disolucin, todos ellos
capaces de precipitar con un reactivo comn, se separan mediante ese reactivo: un ion precipita
mientras que el otro o los otros, con propiedades semejantes, permanecen en disolucin. La
condicin principal para una buena precipitacin fraccionada es que haya una diferencia
significativa en las solubilidades de las sustancia que se van a separar (normalmente una diferencia
significativa en sus valores de Kps). La clave de esta tcnica es la adicin lenta (por ejemplo con
una bureta) de una disolucin concentrada del reactivo precipitante a la disolucin donde debe
producirse la precipitacin A partir de los productos de solubilidad es posible predecir cual de los
iones precipita primero y si esta precipitacin es completa cuando empieza a precipitar el
segundo. Dicho de otra forma, es posible deducir si pueden separarse cuantitativamente dos iones
por precipitacin fraccionada.

Fabricacin de yeso por precipitacin.

Cromatografa lquida de columna:
A diferencia de la Cromatografa en Capa Fina, que se utiliza tanto con fines analticos como
preparativos, la Cromatografa en Columna se usa slo con fines preparativos, siendo el mtodos
ms general para la separacin y purificacin de compuestos orgnicos, tanto slidos como
lquidos.
En este tipo de cromatografa, la fase estacionaria (adsorbente) impregnada con la fase mvil
(eluyente) se deposita en el interior de una columna de vidrio dispuesta verticalmente que termina
en un estrechamiento provisto de una llave. La mezcla que se va a separar se deposita sobre la
parte superior de la fase estacionaria y la fase mvil atraviesa todo el sistema. Los distintos
compuestos son arrastrados por la fase mvil (eludos) y van saliendo por el otro extremo de la
columna donde se recogen en fracciones. Los ms polares son ms fuertemente retenidos por la

fase estacionaria polar y salen ms tarde que los compuestos poco polares, que son eludos muy
rpidamente.
El tiempo necesario para elur un compuesto de la columna recibe el nombre de "tiempo de
retencin" y es caracterstico para cada compuesto en unas condiciones cormatogrficas dadas
(naturaleza, cantidad y caractersticas del adsorbente, fase mvil, dimetro y longitud de la
columna, temperatura, presin, etc.)
El adsorbente ms utilizado para la cromatografa en columna es el gel de slice, mientras que la
almina y el florisil (silicato de magnesio) se emplean como sustitutos cuando el gel de slice es
incompatible con la mezcla que se va a cromatografiar.
El proceso de cromatografa en columna se puede realizar de forma que la fase mvil atraviese la
fase estacionaria por gravedad (tamao de partcula 0.063-0.200 mm) o aplicando media presin
(flash cromatography, dimetro de partcula entre 0.040-0.063 mm). En este ltimo caso, se
conecta a la cabeza de la columna un compresor de media presin (5-10 psi).
El dimetro de la columna y la cantidad de gel de slice debe estar de acuerdo tanto con los Rf de
las sustancias a separar como con la cantidad de muestra que se va a someter al proceso.
En la figura se indica un esquema del sistema descrito.

Cromatografa de intercambio inico:

Es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades
de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo
grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es
usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados
analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.
Las protenas tienen numerosos grupos funcionales que tienen cargas positivas y negativas. La
cromatografa de intercambio inico separa las protenas de acuerdo a su carga neta, la cual
depende la composicin de la fase mvil. Ajustando el pH o la concentracin de iones de la fase
mvil, varias molculas de protena pueden ser separadas. Por ejemplo, si la protena tiene una
carga positiva con un pH de 7, entonces puede unirse a una columna cargada negativamente,
mientras que una protena con carga negativa no lo podra hacer. Tambin podra eliminarse
cambiando el pH para que la carga neta de la protena sea negativa.
La elucin por el cambio de la fuerza inica en la fase mvil tiene un efecto ms sutil, trabaja como
iones de la fase mvil interactuando con los iones inmovilizados en preferencia sobre estos en la
fase estacionaria. Estos "escudos" de la fase estacionaria de la protena, (y viceversa), y permite a
la protena eluirse.

Cromatografa de filtracin en gel:

La cromatografa de filtracin en gel es una tcnica que permite separar molculas en funcin de
su tamao molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya matriz
consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Cada gel se caracteriza por un rango
de fraccionamiento que depende del tamao de sus poros.

Con la cromatografa de filtracin en gel se separan molculas en virtud de sus diferencias de

tamao. La capacidad separadora reside en el gel cuya matriz consta de un gran nmero de
esferas porosas microscpicas. Estas esferas estn constituidas por largas cadenas de polmeros
unidas entre s por enlaces qumicos para formar una red tridimensional.

Cromatografa por afinidad:

La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o
capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la
columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando
son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la
columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u
otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.Naturaleza de fase
estacionaria=solido
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la que la sustancia de
naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas y otras molculas)
denominadas ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos adecuados,
retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera reversible y

selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico de la biologa

molecular.

Electroforesis en gel SDS-PAGE:

Las protenas desnaturalizadas son posteriormente aplicadas en un extremo de una capa del gel
de poliacrilamida en un tampn qumico adecuado. Se aplica una corriente elctrica que recorre el
gel, provocando que las protenas con carga negativa migren a travs de l en direccin al nodo.
Dependiendo de su tamao, cada protena se mover de modo diferente a travs de la matriz del
gel: las protenas de tamao corto encajarn ms fcilmente a travs de los poros del gel, mientras
que las de tamao mayor tendrn mayor dificultad para hacerlo (encontrarn mayor resistencia).
Tras un cierto tiempo (habitualmente unas horas, aunque esto depende del voltaje aplicado al gel:
se debe tener que voltajes mayores producen una migracin ms rpida, pero tienden a producir
una resolucin algo ms deficiente), las protenas habrn migrado de forma diferencial en base a
su tamao. Las menores se desplazarn ms rpido, mientras que las mayores permanecern ms
cerca del punto de origen. Por tanto, las protenas se separarn aproximadamente de acuerdo a su
tamao (y por tanto, su peso molecular). Tras la electroforesis, el gel debe ser teido (lo ms
habitual con Coomassie blue o tincin argntea, permitiendo la visualizacin de las protenas
separadas o su procesamiento posterior (ej.: Western blot). Tras la tincin, las diferentes protenas
aparecern como bandas distintas en el gel. Es comn correr marcadores moleculares de tamao
molecular conocido en una calle aparte del gel para calibrarlo y determinar el peso de protenas
desconocidas comparando la distancia recorrida con la del marcador. El gel se forma en realidad
porque la solucin contiene una pequea cantidad, normalmente 1 parte en 35 de bisacrilamida,
que puede formar enlaces cruzados entre dos molculas de poliacrilamida. La proporcin entre
ambas sustancias puede variar de acuerdo al propsito para el que se disea.

La electroforesis en gel es normalmente la primera opcin en un ensayo de pureza de protenas

debido a su fiabilidad y a su sencillez. Aun as se pueden dar falsos positivos y negativos. Un
contaminante que migre conjuntamente puede aparecer en la misma banda que la protena
deseada. Esta comigracin tambin puede hacer que la protena migre en una posicin diferente o
no sea capaz de penetrar en el gel. Esto es por lo que es importante teir el gel completo, incluida
la seccin de apilamiento (o carga). El colorante Coomassie Blue tambin puede unirse con menor
afinidad a las glicoprotenas y protenas fibrosas, lo que interfiere con la cuantificacin.

Electroforesis bidimensional:
La electroforesis bidimensional es una tcnica de alta resolucin cuyo objetivo es la separacin de
mezclas de protenas altamente complejas. La base de su elevado poder de resolucin est
precisamente en la bidimensionalidad, es decir, en que las protenas son separadas
secuencialmente por dos criterios fsicos. En primer lugar las protenas son separadas en un gel
con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo con su punto isoelctrico
(isoelectroenfoque). Tras esta separacin por carga las protenas son separadas de acuerdo con su
masa molecular por electroforesis discontinua en gel de poliacrilamida en presencia de SDS (SDSPAGE). Tras la tincin del gel las protenas aparecen formando manchas circulares (spots).