PRACTICA N 9

ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

Introduccin

Los alimentos son fcilmente colonizados (contaminados), ya sea de forma natural, en
origen o durante el procesamiento y la manipulacin. La multiplicacin de los
microorganismos en el alimento puede implicar desde una alteracin inapreciable hasta su
deterioro completo y puede ser, en cualquier caso, una va de transmisin de
enfermedades. Generalmente, cuando hablamos de calidad de un alimento debemos
considerar el aspecto microbiolgico que resulta fundamental porque influye en la
conservacin y la vida til del producto, pero adems, porque los microorganismos pueden
ser causantes de enfermedades conocidas como enfermedades transmitidas por los
alimentos (ETAs). De tal manera que, para garantizar inocuidad del alimento, se requiere la
determinacin de criterios para los microorganismos patgenos y/o toxinas y en algunos
casos la utilizacin de microorganismos indicadores (relacionados con la presencia de un
patgeno). Se entiende por criterios microbiolgicos al valor o gama de valores
microbiolgicos establecidos mediante el empleo de procedimientos definidos, para
determinar la aceptacin o rechazo de un alimento muestreado. Los microorganismos con
respecto a las clases de criterios microbiolgicos, se agrupan como: Microorganismos de
carcter o criterio imperativo, Microorganismos indicadores de higiene y Microorganismos
de alerta.

Los microorganismos de carcter o criterio imperativo, son aquellos que no deben estar
presentes en el alimento o bebida ya que su presencia representa un dao a la salud o la
vida de los consumidores. Su presencia determinar la eliminacin del alimento de acuerdo
a la Norma que para tal efecto dicte el Ministerio de Salud. Son microorganismos de
carcter o criterio imperativo:
a) Salmonella sp.
b) Clostridium botulinum
c) Listeria monocytogenes
d) Escherichia coli enterohemorrgico O157:H7
e) Brucella melitensis
f) Vibrio cholerae
g) Hongos toxignicos
h) Anaerobios mesfilos/termfilos (conservas)

Los microorganismos indicadores de higiene, son aquellos que no deben estar presentes en
el alimento o bebida en lmites superiores a los especificados en la NORMA SANITARIA DE
CALIDAD SANITARIA E INOCUIDAD PARA LOS ALIMENTOS Y BEBIDAS DE CONSUMO
HUMANO. El exceso de estos microorganismos indica que las condiciones de higiene en el
procesamiento de los alimentos o bebidas son deficientes; estos productos deben ser
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rechazados, debiendo establecerse las medidas sanitarias que el caso amerite. Son
microorganismos indicadores de higiene:
a) Escherichia coli
b) Staphylococcus aureus coagulasa +
c) Bacillus cereus
d) Clostridium perfringens

Los microorganismos de alerta, son aquellos que al exceder los lmites especificados
requerirn la aplicacin de medidas correctivas para tener el proceso bajo control. Son
microorganismos de alerta los siguientes:
a) Coliformes termotolerantes (fecales)
b) Hongos (Mohos y Levaduras)
c) Aerobios mesfilos/psicrfilos/termfilos
d) Anaerobios mesfilos/termfilos

As tambin, la NORMA SANITARIA establece 17 grupos de alimentos y bebidas segn su
origen y/o tecnologa aplicada en su procesamiento o elaboracin. Son:
a) Leche y productos lcteos
b) Helados y mezclas para helados
c) Productos grasos
d) Caldos, sopas, cremas, y mezclas deshidratadas
e) Productos elaborados a partir de cereales
f) Azcares y miel
g) Productos de confitera
h) Productos de panadera y pastelera
i) Alimentos de uso infantil
j) Carnes y productos crnicos
k) Productos hidrobiolgicos
l) Huevos y oviproductos
m) Salsas, aderezos, especias y condimentos
n) Frutas y verduras
o) Comidas y platos preparados
p) Bebidas
q) Estimulantes y fruitivos

En esta prctica nos centraremos en algunas bacterias que sirven como microorganismos
indicadores de higiene, as tambin, de aquellas clasificadas como microorganismos de
alerta. En los microorganismos indicadores de higiene se estudiar a E. coli, como indicador
de contaminacin fecal, cuya deteccin tiene la ventaja, desde un enfoque de prevencin
de riesgos, de indicar un manejo inadecuado o presencia de contaminacin. Tambin, su
deteccin puede resultar ms sencilla, rpida y econmica, pudiendo brindar informacin
de manera oportuna. As tambin, se estudiar a los microorganismos de alerta, Coliformes
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fecales y aerobios mesfilos, cuya presencia nos dan idea de la calidad de la materia prima
y del proceso de elaboracin del producto, cifras altas en este recuento pueden indicar un
proceso de alteracin del alimento, aunque no necesariamente hay que relacionarlo con la
presencia de grmenes patgenos.

OBJETIVO
Adiestrar al alumno en la identificacin de microorganismos relacionados con la
contaminacin y deterioro de alimentos.
Adiestrar al alumno en la cuantificacin de la presencia de microorganismos
causantes de contaminacin a travs del NMP y UFC

I. MATERIALES
Diversas muestras de alimentos
Tubos de ensayo con 9 ml de agua peptonada al 0.1%
Agar Plate count lquido.
Placas Petri.
Pipetas de 1 y 10 mL
Tubos con 1 mL de agua destilada estril
Gradillas
Plumn indeleble.
Mechero de alcohol
Encendedor

II. PROCEDIMIENTO

1. Tomar 10 mL 10 g de la muestra problema segn sea lquida o slida y transferir a
un matraz con 90 mL de agua peptonada al 0.1%, sta constituir la dilucin 10
-1
.
2. Realizar diluciones seriadas 10
-2
, 10
-3
y 10
-4
en los tubos con agua peptonada estril.
3. Proceder al aislamiento por los mtodos descritos abajo.

A) RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS POR EL METODO DE DIFUSIN EN PLACA:

1. Tomar 1 mL de la ltima dilucin (10
-4
) de la muestra en condiciones estriles.
2. Destapar con la mano izquierda la placa Petri lo necesario y depositar el inculo.
3. Colocar la cubierta de la placa Petri.
4. Incorporar 10 a 15 mL del Agar Plate Count mantenidos a 35C, tapar y realizar
movimientos rotatorios a fin de distribuir homogneamente el inculo.
5. Repetir el mismo procedimiento con la penltima dilucin (10
-3
).
6. Rotular e incubar a 28 C.
7. Contar el nmero de colonias que aparecen al final de la incubacin.
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8. Realizar los clculos UFC para cada dilucin.
9. Realizar la discusin de los resultados obtenidos.

B) RECUENTO DE Escherichia coli Y MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES POR EL
METODO DEL NUMERO MAS PROBABLE ( NMP)

Escherichia coli
1. Tomar 3 cubos con caldo EC e inocular 1 mL de la ltima dilucin a cada uno, repetir el
procedimiento con las otras 2 ltimas diluciones tomando siempre 3 tubos para cada
dilucin, empezando siempre con la menor dilucin.
2. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
3. Calcular el valor del NMP (Tabla I).

MICROORGANISMOS COLIFORMES TOTALES
1. Tomar 3 cubos con caldo BRILLA e inocular 1 mL de la ltima dilucin a cada uno,
repetir el procedimiento con las otras 2 ltimas diluciones tomando siempre 3 tubos
para cada dilucin, empezando siempre con la menor dilucin.
2. Rotular los datos en los tubos e incubar a 28 C por 48 horas.
3. Verificar este resultado en la tabla I para determinar el nmero ms probable.
4. Calcular el valor del NMP (Tabla I).

Se considerar como resultado positivo aquellos tubos que presenten formacin de gas
dentro de los tubos durham acompaando el crecimiento microbiano (turbiedad)

III. PRESENTACIN DEL INFORME
Realizar la discusin de los resultados del clculo del NMP para el recuento de E. coli y
microorganismos coliformes totales en relacin a los Lmites Mximos Permisibles de
acuerdo a la clasificacin del alimento
(http://www.digesa.sld.pe/norma_consulta/Proy_RM615-2003.pdf).

IV. CUESTIONARIO

1. Qu caractersticas presentan los microorganismos del grupo de coliformes fecales y
aerobios mesfilos.
2. Explique en qu consiste el deterioro de los alimentos causado por Escherichia coli.
3. Mencione las posibles fuentes de contaminacin de los alimentos por coliformes
fecales y aerobios mesfilos antes y despus del proceso de produccin.
4. Menciones las medidas preventivas necesarias para evitar la contaminacin microbiana
de los alimentos en el proceso de produccin.

TABLA I
Tabla 1. ndice del NMP para varias combinaciones de resultados positivos y negativos para 1g de muestra cuando se usan 3 tubos con alcuotas
de 0.1; 0.01 y 0.001g.


Referencia: Official Methods of Analysis of AOAC International, 18 ed. 2005. Chapter 17.3, pag. 5