Los medios de cultivo en microbiologa

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos

es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es
el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se
han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.

La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares
en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base
de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a
la que se aadirn otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de
medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene
efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que
crecen en l.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que
bastantes bacterias provocan su licuacin.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de
enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de
fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la
sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los
microorganismos menos resistentes.

Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en
pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como
inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-
positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos
casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de
contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas.
En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia
inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias
adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las
reacciones qumicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones
de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaban la prdida de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios
es utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de
nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la
peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade
a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc.
Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales
como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias
promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como
indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo
productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que
muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas
inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la
capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y
comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est
ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de
oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn
adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto
intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida),
mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse
a cualquiera de las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es
imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas
en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas
en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de
agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y
evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que
en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de
los microorganismos fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de
los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con
un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No
se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no
impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar
sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre
15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o
incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los
patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos,
alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir
el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en
dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el
autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante).

Otros aspectos a considerar

Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o
proveedores que suministren productos de calidad.
Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y
fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrios bien lavados y enjuagados con agua destilada o
desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

CONDICIONES FISICAS DE UN MEDIO DE CULTIVO

An cuando las condiciones qumicas del medio de cultivo estn cubiertas, el
crecimiento y desarrollo de los microorganismos no tendr lugar si se
desconocen las siguientes condiciones fsicas:

- TEMPERATURA: cada especie tiene su temperatura ptima de crecimiento.
* mesfilos: 35-37C
* psicrfilos: 15-20C
* termfilos: 50-60C
-PRESIN OSMTICA: la mayora de las bacterias crece en 0.1 a 1% NaCl.
Las halfilas requieren concentraciones superiores.
-PRESENCIA DE OXGENO: segn sus requerimientos de O2 las bacterias se
clasifican en:
* Aerobios estrictas: requieren oxgeno para crecer. Metabolismo respiratorio.
* Microaerfilos: necesitan bajas tensiones de O2 y una atm enriquecida en
CO2. Pueden realizar respiracin aerobia.
*anaerobios obligados: el O2 les resulta txico. Crecen en medios muy
reducidos (sin O2).Metabolismo fermentativo.
* Anaerobios aerotolerantes: crecen en ausencia de O2 (metabolismo
fermentativo) y cuando son expuestos al O2 no mueren.
* Anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias (metabolismo
respiratorio) como anaerobias (metabolismo fermentativo).

-HUMEDAD: todas bacterias necesitan un ambiente mucho ms hmedo para
su desarrollo que los hongos. En condiciones ambientales adversas, algunas
especies producen estructuras de resistencia a la desecacin llamadas esporas
que permanecen viables durante tiempo prolongado hasta que el ambiente sea
propicio para la germinacin. Producen esporas los gneros Clostridium (ej. C.
tetani,, C. botulinum), Bacillus (ej. B. cereus, B. subtilis), Sporosarcina, entre
otros.

- LUZ: es importante para los microorganismos fotosintticos.

-PH: la mayora de las bacterias crece en medio neutro o ligeramente alcalino
(7 7.6). Excepciones son los lactobacilos (pH 5, acidfilos), Vibrio cholerae
(pH 8.6,). Los hongos crecen a pH menor que 7.

Propiedades fsicas. Las caractersticas del medio son: pH, osmolaridad,
temperatura, viscosidad y tensin superficial.
8 pH y capacidad tamponadora. El pH ptimo de crecimiento para la mayora
de tipos celulares es de 7,4 aunque existen pequeas
variaciones: algunas lneas normales de fibroblasto crecen mejor entre pH 7,4 y
7,7 y clulas transformadas lo hacen en el margen de pH
de 7,0 a 7,4 (Eagle, 1973), clulas epidrmicas pueden ser mantenidas a pH
5,5 (Eisinger y col., 1979).
El indicador de pH que se suele emplear es rojo fenol, que presenta color rojo a
pH 7,4, naranja a pH 7,0, amarillo a pH 6,5, azul-rojo a pH
7,6 y prpura a pH 7,8. El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de
evitar los cambios bruscos de pH. La solucin tamponadora ms
empleada sigue siendo el tampn bicarbonato, que equilibra el CO2
atmosfrico, a pesar de su escasa capacidad tamponadora, debido a: su
bajo coste, baja toxicidad, y beneficios nutricionales para el cultivo. HEPES es
la solucin tamponadora de eleccin por su elevada
capacidad tamponadora en el rango 7,2 a 7,6, y se emplea en concentraciones
de 10 a 20 mM. Cuando se usa conjuntamente con CO2
externo, debe estar a concentracin doble del bicarbonato para un
tamponamiento adecuado (ver figura 3.3).
8 Osmolaridad. Muchas clulas en cultivo tienen una amplia tolerancia frente a
la osmolaridad del medio, creciendo bien en el rango de 260 a
320 mOsm/kg, con pequeas variaciones dependiendo de la especie
considerada. Es recomendable emplear medios ligeramente
hipotnicos para compensar la evaporacin durante el periodo de incubacin,
especialmente en incubadores sin control de la humedad
ambiente.
La osmolaridad se controla mediante la determinacin del punto de congelacin
o la elevacin de la presin de vapor. Hay que tener en
cuenta que la adicin de HEPES, de drogas disueltas en cidos fuertes y la
neutralizacin posterior pueden afectar fuertemente a la
osmolaridad del medio.
8 Temperatura. La temperatura tiene gran influencia en la tasa de crecimiento
de las clulas, de ah la importancia de un buen control de
sta en la incubacin. Influye asimismo en el pH del medio, por lo que se
recomienda o bien ajustar el pH del medio 0,2 unidades por
debajo del ptimo, a temperatura ambiente, o bien preparar el medio completo,
incluso suero, dejar equilibrar en la estufa y despus
ajustar el pH, antes de aadirlo al cultivo.
8 Viscosidad. La viscosidad del medio viene determinada fundamentalmente
por el contenido en suero y tiene poca influencia sobre el
crecimiento. S es importante para evitar el dao celular en la agitacin del
cultivo (menor dao a ms viscosidad) y en la tripsinizacin. Se
puede incrementar la viscosidad, especialmente en medios libres de suero,
aadiendo al medio carboximetil-celulosa o polivinilpirrolidona
(Birch y Pitch, 1971).
8 Tensin superficial. La tensin superficial se ha de mantener baja, y en
general slo se ve alterada por la aparicin de espumas en los
cultivos en suspensin donde se burbujea CO2. En estos casos es
recomendable emplear un agente antiespumante de silicona pues en
stos casos se produce un aumento de la desnaturalizacin de protenas y se
incrementa el riesgo de contaminacin si la espuma alcanza el
cuello del recipiente de cultivo.