El mtodo de Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR)

Kary B. Mullis, en 1994 deca que: saba que una tcnica que permitiese
fcilmente identificar el nucletido presente en una posicin determinada de una
molcula de ADN sera muy til, sobre todo en los casos de gran complejidad del
ADN y con pequea cantidad disponible de esta molcula. No vea por qu no se
poda utilizar la enzima polimerasa de ADN en una variante del mtodo de
secuenciacin con ddNTPs y dise un cndido experimento para someter esa idea a
comprobacin. Pasaron meses mientras preparaba mi primer experimento para
comprobar si la PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) funcionaba. Cuando
estuvo todo listo, acomet mi tipo favorito de experimento: el que slo necesita un
tubo de ensayo y en el que la respuesta es positiva o negativa. Multiplicara la PCR
la secuencia de ADN seleccionada? La respuesta fue s.
PCR son las siglas en ingles de Polymerase Chain Reaction o Reaccion en
Cadena de la Polimerasa. La idea bsica de la tcnica es sintetizar muchas veces un
pedazo o fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a
temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que
vive a altas temperaturas (79oC a 85oC). Cuando hacemos una reaccin de PCR
simulamos lo que sucede en una clula cuando se sintetiza el ADN y en el tubo se
mezclan todos los ingredientes necesarios para hacerlo: la polimerasa, el ADN del
organismo que queremos estudiar donde se encuentra el fragmento que queremos
sintetizar , los oligonucletidos (llamados tambin primers, iniciadores, cebadores,
oligos, etc.) necesarios para que se inicie la transcripcin, di nucletidos (dNTPs),
y las condiciones para que la enzima trabaje adecuadamente (cierto pH, determinadas
cantidades de magnesio en forma de MgCl2, KCl, y pueden necesitarse otras sales o
reactivos, dependiendo de cada polimerasa). Esta tcnica tan ingeniosa tiene
muchsimas aplicaciones distintas y se ha convertido en una herramienta muy
importante en la biologa molecular; sus aplicaciones van desde la gentica de
poblaciones, evolucin molecular y genmica hasta la medicina forense (Espinosa,
2007).
La PCR es una tcnica enzimtica in vitro utilizada para amplificar
exponencialmente una regin determinada de ADN situada entre dos regiones de
ADN, cuya secuencia se conoce, a partir de una mezcla compleja de cidos
nucleicos. Para ello requiere: 1. el molde a partir del cual se generarn las copias, 2.
dos oligonucletidos (cebadores o primers) especficos complementarios a una
porcin de la regin que se desea amplificar, 3. Una enzima capaz de sintetizar
ADN utilizando como molde ADN (una ADN polimerasa) o ARN (una ADN
polimerasa ARN dependiente) en el caso de la RTPCR (retrotranscripcin seguida
de PCR) y 4. Los deoxinucletidos (dNTPs) que sern incorporados a las cadenas
nacientes de ADN. El resultado de la reaccin son varios millones de copias
fragmento de ADN comprendido entre los dos oligonuclotidos especficos (Mullis,
1986)
Generalmente, la reaccin de amplificacin de PCR se describe en tres pasos
caractersticos. La primera fase, denominada fase lag, en los primeros 510 ciclos
(dependiendo de la cantidad de molde inicial presente en la reaccin), dnde no se
producen todava los fragmentos especficos. La segunda, es la fase exponencial,
en la cual en cada ciclo se duplican los fragmentos producidos en el ciclo anterior
y por ltimo, la fase plateau, en la cual no se produce ms amplificacin (Bustin,
2004).
En general cada ciclo de la reaccin se divide en 3 partes
a. Desnaturalizacin: en esta etapa, el ADN molde doble cadena se
desnaturaliza y sus hebras se separan. Esto se logra aumentando la temperatura de
la reaccin, en general a 94
o
C para asegurar que todas las molculas se encuentran
en simple hebra y permitir que ocurra el segundo paso.
b. Anillado o annealing: en esta etapa, la temperatura de la reaccin
disminuye para permitir que los oligonucletidos cebadores que delimitan el
fragmento que se desea amplificar suban a su regin blanco. La temperatura
de unin de los cebadores depender de la composicin de bases de los
mismos.
c. Extensin: en este paso, la temperatura de la reaccin es aquella que
permite la actividad ptima de la enzima polimerasa presente en la reaccin
(Bustin, 2004).



2.1 Cebadores
Los cebadores o iniciadores: de la reaccin son oligonucletidos cortos (entre
18 y 30 nucletidos), complementarios a la secuencia blanco que se desea
amplificar. Se utilizan dos cebadores en cada reaccin, cada uno complementario a
uno de las hebras del ADN molde, delimitando la regin que se desea amplificar.

2.2 ADN Polimerasas:
Las ADN polimerasas son enzimas que intervienen en la replicacin del
ADN. Son capaces de adicionar dNTPS a partir de la regin 3 de un cebador y
copiar una secuencia molde. Las polimerasas sintetizan el ADN en la direccin 5' a
3'. Ninguna ADN polimerasa conocida es capaz de comenzar una nueva cadena. Ella
slo puede aadir un nucletido en un grupo 3'OH que ya existe. Por esta razn la
enzima precisa un cebador que presente un grupo 3' OH al cual puede aadir el
primer nucletido.
En la actualidad se han descrito y utilizado diferentes polimerasas en la reaccin
de PCR. La eleccin de la enzima depender de factores tales como: la fidelidad
de la enzima o tasa de error (capacidad de producir errores o no durante el
copiado), la velocidad (cantidad de nucletidos incorporados por segundo en la
cadena naciente de ADN), la procesividad (capacidad de unirse al molde), la
actividad exonucleasa (capacidad de correccin de errores), extremos del ADN
resultante, etc (Bustin, 2004).

2.3 Variantes de la PCR

Una vez que el uso de la PCR se masific, a partir de la dcada de 1990, han
surgido variantes y nuevas aplicaciones a la tcnica.

a. RT PCR: Es una variante de la PCR muy utilizada en la que se utiliza ARN
como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa reversa (una
polimerasa de ADNARN dependiente) para realizar la sntesis de un ADN
complementario al ARN (ADNc). En esta primera ronda, como cebador se pueden
utilizar hexmeros (oligonucletidos de 6 nucletidos de secuencia aleatoria) que se
unen al azar en cualquier regin del ARN molde que permite la captura y la
realizacin del ADNc a partir del ARNm. Una vez que se obtiene el ADNc, se
realiza la reaccin de PCR convencional como se detall ms arriba. Puede utilizarse
como mtodo de deteccin molecular de genes, para estudiar el genoma de virus de
ARN como los retrovirus (tales como el VIH) o el virus de la gripe (virus de la
influenza).
b. PCR anidada o nested: Se trata de una tcnica que aumenta la sensibilidad
de la PCR. En este caso se trabaja con 4 cebadores, en una primera ronda se
amplifica de manera convencional con los dos cebadores ms externos a la regin
que se desea amplificar. El producto de este primer PCR se utiliza como molde para
una segunda ronda que utiliza cebadores internos a la regin previamente
amplificada. La desventaja de esta tcnica es la posibilidad aumentada de
contaminacin, y adems no permite cuantificar la cantidad inicial de ADN molde
presenta en la muestra analizada.
c. PCR in situ: La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones
histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio
de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la
tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y
luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de
ADN/ARN.
d. PCR mltiplex: PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una
misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin
de amplificar simultneamente diferentes fragmentos de ADN. Consiste en
combinar en un nico tubo de reaccin todos los pares de cebadores de las
secuencias que queremos amplificar, junto con el resto de los reactivos de la
reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios
loci en una sola reaccin, requiere menor cantidad de molde para el anlisis y
menor cantidad de reactivos. Los ejemplos de PCR mltiplex son muy comunes en
el diagnstico de agentes infecciosos, donde se intenta amplificar varios tipos
virales en el mismo tubo y al mismo tiempo (ej. Amplificacin de Herpes Virus en
muestras biolgicas).

2.4. PCR en tiempo real:
La PCR en tiempo real es hoy una de las variantes ms utilizadas. Esta tcnica
permite, a diferencia del PCR convencional, la cuantificacin de los productos de
amplificacin, adems de otras oportunidades. La cuantificacin es muy utilizada en
lo que refiere al anlisis de expresin gnica (Wilhelm y Pingoud, 2003).
La PCR en tiempo real fue reportada por primera vez en un artculo de
Higuchi y colaboradores (R. Higuchi y col., Biotechnology 1993, 11). Estos
autores, utilizando una cmara para monitorear reacciones de PCR durante el
curso del termociclado, detectaron la acumulacin de ADN doble cadena en cada
ciclo de PCR, evidenciado por un incremento en la fluorescencia producto de la
adicin de Bromuro de Etidio en la reaccin. El aumento de fluorescencia se
relaciona directamente con el nmero de copias de la molcula que est siendo
amplificada, presentes inicialmente en la reaccin. A menor nmero de copias
presentes inicialmente, menor el nmero de ciclos necesarios para detectar
fluorescencia.
Mediante esta variacin de la PCR es posible seguir la cintica de cada
reaccin en tiempo real, por lo que permite una cuantificacin sensible y especfica
del blanco que se desea analizar, al utilizar la fase exponencial de la curva de
amplificacin. Adems, esta tcnica presenta un amplio rango dinmico de
cuantificacin (Wilhelm y Pingoud, 2003).
En 1997 surgen los primeros equipos comerciales de PCR en tiempo real,
producidos por Applied Biosystems. Desde entonces han surgido numerosos
equipos con diferentes propiedades, entre ellos destacamos el LigthCycler de
Roche (hoy discontinuado), y el RotorGeneQ (producido en la actualidad por
Qiagen).
Junto al surgimiento de los equipos de PCR en tiempo real,
surgieron tambin diferente aproximaciones y estrategias para detectar la
fluorescencia. En este sentido, el Bromuro de Etidio fue sustituido por el SYBR
Green, una molcula que tambin se intercala en el ADN doble cadena, pero
presenta mayor afinidad y especificidad que el Bromuro de Etidio. Si bien el SYBR
Green contina siendo utilizado en la actualidad, existe un amplio espectro de
estrategias basadas en sondas especficas marcadas fluorescentemente que
muestran mayor especificidad y permiten adems de la cuantificacin otras
alternativas como el diagnstico de polimorfismos puntuales, por ejemplo (Wilhelm
y Pingoud, 2003).

2.5. Aplicaciones
En el estudio de una serie de fragmentos de ADN presentes en todos los
individuos, pero que poseen la caracterstica de ser altamente variables o
polimrficos entre los mismos. El anlisis de un determinado nmero de estas
secuencias o fragmentos de ADN permite inclusive identificar a un ser humano con
una probabilidad muy cercana al 100%. Adems de ser muy poli-mrfico, el ADN
que se utiliza para este tipo de identificaciones, es un ADN no codificante o no
expresivo, por lo que no revela caractersticas feno-tpicas de los individuos; este
hecho es de gran importancia a la hora de considerar la creacin de las bases de datos
genticas (Cornide, 2000).
Para analizar dichos polimorfismos del ADN se utilizan una serie de tcnicas
que estn en continua evolucin, consiguiendo que cada vez la identificacin por
medio del ADN sea ms precisa y rpida. Se parte entonces de unas regiones del
ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir, de regiones
polimrficas del ADN. As, analizando un determinado nmero de regiones
polimrficas, la probabilidad de que dos individuos sean genticamente iguales es
prcticamente nula (excepto en el caso de gemelos univitelinos).
El estudio de indicios biolgicos por PCR ha permitido la resolucin de un gran
nmero de casos en Criminalstica que hasta entonces eran desestimados por no
poseer la suficiente cantidad de muestra para su anlisis por RFLP. Con el uso de la
PCR muestras tan mnimas como pueden ser un pelo con raz, una minscula mancha
de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo
un anlisis de identificacin gentica (Entrala, 2000).
Actualmente, la obtencin de la huella gentica o perfil de ADN de un animal se
realiza mayoritariamente mediante la informacin proporcionada por mltiples loci
microsatlite. Es un proceso que incluye varias etapas:
a) Se parte de una muestra de tejido del ADN (sangre, msculo, semen) de
donde se extrae y purifica el ADN
b) A continuacin el ADN se amplifica por PCR, es decir obtenemos millones
de copias de los fragmentos de ADN que se quieran identificar. Estos fragmentos
son los llamados marcadores de ADN, regiones de ADN hipervariables y dispersas
por todo el genoma, que varan de un individuo a otro. El nmero de marcadores de
ADN utilizados es suficiente para conseguir una combinacin de variantes nica
para cada animal, su huella gentica. Semejante a su cdigo de barras. Los
sistemas de identificacin ms comunes en los laboratorios incluyen unos 10-15 loci
microsatlites o unos 30-50 SNPs.
c) Los fragmentos de PCR obtenidos estn marcados por fluorescencia con
distintos colores. De modo que, para la identificacin de las variantes que porta cada
individuo separamos los productos de la PCR por electroforesis capilar y los
detectamos mediante fluorescencia, en equipos que automatizan desde la carga de la
muestra hasta el anlisis de datos. Se carga la muestra y los resultados obtenidos en
estos equipos son volcados en un ordenador en el que se realiza el anlisis de los
datos.
La huella gentica o perfil de ADN obtenido para cada animal se almacena en
una base de datos, junto a la informacin sobre su origen.