1

INDICE GENERAL.
RESUMEN ....................................................................................................................... 9
ABSTRACT .................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIN .................................................................................................. 11
1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico. .................................................................................. 11
1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes teraputicas. .............. 11
1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas en Escherichia coli. ............................ 13
1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de inclusin. ...................... 15
1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico. .......................................................................................... 18
1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido. ....................................... 19
1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos. ...................................... 21
1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico. ............................................. 22
2. HIPTESIS ............................................................................................................. 24
3. OBJETIVOS ............................................................................................................ 24
4. MATERIALES Y MTODOS .............................................................................. 25
4.1. Materiales. ................................................................................................................................. 25
4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos. ......................................................................... 25
4.1.2. Cepas bacterianas. .................................................................................................................... 25
4.1.2. Plsmidos. ................................................................................................................................ 25
4.1.3. Lneas celulares. ....................................................................................................................... 25
4.1.4. Soluciones de cultivo celular. .................................................................................................. 26
4.1.5. Enzimas. ................................................................................................................................... 26
4.1.6. Reactivos y soluciones. ............................................................................................................ 26
4.1.7. Kit comerciales. ....................................................................................................................... 28
4.2. Metodologa. .................................................................................................................................. 29
4.2.1. Sntesis de ADN. ...................................................................................................................... 29
4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN. .................................................................. 29
4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5 mediante electroporacin. ............................. 29
4.2.2.2. Purificacin de plsmidos. ................................................................................................ 29
4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa. ............................................................................. 30
4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa. ..................................................................................... 30
4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN plasmdico. ........ 31
4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa................................................. 31
2

4.2.2.8. Reaccin de ligacin. ........................................................................................................ 32
4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL quimiocompetentes por shock
trmico. ............................................................................................................................................... 32
4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico. .................................................... 34
4.2.5. Precipitacin de protenas. ...................................................................................................... 34
4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles. ............................. 35
4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin de hEGF..... 38
4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de hEGF. ......... 38
4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin. ................................................................ 39
4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho Expandido. ........ 39
4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea..................................................................... 39
4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la capacidad de
unin de la matriz. .......................................................................................................................... 40
4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre la capacidad
de unin de la matriz. ...................................................................................................................... 40
4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa. ................................................. 41
4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa de intercambio
inico. ................................................................................................................................................. 41
5. RESULTADOS ........................................................................................................ 45
5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano.
................................................................................................................................................................ 45
5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano. ............................. 47
5.3. Ruptura celular y extraccin de cuerpos de inclusin. ................................................................... 49
5.4. Solubilizacin de cuerpos de inclusin. ......................................................................................... 49
5.5. Renaturacin y purificacin de hEGF-6xArg mediante Cromatografa de Lecho Expandido. ....... 51
5.5.1. Determinacin de pH y concentracin de NaCl. .................................................................... 51
5.5.2. Determinacin de capacidad de carga de matriz de lecho expandido. .................................... 54
5.5.3. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg a escala preparativa. ..................................... 54
5.6. Escisin de pptido 6xArg C-terminal. ........................................................................................... 57
5.7. Purificacin final de hEGF mediante cromatografa de intercambio catinico y
ultracentrifugacin. ................................................................................................................................. 59
5.8. Determinacin de la actividad mitognica de hEGF en una lnea celular de fibroblastos de ratn. 62
6. DISCUSIN ............................................................................................................ 67
6.1. Sobreexpresin de hEGF-6xArg en forma de cuerpos de inclusin en Escherichia coli. ................ 70
6.2. Solubilizacin de cuerpos de inclusin y renatuacin de hEGF-6xArg mediante adsorcin en
matriz de lecho expandido. ..................................................................................................................... 72
6.3. Escisin de pptido 6xArg y purificacin final de hEGF. ............................................................. 75
6.4. Caracterizacin biolgica de hEGF purificado. ............................................................................. 77
3

6.5. Proyecciones. ................................................................................................................................. 79
7. CONCLUSIONES ................................................................................................... 81
8. AGRADECIMIENTOS .......................................................................................... 82
9. BIBLIOGRAFA ..................................................................................................... 83




































4

INDICE DE FIGURAS
Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas en E. coli mediante el sistema de
vectores pET.. .................................................................................................................. 14
Figura N 2. Esquema que representa las principales vas de sealizacin activadas por
el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico. ........................................................ 20
Figura N 3. Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido..
......................................................................................................................................... 42
Figura N 4. Generacin de una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento
Epidrmico humano.. ....................................................................................................... 46
Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-
6xArg.. ............................................................................................................................. 48
Figura N 6. Optimizacin de la eficiencia de la ruptura celular..... .............................. 50
Figura N 7. Optimizacin de la eficiencia de solubilizacin de cuerpos de inclusin.. 52
Figura N 8. Determinacin del efecto de la variacin de pH en tampn de equilibrio
sobre la capacidad de unin de la matriz.. ....................................................................... 53
Figura N 9. Determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de NaCl en
tampn de equilibrio sobre la capacidad de unin de la matriz.. ..................................... 55
Figura N 10. Determinacin del efecto de la variacin en la cantidad de protenas
solubles cargadas sobre la capacidad de unin de la matriz.. .......................................... 56
Figura N 11. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg mediante cromatografa de
lecho expandido en matriz Streamline SP.. ..................................................................... 58
Figura N 12. Escisin de pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal de hEGF..
......................................................................................................................................... 60
5

Figura N 13. Purificacin final de hEGF.. .................................................................... 61
Figura N 14. Ensayo de actividad proliferativa in vitro en lnea celular de fibroblastos
de ratn 3T3. .................................................................................................................... 63
Figura N 15. Sitios de corte reconocidos por la enzima tripsina en la estructura del
Factor de Crecimiento Epidrmico humano.. .................................................................. 76















6

INDICE DE TABLAS
Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin.. .......................... 33
Tabla N 2. Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %. ................ 36
Tabla N 3. Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-Tricina-
poliacrilamida al 16 %/4%. .............................................................................................. 37
Tabla N 4. Resumen del nivel de pureza y rendimiento de recuperacin de hEGF en
cada paso del proceso de produccin. .............................................................................. 65














7

ABREVIATURAS
C
6xArg
6xHis
ADN
Arg
ARN
BCA
DMEM
DTT
EBA
E. coli
ED
50

EDTA
EGFR/ErbB1
h
hEGF
HPLC
IEC
IPTG
kb
kDa
L
Lis
LB
M
mEGF
mg
mL

Grados Celcius
Cola de poli-arginina
Cola de poli-histidina
cido desoxirribonucleico
Arginina
cido ribonucleico
cido bicinconnico
Medio Mnimo Esencial Dulbecco
Diotriotreitol
Cromatografa de adsorcin en lecho expandido
Escherichia coli
Dosis Efectiva 50
cido etilendiaminotetraactico
Receptor de Factor de Crecimiento Epidrmico
Horas
Factor de Crecimiento Epidrmico humano
Cromatografa Lquida de Alta Eficiencia
Cromatografa de Intercambio Inico
Isopropil--D-1-tiogalactopiransido
Kilo bases
Kilo Dalton
Litros
Lisina
Luria-Bertani
Molar
Factor de Crecimiento Epidrmico murino
Mili gramos
Mili litros

8

mM
ng
PCR
PDGF
pI
PPB
PSA
rpm
SDS
SDS-PAGE

TCA
TAE
TEMED
Tris
UFC/mL
V
VEGF
g
L
Mili molar
Nano gramos
Reaccin en cadena de la polimerasa
Factor de Crecimiento derivado de Plaquetas
Punto Isoelctrico
Tampn Fosfato de Potasio
Persulfato de amonio
Revoluciones por minuto
Dodecil sulfato de sodio
Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
denaturantes
cido tricloroactico
Tris/Acetato/EDTA
Tetrametiletilendiamina
Tris(hidroximetil)aminometano
Unidades formadoras de colonias / mili litro
Volts
Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular
Micro gramos
Micro litros










9

RESUMEN

El Factor de Crecimiento Epidrmico humano (hEGF) es una citoquina que
estimula la proliferacin de clulas epiteliales, endoteliales y fibroblastos. Gracias a este
potencial mitognico, el hEGF ha sido empleado como agente cicatrizante para el
tratamiento de heridas agudas y ulcerosas presentes en la piel, el tracto gastrointestinal y
renal. Debido a su importancia teraputica, el hEGF se ha producido por va
recombinantes a travs de procesos de elevado costo, basados principalmente en la
utilizacin de HPLC como paso purificativo. Debido a esto se ha despertado un gran
inters en el desarrollo de mtodos eficientes y ms econmicos para producir hEGF.
Considerando estos antecedentes, nos propusimos desarrollar un proceso de produccin
eficiente y de bajo costo, que se basa en la adicin de un pptido de 6 residuos de
arginina (6xArg) en el extremo C-terminal de hEGF. Empleamos el organismo
Escherichia coli con el fin de sobreexpresar hEGF en forma de cuerpos de inclusin, que
nos permiti alcanzar un nivel de expresin de hEGF de 100 mg/L cultivo.
Estandarizamos un procedimiento de solubilizacin y replegamiento en matriz de lecho
expandido, que permiti disolver los agregados insolubles y posteriormente renaturar el
hEGF a su estado nativo, con un rendimiento del 72%. Se escindi el pptido 6xArg
mediante tratamiento con tripsina, y establecimos las condiciones para separar el hEGF
de esta enzima y de las trazas de protena no digerida, mediante cromatografa de
intercambio catinico y ultrafiltracin, obtenindose hEGF a un nivel de 42 mg/L de
cultivo, y pureza del 99%. Finalmente, comprobamos la bioactividad de hEGF
estimulando la proliferacin en la lnea celular 3T3, y que la adicin del pptido 6xArg
no afecta significativamente la actividad de la molcula. Con esto demostramos que el
procedimiento diseado fue eficiente y permiti obtener hEGF biolgicamente activo,
con un nivel de pureza adecuado para su aplicacin tpica e inyectable.



10

ABSTRACT

The human Epidermal Growth Factor (hEGF) is a cytokine that stimulate
proliferation of epithelial cells and fibroblasts. Due to this mitogenic potential, hEGF
has been used as a healing agent in treatment to acute and chronic wounds in skin,
gastrointestinal tract and renal tissue. Because of its therapeutic rol, hEGF has been
produced as a recombinant protein through expensive processes, mainly based in a
HLPC purification step. Due to this, has aroused a great interest in developing cheaper
and more efficient methods to produce hEGF. However, most existing strategies are
based on the use of high-cost methods such as HPLC. Considering this background, we
decided to develop a hEGF production process, based on the addition of a six arginine
tag (6xArg) at the C-terminal domain of the protein. We used the prokaryotic organism
Escherichia coli, in order to overexpress hEGF as inclusion bodies, which allowed us to
achieve a hEGF expression level of 100 mg/L of culture. We standardized solubilization
and refolding methods by using expanded-bed adsorption chromatography, allowing us
to dissolve insoluble aggregates of hEGF, and then returning them to their native state
with a yield of 72%. The 6xArg tag was cleaved by trypsin treatment, and we
established the conditions for separating the hEGF of this enzyme and traced undigested
protein by cation-exchange chromatography and ultrafiltration, obtaining hEGF at a
level of 42 mg/L of culture, with a purity of 99%. Finally, we checked the bioactivity of
hEGF stimulating the proliferation of a 3T3 cell line, and that the addition of 6xArg tag
did not significantly affect the molecule activity. This demonstrates that the designed
production process was efficient and allowed us to obtain biologically active hEGF with
a level of purity suitable for topic and intralesional application.





11

1. INTRODUCCIN

1.1. Biofrmacos y protenas de uso teraputico.
El concepto de biofrmaco hace referencia a sustancias farmacuticas basadas en
protenas o cidos nucleicos usadas con fines teraputicos o de diagnstico, producidas a
partir de organismos vivos modificados genticamente, distintos a la fuente original
(Walsh, 2004). Los biofrmacos se presentan como una alternativa para el tratamiento
de aquellas patologas donde los medicamentos existentes slo funcionan como
paliativos de algunos sntomas, controlando la enfermedad de forma ineficaz (Gamboa y
Trujillo, 2009). De esta forma, las protenas de uso teraputico poseen varias ventajas
sobre los medicamentos tradicionales de sntesis qumica, entre ellas cabe destacar (i) su
ventaja funcional, debido a la incapacidad de los compuestos qumicos de imitar
adecuadamente las funciones proteicas; (ii) su especificidad, que disminuye la
posibilidad de interferir en los procesos biolgicos y causar efectos adversos; (iii) su
mejor tolerancia al ser suministrados, reduciendo la probabilidad de generar una
respuesta inmune, y (iv) su potencialidad de ser utilizados en terapias de reemplazo en
vez de terapia gnica para el tratamiento de enfermedades genticas (Leader y col.,
2008).

1.2. Produccin de protenas teraputicas.
Debido a la elevada demanda que han alcanzado los biofrmacos derivados de
protenas recombinantes en el mercado farmacutico, en los ltimos aos se gener un
incremento significativo en la produccin de estas molculas teraputicas, lo que
conduce a la necesidad de desarrollar nuevas estrategias que permitan elevar los
rendimientos de produccin (Walsh, 2010).

1.2.1. Sistemas de expresin para la produccin de protenas recombinantes
teraputicas.
Las protenas de uso teraputico pueden obtenerse por dos vas distintas:
mediante la extraccin directa desde una fuente animal o humana, o a travs de la
12

tecnologa de ADN recombinante utilizando una amplia variedad de organismos vivos
como sistemas hospedantes para la expresin artificial (Leader y col., 2008).
Actualmente la generalidad de las protenas teraputicas de aplicacin en humanos se
producen mediante la tecnologa de ADN recombinante. Esto se debe a que estas
molculas son extradas en muy bajas cantidades desde una fuente natural, y las
metodologas empleadas en su purificacin son demasiado engorrosas a diferencia de las
opciones recombinantes, donde las biomolculas de inters se producen mediante
procesos de purificacin robustos y en concentraciones elevadas (Walsh, 2004).
Dentro de los sistemas de produccin de protenas se encuentran las bacterias,
levaduras, cultivos de clulas superiores (insectos o mamferos) y organismos
transgnicos (animales o plantas) (Ferrer-Miralles y col., 2009). La seleccin de un
sistema u otro para la expresin de protenas teraputicas se basa en los rendimientos y
costos de produccin, as como en el requerimiento de eventos post-traduccionales (ej.
glicosilaciones) necesarios para asegurar la actividad biolgica y farmacocintica de la
molcula (Demain y Vaishnav, 2009).
Los sistemas de expresin basados en levaduras, como Pichia pastoris y
Saccharomyces cerevisiae, se utilizan para expresar protenas que no pueden producirse
en sistemas bacterianos debido a problemas de plegamiento o falta de glicosilaciones
(Demain y Vaishnav, 2009). Aun as, los patrones de glicosilacin generados en las
levaduras son distintos producidos por la maquinaria de las clulas de mamferos, lo que
implica importantes alteraciones en la farmacocintica e inmunogenicidad de la protena
recombinante cuando esta se administra de forma inyectables (Gerngross, 2004).
Para obtener protenas correctamente plegadas y con patrones de glicosilacin
adecuados, se requiere la utilizacin de cultivos artificiales de clulas de mamferos
(Demain y Vaishnav, 2009). Estos sistemas pueden generar patrones de glicosilacin
muy similares a los producidos por las clulas del organismo humano (Dingermann,
2008), y tienen la capacidad de exportar las protenas al medio de cultivo, lo que facilita
el proceso de purificacin (Montesino y Toledo, 2006). No obstante, los elevados costos
de mantencin de los medios de cultivo, as como la posibilidad de contaminacin del
producto con agentes virales, son algunas de sus principales desventajas (Wurm, 2004).
13

1.2.2. Produccin de protenas recombinantes teraputicas en Escherichia coli.
Los sistemas de produccin basados en organismos procariontes como
Escherichia coli son los ms empleados para la produccin de protenas recombinantes
de bajo peso molecular y carentes de glicosilaciones. Esto se debe a su rpido
crecimiento y acumulacin de biomasa mediante procesos fermentativos de alta
densidad celular que utilizan fuentes de carbono de bajo costo, a los altos rendimientos
productivos, al fcil escalamiento desde matraces de cultivo hasta fermentadores, y a su
capacidad de sobreexpresar protenas exgenas de forma controlada, que puede alcanzar
entre un 10% a 50% de las protenas totales (Sahdev y col., 2008). Entre las principales
desventajas de Escherichia coli como sistema de expresin, se destaca la carencia de
enzimas encargadas de glicosilar protenas, limitando el espectro de biofrmacos que
pueden generarse mediante dicho sistema, y la inexistencia de ptimos sistemas de
secrecin (Wacker y col., 2002).
Un paso crtico dentro de la primera etapa del proceso productivo de protenas
recombinantes es la eleccin del promotor y la metodologa que se emplear para regular
la expresin del gen que codifica para la protena teraputica. Estos promotores deben
estar finamente regulados, generalmente por sustratos que funcionan como inductores de
la transcripcin. Idealmente, estos sistemas inducibles deben estar basados en
procedimientos simples y de bajo costo (Demain y Vaishnav, 2009). Uno de los sistemas
de vectores ms utilizados a escala de laboratorio para la produccin de biofrmacos en
bacterias est basado en los plsmidos pET (Novagen, EE.UU.). En estos vectores el gen
de inters se encuentra bajo el control transcripcional del promotor de la ARN
polimerasa del bacterifago T7. Por esta razn, estos vectores deben emplearse en cepas
bacterianas que posean el gen que codifica esta ARN polimerasa, cuya expresin este
regulada por algn promotor derivado del promotor lac, inducible por isopropil--D-1-
tiogalactopiransido (IPTG) (Fig. 1) (Srensen y Mortensen, 2005).



14




Figura N 1. Expresin de protenas heterlogas en E. coli mediante el sistema de
vectores pET. Dentro del genoma de la bacteria se encuentra una copia del gen que
codifica a la ARN polimerasa del fago T7, cuya expresin est controlada por el
promotor lacUV5, y una copia del gen que codifica al represor lac I. Cuando se adiciona
IPTG al medio de cultivo, este se une al represor lac I y altera su estructura de tal forma
que este pierde afinidad por el operador lac, activndose la expresin de la ARN
polimerasa del fago T7. Finalmente la T7 ARN polimerasa activa la expresin del gen de
inters presente en el vector plasmdico (Quiroga, 2010).


15

El siguiente paso conlleva la aplicacin de una serie de metodologas de
purificacin, cuya finalidad es eliminar las molculas endgenas producidas por el
organismo husped, como endotoxinas o agentes pirognicos, para as alcanzar niveles
de pureza cercanos al 99%. De esta forma en el primer paso se realiza la remocin de las
clulas desde el caldo de fermentacin, y su posterior ruptura mediante procedimientos
enzimticos o mecnicos. A continuacin, dependiendo de las caractersticas
fisicoqumicas de la molcula, se aplican tcnicas de separacin cromatogrfica como
cromatografa de intercambio inico, de exclusin molecular o de afinidad. Para esta
ltima suelen emplearse pptidos de afinidad como el eptope FLAG, terminaciones o
colas de poli-histidina o poli-arginina unidas a la protena de inters, los cuales poseen
alta afinidad por determinadas molculas que son ancladas a un soporte slido o matriz,
permitiendo de esta forma la captacin y purificacin especfica de la molcula marcada
(Jonasson y col., 2002).
Un ejemplo de esto es el sistema de purificacin basado en el pptido terminal
de poli-arginina (6xArg), diseado para la purificacin de protenas expresadas en
sistemas bacterianos mediante la utilizacin de resinas de intercambio catinico. Este
sistema permite eluir la protena marcada con 6xArg mediante la aplicacin de un
gradiente de NaCl a pH alcalino en un primer paso cromatogrfico, seguido por la
remocin de los residuos de arginina empleando las enzimas tripsina o carboxipeptidasa
B, y un segundo paso de purificacin en un resina de intercambio catinico (Sassenfeld
y Brewer, 1984).

1.2.3. Sobreexpresin de protenas recombinantes en forma de cuerpos de
inclusin.
Una de las principales ventajas de los sistemas procariontes es su capacidad de
sobreexpresar protenas recombinantes, sin embargo esto lleva generalmente a la
acumulacin de las protenas en forma de agregados insolubles, denominados cuerpos de
inclusin. Si bien este evento de agregacin es una caracterstica predominante de los
sistemas de alta expresin, tambin es promovido bajo condiciones de elevada
concentracin de inductor y alta temperatura de crecimiento celular (Li y col., 2004).
16

Estos agregados intracelulares se encuentran principalmente conformados por la protena
sobreexpresada en una conformacin no nativa carente de actividad biolgica, y en
menor porcentaje por otras protenas celulares, ADN y ARN ribosomal (Panda, 2003). A
pesar de generar la protena en forma inactiva, la expresin en forma de cuerpos de
inclusin presenta importantes ventajas, como la proteccin ante la degradacin
proteoltica, fcil separacin de estos agregados de las protenas solubles mediante
procedimientos de centrifugacin, filtracin o cromatografa de exclusin molecular, y
la posibilidad de expresar protenas txicas para la bacteria (Li y col., 2004). Por tanto,
el mayor desafo de expresar protenas en forma de cuerpos de inclusin es convertir la
protena insoluble e inactiva en un producto soluble, correctamente plegado y
biolgicamente activo (Clark, 1998).
La recuperacin de la protena activa desde los cuerpos de inclusin se realiza
inicialmente a travs del aislamiento de estos desde el lisado bacteriano. Los cuerpos de
inclusin se caracterizan por poseer una densidad especfica elevada, por lo que se
pueden separar de la fraccin de protenas solubles mediante pasos de centrifugacin a
alta velocidad (8.000 a 10.000 g) (Panda, 2003). Posteriormente se realiza la
solubilizacin de los agregados usando agentes reductores como DTT y -
mercaptoetanol, y altas concentraciones de agentes caotrpicos (6-8 M) como urea o
cloruro de guanidinio, los que generan la perdida de la estructura secundaria, llevando a
la protena a la formacin de una estructura al azar (random coil). Finalmente se lleva a
cabo el replegamiento de la protena denaturada mediante la remocin del agente
caotrpico y reductor (Fahnert y col., 2004).
De estas etapas, el replegamiento es la etapa principal que determinar los
rendimientos de recuperacin. Existen tres modelos que pueden ser empleados para
realizar la renaturacin de las protenas solubilizadas (Singh y Panda, 2005):
(1) Dilucin. En este modelo la protena solubilizada se diluye directamente en
un tampn de renaturacin que favorezca el replegamiento de la protena,
disminuyendo la concentracin del agente denaturante. Este procedimiento
normalmente es empleado a nivel de laboratorio debido a que requiere de
17

grandes cantidades de tampn, y es necesario realizar procedimientos de
concentracin de la muestra, lo que aumenta el costo de produccin.
(2) Intercambio de solvente. Se realiza mediante procedimientos de dilisis,
diafiltracin o cromatografa de exclusin molecular. En este procedimiento,
los agentes denaturante y reductor son removidos completamente del medio,
e intercambiados por un tampn de renaturacin. Los procedimientos de
dilisis y diafiltracin que emplean membranas de ultra-filtracin, se
emplean en menor grado debido su lentitud, a la perdida de polipptidos no
plegados que pueden atravesar la membrana, y a la obstruccin de estas
debido a la acumulacin de las protenas denaturadas sobre la membrana.
(3) Adsorcin reversible de protenas denaturadas a un soporte slido. Las
protenas denaturadas unidas a un soporte slido, como matriz de
intercambio inico o afinidad a iones metlicos, se encuentran espacialmente
separadas e inmovilizadas durante el proceso de replegamiento, previniendo
su difusin e interaccin, y por lo tanto su re-agregacin.
Dentro del tercer modelo de replegamiento cabe destacar la utilizacin de la
cromatografa de adsorcin en lecho expandido, la cual se ha empleado para realizar el
replegamiento y la purificacin parcial de protenas recombinantes expresadas como
cuerpos de inclusin, en un solo paso (Cho y col, 2002; Jin y col., 2005; Alibolandi y
col., 2011). Esta tcnica se basa en la utilizacin de matrices de afinidad o intercambio
inico, las cuales al ser sometidas a un flujo ascendente expanden su volumen hasta
alcanzar el equilibrio entre la velocidad de sedimentacin de las partculas y el flujo
ascendente, lo que permite formar un lecho estable y uniforme (Anspach y col., 1999).
De esta forma, al expandir el lecho cromatogrfico las interacciones intermoleculares
entre las protenas denaturadas se minimizan debido a la separacin espacial existente
entre ellas, de tal forma que al realizar la remocin del agente caotrpico desde el lecho
cromatogrfico expandido, se disminuyen los eventos de re-agregacin (Jin y col.,
2005).

18

1.3. Factor de Crecimiento Epidrmico.
El Factor de Crecimiento Epidrmico pertenece al grupo de los factores de
crecimiento, molculas biolgicas de carcter proteico u hormonal capaces de estimular
el crecimiento celular, la proliferacin y la diferenciacin celular. Su hallazgo se
remonta a la dcada de los aos 60 del siglo XX, en el marco de los estudios dirigidos
por Stanley Cohen para caracterizar el Factor de Crecimiento Nervioso presente en la
glndula submaxilar de ratones. Al inyectar diariamente un extracto puro de la glndula
en ratones recin nacidos, se generaban cambios fisiolgicos inesperados como apertura
precoz de parpados y prematura erupcin de dientes (Cohen, 1962). Dichos efectos
morfolgicos fueron atribuidos posteriormente a la estimulacin del crecimiento
epidrmico y queratinizacin inducida por el Factor de Crecimiento Epidrmico murino
(mEGF). Este corresponde a una cadena polipeptdica de 53 residuos de aminocidos,
producida en la glndula submaxilar, interconectada por tres enlaces disulfuro
responsables de su alta estabilidad trmica, y cruciales para su actividad biolgica
(Savage y col., 1973).
Posteriormente, se determin que el mEGF estimulaba el crecimiento epitelial y
la sntesis de ADN y ARN en cultivos celulares de fibroblastos humanos, lo que llev a
pensar en la posibilidad de que este factor se encontrara presente adems en humanos
(Starkey y col., 1975). De esta forma se logr purificar por primera vez el Factor de
Crecimiento Epidrmico humano a partir de orina, bajo el nombre de Urogastrona,
debido a su capacidad de inhibir la secrecin de cido gstrico (Starkey y Cohen, 1975).
Posteriormente, se comprob que este factor estimula la proliferacin y diferenciacin
de clulas epiteliales de la piel, cornea, tejido pulmonar y del tracto gastrointestinal,
promueve el crecimiento y migracin de queratinocitos, y aumenta la proliferacin de
fibroblastos y clulas endoteliales. Por lo tanto, se postul que el EGF podra jugar un
rol crucial dentro del proceso de reparacin de tejido y organognesis (Carpenter y
Cohen 1979).

19

1.3.1. Sealizacin molecular y estimulacin de la reparacin de tejido.
El efecto mitognico del EGF es mediado por un receptor transmembrana
especfico denominado EGFR/ErbB1, presente en la membrana plasmtica de las clulas
blanco. Este se organiza formando 3 dominios: un dominio extracelular donde se
encuentra el sitio de unin al ligando, un dominio transmembrana, y una porcin
intracelular rico en residuos de serina, treonina y tirosina. Al unirse el EGF al dominio
extracelular del receptor se desencadena la dimerizacin de este, estimulndose la
actividad quinasa del receptor, que finalmente resulta en la autosforilacin de residuos
de tirosina en el dominio intracelular y en la transduccin de la seal proliferativa
(Carpenter y Cohen, 1990).
Posteriormente se genera la activacin de vas de sealizacin intracelular,
como la va RAS-RAF-MEK-MAPK que controla la progresin del ciclo celular desde
la fase G1 a S, la va de Fosfoinositol 3-quinasas/Proteina quinasa B
(Phosphatidylinositide 3-kinases/Protein Kinase B, PI3K-Akt) que activa una cascada de
seales anti-apoptticas y citoprotectivas que inducen la recuperacin de las clulas
daadas, y la activacin de Fosfolipasa C1 y la va de Protenas Quinasas Activadas
por Mitgenos (Mitogen-Activated Protein Kinases, ERK/MAP) que estimulan la
migracin celular (Fig. 2) (Citri y Yarden, 2006).
Estas vas finalmente inducen la expresin de una amplia variedad de genes que
estimularn tres importantes procesos biolgicos implicados en la reparacin de tejidos:
proliferacin celular, citoproteccin y locomocin en clulas epiteliales y fibroblastos
(Berlanga-Acosta y col., 2009).
Una vez que el EGF se une a su receptor, se genera la internalizacin del
complejo, y su posterior degradacin enzimtica dentro del lisosoma (Carpenter y Cohen
1979). De esta forma la clula realiza un proceso de recambio del receptor ErbB1 en la
superficie celular, lo cual conduce posteriormente a un incremento compensatorio en la
expresin y sntesis del receptor (Earp y col., 1986).



20





Figura N 2. Esquema que representa las principales vas de sealizacin
activadas por el Receptor del Factor de Crecimiento Epidrmico luego de
la unin con su ligando.



21

1.3.2. Cicatrizacin y alteraciones en el proceso de reparacin de tejidos.
La reparacin de tejidos es un proceso biolgico complejo que implica la
accin de un amplio nmero de factores de crecimiento y citoquinas. Este puede
resumirse en cuatro etapas: (i) estimulacin de la migracin de clulas productoras hacia
la zona daada, (ii) estimulacin del crecimiento del tejido granular, incluyendo
acumulacin de matriz extracelular y angiognesis, (iii) estimulacin de la contraccin
de la herida mediante estimulacin de la proliferacin de miofibroblastos, y (iv)
estimulacin del recubrimiento del rea daada mediante migracin y proliferacin de
las clulas epiteliales (Pastore y col., 2008).
La alteracin del proceso de cicatrizacin es un problema significativo tanto a
nivel medico como econmico, principalmente para aquellos pacientes diabticos que
desarrollan heridas ulcerosas en sus extremidades inferiores (lceras de Pe Diabtico)
(Berlanga-Acosta y col., 2009). Estos se caracterizan por padecer severos trastornos
endoteliales sistmicos, fallas en las defensas anti-bacterianas, irrigacin sangunea
anmala, y una deficiencia en el proceso de reparacin de tejidos. Finalmente todos
estos factores habitualmente llevan a la amputacin de las extremidades inferiores
(Tiaka y col., 2012). A nivel mundial, ms de 370 millones de personas sufren de
diabetes, de los cuales se estima que aproximadamente un 20% desarrolla una lcera
crnica en algn pe. En Chile, la prevalencia de diabetes mellitus asciende a un 9.4%.
Del total de los pacientes diabticos, aproximadamente el 12,5% desarrolla una lcera de
pie diabtico, de los cuales el 12% son sometidos a amputacin de sus miembros
inferiores (aprox. 18.750 personas) (Encuesta Nacional de Salud, 2009-2010).
El mecanismo molecular por el cual se origina una disminucin en el proceso
de reparacin del tejido an no ha sido dilucidado, sin embargo existe evidencia que
sugiere que esta deficiencia podra deberse a una expresin anormal o reducida de
algunos factores de crecimiento, o a una alteracin en su actividad proliferativa debido a
un proceso de glicosilacin no enzimtico (glicacin) de estas molculas inducida por la
condicin hiperglicmica (Papanas y Maltezos, 2010).
Finalmente este dficit desencadena una serie de efectos fisiolgicos a nivel
epidrmico: (i) un dao en la funcin de los fibroblastos, limitando la formacin,
22

maduracin y remodelacin de la matriz extracelular, (ii) una disminucin en la
poblacin de miofibroblastos, reduciendo la contraccin de la herida, y (iii) una limitada
o nula respuesta angiognica (Berlanga-Acosta y col., 2009).
Bajo este contexto, con la finalidad de contrarrestar el dficit de factores de
crecimiento, y disminuir los sntomas generados, se desarroll un nuevo tratamiento
denominado Terapia de Reemplazo de Factores de Crecimiento, cuyo objetivo es
estimular y restaurar el proceso de cicatrizacin. Este se basa en la administracin
exgena de factores de crecimiento como el PDGF (factor de crecimiento derivado de
plaquetas), VEGF (factor de crecimiento vascular endotelial) o EGF, obtenidos a partir
de su fuente natural, o mediante tcnicas de ADN recombinantes (Kwon y col., 2006).

1.3.3. Utilizacin teraputica de Factor de Crecimiento Epidrmico.
Varios ensayos in vivo se realizaron con la finalidad de probar el efecto de EGF
sobre el proceso de cicatrizacin. Para esto se emplearon distintos modelos de heridas
(heridas parciales o profundas, quemaduras trmicas o qumicas) inducidas en diversos
modelos de animales como ratones, cerdos y perros (Nanney, 1990; Tanaka y col., 2005;
Alemdaroglu y col., 2006; Kwon y col., 2006). Dichos experimentos permitieron llegar a
la conclusin de que la aplicacin tpica de EGF sobre el rea daada estimula la
cicatrizacin debido a una aceleracin en la proliferacin de las clulas epiteliales
nuevas y un aumento en la contraccin de la herida, condicionado por un incremento en
la proliferacin de miofibroblastos y la deposicin de colgeno. Finalmente, estos
eventos generan un aumento significativo en la velocidad de la cicatrizacin y una
disminucin del tiempo de cierre de la herida (Kwon y col., 2006). Por otro lado, se
realizaron ensayos clnicos en humanos con la finalidad de probar el efecto de la
aplicacin tpica en heridas crnicas, obtenindose resultados similares en cuanto a la
estimulacin del proceso de cicatrizacin (Brown y col., 1991; Borges y col., 1994). Sin
embargo, la mayora de los ensayos clnicos que implican la utilizacin de EGF como
agente cicatrizante, estn destinados a estudiar su efecto sobre las lceras de pie
diabtico. Se realizaron estudios en lceras de pie diabtico de diversa severidad (ulceras
de grado I a IV segn el sistema de clasificacin de Wagner), aplicando de forma tpica
23

el EGF sobre la zona daada, generndose una cicatrizacin parcial (Tsang y col., 2003)
o completa de la herida (Hong y col., 2006), lo cual finalmente llev a una reduccin en
el riesgo de amputacin. Sin embargo, la aplicacin tpica puede generar efectos
variados que dependen de la disponibilidad del agente en las capas profundas de la
herida, mayoritariamente debido a la presencia de proteasas en la zona de dao (Tiaka y
col., 2012). De esta forma, a diferencia de la aplicacin tpica, la inyeccin intralesional
permite liberar el agente activo directamente en la regin deseada, generndose un
efecto directo que permite mejorar el proceso de cicatrizacin (Fernndez-Montequin y
col., 2009).
Segn lo expuesto anteriormente, el Factor de Crecimiento Epidrmico posee
una funcin esencial en el proceso de regeneracin de tejido, y la ausencia de esta
molcula condiciona el desarrollo de lceras de pe diabtico. Esta afeccin tiene una
elevada incidencia tanto a nivel mundial como nacional, por lo cual se hace necesaria la
generacin de una plataforma para la produccin de esta molcula. Debido al costo de
operacin implicado en la utilizacin de sistemas de expresin de protenas
recombinantes basados en clulas de mamferos, y a las caractersticas fisicoqumicas
del EGF, nos preguntamos en este trabajo si mediante la adicin de un pptido rico en
residuos de arginina en el extremo C-terminal del EGF, y la utilizacin de Escherichia
coli como sistema de expresin, es posible establecer un proceso de produccin de alto
rendimiento, escalable y de bajo costo de operacin, para la expresin del Factor de
Crecimiento Epidrmico humano recombinante.








24

2. HIPTESIS

La adicin de un pptido compuesto por 6 residuos de aminocido Arginina al
extremo C-terminal de la molcula del Factor de Crecimiento Epidrmico humano
permite establecer un proceso productivo para obtener esta protena recombinante
biolgicamente activa y con un nivel de pureza superior o igual al 99%, partiendo de su
expresin en Escherichia coli.

3. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL.
Establecer un proceso productivo para la generacin de Factor de Crecimiento
Epidrmico humano recombinante en una forma biolgicamente activa, basado en la
adicin de un pptido de 6 residuos de arginina al extremo C-terminal de la protena.

OBJETIVOS ESPECFICOS.
I. Clonar y expresar en Escherichia coli la molcula de Factor de Crecimiento
Epidrmico humano unida a una cola de 6 residuos de Arginina.
II. Establecer un procedimiento de purificacin de la molcula basado en tcnicas
cromatogrficas de intercambio inico y adsorcin en una matriz de lecho
expandido, garantizando un nivel de pureza superior o igual al 99%.
III. Determinar los rendimientos en cada paso del procedimiento de purificacin.
IV. Evaluar la actividad biolgica in vitro del Ingrediente Farmacutico Activo
purificado.





25

4. MATERIALES Y MTODOS

4.1. Materiales.

4.1.1. Medios de cultivo de bacterias y antibiticos.
Medio LB (MoBio, EE.UU), Agar LB (MoBio, EE.UU), Ampicilina (SIGMA, EE.UU.),
Cloranfenicol (SIGMA, EE.UU.), IPTG (Promega, EE.UU.).

4.1.2. Cepas bacterianas.
DH5: F
-
endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG 80dlacZM15
(lacZYA-argF)U169, hsdR17(r
K
-
m
K
+
), .
Cepa de E. coli empleada para el clonamiento y replicacin de vectores bacterianos
debido a su alta eficiencia de transformacin.
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL: E. coli B F

ompT hsdS(r
B

m
B

) dcm
+
Tet
r
gal (DE3)
endA Hte [argU ileY leuW Cam
r
] (Stratagene, EE.UU).
Cepa de E. coli empleada para la expresin de protenas heterlogas. Contiene copias
extra de los genes que codifican para los ARNt argU, ileY e leuW. Adems posee dentro
de su genoma el gen codificante para la ARN polimerasa del bacterifago T7, cuyo
expresin se encuentra controlada por el promotor lac inducible por IPTG.

4.1.2. Plsmidos.
pET-22b(+): vector plasmdico desarrollado para la expresin de protenas
recombinantes en Escherichia coli. El gen heterlogo es clonado bajo el control el
promotor de ARN polimerasa del bacterifago T7. Este vector debe ser introducido en
una cepa bacteriana que contenga una copia de ARN polimerasa del bacterifago T7
dentro de su cromosoma, la cual se encuentre bajo el control de un promotor inducible
como lacUV5, cuya expresin es inducida mediante la adicin de IPTG (Novagen,
EE.UU.).

4.1.3. Lneas celulares.
3T3: Lnea celular de fibroblastos de ratn (ATCC CRL-1658).
26

4.1.4. Soluciones de cultivo celular.
Medio DMEM: 4,5 g/L de D-glucosa; 3,7 g/L NaHCO3 (HyClone, EE.UU.)
suplementado con 0.3 mg/mL L-glutaminutosa, 1 mM piruvato sdico y solucin
antibitico-antimictico 1X (Gibco-BRL, EE.UU.).
Medio de crecimiento: DMEM suplementado con suero de bovino fetal al 10%
(HyClone, EE.UU.).
Tampn fosfato salino: 8 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.09 g/l Na
2
HPO
4
, pH 7.2.
Tripsina-EDTA 0,25% (HyClone, EE.UU.): Usada para quitar las clulas de la placa
de cultivo.

4.1.5. Enzimas.
NdeI, XhoI, T4 DNA Ligasa (New England BioLabs, Inglaterra), Tripsina de pncreas
de bovino (Calbiochem, Inglaterra).

4.1.6. Reactivos y soluciones.

Soluciones para extraccin y purificacin de ADN plasmidial y ARN:
Solucin I: 50 mM Glucosa (Merck, Alemania), 25 mM Tris-Cl pH 8.0 (SIGMA,
EE.UU.), 10 mM EDTA pH 8.0 (Calbiochem, Inglaterra), 10 mg/ml ARNasa (US
Biologicals, EE.UU.).
Solucin II: 0.2 M NaOH (Merck, Alemania), 1% (p/v) SDS (Merck, Alemania).
Solucin III: 5 M Acetato de potasio (Merck, Alemania), Acido actico glacial
(Merck, Alemania).
Cloroformo (Winkler, Chile), Isopropanol (Merck, Alemania), Etanol absoluto (Merck,
Alemania).

Soluciones para electroforesis de ADN:
Agarosa (Calbiochem, Inglaterra), Tampn de carga ADN 6x (New England Biolabs),
Tampn TAE 5x (Merck, Alemania), Bromuro de etdio (Merck, Alemania Millipore),
Marcador de peso molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Fermentas).
27

Soluciones para extraccin y purificacin de protenas:
Tampn fosfato de potasio: KH
2
PO
4
y K
2
HPO
4
, (Fisherbiotech, EE.UU.).
Tampn de lisis: 10 mM EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 25 mM PPB, pH 8.0.
Solucin de denaturacin: 8 M Urea (Fisherbiotech, EE.UU.), 5 mM DTT
(Calbiochem, Inglaterra).
Tampn renaturacin I: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 2 M Urea (Fisherbiotech,
EE.UU), 25 mM PPB, pH 8.0.
Tampn de renaturacin II: 200 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 8.0.
Tampn de elucin: 25 mM PPB, 500 mM NaCl pH 8.0.
Tampn de diafiltracin: 50 mM NaCl (Merck, Alemania), 25 mM PPB, pH 7.4.
Solucin de tripsina: 2.5 g/l Tripsina de pncreas de bovino (SIGMA, EE.UU.), 0.2
g/l EDTA (Calbiochem, Inglaterra), 50 mM NaCl, 25 mM PPB, pH 7.4.
Tampn equilibrio IEC: 25 mM PPB, pH 6.0.
Tampn de elucin IEC: 25 mM PPB, 1 mM NaCl, pH 6.0.

Soluciones para electroforesis de protenas en condiciones reductoras:
Acrilamida/bisacrilamida 30%/1%, Acrilamida/bisacrilamida 16% T/3% C (Sigma,
EE.UU.), 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 (Calbiochem, Inglaterra), 0.5 M Tris-HCl pH 6.8
(Calbiochem, Inglaterra), 3.0 M Tris-HCl/0.3% SDS, 10 % (p/v) PSA (Calbiochem,
Inglaterra), 20 % (p/v) SDS (Calbiochem, Inglaterra), Patrn de peso molecular
AccuRuler RGB Prestained Protein Ladder 10-180 kDa (MaestroGen, EE.UU.) y
Precision Plus Protein Dual Xtra Standards 2-250 kDa (Bio-Rad, EE.UU.)
Tampn de corrida: 25 mM Tris (Calbiochem, Inglaterra), 192 mM Glicina
(Calbiochem, Inglaterra), 1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).
Tampn Ctodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris (Calbiochem, Inglaterra), 0.1 M Tricina
(Sigma, EE.UU.), 0.1% SDS (Calbiochem, Inglaterra).
Tampn Anodo Tris-Tricina: 0.1 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra), pH 8.9.
28

Tampn de carga 4x: 0.25 M Tris-HCl (Calbiochem, Inglaterra) pH 6.8, 4% SDS
(Calbiochem, Inglaterra), 40% Glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.4% Azul de
bromofenol (Merck, Alemania), 1.2 M -mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.).
Tampn de carga Tris-Tricina: 12% SDS (Calbiochem, Inglaterra), 6% -
mercaptoetanol (Sigma, EE.UU.), 30% glicerol (ISN Scientific Corporation), 0.05%
Azul de Coomassie R-250 (Merck, Alemania), 150 mM Tris/HCl pH 7.0 (Calbiochem,
Inglaterra).
Solucin de tincin: Azul de Coomassie 0.5 g/l (Merck, Alemania), Metanol 10 %,
(TCL, Chile),
Solucin de destincin: 7 % Metanol (TCL, Chile), 5 % cido actico (Merck,
Alemania).

Matrices y columnas para purificacin de protenas:
Matriz de lecho expandido STREAMLINE SP (GE Healthcare Life Science, Inglaterra),
matriz de intercambio inico GigaCap S-650 (Tosoh Bioscience, Japn), Columna XK
16/20, Columna C 16/40, Columna C 10/10 (GE Healthcare Life Science, Inglaterra).

4.1.7. Kit comerciales.
Gel Extraction Kit EZNA (Omega Bio-Tek, EE.UU.): Kit utilizado para la
purificacin de ADN plasmidial desde geles de agarosa, basado en el uso de una matriz
de de afinidad que retiene el ADN contenido en agarosa fundida.
Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, EE.UU.): Kit que combina la
reduccin de Cu
2+
a Cu
1+
, y la deteccin altamente selectiva de Cu
1+
por el cido
bicinconnico para la cuantificacin de protenas totales.






29

4.2. Metodologa.

4.2.1. Sntesis de ADN.
Se envi a sintetizar a la compaa GENEART (Toronto, Canad) el gen que
codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano, seguido de un pptido de 6
residuos de arginina en su extremo C-terminal, flanqueado por los sitios de
reconocimiento para las enzimas de restriccin XhoI y NdeI.

4.2.2. Mtodos generales para la manipulacin de ADN.
Los procedimientos generales requeridos para el manejo y evaluacin del ADN
se realizaron de acuerdo a lo descrito en el Manual de Protocolos Molecular Cloning: A
Laboratory Manual (Sambrook y col. 2012). Las digestiones de ADN con las enzimas
de restriccin se realizaron de acuerdo a las recomendaciones de los fabricantes
(Promega, EE.UU.). Las electroforesis de ADN se efectuaron en geles de agarosa al 0.8,
y 2% peso/volumen en tampn TAE a 5 V/cm.

4.2.2.1. Transformacin de bacterias E. coli DH5 mediante electroporacin.
Se adicionaron 40 L de clulas electrocompetentes DH5 descongeladas en
hielo por cada muestra de ADN plasmidial, despus de 5 minutos de incubacin en hielo
se introdujo la mezcla en cubetas de electroporacin de 0.1 cm de ancho (Bio-Rad,
EE.UU.), previamente enfriadas en hielo. Los parmetros de electroporacin fueron:
resistencia 200 , capacitancia 25 f y voltaje de 1.8 mV, ajustados previamente en el
electroporador (Bio-Rad, EE.UU.). Se activ el pulso elctrico con un tiempo promedio
de 8 mS, y se adicionaron lentamente 600 L de medio LB lquido a la muestra, las
clulas se incubaron a 37 C durante 1 hora. Las clulas se sembraron en placas con
medio selectivo y se incubaron a 37 C durante 16 horas.

4.2.2.2. Purificacin de plsmidos.
La purificacin del ADN plasmidial de E. coli se realiz a travs del mtodo
de lisis alcalina (Birnboim y Doly, 1979).
30

4.2.2.3. Purificacin a escala mini preparativa.
Se inocularon colonias individuales en cultivo de 5 mL de medio LB lquido
suplementado con el antibitico de seleccin ampicilina en una concentracin de 50
g/ml. Se incubaron a 37 C con agitacin durante 16 horas. Se tomaron 1.5 mL del
cultivo y se centrifugaron durante 5 minutos a 6.000 rpm. El precipitado celular se
resuspendi en 100 L de solucin I y se incub a 25 C durante 5 minutos. A
continuacin se le aadieron 100 L de solucin II, se agit suavemente por inversin y
se incub en hielo durante 5 minutos. Posteriormente se aadieron 100 L de solucin
III, se agit suavemente por inversin, se incub 5 minutos en hielo y se centrifug 5
minutos a 12.000 rpm. Se extrajo el sobrenadante, se le aadi un volumen equivalente
de isopropanol y se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos. El precipitado se lav
con etanol al 70 % para eliminar las sales y se sec al vaco. Las muestras se
resuspendieron en 30 L de agua destilada estril y se analizaron mediante electroforesis
en gel de agarosa al 0.8%.

4.2.3.4. Purificacin a escala preparativa.
Se inocul una colonia en 300 mL de medio LB suplementado con el
antibitico de seleccin correspondiente, y se incub a 37 C con agitacin durante 16
horas. El cultivo se centrifug a 6.000 rpm durante 15 minutos a 4 C, se desech el
sobrenadante y se resuspendi el precipitado en 10 mL de solucin I. A la suspensin
celular se le adicionaron 10 mL de solucin II, se mezcl por inversin y se dej reposar
a 25
o
C durante 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 10 mL de solucin III, se
mezcl por inversin, se incub en hielo durante 20 minutos y se centrifug a 12.000
rpm durante 30 minutos a 4C. Se elimin el sobrenadante, se adicionaron 0.8
volmenes equivalentes de isopropanol, y se incub a 25
o
C durante 10 minutos.
Posteriormente se centrifug la mezcla a 12.000 rpm durante 30 minutos a 4 C, se
desech el sobrenadante y el precipitado se resuspendi en 600 L de agua estril. La
suspensin de ADN se incub a 37 C con 20 g/mL de ARNasa durante 2 horas. Las
protenas contaminantes se extrajeron con fenol/cloroformo, el precipitado final se
resuspendi en 300L de agua estril y la pureza del ADN se determin mediante
31

espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar NANO BMG LABTECH,
Alemania).

4.2.2.5. Extraccin de protenas con fenol/cloroformo y precipitacin de ADN
plasmdico.
Por cada muestra de ADN se adicionaron 0.5 volmenes de fenol saturado y
0.5 volmenes de cloroformo. Se agitaron vigorosamente y se centrifugaron a 12.000
rpm durante 5 minutos. Se colect la fase superior y se adicionaron 2.5 volmenes de
etanol absoluto y 0.1 volumen de acetato de sodio 3 M, pH 5.2. El ADN se precipit a -
20 C durante 1 hora. Las muestras se centrifugaron a 12.000 rpm durante 15 minutos y
se elimin la fase superior. El precipitado de ADN se lav con etanol al 70 % y
posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos y se resuspendi en el
volumen deseado de agua estril.

4.2.2.6. Extraccin de ADN plasmidial a partir de gel de agarosa.
Se utiliz el kit comercial Gel Extraction Kit (Omega Bio-Tek, EE.UU.). Se
cort la porcin de agarosa que contena la banda de inters. El fragmento se coloc en
un tubo de centrfuga de 1.5 mL y se pes. Se adicionaron 100 L de solucin de unin
(XP2) por cada 100 mg de agarosa. Los tubos se incubaron a 50C durante 10 minutos
agitando a intervalos para favorecer la disolucin de la agarosa. Se aplicaron 700 L de
muestra en la columna comercial y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. Se
lav la columna con 700 L de solucin de lavado (SPW), seguida de dos
centrifugaciones a 12.000 rpm durante 1 minutos. Para eluir el ADN se adicionaron
50 L de agua estril y se centrifug a 12.000 rpm durante 1 minutos. La concentracin
de ADN se determin mediante espectrofotometra (espectrofotmetro SPECTROstar
NANO BMG LABTECH, Alemania).

4.2.2.7. Digestin enzimtica de ADN plasmdico.
Para la digestin enzimtica se utiliz como material de partida ADN
plasmdico a una concentracin final entre 50 y 100 ng/L, y se emplearon enzimas de
32

restriccin a razn de 1 UI por g de ADN. Las soluciones tampn, el BSA, la
temperatura de reaccin, as como otros requerimientos adicionales fueron especficos
para cada tipo de enzima segn las recomendaciones del fabricante (Catlogo New
England BioLabs, Inglaterra). Para cada reaccin se aadi de forma secuencial el ADN,
la solucin tampn especfica y BSA, se adicion agua estril hasta completar el
volumen final de la reaccin y finalmente se aadi la enzima respectiva. Luego de 2
horas de incubacin a 37 C, la digestin se comprob por electroforesis en gel de
agarosa al 0.8 o 2 %.

4.2.2.8. Reaccin de ligacin.
Las ligaciones de fragmentos de ADN se realizaron con soluciones tampn y
enzimas de la firma New England BioLabs. En todas las reacciones de ligacin se
emplearon 100 ng de vector y se probaron varias proporciones banda/vector. La cantidad
de banda en cada reaccin se calcul de acuerdo a las recomendaciones de los
fabricantes (Promega, EE.UU.).

Se prepararon 4 mezclas de reaccin de ligacin. Las cantidades de reactivos para cada
reaccin se presentan en la Tabla N1.
Las ligazones con extremos cohesivos se realizaron a 25
o
C durante 3 h, mientras que las
reacciones que involucraban extremos romos se realizaron a 16 C toda la noche. De
forma paralela se mont una reaccin de ligazn carente de banda para estimar en qu
medida la presencia de banda favoreca la circularizacin del plsmido.

4.2.3. Transformacin de bacterias E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL
quimiocompetentes por shock trmico.
Se tomaron 100 l de la cepa quimiocompetente, se mezclaron con el plsmido
a transformar (5 - 20 ng) y se incub en hielo durante 10 minutos.

33






Reactivo Vector
Vector + T4
ligasa
Vector +
banda
Vector +
banda 2
Vector (l) 1 1 1 1
Tampn de
enzima (l)
1 1 1 1
Banda (l) --- --- 3 6
H
2
O (l) 8 8 4 1
Enzima (l) --- 1 1 1
Tabla N 1. Protocolo para la preparacin de la reaccin de ligacin. Las reacciones
correspondientes a Vector y Vector + T4 ligasa corresponden a controles para la
reaccin de ligacin.







34

Se dio un shock trmico a 42 C durante 2 minutos, y se volvi a incubar en
hielo durante 10 minutos. Posteriormente se adicionaron lentamente 600 l de medio LB
sin antibitico, y se incub a 37 C durante 50 minutos. Se plaquearon 150 l del
cultivo de bacterias transformadas en placas de agar LB suplementado con ampicilina
50 g/ml. Las placas se incubaron a 37C durante 16 horas.
Finalmente se inocularon colonias aisladas en medio LB suplementado con
ampicilina 50 g/ml, y se crecieron hasta alcanzar una densidad ptica de 0.6. En este
punto las bacterias se mezclaron con glicerol hasta una concentracin final del 15 %.
Los gliceroles se guardaron a -80 C.

4.2.4. Cuantificacin de protenas mediante cido bicinconnico.
Para cuantificar la concentracin de protenas totales se emple el kit Pierce
BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, EE.UU.) de acuerdo a las indicaciones del
fabricante. Se prepar una curva de calibracin de BSA con concentraciones desde 0 a
1000 g/mL. Se aplicaron 25 l de cada calibrador o muestra en una placa de 96
pocillos, se adicionaron 200 l de mezcla BCA (reactivo A y B mezclados en
proporcin 50:1) y se ley la placa a 562 nm en espectrofotmetro SPECTROstar
NANO (BMG LABTECH, Alemania). La concentracin de las muestras se determin a
travs del software de anlisis de datos MARS Data Analysis Software (BMG
LABTECH, Alemania).

4.2.5. Precipitacin de protenas.
Para cada muestra de protena, se adicion 0.1 volumen de deoxicolato de sodio
15 mg/ml, se dio vrtex a la mezcla y se incub a temperatura ambiente durante 10
minutos. Se adicion 0.1 volumen de TCA 72 % y se centrifug a 10.000 rpm durante
15 minutos. Se elimin el sobrenadante, se adicion 1 volumen de acetona fra, y se
centrifug a 10.000 rpm durante 5 minutos. Se elimin el sobrenadante y el precipitado
se sec al aire durante 30 segundos. Finalmente el precipitado resultante se resuspendi
en agua de biologa molecular (Brown y col, 1989).
35

4.2.6. Electroforesis de protenas en condiciones reductoras y anlisis de geles.
La electroforesis se realiz en una cmara vertical MiniProtean II (Bio-Rad,
EE.UU.) y el gel se prepar segn se indica en la Tabla N2. La muestra se mezclaron
en una proporcin 4:1 con tampn de carga 4x, se calentaron a 100 C por 5 minutos y
posteriormente se cargaron en gel de poliacrilamida al 15%. La electroforesis se realiz
en tampn de corrida, a 130 V dentro del gel concentrador, y 150 V una vez que el
frente de corrida entr en el gel separador (fuente de poder para electroforesis Consort
EV202) (Laemmli, 1970).
La preparacin de los geles de Tris-Tricina/SDS-PAGE se realiz de acuerdo al
protocolo que se indica en la Tabla N3. Las muestras se mezclaron en una proporcin
2:1 con tampn de carga Tris-Tricina, se calentaron a 37C durante 15 minutos, y se
cargaron 10 ul de muestra en los carriles del gel concentrador. La electroforesis se
realiz en tampn de corrida, a 30 V dentro del gel concentrador, y 200 V una vez que el
frente de corrida entrar en el gel separador (Schgger, 2006).
El revelado del gel se realiz con solucin de tincin durante 30 minutos en
agitacin lenta. Posteriormente los geles se destieron en solucin de destincin,
durante toda la noche en agitacin constante.
El nivel de pureza de las muestras se determin mediante densitometra ptica
empleado un escner de imgenes MFC-7460DN (Brother, EE.UU.) y el programa
ImageJ v1.46. Se emple el mismo programa para determinar el peso molecular
aproximado del hEGF.

4.2.7. Crecimiento bacteriano y optimizacin de expresin de Factor de
Crecimiento Epidrmico humano.
Se establecieron las condiciones ptimas que maximizan la expresin de Factor
de Crecimiento Epidrmico humano.



36





Reactivo Gel separador 6%
Gel Concentrador
15%
H
2
O 2.6 ml 1.4 ml
Acrilamida 30% /
Bisacrilamida 1%
1 ml 3 ml
*
1.5 M Tris-HCl pH 8.8 /
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
1.25 ml 1.5 ml
SDS 10% 50 l 60 l
PSA 10 % 50 l 60 l
Temed 10 l 12 l
Tabla N 2. Protocolo para la preparacin de gel de poliacrilamida al 15 %.
*
Se utiliz 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 para la preparacin del gel separador, y
0.5 M Tris-HCl pH 6.8 para el gel concentrador.








37







Reactivo Gel separador 4%
Gel Concentrador
16%
Acrilamida/Bisacrilamida
(49.5% T/3% C)
1 ml 10 ml
Tampn Gel
3 ml 10 ml
Glicerol
--- 3 g
Agua (Volumen Final)
12 ml 30 ml
PSA 10 %
90 l 100 l
Temed
9 l 10 l
Tabla N 3. Protocolo para la preparacin de gel discontinuo de Tris-
Tricina-poliacrilamida al 16 %/4%.







38

4.2.7.1. Determinacin de la concentracin de IPTG ptima para la sobreexpresin
de hEGF.
Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido
pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementado
con ampicilina 50 g/ml, y se incub en agitacin a 37 C durante 12 h. Se inocularon
15 l en 5 ml de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a
37 C hasta alcanzar una densidad ptica de 0.4 0.6. Se adicion IPTG a
concentraciones finales de 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM, y los cultivos se crecieron durante
2 horas. Estos se centrifugaron a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los
precipitado hmedos, y se resuspendieron en H
2
O. La expresin de hEGF se analiz en
un gel de poliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada
condicin de crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la
intensidad de la banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de
crecimiento, y se dividi por la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin
inducir.

4.2.7.2. Determinacin del tiempo de induccin ptimo para la sobreexpresin de
hEGF.
Se inocularon 50 l de glicerol de bacterias transformadas con el plsmido
pET-22b(+)-hEGF-6xArg en un precultivo de 5 mL de medio LB lquido suplementado
con ampicilina 50 g/ml, y se incub a 37 C durante 12 h. Se inocularon 15 l en 5 ml
de medio LB lquido suplementado con ampicilina 50 g/ml, y es incub a 37 C hasta
alcanzar una densidad ptica de 0.4 0.6. Se adicion IPTG hasta la concentracin final
determinada en el paso anterior. Los cultivos se crecieron durante 1, 2, 4 y 6 horas. Se
centrifugaron los cultivos a 6.000 rpm durante 10 minutos, se pesaron los precipitado
celulares, y se resuspendieron en H
2
O. La expresin de hEGF se analiz en un gel de
poliacrilamida al 15 % aplicando en cada pocillo 30 g de clulas de cada condicin de
crecimiento. El gel se analiz mediante densitometra, se determin la intensidad de la
banda correspondiente a hEGF-6xArg en cada condicin de crecimiento, y se dividi por
la intensidad de la banda de hEGF-6xArg en el control sin inducir.
39

4.2.8. Extraccin y purificacin de cuerpos de inclusin.
El cultivo celular inducido se centrifug a 8.000 rpm durante 10 minutos. El
precipitado celular obtenido fue resuspendido en tampn de ruptura en una relacin de
10 ml por 1 litro de cultivo, e incubado en hielo durante 1 hora. Se lisaron las clulas
mediante pulsos de sonicacin de 1 minuto a 100 % de amplitud, empleando un
sonicador Q700 SONICATOR (Qsonica, EE.UU.). La eficiencia de la ruptura celular se
optimiz empleando diferentes cantidades de pulsos de sonicacin, y se cuantific
mediante conteo de colonias en diluciones seriadas.
Posteriormente, el lisado celular se centrifug a 11.000 rpm durante 15
minutos, el precipitado obtenido se resuspendi en H
2
O, y se cuantificaron las protenas
totales mediante BCA. La suspensin se centrifug a 11.000 rpm durante 15 minutos, se
lav el precipitado en tampn de ruptura, y finalmente se centrifug a 11.000 rpm
durante 15 minutos.

4.2.9. Solubilizacin y renaturacin de hEGF mediante Cromatografa de Lecho
Expandido.

4.2.9.1. Determinacin de la concentracin de Urea.
Se solubilizaron 0.01 g de cuerpos de inclusin en solucin de solubilizacin
con concentraciones crecientes de urea (1 - 8 M), a modo de alcanzar una concentracin
final de 1.26 mg/ml. Las suspensiones se agitaron a 160 rpm a temperatura ambiente
durante 6 horas. Posteriormente se centrifug a 12.000 rpm durante 20 minutos. Las
fracciones solubles obtenidas en cada condicin se analizaron en geles SDS-PAGE al 15
%, y se determin el porcentaje de hEGF solubilizado mediante densitometra.
La renaturacin de los cuerpos de inclusin se realiz mediante un
procedimiento de replegamiento acoplado a una matriz de lecho expandido de
intercambio inico Streamline sp. Para realizar este procedimiento se determinaron las
condiciones ptimas que maximicen la interaccin de hEGF con la matriz.
40

4.2.9.2. Determinacin de la variacin del pH y concentracin de sales sobre la
capacidad de unin de la matriz.
Se tomaron 500 l de matriz Streamline sp y se mezclaron con 500 l de
tampn de equilibrio preparado a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0). Se adicionaron 500 g
de protenas solubilizadas, y la suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador
Revolver Lab Rotator Tube Mixer (Labnet, EE.UU.). Se extrajo el sobrenadante que
contiene las protenas no unidas a la matriz, y esta se lav en tampn de equilibrio
durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB) a distintos pH (6.5, 7.0, 7.5, 8.0), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se
extrajo el sobrenadante que contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no
unidas y eluidas fueron precipitadas y analizadas en un gel SDS-PAGE al 15 % por
triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y
recuperacin de hEGF en cada condicin.
Paralelamente se mezclaron 500 l de matriz Streamline sp y tampn de
equilibrio suplementado con concentraciones crecientes de NaCl (50, 100, 150 y 200
mM). Se adicionaron 500 g de protenas solubilizadas, y la mezcla se agit durante 1
hora. Posteriormente se extrajo el sobrenadante, y la matriz se lav en tampn de
equilibrio durante 15 minutos. Se adicion 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB), se agit durante 30 minutos, y se extrajo el sobrenadante. Las muestras de
protenas no unidas y eluidas se precipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 %
por triplicado. Mediante densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y
recuperacin de hEGF en cada condicin.

4.2.9.3. Determinacin del efecto de la cantidad de protena soluble cargada sobre
la capacidad de unin de la matriz.
Se tomaron cantidades crecientes de matriz Streamline sp (0.0438, 0.0675,
0.0988, 0.148, 0.222, 0.333 y 0.5 ml) y se mezclaron con 0.5 mg de hEGF solubilizado
y 285 l de buffer de equilibrio preparado a pH y concentracin de NaCl determinados
anteriormente. La suspensin se mezcl durante 1 hora en un rotador Revolver Lab
Rotator Tube Mixer (Labnet. EE.UU.). A continuacin se extrajo el sobrenadante que
41

contiene las protenas no unidas a la matriz, y la matriz se lav en tampn de equilibrio
durante 15 minutos. La matriz se mezcl con 1 ml de tampn de elucin (1 M NaCl, 25
mM PPB), y se agit durante 30 minutos. Finalmente se extrajo el sobrenadante que
contiene las protenas eluidas. Las muestras de protenas no unidas y eluidas se
precipitaron y analizaron en un gel SDS-PAGE al 15 % por triplicado. Mediante
densitometra se determin el porcentaje de enriquecimiento y recuperacin de hEGF en
cada condicin.

4.2.9.4. Purificacin de hEGF solubilizado a escala preparativa.
Para la purificacin de hEGF se emplearon 30 ml de matriz Streamline sp
cargados dentro de una columna cromatogrfica C16/40. Esta se conect a un detector
de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-Rad, EE.UU.), que permite detectar la
presencia de protenas en el efluente de la columna cromatogrfica, mediante medicin a
absorbancia a 280 nm. Las etapas de equilibrio y carga de la matriz se realizaron
mediante un flujo ascendente que permitiera expandir la matriz al doble de su volumen
original. A su vez, las protenas no unidas se eliminaron de la matriz mediante un lavado
de flujo ascendente. Finalmente las protenas unidas a la matriz se eluyeron a travs de
un gradiente de NaCl en flujo descendente. En la Figura N3 se presenta un esquema del
procedimiento de replegamiento en matriz de lecho expandido. Las fracciones que
contienen las protenas no unidas y eluidas se analizaron mediante SDS-PAGE al 15%.

4.2.10. Escisin de pptido 6xArg terminal y purificacin mediante cromatografa
de intercambio inico.
El hEGF renaturado se concentr y dializ contra tampn de diafiltracin,
para lo cual se emple un Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device compuesto por una
membrana de 3 kDa (Merck, Alemania). Se dializ la muestra tres veces en tampn de
diafiltracin, y se llev a un concentracin final de 150 ug/ml.



42







Figura N 3. Metodologa de replegamiento de protenas en matriz de lecho expandido.
Las tres primeras etapas del procedimiento cromatogrfico, equilibrio, aplicacin de la
muestra, lavado y renaturacin se realizan mediante un flujo ascendente. La velocidad
de este flujo debe ser tal que permita expandir la matriz hasta el volumen deseado. La
expansin de la matriz favorece la separacin espacial de las molculas denaturadas, con
el fin de impedir la generacin de los eventos de re-agregacin. Una vez renaturada la
molcula, esta es eluida mediante un flujo descendente.







43

Se elimin el pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal mediante
tratamiento con tripsina. Se determin la cantidad de solucin de tripsina necesaria para
eliminar completamente el pptido C-terminal, para lo que se realizaron digestiones
analticas de hEGF-6xArg mezclado con cantidades decrecientes de solucin de tripsina
(12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8 y 0.4 g de tripsina). La mezcla se incub a 30C durante 15
minutos, y la digestin se detuvo por medio de precipitacin de las muestras. Estas se
analizaron en un gel SDS-PAGE al 15%, y mediante densitometra se determin el
rendimiento de recuperacin final de hEGF luego del paso de tratamiento con tripsina.
Finalmente, la muestra de hEGF digerida fue purificada empleando la matriz
de intercambio catinico GigaCap S-650. Para realizar esto primero se determinaron las
condiciones que favorecieran la purificacin de hEGF, y a continuacin se realiz un
purificacin a escala preparativa. La matriz GigaCap S-650 se empaquet dentro de una
columna XK 16/20 conectada a un detector de luz ultravioleta Econo UV Monitor (Bio-
Rad, EE.UU.). Se colectaron los efluentes que contenan las fracciones de protenas no
unidas a la matriz y eludas, y estas se analizaron en un gel Tricina-SDS-PAGE al 16.5%
T/4% C. Mediante densitometra se determin el rendimiento de recuperacin y la
pureza final de hEGF purificado.

4.2.11. Determinacin de la capacidad de hEGF para estimular la proliferacin
celular.
Se evalu la actividad biolgica del hEGF generado mediante el proceso
establecido, determinando su capacidad de estimular la proliferacin de la lnea celular
de fibroblastos de ratn 3T3 (Choi y col, 2012).
Las clulas 3T3 se mantuvieron a 37C en 5% de CO
2
, en medio DMEM
suplementado con 10% de SFB y estreptomicina/penicilina/anfotericina.
Para determinar la capacidad proliferativa de hEGF, las clulas 3T3 se
sembraron en placas de 24 pocillos a una densidad de 5.000 clulas/pocillo en 400 l de
medio DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de que las clulas se adhirieron a la
placa (10 horas), se estimul la proliferacin celular adicionado varias concentraciones
de hEGF y hEGF-6xArg (0 a 500 ng/ml) en medio DMEM sin SFB. Luego de 48 horas,
44

las clulas se tripsinizaron y se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo
de exclusin con Azul de tripan (Strober, 2001). Los pocillos se contaron tres veces, y
cada condicin experimental se evalu en cuadruplicado (n = 4). La significancia de los
datos se evalu mediante una prueba t-student.
Adicionalmente, se midi la estimulacin de la proliferacin en el tiempo.
Para esto, las clulas 3T3 se sembraron en placas de 12 pocillos a una densidad de
20.000 clulas/pocillo, y se incubaron a 37C durante 12 horas en 1 ml de medio
DMEM suplementado con 10% SFB. Luego de este periodo, las clulas se cultivaron en
presencia de hEGF a una concentracin final de 10 ng/ml, o en ausencia de este (control
negativo), en medio DMEM suplementado con 0.5% SFB. A los 1, 3, 5 y 7 das post-
tratamiento se cont el nmero de clulas viables mediante un ensayo de exclusin con
Azul de tripan (Strober, 2001). Las condiciones se evaluaron en triplicado (n = 3), y
cada pocillos se cont tres veces. La significancia de los datos se evalu mediante una
prueba t-student.















45

5. RESULTADOS

En este trabajo de tesis se realiz la estandarizacin de un proceso de produccin
para la generacin de Factor de Crecimiento Epidrmico humano. Para esto se dise
una variante del Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a un pptido de 6
residuos de arginina en su extremo C-terminal, con el fin de facilitar el proceso de
replegamiento y purificacin de la molcula. Se emple el organismo procarionte
Escherichia coli como sistema de expresin, y se construy un vector plasmdico que
contena la secuencia gnica codificante para la protena en cuestin. A su vez, se
establecieron las condiciones ptimas de crecimiento y expresin del hEGF, junto con
los procedimientos cromatogrficos empleados para realizar el replegamiento y
purificacin del hEGF. Finalmente se comprob la actividad biolgica del hEGF
generado a travs del proceso establecido, mediante un estudio de actividad
proliferativa.

5.1. Generacin de la secuencia gnica codificante para el Factor de Crecimiento
Epidrmico humano.
Con el fin de sobreexpresar el hEGF fusionado a un pptido de 6 residuos de
arginina en su extremo C-terminal en el organismo procarionte Escherichia coli, se
construy un vector de expresin donde la traduccin de hEGF estuviera controlada por
el promotor de la ARN polimerasa del fago T7. Para realizar esto, el segmento de ADN
que codifica para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano con la secuencia de 6
residuos de arginina se extrajo del vector comercial mediante digestin con las enzimas
de restriccin XhoI y NdeI. La banda resultante se insert en el vector de expresin
bacteriano pET-22b(+) linealizado con las mismas enzimas de restriccin, generndose
el plsmido pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Los clones positivos derivados de este paso de
clonacin se detectaron mediante anlisis de restriccin con las endonucleasas XhoI y
NdeI. En la Fig.4 se representan de los pasos de clonacin y el anlisis de restriccin del
plsmido resultante pET-22b(+)-hEGF-6xArg.
46


Figura N 4. Generacin de una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento
Epidrmico humano. (A) Representacin de los pasos seguidos para la construccin de
una secuencia codificante para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a
6 residuos de arginina en su extremo C-terminal. hEGF-6xArg, secuencia codificante
para el Factor de Crecimiento Epidrmico humano fusionada a 6 residuos de arginina;
Prom T7, promotor de ARN polimerasa de fago T7; Term T7, terminador de ARN
polimerasa de fago T7; f1, origen de replicacin; AmpR, gen de -lactamasa; ori, origen
de replicacin en bacteria del plsmido pBR322; lacI, represor lac. (B) Chequeo de
restriccin del vector plasmdico pET-22b(+)-hEGF-6xArg. Carril 1: vector pET-22b(+)
digerido con Xho I/Nde I (banda esperada: 5206 pb); Carril 2: patrn de peso molecular
1 kb; Carril 3: vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg digerido con Xho I/Nde I (bandas
esperadas: 5206 y 239 pb).
47

La correcta insercin del segmento de ADN correspondiente al gen de hEGF se
evidenci en el anlisis de restriccin al obtenerse la banda insertada de 239 pb y el
segmento de aproximadamente 5206 pb correspondiente al vector inicial linealizado
(Fig. 4B, carril 3).

5.2. Optimizacin de la expresin del Factor de Crecimiento Epidrmico humano.
Luego de transformar el vector pET-22b(+)-hEGF-6xArg en bacterias E. coli
BL21-CodonPlus(DE3)-RIL, se indujo la sobreexpresin de hEGF-6xArg mediante la
adicin del inductor IPTG al medio de cultivo. Esto indujo la produccin de una protena
con una movilidad electrofortica de aproximadamente 8.6 kDa en un gel SDS-PAGE al
15%, correspondiente a hEGF-6xArg (Fig. 5A, carril 3). El tamao de la protena
generada concord con el peso molecular terico de 8.8 kDa determinado empleando la
herramienta online Compute pI/Mw presente en el servidor Expasy
(http://web.expasy.org/compute_pi/). Por el contrario, las clulas no inducidas con IPTG
no expresaron la protena de inters (Fig. 5A, carril 2).
Con el objetivo de optimizar los niveles de expresin de hEGF-6xArg sin alterar el
crecimiento celular, se determin la concentracin de IPTG y el tiempo de induccin
mnimo necesario para obtener la mayor expresin de la protena. El anlisis de la
expresin de hEGF-6xArg a diferentes concentraciones de IPTG (desde 0.1 hasta 5
mM), durante un tiempo de induccin constante de una 1 hora, revel que el efecto de la
concentracin de inductor sobre de la sobreexpresin de hEGF-6xArg fue mnimo (Fig.
5B). De esta forma, se escogi 0.5 mM de IPTG como concentracin para la induccin
de hEGF-6xArg. A continuacin, para determinar el tiempo de induccin ptimo se
analiz la expresin de hEGF-6xArg en bacterias inducidas a una concentracin final de
0.5 mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas. En este caso, el tiempo de induccin tuvo una
influencia significativa en la expresin de hEGF-6xArg durante las 4 primeras horas. La
expresin de la protena se increment progresivamente junto con el tiempo de
induccin, alcanzando su meseta a las 4 horas.
48


Figura N 5. Optimizacin de las condiciones de induccin para la expresin de hEGF-
6xArg. (A) Anlisis de la expresin de hEGF-6xArg mediante SDS-PAGE al 15%,
Carril1: Patrn de peso molecular, Carril 2: Bacterias E. coli no inducidas con IPTG,
Carril 3: Bacterias E. coli inducidas con IPTG. (B) Efecto de la concentracin de inductor
sobre la expresin de hEGF-6xArg. Cultivo inducidos a concentraciones finales de 0.1,
0.2, 0.5, 1, 2 y 5 mM de IPTG, durante 1 hora a 37C. Los valores representan el cociente
entre la intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de
banda de hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis
estadstico se realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, * p 0.05. (C) Efecto
del tiempo de induccin sobre la expresin de hEGF-6xArg. Las bacterias inducidas a 0.5
mM de IPTG durante 1, 2, 4 y 6 horas a 37C. Los valores representan el cociente entre la
intensidad de banda de hEGF-6xArg en cada tratamiento, y la intensidad de banda de
hEGF-6xArg en control negativo, la desviacin estndar. El anlisis estadstico se
realiz acorde a una prueba de Mann-Whitney; n = 3, * p 0.05.
49

En este tiempo se alcanz la mxima expresin de hEGF-6xARg, que result ser
2.1 veces mayor que la alcanzada a 1 hora de induccin (Fig. 5C). De esta forma, las
condiciones que maximizaron la expresin de hEGF-6xArg fueron 0.5 mM de IPTG y 4
horas de induccin. Posteriormente estas condiciones se extrapolaron a cultivos
bacterianos discontinuos de 1 litro de medio LB suplementado con 50 g/ml de
ampicilina. Bajo estas condiciones se alcanz un nivel de expresin de hEGF-6xArg del
23% de las protenas celulares totales, equivalente a 100 mg/L cultivo (Tabla N4).

5.3. Ruptura celular y extraccin de cuerpos de inclusin.
Con el objetivo de extraer desde el citoplasma bacteriano los cuerpos de inclusin
que contienen el hEGF-6xArg, se realiz una ruptura celular mediante sonicacin, en
pulsos de 1 minuto a 100% de amplitud, y se optimiz la eficiencia de la ruptura celular
evaluando viabilidad celular luego de aplicar distintas cantidades de pulsos de
sonicacin. Este anlisis revel que el nmero del nmero de clulas viables disminuy
de forma progresiva a medida que las clulas se sometieron a un mayor nmero de
pulsos de sonicacin, logrndose un 99.99% de eficiencia de ruptura a los 10 pulsos
(222 UFC/mL) (Fig. 6A). A continuacin las fracciones de protenas solubles e
insolubles se separaron mediante centrifugacin a alta velocidad (11.000 rpm), lo que
permiti eliminar algunos contaminantes de los cuerpos de inclusin, incrementndose
la pureza de hEGF-6xArg a un 28% (Fig. 6B). Finalizado el proceso de ruptura celular
se logr alcanzar un rendimiento de recuperacin de 80% de las protenas totales, y un
100% de hEGF-6xArg (Tabla N5). Por lo tanto, el proceso de lisis celular permiti
aumentar la pureza de los cuerpos de inclusin, y no afect a la recuperacin de estos
mismos.

5.4. Solubilizacin de cuerpos de inclusin.
Con la finalidad de determinar la concentracin necesaria de Urea para optimizar
la eficiencia de solubilizacin de hEGF-6xArg, se evalu la solubilidad de los cuerpos
de inclusin a concentraciones desde 1 a 8 M del agente caotrpico.

50






Figura N 6. Optimizacin de la eficiencia de la ruptura celular. Las bacterias se
trataron con pulsos de sonicacin de 1 minuto a 100% de amplitud. (A) Determinacin
del nmero de pulsos necesarios para maximizar la ruptura celular. Se cuantific la
eficiencia de la ruptura celular mediante conteo de UFC (unidades formadoras de
colonias)/mL luego de realizar 4, 6, 8 y 10 pulsos de sonicacin. (B) Anlisis de la
eficiencia de la ruptura celular mediante SDS-PAGE al 15%. Carril 1: Patrn de peso
molecular. Carril 2: Protenas solubles presentes en el sobrenadante de la ruptura celular.
Carril 3: Protenas insolubles (cuerpos de inclusin) presentes en el precipitado de la
ruptura celular.




51

Adems, para evitar la formacin de puentes disulfuro inter e intramoleculares, se
emple el agente reductor DTT a una concentracin final de 5 mM. Mediante un anlisis
en un gel SDS-PAGE al 15% se determin que la solubilidad de hEGF-6xArg se vio
incrementada de forma gradual con el aumento en la concentracin del agente
caotrpico, la cual alcanz su mximo a una concentracin final de 8 M de Urea y 5 mM
de DTT (Fig. 7A, carril 8). Bajo estas condiciones se logr alcanzar un porcentaje de
recuperacin de 90% del hEGF-6xArg total (Fig. 7B). No obstante, este paso de
solubilizacin dio como resultado la denaturacin del hEGF-6xArg a un estado
desplegado, por lo cual fue necesario realizar un procedimiento de renaturacin que
permita reestructurar la molcula a su estado nativo.

5.5. Renaturacin y purificacin de hEGF-6xArg mediante Cromatografa de
Lecho Expandido.
Con el objetivo de renaturar el hEGF-6xArg a su estado nativo original, se realiz
un procedimiento de renaturacin acoplado a una matriz de lecho expandido.

5.5.1. Determinacin de pH y concentracin de NaCl.
Con el fin optimizar la interaccin de hEGF-6xArg a la matriz, y evitar la unin
de protenas bacterianas, se determin la capacidad de unin de la protena de fusin y
las protenas contaminantes a la matriz Streamline sp a distintos valores de pH. Segn
este anlisis se determin que el aumento en el pH del tampn de equilibrio gener un
incremento en la adsorcin de hEGF-6xArg a la matriz, lo que se vio reflejado en un
aumento uniforme del porcentaje de recuperacin, desde un 70% a 82% de la protena
(Fig. 8A). Por otro lado, si bien no se evidencio diferencia significativa entre las
distintas condiciones, este aumento en el pH gener una disminucin en la adsorcin de
protenas contaminantes a la resina, que se tradujo en una leve tendencia de aumento en
la pureza final de la protena, desde 25% hasta 32% (Fig. 8B).
52


Figura N 7. Optimizacin de la eficiencia de solubilizacin de cuerpos de
inclusin. (A) Evaluacin de la solubilidad de hEGF-6xArg en un gel SDS-
PAGE al 15%, mediante tratamiento con DTT 5 mM y distintas
concentraciones de Urea. Carril 1-8: hEGF-6xArg solubilizado en DTT 5 mM
y Urea 1-8 M. (B) Determinacin del porcentaje de hEGF-6xArg solubilizado
mediante tratamiento con DTT 5 mM y Urea 8 M. Se grafica el promedio
desviacin estndar de cinco experimentos de solubilizacin independientes.
El anlisis estadstico se realiz acorde a una prueba de Mann Whitney; n = 5,
** p 0.01.
53


Figura N 8. Determinacin del efecto de la variacin de pH en tampn de equilibrio
sobre la capacidad de unin de la matriz. (A) Efecto de pH sobre la capacidad de unin
de hEGF-6xArg a la matriz, representado como porcentaje de recuperacin de la
protena. (B) Efecto del pH sobre la capacidad de unin de las protenas contaminantes a
la matriz, expresado como porcentaje de pureza de hEGF-6xArg. (C) Gel SDS-PAGE al
15% empleado para realizar el anlisis densitomtrico. El porcentaje de rendimiento se
calcul comparando la intensidad de banda del hEGF-6xArg en cada condicin contra la
intensidad de banda de hEGF-6xArg presente en la muestra de entrada. La pureza se
determin comparando la intensidad de banda de hEGF-6xArg contra la intensidad total
del resto de las bandas. El anlisis estadstico se realiz acorde a un ANOVA y una
prueba de comparaciones mltiples de Bonferroni para cada uno de los muestreos
realizados. n = 3; *** p 0.0001; ** p 0.01 y * p 0.05.
54

A su vez se analiz el efecto del NaCl sobre la capacidad de unin de hEGF-
6xArg a la matriz, y la interaccin de esta con las protenas contaminantes. Por medio de
este anlisis se determin que al aumentar la concentracin de NaCl en el tampn de
equilibrio desde 50 hasta 250 mM, se produjo una reduccin en la adsorcin de las
protenas a la matriz, que se tradujo en una disminucin progresiva en la recuperacin de
hEGF-6xArg (desde 84% hasta 68%) (Fig. 9A). Asimismo, el aumento en la
concentracin de NaCl caus un incremento significativamente lineal en el nivel de
pureza de hEGF-6xArg, alcanzando un 48% a los 250 mM de NaCl (Fig. 9B).

5.5.2. Determinacin de capacidad de carga de matriz de lecho expandido.
Una vez establecidas las condiciones de equilibrio de la matriz, se determin la
capacidad de carga ptima de la matriz. Para esto se cargaron cantidades crecientes de
protena solubilizada y se evalu el porcentaje de recuperacin y pureza de hEGF-
6xArg. El anlisis de la fraccin eluida evidenci un incremento paulatino en la
recuperacin y pureza final de la protena a medida que disminuy la relacin masa de
protena/volumen de matriz desde 11.4 mg/mL hasta 1 mg/mL. El incremento se gener
de forma sigmoidal, alcanzado meseta en el rango de 1.5 1 mg protena/ml matriz,
donde el porcentaje de recuperacin y pureza llegaron valores cercanos al 70% y 60%,
respectivamente (Fig. 10A y B).

5.5.3. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg a escala preparativa.
Con la finalidad de realizar la purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg, la
fraccin de protenas solubilizadas se someti a un proceso cromatogrfico de
renaturacin en matriz de lecho expandido. Para realizar este procedimiento se
emplearon las condiciones experimentales determinadas anteriormente (pH 8.0 y
capacidad de carga de 1.5 a 1 mg/ml), y se prepar una columna C16/40 con 30 ml de
matriz Streamline sp. El hEGF-6xArg se carg en la matriz a una razn de 1 mg/ml de
matriz mediante la aplicacin de un flujo ascendente que expandiera la matriz al doble
de su volumen.

55


Figura N 9. Determinacin del efecto de la variacin en la concentracin de NaCl en
tampn de equilibrio sobre la capacidad de unin de la matriz. (A) Efecto de la
concentracin de NaCl sobre la capacidad de unin de hEGF-6xArg a la matriz,
representado como porcentaje de recuperacin de la protena. (B) Efecto de la
concentracin de NaCl sobre la capacidad de unin de las protenas contaminantes a la
matriz, expresado como porcentaje de pureza de hEGF-6xArg. (C) Gel SDS-PAGE al
15% empleado para realizar el anlisis densitomtrico. El porcentaje de rendimiento se
calcul comparando la intensidad de banda del hEGF-6xArg en cada condicin contra la
intensidad de banda de hEGF-6xArg presente en la muestra de entrada. La pureza se
determin comparando la intensidad de banda de hEGF-6xArg contra la intensidad total
del resto de las bandas. El anlisis estadstico se realiz acorde a un ANOVA y una
prueba de comparaciones mltiples de Bonferroni para cada uno de los muestreos
realizados. n = 3; *** p 0.0001; ** p 0.01 y * p 0.05.
56


Figura N 10. Determinacin del efecto de la variacin en la cantidad de protenas
solubles cargadas sobre la capacidad de unin de la matriz. (A) Efecto de la variacin en
la cantidad de protenas solubles cargadas, sobre la capacidad de unin de hEGF-6xArg
a la matriz, representado como porcentaje de recuperacin de la protena. (B) Efecto de
la variacin en la cantidad de protenas solubles cargadas, sobre la capacidad de unin
de las protenas contaminantes a la matriz, expresado como porcentaje de pureza de
hEGF-6xArg. (C) Gel SDS-PAGE al 15% empleado para realizar el anlisis
densitomtrico. El porcentaje de rendimiento se calcul comparando la intensidad de
banda del hEGF-6xArg en cada condicin contra la intensidad de banda de hEGF-6xArg
presente en la muestra de entrada. La pureza se determin comparando la intensidad de
banda de hEGF-6xArg contra la intensidad total del resto de las bandas. El anlisis
estadstico se realiz acorde a un ANOVA y una prueba de comparaciones mltiples de
Bonferroni para cada uno de los muestreos realizados. n = 3; *** p 0.0001; ** p 0.01
y * p 0.05.
57

La matriz se equilibr con 5 volmenes de solucin de denaturacin, con la
finalidad de evitar la generacin de eventos de replegamiento prematuros al momento de
cargar las protenas solubilizadas en la matriz. Se realiz la renaturacin de hEGF-6xArg
mediante lavado con 5 volmenes de tampn de renaturacin I, y 5 volmenes de
tampn de renaturacin II. A continuacin, las protenas adheridas a la matriz de forma
inespecfica se eliminaron por medio de elucin con 4 volmenes de tampn de lavado
(Fig. 11B, carril 3). Las protenas unidas a la matriz se eluyeron a una concentracin de
NaCl de 500 mM, obtenindose un peak nico en el cromatograma (Fig. 11A). El
anlisis de la fraccin eluida en un gel SDS-PAGE al 15% revel la presencia de una
banda mayoritaria, con un patrn de migracin cercano a los 8.6 kDa, correspondiente a
hEGF-6xArg, cuya pureza en la fraccin eluida fue de un 90% de las protenas totales
(Fig. 11B. carril 4). El rendimiento de recuperacin global durante este paso
cromatogrfico fue de 72 mg hEGF/l de cultivo bacteriano (72%), y un 81% de
recuperacin de la masa total de protenas cargadas a la matriz (Tabla N4).
Si bien este paso de renaturacin y purificacin permiti obtener hEGF-6xArg
con un alto nivel de pureza y rendimiento, fue necesario asegurar que la molcula fuera
biolgicamente activa. Debido a esto se hizo necesaria la eliminacin del pptido 6xArg,
debido a que este puede interferir en la interaccin de la protena con su receptor.

5.6. Escisin de pptido 6xArg C-terminal.
Con el objetivo de eliminar el pptido compuesto por 6 residuos de arginina
ubicado en el extremo C-terminal del hEGF, se procedi a realizar un tratamiento con la
enzima Tripsina. En primer lugar se diafiltr el hEGF-6xArg obtenido del proceso de
replegamiento en matriz de lecho expandido. Esto se realiz con el objetivo de eliminar
el NaCl presente en el medio, y dejar la protena en una solucin con pH entre 7 9, de
tal manera que se favorezca la actividad cataltica de la enzima. De esta forma, se
diafiltr contra tampn fosfato de potasio pH 7.4 suplementado con 50 mM NaCl, se
ajust la concentracin de hEGF-6xArg a 150 g/ml, y se digiri la protena con
cantidades crecientes de Tripsina (0.4, 0.8, 1.6, 3.2, 6.4 y 12.8 g de tripsina).
58



Figura N 11. Purificacin y replegamiento de hEGF-6xArg mediante cromatografa de
lecho expandido en matriz Streamline sp. (A) Cromatograma del procedimiento de
purificacin y replegamiento en matriz de lecho expandido. (B) Anlisis de los distintos
efluentes obtenidos durante el procedimiento de purificacin mediante SDS-PAGE al
15%. Carril 1: muestra de entrada (protenas solubilizadas). Carril 2: protenas no unidas
a la matriz. Carril 3: protenas lavadas a 200 mM NaCl. Carril 4: protenas eluidas en
500 mM de NaCl.

59

Como se esperaba, el tratamiento con tripsina gener la aparicin de la banda con
un movilidad electrofortica de aproximadamente 6.7 kDa, correspondiente a la forma
digerida de hEGF-6xArg. En el anlisis electrofortico en un gel SDS-PAGE al 15% se
comprob que el aumento en la cantidad de enzima tripsina gener una disminucin
gradual en la presencia de hEGF-6xArg, y un aumento de hEGF. Sin embargo este
efecto se observ solo hasta aproximadamente 223.7 g de tripsina/mg de hEGF-6xArg
(Fig. 12, carril 4). La mayor recuperacin de hEGF se logr con 112 g de tripsina/mg
de hEGF-6xArg (Fig. 12, carril 6), donde se alcanz un 67% de recuperacin de la masa
total de protena originalmente digerida (Tabla N4).
Si bien la enzima tripsina permiti eliminar el pptido 6xArg, su utilizacin
signific la adicin de un nuevo contaminante a la muestra de hEGF, por lo cual fue
necesario idear una estrategia para separarla de la protena de inters.

5.7. Purificacin final de hEGF mediante cromatografa de intercambio catinico
y ultracentrifugacin.
Con el propsito de eliminar la enzima tripsina empleada para escindir el pptido
6xArg, junto con las trazas de hEGF-6xArg no digerido, se realiz un ltimo paso de
purificacin cromatogrfica. Para esto se emple una resina de intercambio catinico y
se determinaron las condiciones que favorecieran la purificacin de hEGF.
En primer lugar se analiz la interaccin de la enzima tripsina con la matriz
GigaCap S-650 (Tosoh Bioscience, Japn) a distintos valores de pH. Por medio de este
anlisis se comprob que a medida que se increment el pH del tampn de equilibrio, se
gener una disminucin en la interaccin de la enzima con la matriz, disminuyendo su
retencin a medida que el pH se acercaba a la neutralidad (Fig. 13A). Debido a este
comportamiento, la mxima retencin a la matriz se alcanz a un valor de pH 6.0 (Fig.
13A, Carril 2 y 3).


60






Figura N 12. Escisin de pptido 6xArg ubicado en el extremo C-terminal de hEGF. El
hEGF obtenido del proceso de replegamiento (29 g) se digiri con cantidades
crecientes de tripsina en reacciones separadas, a 30C durante 15 minutos. Las muestras
se analizaron mediante un gel SDS-PAGE al 15%. Carril 1: Patrn de peso molecular,
Carril 2: hEGF-6xArg no digerido, Carril 3-8: hEGF-6xArg + 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8 y
0.4 g de tripsina, respectivamente.





61


Figura N 13. Purificacin final de hEGF. (A) Purificacin de tripsina a escala
analtica a distintos valores de pH. Carril 1: Patrn de peso molecular, Carril 2, 4 y
6: Protenas no unidas a pH 6.0, 6.5 y 7.0, respectivamente, Carril 3, 5 y 7:
Protenas eludas a pH 6.0, 6.5 y 7.0, respectivamente. (B) Purificacin a escala
preparativa de hEGF. Carril 1: Patrn de peso molecular, Carril 2: hEGF digerido +
Tripsina, Carril 3: fraccin de protenas no unidas, Carril 4: fraccin de protenas
eludas. (C) Cromatograma de la purificacin de hEGF. (D) Purificacin por
ultracentrifugacin en membrana de 10 kDa. Carril 1: Patrn de peso molecular,
Carril 2: muestra filtrada (hEGF).
62

Por lo tanto, para realizar la purificacin final de hEGF se carg la protena a una
razn de 2 mg/ml de matriz GigaCap S-650 (Tosoh Bioscience, Japn) previamente
equilibrada con 5 volmenes de PPB 25 mM, pH 6.0. Las protenas unidas a la matriz se
eluyeron a 500 mM de NaCl. El anlisis en un gel de Tricina-SDS-PAGE al 16% de los
efluentes obtenidos del proceso de purificacin evidenci la presencia de una banda
mayoritaria de 6.7 kDa en la fraccin de protenas no unidas, correspondiente al hEGF
(Fig. 13B, carril 4), y otra banda de 25 kDa en la fraccin de protenas eludas,
correspondiente a la enzima tripsina (Fig. 13B, carril 5). Mediante este procedimiento se
logr obtener hEGF con un rendimiento global del 42%, y un 100% de recuperacin de
las protenas cargadas a la matriz, y con un nivel de pureza del 97% (Tabla N4).
Si bien la pureza de hEGF fue elevada, aun despus del ltimo paso purificativo se
detect la presencia de protenas contaminantes con una movilidad electrofortica
superior a los 60 kDa. Por lo tanto para eliminar estos contaminantes se realiz un
procedimiento de ultrafiltracin en una membrana con tamao de poro de 10 kDa.
Mediante esta metodologa se logr obtener hEGF con un nivel de pureza del 99%,
determinado mediante densitometra en un gel Tricina-SDS-PAGE (Fig. 13D).

5.8. Determinacin de la actividad mitognica de hEGF en una lnea celular de
fibroblastos de ratn.
Con el objeto de comprobar el correcto plegamiento de hEGF, y por tanto que la
protena fuera biolgicamente activa, se evalu su capacidad para inducir proliferacin
celular en la lnea de fibroblastos de ratn 3T3. A su vez se compar la actividad
proliferativa de hEGF y hEGF-6xArg, con la finalidad de comprobar si el pptido 6xArg
alter la capacidad de interaccin de la protena con el receptor ErbB-1.
El tratamiento con hEGF claramente gener una estimulacin significativa en la
proliferacin celular, lo que se evidenci a travs del aumento en el nmero de clulas
de manera dosis-dependiente. El mximo crecimiento celular se alcanz a la
concentracin de 50 ng/ml, donde el nmero de clulas aumento 3.8 veces con respecto
a la condicin sin hEGF (Fig. 14A).
63


Figura N 14. Ensayo de actividad proliferativa in vitro en lnea celular de fibroblastos
de ratn 3T3. (A) Determinacin de la capacidad de hEGF y hEGF-6xArg para estimular
la proliferacin celular a distintas concentraciones. Los valores representan el promedio
de 4 conteos celulares la desviacin estndar. El anlisis estadstico se realiz acorde a
una prueba de Mann-Whitney. (* Comparacin con condicin 0 ng/ml; * comparacin
entre hEGF y hEGF-6xArg). (B) Variacin de la actividad proliferativa de hEGF en el
tiempo. Los valores representan el promedio de 9 conteos celulares la desviacin
estndar. El anlisis estadstico se realiz acorde a una prueba t de Student; *** p
0.0001; ** p 0.01 y * p 0.05.
64

Por otro lado, se comprob que hEGF-6xArg fue capaz de estimular la
proliferacin celular de forma similar a hEGF, con una diferencia levemente significativa
en el nmero de clulas alcanzadas a concentraciones saturantes del crecimiento celular
(50 y 100 ng/ml) (Fig. 14A). Mediante un ajuste sigmoidal de los datos, se determinaron
los valores de ED
50
para ambos tratamientos, que fueron iguales a 10.4 y 16.3 ng/ml,
respectivamente.
A su vez se determin la capacidad de hEGF de inducir proliferacin celular en el
tiempo. Luego del tercer da de tratamiento con hEGF, se gener un aumento
significativo en el nmero de clulas con respecto al control negativo, efecto que se
mantuvo hasta el da 7, donde el tratamiento con hEGF indujo un aumento del nmero
celular cuatro veces mayor al control negativo (Fig. 14B).















65







Paso de
purificacin
Total de
protenas (mg)
Rendimiento de
protenas (%)
hEGF
(mg)
Rendimiento
de hEGF (%)
Pureza
(%)
Lisis celular 420 100 100 100 23
Solubilizacin 268 63 89 89 33
EBA 80 30 72 72 90
Digestin 51 63 41 41 80
Purificacin
final
42 82 41 41 97
Ultrafiltracin 41 98 41 41 99
Tabla N 4. Resumen del nivel de pureza y rendimiento de recuperacin de hEGF en
cada paso del proceso de produccin.







66



Figura N15. Diagrama esquemtico del
proceso de produccin de hEGF a partir de
cuerpos de inclusin expresado en
Escherichia coli.

67

6. DISCUSIN

El Factor de Crecimiento Epidrmico es una macromolcula que ha adquirido una
gran relevancia mdica en los ltimos aos, debido a su capacidad de inducir
proliferacin en un amplio nmero de tipos celulares, principalmente en aquellos que
controlan el proceso de cicatrizacin y regeneracin de tejidos. Desde la dcada de los
80s, se desarroll una variedad de estudios, tanto en modelos animales como ensayos
clnicos en humanos, que avalan el potencial teraputico de esta citoquina (Borges y
col., 1994; Alemdaroglu y col., 2006; Kwon y col., 2006; Berlanga-Acosta y col., 2009).
Debido a la capacidad mitognica que posee sobre las clulas epiteliales y
endoteliales, el EGF tiene el potencial de estimular significativamente el proceso de
cicatrizacin, tanto en heridas agudas (quemaduras superficiales), como crnicas. Dentro
de esta ltima categora se destacan las heridas ulcerosas, las que surgen debido a un
desequilibrio en el proceso de cicatrizacin. Las principales causas que originan este tipo
de afecciones son la obesidad y la diabetes (Snchez y col., 2001), enfermedades que
actualmente presentan una alta incidencia a nivel nacional y mundial (Encuesta Nacional
de Salud, 2009-2010). Por otro lado, el EGF tiene la capacidad de estimular la
restauracin del tejido gastrointestinal, demostrndose su potencial teraputico en el
tratamiento de la enterocolitis necrotizante, el sndrome de Zollinger-
Ellison y lceras gastroduodenales (Martnez-Carpio, 2003). Otras
aplicaciones que aun requieren ms investigacin son la utilizacin de
EGF en nefrologa para el tratamiento de necrosis tubular aguda, y en
oftalmologa para el tratamiento de daos en el epitelio corneal (Wong
y col., 2001).
Las numerosas aplicaciones teraputicas existentes para el Factor de Crecimiento
epidrmico han despertado un gran inters en desarrollar nuevos mtodos para producir
EGF a gran escala, mediante procesos eficientes y econmicamente viables. En un
principio esta molcula se obtena desde orina animal o humana, e implicaba la
utilizacin de sistemas de purificacin basados en anticuerpos monoclonales acoplados a
una matriz cromatogrfica, o metodologas que involucraban la utilizacin de mltiples
68

pasos de purificacin. En ambos casos, los rendimientos de obtencin fueron muy bajos
(3 al 5 %), lo que sumado a la baja concentracin de EGF en la orina, daba como
resultado la obtencin de cantidades cercanas a los 200 g de protena (Starkey y col,
1975; Gregory, 1975).
El desarrollo de la ingeniera gentica permiti solucionar el problema relacionado a
la baja disponibilidad de EGF en la orina humana. Entre los principales sistemas de
expresin que se han empleado para producir hEGF se encuentran las cepas de levaduras
genticamente modificados como Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y
Hansenula polymorpha (Heo y col., 2002). Por otro lado, el hecho de que hEGF sea una
protena monomrica, de bajo peso molecular y carente de modificaciones post-
traduccionales, permite que esta protena se exprese en organismos procariontes como
Escherichia coli (Su y col., 2006). Sin embargo, el ambiente reductor existente en el
citoplasma bacteriano impide la formacin de puentes disulfuro presentes en las
protenas, los cuales generalmente son cruciales en la actividad biolgica de las
protenas (Fahnert y col., 2004). Debido a este problema, aquellas protenas que
presentan puentes disulfuro en su estructura, como hEGF, generalmente se expresan en
el citoplasma y luego se transportan al espacio periplmtico, mediante la adicin de una
secuencia aminoacdica que dirige la exportacin (Su y col., 2006). Entre las secuencias
que se han empleado para dirigir la secrecin de hEGF se encuentras las seales de
secrecin de protenas bacterianas como OmpA, -lactamasa, Fosfatasa alcalina y Caf1
(Tong y col., 2001, Ebrahimi y col., 2004, Liu y col., 2006).
En la industria biofarmacutica, el nivel de pureza exigido para la produccin de
protenas teraputicas para uso humano en organismos procariontes se encuentra entre el
97 y 99%, debido a la presencia de endotoxinas y molculas antignicas (Walsh, 2003).
Con el fin de mejorar el nivel de pureza de hEGF, se ha expresado como una protena de
fusin a eptopes de afinidad como FLAG, 6xHis (pptido de 6 residuos de histidina) y
SUMO (Small Ubiquitin-related Modifier) (Abdull y col., 2006; Su y col., 2006; Lee y
col., 2000). Estos eptopes permitieron producir hEGF con un alto rendimiento y pureza,
sin embargo su utilizacin se encuentra protegida bajo patentes de invencin (US
8034910, US 4851341 A). No obstante, con la finalidad de asegurar un nivel de pureza
69

ptimo para la utilizacin teraputica de hEGF, la mayora de los procesos de
produccin de esta citoquina se basan en la utilizacin de Cromatografa Lquida de Alta
Eficiencia (HPLC) como paso final de purificacin (Lee y col., 2003). Si bien esta
tcnica asegura la obtencin de la molcula con un elevado nivel de pureza (>99%), su
implementacin es costosa y encarece en gran medida el proceso de produccin (Heo y
col., 2002; Lee y col., 2003; Ferrer y col., 2003; Esipov y col., 2008).
Los pptidos aminoacdicos policatinicos, compuestos por residuos de arginina o
lisina, tambin se emplean para la purificacin de protenas recombinantes debido su
capacidad de incrementar el punto isoelctrico (pI) de la protena a la que se encuentra
fusionada. Por lo tanto, a valores de pH alcalino (valores de pH 7-9) se genera un
aumento en la fuerza de interaccin electrosttica entre la protena de fusin y la matriz
de carga negativa, aumentando la adsorcin de esta en la resina (Sassenfeld y Brewer,
1984), y disminuyendo la captacin de las protenas bacterianas, debido a que el 90% de
estas poseen valores de pI entre 4 y 7 (Grslund y col., 2000). Este sistema fue
establecido el ao 1984 por Sassenfeld y Brewer, para la purificar -urogastrona humana
(o hEGF) fusionada a un pptido de 5 residuos de arginina en su extremo C-terminal.
Dicho procedimiento de purificacin result efectivo, permitiendo obtener hEGF con un
nivel de pureza >95% y un rendimiento de purificacin del 40%, sin embargo, la
cantidad final de protena producida fue inferior a 2 mg/L de cultivo (Sassenfeld y
Brewer, 1984).
En el presente trabajo, con la finalidad de estandarizar un nuevo proceso para la
produccin de Factor de Crecimiento Epidrmico humano, que evite la utilizacin de
pptidos de afinidad protegidos por patentes de invencin, y tcnicas de purificacin de
elevado costo como HPLC, se construy una variante de hEGF unida en su extremo C-
terminal a un pptido compuesto por 6 residuos de arginina. A partir de este constructo
se dise un proceso de produccin basado en la sobreexpresin de la protena en forma
de cuerpos de inclusin, en la implementacin de un sistema de replegamiento mediante
cromatografa de lecho expandido, y en un paso de purificacin final por medio de
cromatografa de intercambio inico y ultrafiltracin. Mediante este procedimiento
70

conformado por tres pasos de purificacin se logr obtener hEGF con un rendimiento
del 41% (41 mg/L cultivo), y un nivel de pureza del 99%.
6.1. Sobreexpresin de hEGF-6xArg en forma de cuerpos de inclusin en
Escherichia coli.
La sobreexpresin de hEGF-6xArg se realiz mediante el sistema de vectores de
expresin bacteriana pET, que permite regular finamente la expresin de la protena de
heterloga mediante la adicin de IPTG al medio de cultivo (Srensen y Mortensen,
2005). El clonamiento del gen que codifica para la protena de fusin se realiz mediante
digestin del vector pET-22b(+) y ligacin con la secuencia gnica de hEGF-6xArg.
Comprobamos la correcta insercin del gen mediante anlisis de restriccin del vector,
identificndose dos bandas de 239 pb y 5206 pb, correspondiente al gen de hEGF-6xArg
y el vector inicial linealizado (Fig. 4B).
Con el fin de expresar hEGF-6xArg, se transform el vector de expresin pET-
22b(+)-hEGF-6xArg en la cepa Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL. Esta cepa
bacteriana, adems de poseer los elementos regulatorios para controlar la expresin de la
protena de inters (gen lacI y el promotor lacUV5 controlando la expresin del gen de
T7 ARN polimerasa), posee copias extras de los genes codificantes para los ARNt argU,
ileY, and leuW, y carece de la expresin de las proteasas Ion y ompT. Todos estos
elementos demostraron que es posible alcanzar niveles de expresin de la protena
heterloga de 20 a 50% de las protenas totales (Srensen y Mortensen, 2005). Debido a
estas caractersticas, elegimos esta cepa como la ms adecuada para establecer nuestro
sistema de expresin.
La optimizacin de las condiciones de expresin de hEGF-6xArg nos permiti
alcanzar un nivel de expresin del 23% de las protenas totales, equivalente a 100 mg de
hEGF-6xArg/L cultivo (Tabla N4). Este nivel de expresin result ser superior al
alcanzado mediante otras metodologas que implicaban expresin citoplasmtica de la
protena (Lee y col., 2000; Ferrer y col., 2003; Su y col., 2006). Por otro lado, se ha
logrado alcanzar niveles de expresin de hEGF superiores mediante exportacin al
periplasma (200 a 400 mg/L cultivo), no obstante, estos procedimiento implicaron largos
tiempos de induccin (20 a 48 horas) (Sivakesava y col., 1999; Lee y col., 2003). Sin
71

embargo, y en la mayora de los procesos que implican la exportacin al periplasma, los
niveles de productividad de hEGF han sido bajos (1 a 20 mg/mL cultivo) (Huang y col.,
1999; Zhinan y col., 2000; Ebrahimi y col., 2004; Liu y col., 2006). La diferencia en los
niveles de expresin citoplasmtica y periplsmica pueden deberse a la existencia de un
elevado nivel de enzimas proteolticas presentes en el espacio periplsmico, las que
degradan la protena de fusin una vez que esta ha sido exportada (Srensen y
Mortensen, 2005). Si bien dentro del espacio citoplasmtico existe un mayor nmero de
enzimas proteolticas, cuando la protena heterloga se expresa en forma de agregados
insolubles intracelulares, esta se encuentra protegida de la degradacin enzimtica, lo
que da como resultado un nivel de produccin mayor al que se obtiene mediante
expresin periplasmtica, durante el mismo tiempo de induccin (Upadhyay y col.,
2012). Por lo tanto, nuestros resultados estn en concordancia con los niveles de
productividad alcanzados mediante expresin en forma de cuerpos de inclusin, debido
a la proteccin contra la degradacin proteoltica que se logra cuando se forman los
agregados proteicos.
Posteriormente realizamos la ruptura celular mediante pulsos de sonicacin, lo que
permiti lisar la totalidad de la poblacin celular, y liberar los cuerpos de inclusin (Fig.
6A). Debido a la elevada densidad especfica de los cuerpos de inclusin, estos pueden
ser separados del material soluble mediante pasos de lavado con agentes denaturantes y
centrifugacin a alta velocidad (8.000 a 10.000 g), lo que se traduce en una disminucin
considerable en la presencia de protenas contaminantes (Panda, 2003). Si bien los
cuerpos de inclusin se separaron del material soluble mediante centrifugacin a 11.000
rpm, este paso no signific un aumento sustancial en el nivel de pureza de hEGF-6xArg,
el que aument slo a un 28% (Fig. 6B, Tabla N4). Este porcentaje podra aumentarse
mediante un procedimiento de lavado con detergentes inicos y bajas concentraciones de
agentes caotrpicos, con la finalidad de eliminar el material soluble que interacciona
inespecficamente con los cuerpos de inclusin, como se ha descrito anteriormente
(Misawa y Kumagai, 2000; Fahnert y col., 2004).

72

6.2. Solubilizacin de cuerpos de inclusin y renatuacin de hEGF-6xArg mediante
adsorcin en matriz de lecho expandido.
La solubilizacin de los cuerpos de inclusin se realiza generalmente en una
solucin concentrada de un agente caotrpico como urea o cloruro de guanidinio (Gdn-
HCl), el cual genera una disrupcin en las fuerzas intramoleculares no covalentes que
mantienen la estructura secundaria y terciara de la protena (Fahnert y col., 2004). En el
caso de protenas que contienen puentes disulfuro, como hEGF, la estructuracin de los
cuerpos de inclusin se estabiliza por la formacin de enlaces disulfuro
intermoleculares, que reduce la solubilidad de estos agregados. Por lo tanto, la adicin
de un agente reductor como ditiotreitol, glutatin, cistena o -mercaptoetanol ayuda a
mantener los residuos de cistena en un estado reducido (-SH), evitando la formacin de
enlaces disulfuro, y facilitando la solubilizacin de los cuerpos de inclusin (Misawa y
Kumagai, 2000).
Bajo estas condiciones de solubilizacin, logramos alcanzar la mxima solubilidad
de hEGF a una concentracin final de urea de 8 M (Fig. 7A), no obstante, no se logr
solubilizar el 100% de la protena (Fig. 7B). El rendimiento de solubilizacin podra
aumentarse mediante un lavado previo de los cuerpos de inclusin, aumentando el
volumen de tampn de denaturacin, e incrementado la temperatura durante el proceso
de solubilizacin (Fahnert y col., 2004).
Con la finalidad de recuperar el hEGF en su forma biolgicamente activa, fue
necesario renaturar la protena a su estado nativo. Este procedimiento se realiza
mediante la remocin de los agentes denaturantes que mantienen a la protena en un
estado desplegado. Debido a su sencillez y bajos costos de implementacin, los mtodos
ms utilizados para realizar este procedimiento son la dilucin y dilisis (Misawa y
Kumagai, 2000). No obstante, estos procedimientos son difcilmente escalables, y el
rendimiento de replegamiento generalmente es bajo, debido a los eventos de re-
agregacin que se generan producto de las interacciones hidrofbicas entre los
intermediarios de plegamiento (Choi y col., 2005). Por otro lado, los mtodos de
replegamiento mediante adsorcin en matriz favorecen la renaturacin proteica. Este
procedimiento se realiza mediante la adsorcin de la protena denaturada a un soporte
73

slido (matriz), que permite mantener separadas las molculas de protena durante el
proceso de renaturacin, minimizndose el problema de la re-agregacin.
Posteriormente, los agentes denaturantes se remueven de la matriz mediante lavado, y
finalmente la protena renaturada se eluye selectivamente de la matriz (Misawa y
Kumagai, 2000). Este proceso de replegamiento puede realizarse mediante adsorcin en
matrices empaquetadas o de lecho expandido. Estas ltimas han demostrado mayor
eficiencia en el proceso de replegamiento, debido a su capacidad de aumentar la
separacin espacial de las molculas de protena durante la renaturacin, eliminndose
completamente el problema de la re-agregacin (Choi y col., 2005, Jin y col., 2006).
Debido a esta ventaja, decidimos emplear la matriz de lecho expandido Streamline
sp para realizar el proceso de replegamiento de hEGF-6xArg. Primero se optimizaron las
condiciones de adsorcin de hEGF-6xArg, estudiando cmo se alteraba la capacidad de
carga de la matriz, y el rendimiento de recuperacin y pureza de hEGF, luego de
modificar el pH, la fuerza inica y la cantidad de protena cargada en la matriz.
1. A medida que se increment el pH en el tampn de equilibrio se gener un
aumento en la adsorcin de hEGF-6xArg, que se tradujo en un incremento del
rendimiento de recuperacin y pureza de hEGF-6xArg (Fig. 8A y B). Podemos
inferir que este fenmeno se debe al elevado punto isoelctrico de hEGF-6xArg
(pI igual a 9.0), que permite que a pH alcalino este mantenga su carga positiva
y sea adsorbido por la matriz, mientras que la mayora de las protenas
bacterianas adquieren un carga neta negativa, por lo que no se adhieren a la
resina.
2. El aumento en la fuerza inica en el tampn de equilibrio produjo una
disminucin paulatina en el rendimiento de recuperacin, y un incremento en la
pureza de hEGF-6xArg (Fig 9A y B). Este fenmeno podra explicarse a travs
de resultados presentados en trabajos anteriores, donde el aumento de la fuerza
inica gener una disminucin en la capacidad de carga de la matriz (Cho y
col., 2001). El aumento en la concentracin de iones Na
+
generara un
desplazamiento de las molculas de hEGF y protenas bacterianas adsorbidas a
74

la matriz, reduciendo la cantidad de hEGF recuperado, y la adsorcin de
protenas contaminantes a la matriz.
3. Al igual que lo que se comprob en estudios anteriores (Choi y col., 2005, Jin y
col., 2006), el rendimiento de recuperacin y pureza de la protena renaturada
aumentan a medida que disminuye la cantidad de protena cargada por volumen
de matriz (Fig. 10 A y B). Este fenmeno se debe a que cuando la cantidad de
protena cargada se mantiene baja, se favorece la adsorcin de hEGF por sobre
la retencin de las protenas bacterianas a la matriz, debido a la fuerte carga
positiva de hEGF.
Teniendo en consideracin los factores mencionados, se estableci el proceso de
replegamiento a escala preparativa. En primer lugar la matriz se equilibrio con tampn
de denaturacin a pH 8.0, con la finalidad de favorecer la adsorcin de hEGF-6xArg en
estado denaturado, y se cargaron 30 mg de protena solubilizada en 30 ml de matriz
expandida al doble de su volumen. A continuacin se realiz la renaturacin de hEGF-
6xArg mediante la eliminacin paulatina de los agentes denaturantes presentes en el
medio, luego de lo cual se eluyeron las protenas adsorbidas de forma inespecfica a la
matriz mediante lavado con 200 mM de NaCl. Finalmente el hEGF-6xArg adsorbido en
la matriz se eluy a una concentracin de 500 mM de NaCl. Este procedimiento permiti
recuperar un 81% de la totalidad de hEGF-6xArg aplicado originalmente a la matriz, el
cual present una pureza del 90% de las protenas totales presentes en la fraccin de
protenas eludas (Fig. 11A y B). Si bien no se evalu el rendimiento de replegamiento
en la fraccin de protena eludas (porcentaje de hEGF renaturado a su estado nativo),
consideramos que este valor es cercano al 80% de la masa total de hEGF-6xArg eluido.
Esta suposicin se basa en resultados obtenidos en trabajos anteriores, donde esta misma
metodologa permiti obtener rendimientos de replegacin superiores al 90%, para
protenas estructuralmente ms complejas que hEGF (Cabanne y col., 2005; Jin y col.,
2006; Alibolandi y col., 2011).

75

6.3. Escisin de pptido 6xArg y purificacin final de hEGF.
Debido a que el pptido 6xArg adicionado al extremo C-terminal de hEGF podra
alterar su capacidad de interaccin con su receptor, se decidi eliminar esta secuencia
mediante protelisis con la endopeptidasa Tripsina. Esta enzima tiene la capacidad de
catalizar la escisin especfica de secuencias polipeptdicas en el extremo C-terminal de
residuos de arginina y lisina ubicados en el interior de una cadena de aminocidos
(Olsen y col., 2004). Mediante una digestin analtica de hEGF-6xArg con distintas
cantidades de esta enzima, se logr establecer que al emplear 110 ug de la enzima /mg
de hEGF-6xArg se alcanz el mayor rendimiento de protelisis, recuperndose un 67%
del hEGF digerido originalmente (Fig. 10). Consideramos que el bajo rendimiento de
recuperacin puede deberse al corte proteoltico en residuos de arginina y lisina
presentes en el interior de la protena. El hEGF posee dentro de su secuencia 2 residuos
de arginina (Arg 41 y 45) y 2 residuos de lisina (Lis 28 y 48), de los cuales slo Arg 41
no presenta su tomo de carbono C-terminal expuesto, de modo que los dems residuos
tienen posibilidad de ser escindidos (Fig. 15). En el ao 1985, Sassenfeld y Brewer
emplearon esta misma estrategia de purificacin, sin embargo ellos utilizaron la enzima
carboxipeptidasa- en vez de tripsina, con lo cual obtenan rendimientos de protelisis
mayores. Esta diferencia puede deberse al hecho de que a diferencia de la tripsina,
carboxipeptidasa- es una exopeptidasa, de modo que solamente escinde el extremo C-
terminal de cadenas polipeptdicas que posean en esta posicin residuos de arginina o
lisina, evitando la protelisis interna (Sassenfeld y Brewer, 1984).
Para eliminar las trazas de hEGF-6xArg no digerido y la enzima tripsina, se realiz
un segundo paso de purificacin cromatogrfica en una resina de intercambio catinico.
Se analiz la adsorcin de la enzima a distintos valores de pH, con lo que determinamos
que la mayor retencin se gener a un valor de pH igual a 6.0 (Fig. 13A). Por lo tanto,
este procedimiento de purificacin se realiz cargando la muestra de hEGF-6xArg
digerido en la matriz GigaCap-650c a pH 6.0. Esta condiciones permitieron que hEGF
no fuera adsorbido por la matriz, mientras que la enzima y las trazas de hEGF-6xArg se
retuvieran completamente a ella.
76





Figura N 16. Sitios de corte reconocidos por la enzima tripsina en la estructura del
Factor de Crecimiento Epidrmico humano. En rojo se muestran los residuos de
arginina o lisina presentes en hEGF, y el azul se identifican los tomos de carbono del
extremo C-terminal de estos residuos.



77

Este comportamiento se debi al elevado punto isoelctrico de la tripsina y hEGF-
6xArg (pI igual a 10.5 y 9.0, respectivamente), que permiti que a pH levemente cido,
ambas protenas adquieran una carga neta positiva, quedando adheridas a la resina de
carga negativa (Fig. 13B, carril 4). El hEGF posee un pI igual a 4.6, por lo que bajo esta
condiciones adquiere una carga neta negativa y no interacciona con la matriz,
permitiendo su paso de forma directa a travs de la resina (Fig. 13B, carril 3). Este
procedimiento permiti recuperar hEGF con un nivel de pureza del 97% de las protenas
totales presentes en la fraccin de protenas no unidas a la matriz.
No obstante, este nivel de pureza no es suficiente para su utilizacin teraputica en
humanos (Walsh, 2003). Por lo tanto, se empleo una membrana con tamao de poro de
10 kDa con la finalidad de eliminar los contaminantes que presentan un peso molecular
superior a 50 kDa (Fig. 13B, carril 3). Mediante este procedimiento se logr obtener
hEGF con un nivel de pureza del 99%, determinado mediante densitometra en un gel
Tricina-SDS-PAGE al 16%. Sin embargo, es necesario emplear alguna tcnica de mayor
sensibilidad, como HPLC, para determinar la pureza de hEGF.

6.4. Caracterizacin biolgica de hEGF purificado.
Para validar finalmente el proceso de produccin de hEGF establecido, fue
necesario determinar la actividad biolgica de esta citoquina. La bioactividad de hEGF
est determinada por la interaccin con el receptor ErbB1 que se encuentra presente en
la membrana plasmtica de las clulas blanco. Por lo tanto, para que pueda generarse
esta interaccin, es necesario que esta citoquina se encuentre en un estado nativo con
correcto plegamiento, el cual est principalmente determinado por la correcta
disposicin de los puentes disulfuro (Carpenter y Cohen, 1990).
La bioactividad de hEGF se determina generalmente a travs de ensayos de
proliferacin celular de dosis respuesta, donde el incremento de la concentracin de la
protena genera un aumento en el nmero de clulas. Este aumento se genera de forma
sigmoidal, de modo que la actividad proliferativa puede ser cuantificada mediante la
determinacin de la dosis efectiva 50 (ED
50
), que se define como la concentracin de
protena necesaria para alcanzar la mitad de la mxima respuesta biolgica (van Zoelen,
78

1990). La bioactividad de hEGF se ha determinado mediante la utilizacin de un amplio
nmero de lneas celulares como A549 (Lee y col., 2000), HEK-293 (Liu y col., 2006),
MCF-7 (Date y col., 2005) y 3T3 (Huang y col., 1999; Su y col., 2006; Choi y col.,
2012; Ruan y col., 2013). La lnea celular 3T3 es la ms empleada para la determinacin
de la capacidad proliferativa de hEGF debido a su sensibilidad a la accin de esta
citoquina, determinada por la elevada cantidad de receptores ErbB1 presentes en la
membrana plasmtica de las clulas (Pandiella y col., 1988).
Por lo tanto, mediante la utilizacin de este modelo de proliferacin celular
comprobbamos que el hEGF producido fue la capacidad de estimular el crecimiento
celular de forma dosis-dependiente (Fig. 12). Mediante el ajuste de los datos a una curva
sigmoidal se determin el ED
50
igual a 10.4 ng/ml, no obstante, este valor se encuentra
por sobre el especificado para versiones comerciales de esta molcula, lo que hace
pensar que la molcula no fue producida en su estado nativo de mxima actividad
biolgica. Alewood y colaboradores, en el ao 2005 determinaron que la ausencia del
puente disulfuro establecido entre los residuos 6-20 genera una notable disminucin en
el ED
50
(desde 0.1 ng/ml a 21 ng/ml), determinado mediante un ensayo de proliferacin
en la lnea celular 3T3 (Alewood y col., 2005). De esta forma, se cree que el proceso de
replegamiento no fue completamente eficiente al momento de reestructurar hEGF a su
estado nativo, generndose una modificacin en la disposicin de los puentes disulfuro,
que provocara una alteracin en la conformacin tridimensional de hEGF, y por ende
una variacin negativa en su actividad biolgica. No obstante, este problema podra
solucionarse ajustando el grado de expansin de la matriz durante el proceso de
replegamiento. Esto se fundamenta a travs del trabajo realizado por Jin y
colaboradores, quienes determinaron que el grado de expansin de la matriz durante el
proceso de renaturacin, determina el plegamiento de la protena, y por ende su
actividad biolgica (Jin y col., 2006).
Al analizar la actividad proliferativa de hEGF-6xArg, comprobamos que esta
variante tambin posee la capacidad de estimular la proliferacin celular, de forma
similar a hEGF (Fig. 12A). Por lo tanto, la presencia del pptido 6xArg en el extremo C-
terminal de hEGF no afectara significativamente su capacidad de interaccin con el
79

receptor ErbB1, permitiendo inducir un aumento en la proliferacin celular. Estos
resultados concuerdan con los presentados en trabajos anteriores, donde la adicin de
pptidos compuestos por residuos de arginina, a los extremos C y N-terminal de hEGF,
no afectaron la bioactividad de la molcula (Choi y col., 2012; Ruan y col., 2013).
En resumen, los resultados que obtuvimos durante este trabajo de tesis validan el
procedimiento de produccin de hEGF. La expresin de esta citoquina en forma de
cuerpos de inclusin en bacterias Escherichia coli dio como resultado un alto niveles de
productividad, debido a la baja degradacin citoplasmtica de hEGF lograda gracias a la
proteccin de la molcula dentro de los agregados insolubles. Mediante una metodologa
de solubilizacin y renaturacin en matriz de lecho expandido logramos renaturar el
hEGF a una estructura similar a su conformacin nativa, lo que se evidencio a travs de
un ensayo de actividad proliferativa in vitro en la lnea celular 3T3. Adems, logramos
establecer un proceso de purificacin de hEGF, consistente en dos pasos de purificacin
cromatogrfica de intercambio inico y un procedimiento de ultrafiltracin, evitando as
la utilizacin de pptidos de afinidad protegidos por patentes de invencin y
metodologas de purificacin costosas como HPLC. El rendimiento de produccin final
de hEGF fue ligeramente superior al alcanzado en trabajos anteriores, no obstante la
metodologa que se estableci implica bajos costos de operacin, y un nmero menor de
pasos purificativos. Por lo tanto, este proceso es econmicamente factible, y tiene el
potencial de convertirse en una eficiente plataforma para la produccin de hEGF en
nuestro pas.

6.5. Proyecciones.
En el futuro pretendemos escalar este proceso de produccin de hEGF a una
produccin a escala piloto. Para esto se implementar la utilizacin de un sistema de
alimentacin continua en fermentadores de alta capacidad, se emplearn procedimientos
de purificacin de mayor capacidad basados en columnas cromatogrficas de mayor
tamao y sistemas automatizados para la recoleccin de los efluentes generados en cada
paso de purificacin, y se utilizarn sistemas de ultrafiltracin de mayor capacidad. De
80

esta forma, se pretende establecer un proceso de bajo costo operacional y alto
rendimiento, para la produccin de hEGF a gran escala.
En cuanto a la utilizacin teraputica de hEGF, nos hemos planteado como futuro
objetivo comprobar la actividad regeneradora de tejidos de la citoquina purificada,
mediante la estandarizacin de modelos de heridas superficiales en animales como
ratones o cerdos. A su vez, pretendemos analizar la capacidad regeneradora de otras
variantes de esta molcula, como hEGF-6xArg, puesto que se ha comprobado que la
adicin de pptidos compuestos por residuos con carga positiva facilita la penetracin de
hEGF en las capas drmicas superficiales de la piel. Una vez comprobada la actividad
biolgica in vivo, esperamos realizar ensayos de actividad regenerativa en pacientes que
presenten tanto heridas agudas como crnicas. Todos estos objetivos tienen como
finalidad avanzar hacia el desarrollo de un nuevo producto farmacutico con capacidad
regenerativa, para el tratamiento de heridas superficiales, quemaduras y principalmente,
lceras de pe diabtico.












81

7. CONCLUSIONES

El proceso de purificacin establecido a travs de la adicin de un pptido
compuesto por 6 residuos de arginina y la utilizacin de resinas de intercambio
catinico, permite alcanzar un nivel de pureza y rendimiento productivo similar al
obtenido a travs de purificacin mediante Cromatografa Lquida de Alta
Eficiencia.

El Factor de Crecimiento Epidrmico humano puede producirse en forma
biolgicamente activa a partir de un proceso de replegamiento en matriz de lecho
expandido.

La variante hEGF-6xArg posee una actividad proliferativa similar a la de hEGF. Por
lo tanto, la presencia del pptido 6xArg en el extremo C-terminal de hEGF no afecta
su actividad biolgica.












82

8. AGRADECIMIENTOS

A los Dr. Jorge Toledo y Oliberto Snchez por guiar el desarrollo de esta tesis con
gran compromiso, dedicacin y responsabilidad. Adems, por permitirme realizar este
trabajo de investigacin bajo su tutela y por contribuir significativamente a mi
formacin cientfica.

A los miembros de los laboratorios de Biofrmacos Recombinantes y Biotecnologa
y Biofrmacos, por su ayuda incondicional y apoyo acadmico.

Al laboratorio del Dr. Juan Carlos Vera, Depto de Fisiopatologa, Universidad de
Concepcin, por su gentileza y disponibilidad.

Y al financiamiento entregado por:
Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad de Concepcin.
Proyecto Innova Bio-Bio de Apoyo a la Realizacin de Tesis de Pre-grado 12.492


83

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