uo Huang, Karen A.

McDonald
Departamento de Ingeniera y Qumica de Materiales Ciencias de la Universidad de California,
Davis, Uno Escudos Avenue, Davis , CA 95616 , Estados Unidos
a r t i c i l e n f o un b s t r a c t
Disponible en lnea 06 de agosto 2011
Palabras clave:
protena heterloga
Cultivo de clulas vegetales
biorreactor
Bioprocesos
Biomanufacturing
Las clulas vegetales se han demostrado para ser un husped de expresin heterlogo
atractiva ( el uso de plantas enteras y
cultivos in vitro de clulas vegetales) para la produccin de protenas extraas en los
ltimos 20 aos. en lquido vitro
cultivos de clulas vegetales en un biorreactor totalmente contenida se han convertido en
una alternativa prometedora a los tradicionales
la fermentacin microbiana y cultivos de clulas de mamferos como una plataforma de
expresin de la protena extranjera , debido a la
caractersticas nicas de las clulas vegetales como anfitrin de produccin, incluyendo la
seguridad del producto , biomanufacturing rentable ,
y la capacidad para protenas complejas modificaciones post -tradicionales. Protenas
heterlogas tales como
teraputicas , anticuerpos , vacunas y enzimas para aplicaciones farmacuticas e
industriales han sido
expresado con xito en los sistemas basados en el cultivo de clulas de plantas de
biorreactores incluyendo desdiferenciado suspendida
clulas de las plantas, musgo y races peludas, etc. En este artculo, el estado actual y las
tendencias emergentes de la clula de la planta
Cultura para la produccin in vitro de protenas extraas se discutir con nfasis en lo tecnolgico
Progreso que se ha hecho en los sistemas de biorreactores de cultivo celular de plantas.
2011 Publicado por Elsevier Inc

1. Introduccin
Biomanufacturing de productos de protena heterloga se ha ganado
cada vez ms importancia debido a la demanda del mercado ampliado para
aplicaciones teraputicas e industriales que conducen al desarrollo
de las plataformas de expresin seguras y rentables alternativas y
tecnologas emergentes (Hacker et al, 2009 ; . Karg y Kallio, 2009).
En la actualidad, varios sistemas de expresin de genes se han desarrollado para
produccin de protenas extraas. Cada sistema ofrece distintas caractersticas
que consiste en la mejora expresin de la protena, facilidad de gentica
calidad de la manipulacin, y la protena (Durocher y Butler, 2009). en
la ltima dcada, la plataforma de expresin a base de clulas de plantas como
sistema de biorreactor ( plantas enteras y in vitro de clulas vegetales , rganos y
cultivos de tejidos ) se han investigado como una alternativa potencial para
la produccin a gran escala de protenas extraas incluyendo producidos por plantas
productos farmacuticos ( PMP ) y productos industriales producidos por plantas ( PMIP )
( Davies, 2010 ; Sharma y Sharma , 2009 ) . Biorreactores de clulas vegetales
proporcionar caractersticas atractivas sobre los sistemas de expresin tradicionales que
utilizar microbiana y las clulas husped de mamfero , incluyendo su intrnseca
clulas de seguridad ( de plantas no se propagan los virus de mamferos y
patgenos y puede ser fcilmente crecido sin derivado animal de cualquier
componentes que son consideraciones importantes para la teraputica
aplicaciones ) , biomanufactura rentable que conduce a la disminucin
costos de produccin ( Shadwick y Doran , 2005 ), y la capacidad para
modificaciones posteriores a la traduccin ( capacidad para producir glicoprotenas
y protenas multimricas complejos con similitud a su nativa
contrapartes en trminos de estructura -N glicanos en comparacin con los mamferos
clulas) ( Gomord et al. , 2010 ) . Las caractersticas de varios anfitrin cellbased
sistemas de expresin de protenas se han discutido ampliamente
( Demain y Vaishnav , 2009 ; . Yin et al, 2007) .
En comparacin con el uso de plantas enteras como una plataforma de produccin , en
cultivos in vitro de clulas de plantas ( clulas vegetales en suspensin , tejido y rgano
culturas, etc ) obtenidas en los sistemas de biorreactores controlables oferta adicional
caractersticas para la produccin de protenas extraas sostenido econmico
( Hellwig et al . , 2004 ), tales como 1 ) los ciclos de produccin ms cortos en que el
escala de tiempo para la produccin de protenas extraas en cultivo de clulas vegetales requiere
das o semanas en comparacin con el mes en plantas transgnicas ; 2) ms
rendimiento de producto de consistencia en lote a lote , la calidad y la homogeneidad
del patrn de protena diana -N glicanos debido a la cultura homognea
de clulas de plantas en condiciones controladas de bioreactor ( De Muynck et al. ,
2010 ; Lienard et al, 2007) . ; 3 ) ms barato y ms simple aguas abajo
la recuperacin y purificacin particularmente para productos secretados en el
medio extracelular y el metabolito secundario inferior y de la clula husped
concentracin de protenas ( Rawel et al, 2007 . ); 4 ) eliminacin de la necesidad
de mano de obra intensiva para el cultivo de invernadero o plantas cultivadas en el campo ;
5 ) reduccin de la contaminacin de endotoxina y de micotoxinas ; 6 ) ms seguro
plataforma de produccin en un sistema de biorreactor cerrado , evitando el flujo de genes
en el medio ambiente y la contaminacin de las cadenas alimentarias ( Franconi
et al. , 2010 ) , y 7 ) la facilidad de cumplimiento de los requisitos de cGMP y
proceso de registro del producto, etc
El notable avance para mejorar la produccin de protenas extraas
rendimiento y calidad a travs de la ingeniera bio-reactor ( Huang y
McDonald, 2009 ) y de la ingeniera gentica enfoques ( Desai et al. ,
2010 ; Streatfield , 2007 ) , tales como una mayor transcripcin del transgn ,
estabilidad despus de la transcripcin y traduccin de eficiencia , se ha demostrado
que el cultivo de clulas de plantas in vitro se convierta en un entorno propicio
tecnologa para Biomanufacturing protenas extraas . En este artculo, el
recientes avances tecnolgicos en los cultivos celulares de plantas a base de biorreactores
para la produccin in vitro de protenas extraas se discutir.
2 . La produccin de protenas de Relaciones Exteriores en el uso de cultivo de clulas vegetales in
vitro
En la actualidad, las protenas extraas que incluyen protenas teraputicas (anticuerpos ,
antgenos , vacunas y protenas de la sangre humana , etc ) , protenas de la especialidad
( por ejemplo, gelatina y colgeno para cpsulas de la droga ) , y enzimas industriales (tales
como celulasas y lipasas para aplicaciones de biocombustibles ) se pueden expresar en la planta
cultivos de clulas , incluyendo clulas vegetales indiferenciadas (como suspendido
clulas de tabaco , arroz y zanahoria, etc ) y los tejidos de la planta y diferenciada
cultivos de rganos (como root musgo y peludo , etc ) ( Holland et al. , 2010 ) .
Un sistema ideal de plantas de clulas de cultivo del biorreactor para la protena extranjera a gran
escala
la produccin debe tener las siguientes caractersticas: 1 ) la facilidad de gentica
manipulacin por cualquiera de transformacin estable o la expresin transitoria , 2 )
alto nivel de expresin de protenas, 3 ) la actividad proteoltica endgena baja, 4 )
alta estabilidad de producto en el medio ambiente expresin heterloga
(dentro y fuera de las clulas) , 5 ) baja concentracin de secundaria
metabolitos (puede causar cambios en las protenas estructurales y biolgicas
propiedades y / o complicar los procesos downstreaming ) , 6 ) postraduccional
capacidad de modificacin, patrn de glicosilacin uniforme y
plegamiento de la protena , y 7 ) dispersin homognea en un biorreactor ,
etc Tabla 1 muestra ejemplos de expresin de la protena extranjera por establemente
transforman los sistemas de cultivo de clulas vegetales . En esta seccin, el estado actual
y las caractersticas de diferentes tipos de clula de la planta basada en biorreactor
Se discutirn las culturas para la produccin de protena extraa.
2.1 . La produccin de protenas de Relaciones Exteriores en las clulas vegetales indiferenciadas
suspendidos
Cultivos en suspensin de clulas vegetales indiferenciadas impulsados por una variedad
de sistemas de expresin de genes , se utilizan comnmente para la protena extraa
produccin ( Huang y McDonald, 2009 ; . Lico et al, 2008 ) debido a la
hecho de que son ms susceptibles a las regulaciones cGMP y pueden ser
cultivada y optimizado fcilmente en biorreactores a gran escala ( Shih y
Doran, 2009 ) . Cultivos en suspensin de clulas vegetales se derivan generalmente de
transformado de manera estable los tejidos vegetales por transformacin mediada por
Agrobacterium .
Clulas de callos iniciados a partir de explantes de plantas transgnicas
pueden ser cultivadas en un medio definido qumicamente para establecer transgnico
cultivos en suspensin de clulas ( Rao et al. , 2009). Generalmente la adicin de
reguladores de crecimiento se requiere en el medio para promover la rpida
crecimiento de las clulas y mantener la morfologa celular .
Recientemente Protalix Biotherapeutics en Israel y Pfizer en los EE.UU.
anunciado una colaboracin para desarrollar y comercializar dicha planta de la
glucocerebrosidasa recombinante ( prGCD ) usando una zanahoria transgnica
suspensin de cultivo celular plataforma biorreactor como un agente teraputico biolgico
drogas de protena para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher en la UE y EE.UU.
( Ratner, 2010 ) . Esto representa un hito emocionante para el reconocimiento de
clula vegetal biomanufacturing basado en la cultura como un bio- equivalente y
alternativa econmica a la produccin de productos biofarmacuticos de mamferos humanos,
lo que sugiere adems la posibilidad de productos bioequivalentes para
frmacos de protenas existentes. En otro acontecimiento prometedor, un recombinante
vacuna animal contra la enfermedad de Newcastle (NDV ) produce en
cultivos celulares de tabaco transgnicas por Dow Agrosciences fue aprobado por
USDA en febrero de 2006 ( Travis, 2008 ) . Ambos representan
avances para el desarrollo de cultivo de clulas vegetales como biomanufacturing
plataforma para la produccin a gran escala de productos de protena extranjera.
Protalix Biotherapeutics ha desarrollado una suspensin zanahoria transgnica
plataforma de cultivo de clulas (llamado ProCellEx ) para la produccin de prGCD para
pacientes con enfermedad del trastorno gentico de Gaucher , un lisosomal rara
la enfermedad , que no son capaces de degradar glucosilceramidas en el cuerpo debido
al hecho de que GCD es ausente o no funcional ( Shaaltiel et al . , 2007 ) .
Actualmente, los pacientes se tratan con ya sea el Ceredase por Genzyme , una

Tabla 1
Seleccin de ejemplos de producciones de protena extranjera por cultivo de clulas vegetales en
diversos sistemas de biorreactores (Huang y McDonald , 2009 ).
Especies de plantas Cultura
tipo
Condiciones de trabajo de nivel de sistema de biorreactor de localizacin sistema Promotor
Producto proteico Produccin Ref .
Nicotiana
benthamiana
suspensin
clulas
AAT Humanos CaMV 35S ( constitutiva ) secretada,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
25 C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , B1 lote g - FAAT / L (sin control de pH ) ,
100 mg - FAAT / L (control del pH)
Huang et al .
( 2009 )
Nicotiana
benthamiana
suspensin
clulas
Sistema XVE inducible AAT Estradiol Humano
( inducible qumica )
secretada ,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
25 C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , por lotes ,
10 M estradiol (single induccin)
b1 g - FAAT / L (sin control de pH ) ,
60 mg - FAAT / L (control del pH)
Huang et al .
( 2009 )
Suspensin N. benthamiana
clulas
Virus del mosaico del pepino AAT humana
vector vrico inducible ( CMViva )
secretada ,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
25 C , 50 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , por lotes ,
10 M estradiol (single induccin)
25 mg - FAAT / L ( sin control de pH) ,
100 mg - FAAT / L (control del pH)
Huang et al .
( 2009 )
Suspensin N. benthamiana
clulas
Virus del mosaico del pepino AAT humana
vector vrico inducible ( CMViva )
secretada ,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
25 C , 50 a 100 rpm , 40 % DO, pH 6,4 , SCC ,
1 M de estradiol ( mltiple de induccin)
600 g - FAAT / L ( control de pH ) Huang et al .
( 2010 )
Oryza sativa ( arroz) Suspensin
clulas
AAT RAmy3D humano ( metablica inducible ) secretada,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
75 rpm , 27 C , 70 % lo hacen , 0,1-0,2 vvm ,
la cultura de dos etapas
40-110 mg / l , 3-12 mg / ( L - da ) ,
4-8 mg / ( g- DCW - da )
Trexler et al .
( 2005 )
O. sativa ( arroz) Suspensin
clulas
AAT humano RAmy3D secretada,
extracelular
biorreactor de membrana
( CELLine )
25 C , 130 rpm , la cultura de dos etapas
( inanicin azcar)
100-247 mg / l , 4-10 % de TSP McDonald et al .
( 2005 )
N. tabacum L.
cv. BY- 2
suspensin
clulas
ASh CaMV 35S secretada,
extracelular
STB , de tono
turbina de pala
26 C , 200 rpm , 20 % DO, 0,1 vvm , lote 3.9 a 4.2 mg / L de Schmale et al .
( 2006 )
O. sativa ( arroz) Suspensin
clulas
ASh RAmy3D secretada,
extracelular
Burbuja columna de 27 C , pH 7 , 1,6 vvm , lote repetido 76,4 mg / L de Huang et al .
( 2005 )
N. tabacum L. Suspensin
clulas
HGM - CSF CaMV 35S secretadas ,
extracelular
Frasco 110 rpm , 12 das , 25 C , lote 105 g / L de Hong et al .
( 2002 )
O. sativa ( arroz) Suspensin
clulas
hGM -CSF RAmy3D secretada,
extracelular
Frasco 110 rpm , 13 das , 27 C , lote 129 mg / l , 25 % de TSP Shin et al . ( 2003 )
Glycine max
(soja)
suspensin
clulas
HBsAg quimricos (AO) 3MAS
( constitutiva )
Intracelular Frasco 120 rpm , 27 C , oscuro , lote 22 mg / L de Smith et al .
( 2002 )
G. max
(soja)
suspensin
clulas
HBsAg Arabidopsis ubiquitina
( constitutiva )
Intracelular , ERretention
Frasco de 80 rpm , 16 h luz / 8 h oscuridad , lote 700 ng / ( g- FCW ) Ganapathi et al.
( 2007 )
patata
( var. Kufri Bahar )
Etileno races peludas HBsAg enzima formando
promotor del gen de pltano
Agitador intracelular Frasco giratoria , oscuridad durante 10 das. 97,1 ng / g- FCW Sunil Kumar
et al . ( 2006 )
N. tabacum cv NT- 1 races peludas ratn mAb IgG CaMV 35S ( pMON 530 ) secretada ,
extracelular
Frasco de 25 C, 100 rpm 1,4 mg / L en 36 das, 1,1 mg / g- DCW Sharp y Doran
( 2001b )
N. tabacum cv NT- 1 Suspensin Mouse mAb IgG CaMV 35S ( pMON 530) secretadas ,
extracelular
Frasco de 25 C, 100 rpm 3,6 mg / l en 5 das, 1,2 mg / g- DCW Sharp y Doran
( 2001b )
Suspensin de zanahoria
clulas
Humano GCD CaMV 35S intracelular
(seal vacuolar )
burbuja desechable
contenedor de la columna
25 C , 0,25 vvm No disponible Shaaltiel et al .
( 2007 ) )
N. tabacum L. cv.
Xanthi
Suspensin antirrbico Humanos
virus mAb
Cadena pesada por CaMV 35S ;
cadena ligera por Pin2p
Intracelular Wave - mezclado y
biorreactor Undertow
25 C 30 g / g - DCW , 0,5 mg / L de Girard et al .
( 2006 )
Hordeum vulgare suspensin de colgeno humano I
alfa 1 cadena
Ubiquitina de Arabidopsis intracelular , ERretention
( HDEL )
Wave - mezclado
biorreactor , discontinuo alimentado
22 C , 0,5 SLPM , 9 ngulo de balanceo ,
10 oscilaciones por minuto.
2 a 9 g / L de Ritala et al .
( 2008 )
N. tabacum cv
Xanthi
Races peludas cadena sencilla
IL-12 murina
35S - dobles mejorada
promotor
Intracelular frasco ; air-lift ; niebla
reactor
25 C , 100 rpm ( matraz ) ; 25 C , 0,1
vvm ( AR y Niebla )
31 g / L- da ( frasco ) , 14 mg / L- da
( AR ) , 22 mg / L- da ( Mist )
Liu et al . , 2009
El musgo Physcomitrella
patens
Protonemal
tejido
VEGF CaMV 35S intracelular 28 m de longitud tubular
fotorreactor
pH 5,8 , 22 C , la perfusin por CFF
con D = 10 o 20 por da ;
360 mg / g- DCW en 30 das ( Lucum y
Posten , 2006 )
Musgo P. patens Protonemal
tejido
VEGF 35S de CaMV ; beta - tubulina
promotor de Physcomitrella
Intracelular STB , impulsor marina ,
500 rpm
pH 4,5 a 7 , 25 C , semiinconsciente con
D en 0.57/day
3 - pliegues rendimiento superior al obtenido
con el promotor 35S de CaMV
Jost et al . ( 2005 )
AR : air-lift ; BC: columna de burbujas ; HACER: oxgeno disuelto ; DCW : peso de clula seca ; FCW
: peso de clulas frescas; ER : retculo endoplasmtico ; D: tasa de dilucin ( 1 por da ) .
STB : biorreactor de tanque agitado ; CFF : filtracin de flujo cruzado ; vvm : volumen de gas por
volumen de cultivo por minuto ; SCC : cultura semicontinuo .
TSP : protena soluble total ; AAT : alfa- 1 - antitripsina ; FAAT : funcional alfa - 1 - antitripsina ;
HSA: albmina de suero humano ; HBsAg : antgeno de superficie de la hepatitis B


Forma de la GCD nativa purificada a partir de tejido de placenta humana, o
Cerezyme de Genzyme, una GCD humana recombinante producida en clulas CHO
Cultivo celular ( Ratner, 2010 ) . Sin embargo, la rGCD purificado a partir de clulas CHO
Cultura requiere adicional en reacciones enzimticas in vitro para exponer la
Residuos de manosa terminales de sus cadenas -N glicanos para facilitar la absorcin de
el MCD en macrfagos. Este complejo processingmakes GCD uno de
las terapias ms costosas hasta la fecha con un costo anual del tratamiento
de cerca de 200.000 dlares EE.UU. por paciente (Kaiser , 2008 ) . El prGCD expres
en cultivo de clulas de zanahoria transgnica a partir de Protalix se fusiona al extremo N -
terminal de
pptido seal de Arabidopsis thaliana endoquitinasa bsica y un C-terminal
vacuolar secuencia fromtobacco quitinasa A. Debido
prGCD se retiene en ER ( retculo endoplasmtico ) durante la glicosilacin
modificacin y entonces dirigido a la vacuola , los N-glicanos se recortan
para exponer los residuos de manosa y la manosa glicosilacin correcta
patrn puede bemade clulas vegetales dentrode . Por lo tanto , la in vitro recorte
de los glicanos se elimina en el procesamiento aguas abajo , dando como resultado
reduccin significativa de costos para in vitro proteinmodification ( Shaaltiel et al. ,
2007 ) . Adems , la vida media de prGCD era ms larga que la de
Cerezyme de Genzyme . Actualmente , prGCD est experimentando una fase III
estudio de ensayo clnico para evaluar su seguridad y eficacia en pacientes de Gaucher .
2.2 . Produccin de protenas extranjera en rgano de la planta diferenciada y tejidos
cultura
La divisin celular de las plantas puede ocurrir ya sea en un patrn no organizado, como en
el crecimiento de callo , o en un patrn organizado con la formacin de
centros meristemticos directamente en los tejidos de explantes para el desarrollo de
en brotes, races o embriones somticos. El tejido vegetal y cultivos de rganos ,
como culturas de races musgo y peludas , se utilizan comnmente para la secundaria
metabolito ( Zhong , 2001 ) y la produccin de protena extraa ( Shih y
Doran, 2009 ) . Debido a que las clulas del rgano de la planta o tejido son totalmente
, la inestabilidad gentica diferenciada observado en planta dediferenciado
no se ha informado de cultivos de clulas . Sin embargo , la morfologa de la planta
cultivos de tejidos y rganos en una bioreactormay complican el biorreactor
operacin y hacen que sea difcil lograr una cultura homognea
medio ambiente.
2.2.1 . Moss y la lenteja de agua en el cultivo in vitro
El ciclo de vida de las patenas musgo Physomitrella , perteneciente a la
Bryophyta phylum , comienza con la germinacin de las esporas , seguido por
el crecimiento de un filamento de clulas ramificado , el protonema ( Decker y
Reski , 2004 ) . Aunque el cultivo in vitro de todas las etapas del musgo
ciclo de vida se ha establecido , el protonema es el ms vegetativo
escenario para la ingeniera gentica y la operacin del biorreactor a gran escala para
produccin de protenas extraas . El musgo se puede cultivar en una chemicallydefined
medio compuesto por sales inorgnicas con la luz y el CO2 como el
fuentes de energa y de carbono en un sistema de biorreactor , proporcionando nico
caractersticas que cumplan los requisitos para la produccin de protenas extraas,
crecimiento celular tan rpido , facilidad de manipulacin gentica y transformacin ,
alta estabilidad gentica , la capacidad de la protena glicosilada hechos a planta
la produccin con los patrones de glicano humanizados no inmunognicos
( Gomord et al, 2010 ; . Gorr andWagner , 2008 ) , y la protena extraa seguro
produccin sin la necesidad de compuestos derivados de animales .
Adems de Protalix mediante el cultivo de clulas de zanahoria transgnica para prGCD
produccin, Biolex Therapeutics es otra empresa que tiene una planta de
cultura - producido frmaco proteico ( interfern alfa - 2b para el tratamiento de
hepatitis C ) a finales de la Fase 2b ensayo clnico hasta la fecha. Biolex ha desarrollado
su LEX SystemSM , que utiliza la cultura acutica Lemna transgnico en un
biorreactor , por biomanufacturing de seguimiento de productos biolgicos ( biosimilares ) ,
difciles de producir protenas teraputicas y anticuerpos monoclonales que son
esperado para mejorar su eficacia y potencia en comparacin con thosemade
en clulas de mamfero ( Ratner , 2010 ) .
2.2.2 . Hairy raz en cultivos celulares in vitro
Races peludas transformadas de muchas especies de plantas han sido
investigado como un sistema de biorreactor clula vegetal alternativa a plantar
cultivo en suspensin de clulas de ambos metabolitos secundarios valiosos ( Giri
y Narasu , 2000 ) y la produccin de protenas extraas ( Georgiev et al. ,
2007 ; Shadwick y Doran , 2007 ) . Races peludas son races neoplsicas
derivada de races de las plantas transformadas por la integracin de los genes de
Ri plsmido de Agrobacterium rhizogenes en el genoma de la planta husped ,
lo que resulta en la proliferacin activa de races peludas ( Chilton et al . , 1982 ) .
Una ventaja nica para el cultivo a gran escala es que las races peludas pueden ser
propaga indefinidamente en medio lquido y retener su morfolgico
la integridad y la estabilidad en la ausencia de crecimiento de la planta exgena
reguladores. Los estudios han demostrado que el cultivo de la raz peluda tiene significativamente
mejora gentica a largo plazo y la estabilidad de biosntesis en comparacin con
las clulas vegetales en suspensin para la produccin de protenas extraas ( agudos y
Doran, 2001b ) . Shadwick y Doran ( 2007 ) utilizaron tipo salvaje races peludas
como un sistema de cultivo in vitro para la propagacin de virus de plantas ,
lo que sugiere la viabilidad de la expresin transitoria basados en virus vegetal en
races peludas .
2.3 . Caractersticas de los cultivos in vitro de clulas vegetales en
Las clulas vegetales presentan caractersticas atractivas para la produccin de protenas extraas
;
sin embargo, su fisiologa biolgica , morfolgica y celular
caractersticas, que son distintivos de microbios y mamferos
cultivos de clulas , deben ser considerados para su escalabilidad en la produccin .
La Tabla 2 resume las caractersticas de los cultivos in vitro de clulas vegetales en como
consideraciones prcticas en el desarrollo de una operacin basada en biorreactor
para la produccin de protenas extraas , incluyendo el crecimiento celular , el oxgeno
demanda , la morfologa y la agregacin , cultura de la propiedad reolgica
y sensibilidad a la cizalladura de cultivos de clulas de plantas, etc El cultivo celular crtico
condiciones, que afectan la productividad de protenas extraas y calidad, y
acoger el crecimiento celular , que tenga que ser optimizada y controlada durante
operacin de biorreactor .
3 . Sistemas de biorreactores para cultivos in vitro de clulas vegetales en
Diferentes diseos de biorreactores ofrecen caractersticas nicas para proporcionar una
ambiente ptimo para el crecimiento celular eficaz y protena extraa
produccin bajo diferentes circunstancias . Disear, seleccionar y operar
un biorreactor adecuado para la produccin de protenas extraas , uno necesita
considerar las caractersticas de los cultivos in vitro de clulas vegetales (Tabla 2 ) y
propiedades de la protena diana , incluyendo el vector de expresin gnica ( constitutiva
o un sistema de promotor inducible ) , la localizacin del producto y la estabilidad innata ,
etc sistemas de biorreactores disponibles para la clula microbiana y de mamfero
la cultura y de las culturas de clulas vegetales para la produccin de metabolitos medicinal
y micropropagations se pueden implementar para la produccin de
protenas extraas en cultivos de clulas de plantas. Adems , la escalabilidad y
condiciones sostenibles del biorreactor systemwhich proporcionar adecuada
mezclando andmass transferwhile minimizar la intensidad esfuerzo cortante
las clulas vegetales se deben considerar para la protena extranjera a gran escala
produccin . En esta seccin, el progreso tecnolgico en biorreactor
se discuten los sistemas in vitro para los cultivos de clulas de plantas en . Tabla 3
se resumen las caractersticas importantes de diversos sistemas de biorreactor in vitro
cultivos de clulas vegetales .
3.1 . Sistemas de biorreactores reutilizables
Sistemas de biorreactor reutilizables , en la que se hacen recipientes de cultivo
de acero inoxidable con una configuracin estndar o modificado , que requiere
esterilizacin in situ (SIP) y sistemas (CIP) de limpieza en el lugar , son
comnmente utilizado en la industria para la clula de mamfero gran escala
la cultura y la fermentacin microbiana, con escalas que van desde
1000 L a 25.000 L en el volumen de trabajo .
3.1.1 . Biorreactores de tanque agitado
Biorreactores de tanque agitado (STB) equipado con impulsores adecuados puede
proporcionar altos coeficientes de transferencia de masa volumtricay una homognea
entorno propicio el crecimiento de clulas vegetales en suspensin y protena extraa







Tabla 2
Caractersticas importantes de cultivos in vitro de clulas vegetales para la seleccin y en el
funcionamiento del sistema de biorreactor .
Caractersticas Consideraciones prcticas para la seleccin y operacin de biorreactor
Crecimiento de las clulas de plantas Espectculos variados cintica de crecimiento celular en
biorreactor (tiempo, td, de 12 a 96 h de duplicacin ) . Tabaco clulas BY- 2 muestran una td ms
corto ( 12 h ) , N. benthamiana y clulas de arroz
expresando AAT en un STB tienen TD de 3 das (Huang et al. , 2010) y 2 das ( Trexler et al. , 2002 ),
respectivamente. Potato raz peluda expresar HBsAg exhibe td de
2,5 das ( Sunil Kumar et al . , 2006 ) .
La demanda de oxgeno celular Planta Tpico NUESTRO es aproximadamente 2-10 mmol -O2 / (
LH). Especfico NUESTRA se reporta como 0,8 mmol -O2 / ( g- DCW -h ) para los cultivos de clulas
de arroz que expresan AAT humana y 0,3-0,5 mmol -
O2 / ( g- DCW -h ) para los cultivos de clulas NT- 1 que expresan GUS.
coeficiente de transferencia de masa volumtrica de oxgeno tpica ( ELK) requerida es entre 10 y
50 h- 1 ( Curtis y Tuerk , 2006 ) , lo que sugiere un oxgeno disuelto crtica
concentracin de 01.03 a 01.06 g/m3 ( es decir, 20 % de saturacin de aire ) ( Doran , 1999 ) .
la transferencia de masa de oxgeno inadecuada puede inhibir el crecimiento celular y reducir la
produccin de protenas extraas ( Sharp y Doran, 2001a ) .
Agregacin y tamao de celda de Plantas
distribucin
Dependiendo de las especies de plantas , preparacin del inculo , la etapa de crecimiento ,
composicin del medio , tipos de biorreactores y operaciones.
agregados celulares promueven la organizacin y diferenciacin celular , lo que lleva a la falta de
homogeneidad de oxgeno , nutrientes o inductores dentro de grandes agregados de clulas y
dando lugar a efectos adversos en la produccin de protenas extraas ( Kieran , 2001 ) .
agregados celulares complican la operacin del biorreactor y hacer los agregados de clulas
susceptibles a la tensin de corte , lo que resulta en dao a las clulas , que se atribuye a la
superficie total
desercin ( Kieran et al. , 2000 ) y la rotura total ( Namdev y Dunlop , 1995 ) .
Propiedades reolgicas Afectados por tamao del agregado celular y morfologa, concentracin
de biomasa , la etapa de crecimiento celular y condiciones de cultivo .
Las clulas vegetales tienden a pasar de esfrica a las formas alargadas cuando la divisin celular
se termina ( Cosgrove, 1997 ) , lo que lleva a mayor PCV a una determinada exposicin DCW y
comportamiento fluido no newtoniano durante el cultivo ( Su y Arias , 2003 ) .
Las clulas vegetales presentan un comportamiento reolgico newtoniano y no se alargan (
clulas permanecieron casi de forma esfrica ) cuando crecen en cultivo semicontinuo .
Viscosidad aparente tpica de caldo de cultivo de clulas es 4-150 cP .
Sensibilidad al cizallamiento estrs Susceptible a esfuerzo cortante cuando las clulas son de
tamao relativamente grande y contienen grandes vacuolas ( Dunlop et al . , 1994 ) .
Las respuestas celulares al estrs incluyen cambios en la viabilidad celular y el metabolismo (
OUR, actividad mitocondrial, nivel de ATP , la composicin de la pared celular , los iones de calcio
en
citoplasma ) y cambios en la morfologa y agregados tamaos ( Kieran et al . , 2000 ) .
Reducir el estrs por la menor velocidad del impulsor conduce a una mala mezcla y suministro
de oxgeno en el cultivo de clulas de alta viscosidad y mejora la agrupacin de clulas en
agregados
de diferentes tamaos . Estrs de cizallamiento crtica es entre 50 y 200 N/m2 ( Kieran et al . ,
1997 ) .
La formacin de espuma y de crecimiento de la pared Las clulas atrapadas en la espuma se
somete a la deficiencia de nutrientes y oxgeno , lo que resulta en el crecimiento celular y la
reduccin de la productividad , y generar una capa gruesa que
se adhiere a la pared del reactor , el eje impulsor y los sensores , lo que dificulta la mezcla a granel
.
La reduccin de la formacin de espuma por 1 ) la reduccin de la velocidad de agitacin y la
velocidad de aireacin sin afectar la mezcla de transferencia de intensidad y de masas, 2 ) la
adicin de reactivos antiespumantes , 3 )
la aplicacin de aireacin superficial o libre de burbujas - aireacin , y 4 ) el uso de un interruptor
de espuma .
de pH para el crecimiento celular pH del medio se ajusta a la gama de 5,0 a 5,9 antes de la
esterilizacin y extremos de pH se evitan en cultivo celular .
Los efectos del pH sobre la estabilidad de protena extraa secretada en el medio extracelular
necesitan ser investigadas .
Temperatura para el crecimiento celular La temperatura se mantiene entre 20 y 28 C para la
induccin de tejidos de callo y el crecimiento de las clulas vegetales .
Diferentes puntos de ajuste de temperatura durante el en el crecimiento celular y la produccin
de protena de fase se puede aplicar para lograr mayores ttulos de productos .
Temperatura y pH gradientes y variaciones debidas a la mezcla no homognea en biorreactor
pueden afectar la calidad del producto .








Tabla 3
Las comparaciones de los sistemas de biorreactores para la produccin de protenas extraas por
cultivos de clulas vegetales (evaluacin relativa entre los sistemas ).
Biorreactor agitado -tank
biorreactor ( STB )
burbuja
columna
Air-lift biorreactor Fix- cama o TIB solo uso STB Wave -mezclado
biorreactor
membrana
biorreactor
Microbioreactor
Caractersticas
kLa ( OTR) Alta Baja Media Baja Baja-media Media Baja Media
El dao celular por agitacin Alto Bajo Bajo Bajo Medio Bajo Bajo Bajo
El dao celular por aireacin Medio Alto Bajo Medio Alto Bajo Bajo Bajo
Tiempo de mezcla Corto Largo Medio Largo Medio Medio Medio Medio Corto
Operacin Medium Simple Simple Complejo simple Medio Medio Medio
Flexibilidad Alto Alto Alto Bajo Medio Medio Bajo Bajo
CIP / SIP S S S S No No No No
Tamao de la escala Comercial Comercial Comercial piloto ( 2000 L ) Pilot ( 1000 L ) Piloto de
Laboratorio .
Complejo ampliacin Medio Fcil Fcil Medio Complejo Complejo Complejo
Consumo de energa Alto Bajo Bajo Medio Medio Medio Bajo Bajo
Tipo de Cultura Susension ;
microsoporte
Suspensin;
microsoporte
Suspensin;
microsoporte
inmovilizado;
inmersin
Suspensin;
microsoporte
Suspensin;
microsoporte
inmovilizado;
inmersin
suspensin
La densidad celular Bajo / Medio Medio Medio Alto Bajo / Medio Medio Alto Medio
Productividad Media Baja Media Baja - Media Media Media Alta Media
Seguimiento y control directo , fcil,
mltiple
Directo , fcil,
mltiple
Directo , fcil,
mltiple
Indirecta , complejo,
limitado
Directo , fcil,
limitado
Directo , medio ,
limitado
Indirecta , complejo,
limitado
Directo , complejo,
limitado
Operacin cost Alto Medio Medio Medio Bajo Bajo Bajo Bajo
Costo de capital Alto Medio Medio Medio Bajo Bajo Bajo Bajo
Facilidad de cumplimiento GMP S S S S S Difcil Difcil No disponible














la produccin a ser controlado constantemente . Aunque las turbinas Rushton
( resultando en un patrn de flujo radial ) puede proporcionar clulas de plantas completas y
de dispersin de gas , que tambin inducen la alta turbulencia alrededor del impulsor
regin y presentan mayor entrada de energa especfica que la otra impellerswith
patrones de flujo axiales ( tales como impulsores marinos , impulsores de cinta helicoidal ,
impulsores de pdel, e impulsores de hoja aguda ) , lo que resulta en una mayor
cizalla dao a las clulas vegetales . La hoja de tono o marinos impulsor con
la hacia arriba - pumpingmode ofrece capacidades similares , en comparacin con la
Rushton impulsor , para la dispersin agregado celular , mientras que la reduccin de cizalla
estrs a las clulas vegetales cuando se necesita la entrada de potencia a ser restringida debido a
consideraciones dao celular ( Doran , 1999 ) . Sin embargo , la masa de oxgeno
rendimiento de la transferencia de un impulsor de paso de pala - hacia arriba de bombeo fue
pobres en cultivos altamente viscosos ( Kieran , 2001 ) , en comparacin con la de
el mismo impulsor operado en el modo de baja de bombeo ( Junker
et al . , 1998 ) . Generalmente, los sistemas de impulsor que muestra patrones de flujo axiales
con una velocidad punta baja (hasta 2,5 m / s ) se consideran adecuados para la clula vegetal
culturas ( Amanullah et al. , 2004 ) .
Los recientes avances continan reduciendo el dao celular de hidrodinmica
esfuerzo cortante por la agitacin y de la ruptura de la burbuja fromgas cuando entra
la cmara de aire a travs de 1 ) el desarrollo de nuevos rodetes y modificar
impulsores existentes para providemore efficientmixing en la punta inferior de la bomba
velocidades , 2 ) el diseo de nuevos sistemas de aireacin (como sin burbujas
aireacin , cesta de gas, y la jaula - aireacin ) para reducir el esfuerzo cortante causado por
burbujas , y 3 ) la adicin de agentes protectores adecuados , etc Nuevo
tipos de impulsores se han desarrollado para el cultivo de clulas sensibles al cizallamiento
procesos, incluyendo la turbina de disco curvado y paletas, de rotor hidroplano ,
impulsores centrfugos y de clulas -lift ( Doran, 1999 ) . Una serie de baja potencia -
impulsores de nmeros como Intermig , Prochem Maxflow y
Scaba diseado para el cultivo de clulas de mamferos se puede implementar para
cultivo de clulas vegetales ( Varley y Birch , 1999 ) . Adems , el biorreactor
especificaciones geomtricas tales como el dimetro del impulsor , el espaciamiento entre
impulsadores, impulsor despacho fuera de fondo , deflectores y su anchura ,
Tipo de rociador y la posicin , relacin entre la altura y el dimetro del tanque de lquido , y
nmero impulsor tambin son crticos para el rendimiento bioreactor a gran escala
para proporcionar una mezcla suficiente y la transferencia de masa adecuada .
Phyton Biotech en Alemania opera la mayor planta de cGMP de theworld
instalaciones de cultivo celular utilizando biorreactores de tanque agitado de acero inoxidable de
hasta 75.000 L
para producir los taxanos y paclitaxel (produccin hasta 880.000 l / ao
capacidad de taxanos ) y ha sido una API ( farmacutico activo
ingrediente ) proveedor de Taxol oncologa de Bristol- Myers Squibb
producto . Phyton Biotech tiene un acuerdo con Insmed , Inc., en la que
Phyton Biotech utiliza sus instalaciones de cultivo de clulas vegetales cGMP a
fabricar el IPLEX ( rinfabato mecasermina ), aprobado por la FDA en
Diciembre de 2005 para el tratamiento del retraso del crecimiento en nios con
factor de crecimiento de insulina - 1 deficiencia primaria o con la hormona del crecimiento
supresin de genes . Phyton Biotech ha logrado avances prometedores hacia
la consecucin de un rendimiento de producto de 2 g de protena / ( caldo L ) ( Lukjan et al . , 2007
) .
3.1.2 . biorreactores neumticas
El biorreactor neumtico ( columna de burbujas y air-lift ) consiste en un
recipiente cilndrico inwhich aire o gasmixture comprimido se introduce en
la parte inferior del recipiente a travs de un burbujeador para la aireacin y el mezclado . la
caractersticas de bajo capital y costos operativos , nomoving piezas mecnicas
y elementos, y la facilidad de ampliacin de sellado son ventajosas para las grandes
cultivos de clulas vegetales escala. La baja tensin de cizallamiento en biorreactores neumticos
es
deseable para las clulas vegetales sensibles al cizallamiento ( Eibl y Eibl , 2008 ) . burbuja
columnas se utilizan a menudo para micropropagations organognicos , sin embargo ,
no son capaces de proporcionar homogenousmixing y son menos aplicables a los
culturas altos de biomasa debido a la menor rea interfacial gas-lquido
resultante de coalescencia de las burbujas en los cultivos viscosos y la falta de
mecnica ruptura de las burbujas. El rendimiento de una columna de burbujas lata
mejorarse mediante la instalacin de mltiples rociadores en diferentes segmentos de
la entrega de oxgeno a las zonas de cultivos de races peludas alta densidad celular en
la columna ( Mishra y Ranjan , 2008 ) .
Air-lift o modificados biorreactores aire elevadoras contienen un tubo de aspiracin (interno
o bucle externo ) exhiben caractersticas mejoradas : Burbuja 1) prevenir
coalescencia orientndolos en una direccin; 2 ) el aumento de oxgeno
la transferencia de masa al aumentar el nmero de burbujas y de gas - lquido
rea interfacial formass transferencia; 3 ) la distribucin de stressmore cizalla uniformemente
y la reduccin de la tensin de cizallamiento ( Mishra y Ranjan , 2008 ); y 4 ) la promocin







la cyclicalmovement de las clulas resultantes en themediumand de mezcla ms cortos
veces ( Huang et al , 2001b ; . . Wang et al , 2002 ) . Para alta densidad celular
culturas, sin embargo , las cuestiones de la transferencia de masa de oxgeno insuficiente y
poormixing que conduce a la falta de homogeneidad en la biomasa , nutrientes , oxgeno y
el pH y la extensa formacin de espuma (que resulta frompolysaccharides , protenas , grasas
cidos y alta velocidad de gas superficial ) estn siendo factores limitantes en
operacin de biorreactor ( Tanaka , 2000 ) . Adems , desigual distribucin de los
cultivos de clulas de alta densidad de clulas o tejidos de la raz peludas en ciertas posiciones y
excesiva canalizacin en fase gaseosa debido a la alta velocidad de aireacin puede causar
aglutinacin de tejido de la raz y la obstruccin del flujo del lquido .
3.1.3 . Biorreactores de lecho fijo
De lecho fijo (o de lecho empacado ) biorreactores se utilizan con frecuencia para
clula vegetal inmovilizada , sistemas de tejidos de plantas o de rganos diferenciados . para
la aplicacin de cultivos de clulas , las clulas se inmovilizan en apropiada
microsoportes ( Gilleta et al , 2000 ; . Medina- Bolvar y Cramer , 2004 ) ,
que se envasan en las zonas fijas y hay una gran lquido-slido
reas de contacto interfaciales especficas . Amediumreservoir se utiliza para hacer circular
el medio nutritivo oxigenada a travs de la cama y el gastado
medio que contiene el producto que devuelve al depsito puede ser
cosechado en modo discontinuo o continuo . Las principales desventajas de la
biorreactores de lecho fijo son su relativamente pobre transferencia de masa y calor
debido a la capacidad de bajas velocidades del lquido . Biorreactores de lecho fijo tienen
aplicaciones que se muestran en cultivos de clulas animales de perfusin ( Meuwly et al. ,
2007 ) , donde las clulas se inmovilizan dentro de microportadores y por lo tanto
que son menos sensibles a la fuerza de cizallamiento que en cultivo en suspensin .
Aunque el microambiente creado por las clulas inmovilizadas
dentro de la matriz de soporte son diferentes de que en el lquido a granel , con
la seleccin apropiada de soportes para la inmovilizacin de clulas , de clulas de alta
densidad y alta productividad se puede lograr.
3.1.4 . Biorreactores de tambor rotativo
El drumbioreactor rotatorio, superficie havingmoderate al volumen
proporcin en comparacin con otros tipos de biorreactores , puede proporcionar una adecuada
transferencia de masa de oxgeno con menos consumo de energa y esfuerzo de corte
en comparacin con STB . Para cultivos de clulas vegetales , el biorreactor tambor rotativo
ha demostrado ventajas en trminos de homogeneidad suspensin , bajo cizallamiento
crecimiento medio ambiente y reducedwall , sobre cualquiera air-lift o STB ( Sajc et
. al, 2000 ) . Sin embargo , la limitacin es su comparativamente alta energa
consumo en operaciones a gran escala y la dificultad de la ampliacin.
3.2 . Sistemas de biorreactores desechables ( de un solo uso de tecnologa)
Biorreactores desechables , en el que el recipiente de cultivo est hecho de un
de un solo uso bolsa de plstico o contenedor , proporcionan caractersticas muy atractivas para
los
la produccin Biomanufacturing de protenas extraas especialmente para timeand
el ahorro de costes de la flexibilidad para la pequea y mediana escala de operacin ,
fcil manejo , que no requieren el CIP y SIP (pre- estril desechable
bolsas de biorreactores sern descartados despus de la cosecha del producto), instalacin
sencilla
diseo y puesta en marcha (diseo de fabricacin modular) , la reduccin de WFI
requisitos , la facilidad de la validacin , menos inversin de capital para el acero
recipientes de acero , reduccin del tiempo de rotacin entre cada ejecucin , y el potencial
uso de procesos integrados para procesos ms robustos con una menor
tiempo de desarrollo y un mayor rendimiento ( Eibl et al, 2009b ; . Eibl
et al, 2010a . ; Hacker et al. , 2009 ) . La posibilidad de contaminacin cruzada
entre cada ejecucin proceso tambin puede ser minimizado mediante el uso de desechables
sistemas de biorreactores , lo que sugiere la posibilidad de multi- producto
fabricacin en una suite. La reciente comercializacin de desechable
biorreactores , tales como la Sartorius Stedim Biostat CultiBag STR , Xcellerex
XDR , Hyclone SUB (Single -Use biorreactor ) , y GE WAVE biorreactor ,
etc , ofrecen la posibilidad de reducir el uso de la banca y en escala piloto
biorreactores de acero inoxidable y se han aplicado con xito en
instalaciones biomanufacturing preclnicos, clnicos y produccin a escala
( Eibl et al. , 2010b ) . Las limitaciones actuales sobre el uso de desechables
biorreactores incluyen la fuerza plasticmaterial insuficiente en escalabilidad
y la disponibilidad de sensores fiables , desechables y perifrico
elementos tales como vlvulas y sistemas de muestreo , etc ( Eibl et al . , 2010b ) .
Adems , el ms discutido preocupacin por el uso de biorreactores desechables
en la produccin de productos biofarmacuticos son los extrables y lixiviables
whichmay interactwith o contaminar el producto para la terapia humana
( Eibl et al. , 2010a ) .
3.2.1 . Biorreactores desechables estndar
Hasta la fecha , desechables biorreactores de tanque agitado estn disponibles a partir de
empresas como Sartorius , HyClone , y Xcellerex que la fabricacin
de un solo uso de biorreactores con configuraciones de tanque agitado , aunque stas
biorreactores son todava limitados en volumen y en su mayora utilizados para las semillas
expansin y la inoculacin de grandes biorreactores convencionales . la
bolsa de biorreactor agitado desechable , hasta 2000 L , equipada con gas
Filtro de aspiracin y de escape y puertos para sensores de pH , DO, y la temperatura son
contenida dentro de una cubierta exterior de acero inoxidable con refrigeracin y calefaccin
chaqueta para proporcionar el control de la temperatura . El mezclado y la masa
capacidad de transferencia se consigue mediante un impulsor estril , desechable que es
integrado en cada buque bolsa de plstico. Sin embargo , la transferencia de masa de oxgeno
, crecimiento de la pared de limitacin y flotacin celular se observan en clulas de alta
cultivos en suspensin de clulas vegetales densidad en biorreactores agitados desechables,
en parte debido al aumento de la viscosidad caldo de cultivo , capas de espuma estables y
la microsparger utilizado para la aireacin (Raven et al. , 2010 ) .
Biorreactores neumticos desechables, como columnas de burbujas , son
comnmente utilizado para la propagacin de la biomasa para la regeneracin de la planta para
transferir al invernadero (Raven et al. , 2010 ) . Protalix utiliza un
desechable , burbuja de tipo columna de biorreactor (volumen de trabajo L 400 ) ,
que consiste en un polietileno esterilizable bagfilled con clulas de plantas y
medio , para la produccin prGCD en cultivo de clulas de zanahoria transgnica
( Shaaltiel et al. , 2008 ) . Adems , el biorreactor Slug burbuja , diseado para
generar intermitentes grandes y largos burbujas individuales cilndricos de la
fondo de la bolsa mediante la variacin de la presin de entrada de aire , la vlvula de la hora de
apertura
y la frecuencia de la burbuja , se ha demostrado que exhiben kLa comparables
a valores en STB y se ha implementado para el cultivo de tabaco
AP-2 o clulas en suspensin de soja ( Ducos et al, 2009 ; . Terrier et al, 2007 . ) .
El biorreactor de un solo uso orbitalmente sacudido ( tales como el desechable
Biorreactor Sacudido de Nalgene ) consiste en un recipiente cilndrico
montado en una plataforma de agitacin en movimiento circular y un desechable , estril
bolsa de plstico con tubos de conexin apropiados para la siembra , la alimentacin , el gas
de suministro y la cosecha ( Micheletti et al . , 2006b ) . El dimetro de temblar,
velocidad de agitacin , el volumen de trabajo y la suavidad de los cultivos
recipiente se puede ajustar para lograr la transferencia de masa de oxgeno adecuada .
Los estudios han demostrado que los biorreactores agitados desechable puede
proporcionar suficiente transferencia de masa de oxgeno , la formacin de espuma insignificante
e inferior
tensin de cizallamiento ( debido a la distribucin homognea del consumo de energa )
para el crecimiento de las clulas vegetales y animales ( Eibl et al . , 2010c ) .
3.2.2 . Biorreactores Wave - mezclado
Biorreactores Wave - mezclado que poseen las ventajas de bajo costo y
baja tensin de cizallamiento utilizar una bolsa estril impermeable al gas compuesto de un
plasticfilmwhich contiene clulas husped andmedium . Las bolsas arefilledwith
y medio de suspensin celular hasta 50-60 % de su capacidad total ( Eibl
et al. , 2009a ) . La transferencia de la mezcla , la masa y el calor en la onda mixta
biorreactor se caracterizan por bajos mecedora , mecindose ngulo , tipo bolsa y
su geometra y cultureworking volume.Oxygen se suministra desde el aire
o de la mezcla de gas continuamente a travs de la aireacin del espacio de cabeza . mientras que
el
biorreactor de onda mezclada se mece , la superficie del lquido de themedium en el
bolsa se renueva continuamente y la aireacin de superficie sin burbujas tiene lugar
lo que resulta en la oxigenacin y la mezcla a granel con menos esfuerzo de cizallamiento a
clulas cultivadas. Las ventajas adicionales incluyen la formacin de espuma reducida , fcil
operacin y bajo riesgo de contaminacin . En particular , la tensin de corte es
ms alta en el biorreactor de onda mezclada cuando la bolsa est sacudiendo con
nivel mnimo de llenado a la mxima velocidad de balanceo y ngulo de balanceo. la
biorreactor de onda mixta puede funcionar en diferentes modos de cultivo ,
incluyendo lotes , alimentacin por lotes y la perfusin cuando se combina con diferentes
dispositivos de retencin celular - tales como filtros flotantes . Mediciones en lnea de
pH , OD y otras tecnologas de deteccin ( Lea et al. , 2009 ) hacen thewave






















biorreactor mixta y otras biorreactores desechables de gran atractivo para los
cultivos de clulas vegetales ( Eibl et al. , 2009a ) . Tres de onda mezclada comercial
biorreactores se utilizan en la actualidad incluyendo WAVE biorreactor (GE Healthcare,
hasta 1000 volumen total L ) , BIOSTAT CultiBag RM (Sartorius Stedim ,
hasta un volumen de 100 Lworking ) y AppliFlex ( Applikon , hasta 25 Lworking
volumen ) .
Las investigaciones han demostrado la aplicacin de la ola
biorreactor para el cultivo de clulas de tabaco , uva y manzana de suspensin hasta
500 volumen Lworking (Raven et al. , 2010 ) . Eibl et al . logrado planta alta
productividades celular ( V. vinifera) de biomasa de 40 g- FCW / ( L- da ) con un
tiempo de duplicacin de 2 das para observar que no haba significativa
cambio en la morfologa celular en comparacin con cultivos en STB ( Eibl
y Eibl , 2006 ) . Los biorreactores de onda mixta se han implementado
para la produccin de colgeno humano ( Ritala et al . , 2008 ) y humano
virus antirrbico MAB ( Girard et al. , 2006 ) . Sin embargo , el aumento en
viscosidad caldo de cultivo ( ms de 70 veces) y de alta PCV ( N60 % )
el cultivo de clulas vegetales en suspensin puede dar lugar a no homognea
mezcla en biorreactor de onda mezclada . Otros biorreactores onda - mezclado , tales
asWave andUndertowbioreactor ( Terrier et al. , 2007 ) y el reflujo- andflow
biorreactor ( EFBR ) ( Mishra y Ranjan , 2008 ) , diseado para
micropropagations y produccin de metabolitos secundarios pueden ser
aplicados para la produccin de protenas extraas . Adems , una bolsa de cultivo
integrado con matriz de soporte del tejido de la planta se ha usado para
cultivo a base de races en cabellera ( Eibl y Eibl , 2006 ) .
3.2.3 . biorreactores de inmersin
El biorreactor de inmersin temporal ( TIB ) , que consiste en dos vasos
(uno para la celebracin de los cultivos de tejidos vegetales y otro para el lquido
medio), fue desarrollado para permitir el ciclismo de medio de cultivo por
el uso de presin de aire o una bomba para empujar el recipiente de mediumfromone a la
otra para sumergir los tejidos de las plantas y el uso de la gravedad para retirar la
medio , por lo tanto los tejidos vegetales o clulas vegetales inmovilizadas estn expuestos a
el medio de forma intermitente en lugar de continua . Un aire separado o
mezcla de gas se introduce a travs de un burbujeador para airear la clula de la planta o
cultivos de tejidos . TIB ofrece ventajas atractivas incluyendo adecuada
transferencia de oxgeno y el estrs lowshear a los tejidos vegetales (como la raz pilosa
cultura ) debido a la falta de agitacin mecnica , aunque algunos
limitaciones deben abordarse incluyendo el tamao del buque en comercial
escala , disponibilidad de acceso, y insufficientmixing que conduce a la acumulacin de
de inhibitorymetabolites que pueden afectar el crecimiento celular ( Ducos et al. , 2009 ) .
Adems , un TIB modificado , que consta de una caja rgida coloca dentro de un
bolsa de plstico transparente , llamado TIB cuadro en bolsa proporciona la cultura
espacio de cabeza entre los periodos de inmersin y permite horizontal
distribucin de la biomasa para una mejor oxigenacin y la iluminacin que
que en la TIB u otro tipo de biorreactor de inmersin ( Ducos et al. , 2009 ) .
Puertos ubicados por encima de la bolsa se utilizan para la inoculacin y la salida de gas y
puertos situados por debajo de la bolsa se utilizan para la entrada de aire y el medio
cambio. El TIB cuadro en bolsa tambin ofrece el cultivo masivo de in vitro
cultivo de clulas vegetales bajo condiciones photoautrophic . TIB se consideran
un sistema de biorreactor adecuado para cultivos de races peludas gran escala.
3.2.4 . biorreactores de membrana
Biorreactores de membrana estn diseadas para retener las clulas husped y extranjera
productos de la protena en un compartimento celular mediante la utilizacin de especializada
membranas con lmite de peso molecular especfico ( MWCO ) para ya sea
en la aireacin in situ , el suministro de nutrientes , o la separacin del producto ( Qi et al . , 2003 )
.
El medio de cultivo se hace circular en el biorreactor de membrana para
con lo que el oxgeno y los nutrientes a las clulas y la eliminacin de los residuos
metabolitos . Las membranas pueden ser empacados en diferentes geometras
incluyendo placa y lmina , tubulares , en espiral y de fibra hueca
mdulos . Caractersticas de Themain utilizando biorreactores de membrana en la clula vegetal
las culturas son de alta densidad celular y la protena alta productividad volumtrica ,
que resulta de la utilizacin de membranas que retienen el exterior secretada
protena en el compartimento de la celda , concentrando el producto antes
cosecha. Otra caracterstica es que el dao celular inducido por el estrs de cizallamiento
encontrado en STB puede ser minimizada en un biorreactor de membrana debido a que el
las clulas son retenidas en una regin relativamente quiescente en el que las clulas son
protegido de daos mecnicos y no estn en contacto directo con
burbujas de gas . McDonald et al . ( 2005 ) aplicaron una biorreactor de membrana ,
CELLine CL 350 , para la produccin de alfa - 1 - antitripsina humana ( AAT )
mediante el cultivo de clulas de arroz transgnico con un promotor de arroz alfa-amilasa ,
Ramy3D , que se activa bajo condiciones de inanicin de azcar , lo que resulta
en el ttulo de producto extracelular de hasta 250 mg / L y 4-10 % de la
protena soluble total extracelular. Sin embargo , la operacin a gran escala en
problemas de funcionamiento causa bioreactorsmay membrana resulta en pobres
la viabilidad celular , la estabilidad pobre proceso , la heterogeneidad del producto , la membrana
ensuciamiento , y gradientes de difusin (calor y transferencia de masa ) . Por lo tanto la
biorreactor de membrana se aplica principalmente a los procesos de pequea escala
y es difcil de escalar para aplicaciones a gran escala , aunque , pero puede estar
til para aplicaciones de menor escala como especfica del paciente
la teraputica .
3.2.5 . Microbioreactors
Themicrobioreactor est diseado como un alto rendimiento platformfor celular
seleccin de la lnea y la evaluacin , caracterizacin de bioprocesos ( espacio de diseo
determinacin) , diseo y optimizacin de los medios de comunicacin ( Betts y Baganz , 2006 ;
Diao et al. , 2008 ) , y como - downmodel escala para representar la produccin
biorreactor para fines de escalonamiento de bioprocesos ( Micheletti et al. , 2006a ) .
Plataformas Microbioreactor incluyendo placas de microtitulacin (6, 12 , 24 , 96 , con
hasta 384 wellswith un fewmicroliter a mililitro volmenes ) , tubos de centrifugado ( 5 -
50 ml ), agitar matraces ( 25-1000 ml) , y miniatura paralelo agit y
sistemas de biorreactor de columna de burbujas ( Betts y Baganz , 2006 ) han sido
implementado para el cultivo de muchas diferentes lneas de clulas husped . La alimentacin ,
de muestreo , y la cosecha se puede automatizar mediante el uso de una manipulacin de lquidos
sistema con un sistema de control de automatizacin que se puede programar .
Recientemente, los sistemas de deteccin pticos basados en el proceso no invasivo
la tecnologa de anlisis se han utilizado para mediciones en lnea de pH ,
oxgeno disuelto , y la densidad ptica en un microbioreactor ( Zhiyu et al . ,
2007 ) . Applikon sistema de 24 micro-reactor es un tipo de placas de 24 pozos profundos
con pH en lnea , DO y opciones de monitorizacin y control de temperatura.
Sin embargo , la escala reducida no microbioreactormay ser capaz de precisin
imitar las condiciones del proceso de biorreactor a gran escala (como los gradientes de
concentracin de oxgeno disuelto , temperatura, pH , nutrientes , y de cizallamiento
estrs ) debido a las diferencias en heterogeneousmicroenvironments a travs
biorreactores de escala variadas . Las limitaciones de la transferencia de oxgeno y el proceso de
el control de los parmetros de funcionamiento inherentes a la microbioreactor
normalmente slo se permitir el desarrollo de procesos de escala pequea o mediana .
3.3 . Consideraciones especiales para los sistemas de biorreactores de musgo
El musgo puede crecer en un medio sencillo de sales inorgnicas en baja constante
de luz o da - noche ciclos , por lo tanto , un fotobiorreactor es el ms
recipiente comn formoss cultivo in vitro. Cultivo de musgo pequea escala
se puede realizar en un matraz de vidrio o un fotobiorreactor controlable , ya sea
en un biorreactor de tanque agitado de vidrio o biorreactor de vidrio , withworking tubular
volmenes de hasta 30 L. Aunque vidrio agitado -tanque y aire elevadoras biorreactores
se han modificado formoss cultivo in vitro , que se han limitado a
pequea escala de produccin , debido a la limitacin de luz debido a la celda mutua
sombreado en la densidad celular moderado y alto , resultando en ampliacin
complejidad . Actualmente, el modular 100 fotobiorreactor tubular L
y 200 L de sistemas de biorreactor de onda - mezclado desechables han sido
establecido para la produccin de protenas extraas por cultivo de clulas de musgo por
Greenovation Biotech GmbH en Alemania ( Decker y Reski , 2007 ) .
La estructura modular de biorreactores para el cultivo in vitro de musgo permite
fcil de escala se muestra al utilizar varios biorreactores en paralelo. celular Musgo
la diferenciacin y el crecimiento pueden ser estrechamente controlados por distintos
parmetros en un fotobiorreactor para cultivos de alta densidad celular en lotes ,
funcionamiento semicontinuo y continuo ( Lucum y Posten , 2006 ) .
Tensin mecnica adecuada a los filamentos celulares puede prevenir las plantas
desde el desarrollo de los tejidos adultos en un biorreactor . Aunque el simple
medio de crecimiento hace musgo cultivo in vitro una muy rentable
bioprocesos en comparacin con los cultivos celulares othermammalian , la escalabilidad de

























fotobiorreactores y operacin de biorreactor relativamente complejo (crtico
consideraciones que incluyen la intensidad de la luz , los ciclos de luz-oscuridad , la circulacin
tasa de fotobiorreactor tubular , etc ) , son actualmente un desafo que
limita el uso de cultivos de musgo para la produccin a gran escala de los extranjeros
protenas .
3.4 . Consideraciones especiales para los sistemas de biorreactores raz peludas
Las caractersticas de la morfologa y de la cultura de los cultivos de races peludas
crecido en un biorreactor son muy diferentes fromthose de planta suspendida
clulas . El grosor de la raz, longitud de la raz , el nmero de pelos radiculares y races
frecuencia de ramificacin se ven afectados por especies de plantas y el Agrobacterium
cepa utilizada para la induccin de races pilosas. Estas caractersticas han llevado a la
diseo de configuraciones de biorreactores alternativos . consideraciones especiales
necesitar ser tenido en cuenta para la seleccin de biorreactor para la raz peluda
cultivo in vitro , tales como un entorno de estrs lowshear , oxgeno adecuado
transferencia de masa y la disponibilidad de nutrientes en la alta densidad de la raz embalado
culturas. El crecimiento de las races peludas en liquidmediumresults en densa y
lleno de biomasa de las races , la induccin de la formacin de estancamiento y
convirtindose en un papel inhibitorio en la circulacin del fluido y la limitacin de oxgeno
disponibilidad . Adems , el crecimiento de clulas no - homognea y
la produccin de productos de races peludas en un biorreactor puede complicar la
optimizacin de procesos. Georgiev et al . indic que la tendencia a formar
grumos formados por races primarias y puenteados es themain preocupacin por
races peludas cultivadas en un biorreactor ( Georgiev et al . , 2007 ) . La tradicional
STB no es aplicable para la produccin en masa de races peludas desde la escuela
tensin de cizallamiento se genera por el impulsor , provocando la respuesta de la herida y
la formacin de callos . Neumtica estndar y biorreactores lquido disperso
(como lecho percolador y el reactor de niebla goteo ) se modifican para
la mejora de cultivos de races peludas debido a la baja tensin de cizallamiento y la
simplicidad de su diseo y construccin ( Mishra y Ranjan , 2008 ) ,
Aunque todava se observan algunas limitaciones .
Inmovilizacin de races peludas en matrices de anclaje ( tales como metal
bandejas y mallas ) se han demostrado para promover el crecimiento de la raz
en biorreactores STB , de columna de burbujas y de tambor rotatorio modificadas , donde
las races se sumergen en el medio de cultivo ( Shadwick et al . , 2005 ) .
Para evitar daos a las races de la tensin de corte por el impulsor , el
aislamiento de las races de los impulsores en STB es necesario . Sin embargo ,
transferencia de masa insuficiente de oxgeno y nutrientes debido a la suave
mezcla puede inhibir el crecimiento de la raz . Para superar la masa de oxgeno
transferir limitacin, races peludas pueden ser cultivadas principalmente en aerosol
o biorreactores de gotas y biorreactores niebla, donde las races son
inmovilizado sobre soporte de malla y se expone a aire hmedo o un gas
mezcla y los nutrientes se suministran como pequeas gotitas por boquilla de pulverizacin ,
resultando en una alta tasa de crecimiento y la biomasa ( Gupta et al . , 2006 ) .
Liu et al . ( Liu et al . , 2009 ) compar el crecimiento de las races y murino
interleucina 12 ( mIL- 12 ) La produccin de N. tabacum races peludas en tres
diferentes biorreactores incluyendo frascos de agitacin , biorreactores de aire elevadoras, y la
niebla
biorreactores , y encontraron que las races no se distribuyen homogneamente
y form un denso anillo alrededor de la pared del reactor air-lift . Liu et al .
indic que la mIL- 12 la produccin total en el biorreactor niebla era
alrededor del 50 % ms que eso en el biorreactor de aire - ascensor. Sin embargo , la
reto de carga uniforme de las matrices de anclaje raz puede limitar la
escalabilidad de la cultura de raz pilosa en la niebla o biorreactores de pulverizacin. Las races
pueden
ser picado y se bombea como una suspensin en el reactor para mecnicamente
eliminar la necesidad de mano de obra para el corte, la inoculacin y
homogneamente la carga en operaciones a gran escala . Gupta et al . introducido
un proceso de produccin de ginsensidos comercial usando races peludas en un
20 000 L de tipo globo biorreactor como un modelo para el desarrollo de las races en cabellera
proceso de fabricacin basado en la produccin de protenas extraas (Gupta
et al . , 2006 ) . Biorreactores desechables, como biorreactor de onda mezclada o
TIB , tambin son adecuados para el cultivo de races peludas con morfolgica estable
caractersticas de operacin a gran escala. Adems, los sistemas de biorreactor
integrado con los sistemas de cosecha de biomasa raz peludas por seguir
deben tenerse en cuenta los procesos posteriores . Otros biorreactor
sistemas de cultivos de races peludas en pequea escala ( b10 L ) tambin fueron
discutido previamente ( Mishra y Ranjan , 2008 ) .
4 . Optimizacin de modo de operacin de biorreactor
Las operaciones de biorreactor avanzada desarrollada para mamferos y
sistemas microbianos pueden ser implementadas para cultivos de clulas vegetales . uno
aspecto importante en el desarrollo de un proceso de cultivo de clulas vegetales es robusta a
establecer las condiciones de operacin de biorreactor y los rangos de operacin mientras
teniendo en cuenta las caractersticas de la planta de cultivo celular in vitro en . aunque
las condiciones ptimas y el modo de operacin varan para diferentes plantas
especies y medios de cultivo , las consideraciones importantes se discuten en
esta sesin.
4.1 . La expresin constitutiva de protenas extraas en cultivo de clulas vegetales
biorreactores
Para la produccin de protenas extraas crecimiento asociado ( o secretada
producto intracelular ) impulsado por un promotor constitutivo , objetivo
la productividad de protenas puede ser mejorada mediante el aumento de la densidad celular en
la cultura y la prolongacin de la fase de crecimiento exponencial celda activa .
Culturas de alimentacin por lotes se han aplicado para lograr una alta densidad celular
cuando la utilizacin de una estrategia efectiva de alimentacin de sustrato ( Suehara et al. ,
1996 ) . Sin embargo , la acumulacin de metabolitos txicos o inhibidores
cultivos por lote alimentado durante podran limitar la productividad protena extraa.
Por lo tanto , un cultivo en perfusin con un dispositivo de retencin celular ( tal como un
filtro celular acstico, ATF (alternativa de flujo tangencial ) , y el filtro de la vuelta,
etc ) puede ser una alternativa para obtener la cultura alta densidad de las clulas y para
retirar continuamente medio de cultivo ( De Dobbeleer et al, 2006 . ;
Lucum y Posten , 2006 ; Su y Arias , 2003 ) . Por otro lado , la
tasa de crecimiento de las clulas en un lote o lote alimentado de cultivo de clulas vegetales es
generalmente
retardado cuando el PCV alcanza aproximadamente 60-70 % , lo que resulta en una reduccin
de la actividad metablica celular ( Maccarthy et al . , 1980 ) . Por lo tanto ,
aunque de alimentacin por lotes y la perfusin de cultivo se puede aplicar para aumentar
la densidad celular, cultivo semi - continuo o cultivo de perfusin con una hemorragia
corriente se ha demostrado que es ms adecuada para alta clula
cultura densidad debido a la agregacin clula de la planta , la adhesin superficial , y
la alta viscosidad aparente observada a alta concentracin de biomasa
( De Dobbeleer et al . , 2006 ) .
4.2 . Expresin inducible de protenas extraas en biorreactores de cultivos de clulas vegetales
Para la produccin de protena extraa impulsado por un promotor inducible , de dos etapas
culturas se implementan normalmente para permitir el crecimiento celular y
fases de produccin de protenas a ser optimizadas de forma independiente. El biorreactor
operaciones para la fase de induccin (fase de produccin de protenas ) son altamente
depende del tipo de promotor inducible utilizado ( Huang andMcDonald ,
2009 ) . El sistema promotor Ramy3D azcar inanicin ( metablicamente
regulados ) ha sido investigado para expresar protenas extraas incluyendo
AAT humano ( Huang et al . , 2001a ) y hGM -CSF ( Shin et al . , 2003 ) en
cultivos de clulas de arroz transgnicas . En estos estudios, un intercambio de medios a un sin
azcar
medio o medio que contiene una fuente de carbono alternativa
( Terashima et al. , 2001) para inducir la produccin de protena extraa era
aplicado en un momento apropiado en la fase de crecimiento . Durante la induccin
phasewithout suplementacin fuente de carbono , sin embargo , la viabilidad celular
se redujo significativamente , lo que resulta en aumento de la actividad de la proteasa . la
cclica proceso semi-continuo , que alterna entre el crecimiento y
fases de produccin , ha sido desarrollado para reutilizar las clulas transgnicas de arroz
para la operacin a largo plazo ( Trexler et al. , 2005 ) .
Para un sistema qumicamente inducible , el tiempo de induccin y
concentracin y modo de adicin del inductor ( sencillos, retorcidos o
induccin continua ) aplicada a plantar los cultivos celulares son importantes para
la optimizacin de operacin de cultivo celular de plantas biorreactor inducible . Esta voluntad
que sea necesario investigar sobre la base de la naturaleza del inductor ( inductor
especies de estabilidad y toxicidad ) y vegetales (tasa de crecimiento de las clulas y la agregacin
tendencia ) para potenciar la expresin de protenas extraas . inductor Superior























407
concentraciones y aplicaciones mltiples o continuas pueden beneficiarse alta
operationalmodes la densidad celular. Semi-continuous/continuous o perfusin
operacin de biorreactor a alta densidad celular con la tasa de crecimiento ms lenta especfica
para una fase de produccin de protenas prolongada puede ser beneficioso para inducible
la produccin de la protena extraa y la protena extraa secretada pueden ser
cosechado continuamente fromthe caldo de cultivo de clulas . Nuestros resultados sugieren
que la tasa de consumo de oxgeno ( OUR) es un importante parmetro fisiolgico que
determinar el momento ptimo para la induccin ( TOI ) . En el caso de un
promotor qumicamente inducible , el estrgeno basados en receptores sistema ( XVE ) en
cultivo de clulas de tabaco , la TOI ptima se produce en el mximo NUESTRA que
se produce al final de la fase exponencial ( Huang et al . , 2010 ) . nosotros
desarrollado an ms la produccin de cultivo semicontinuo de AAT humana
el uso de un vector viral vegetal qumicamente inducible en clulas de tabaco transgnico
la cultura , lo que lleva a un aumento de cinco veces en la productividad volumtrica de
AAT biolgicamente funcional en comparacin con la operacin por lotes ( Huang et
. al, 2010 ) .
4.3 . Estrategias para mejorar la estabilidad de la protena extranjera
Estabilidad de la protena de Relaciones Exteriores en un entorno heterogneo de expresin
es una consideracin crtica . Las protenas extraas expresadas en cultivos de clulas vegetales
puede ser secretada al medio de cultivo extracelular o retenido en un
compartimiento intracelular , como ER , citoplasma, o vacuola. Desde un rentable
punto de vista de bioprocesos , productos secretados ofrecen ventajas
sobre productos intracelulares . Sin embargo , las protenas extraas secretadas son
comnmente degradado por las enzimas proteolticas que se producen durante
el cultivo de clulas vegetales o los resultados de la muerte celular / lisis ( Doran, 2006a )
y / o puede ser inestable en la clula de la planta culturemedium sencilla ( Tsoi y
Doran , 2002 ) . Para mejorar la estabilidad de las protenas extraas secretadas en
proceso de cultivo de clulas vegetales , las investigaciones ( Benchabane et al, 2008 ; . Doran,
2006b ) han utilizado agentes de estabilizacin de protenas o inhibidores de la proteasa , tales
como gelatina , BSA y otras protenas de bajo valor (para a base de protenas
estabilizacin ) , manitol ( para regular la presin osmtica de themedium
para minimizar la lisis celular ) , PEG , Pluronic F - 68 y otros polmeros ( como
agentes para la proteccin del producto protena estabilizante de desnaturalizacin
agentes liberados de las clulas vegetales en themedium ) . Estos enfoques
han demostrado que disminuye la degradacin o prdida de la extranjera
protena a travs de differentmechanisms , sin embargo , los inhibidores de proteasa han
tiempos de vida corta y son costosos para su aplicacin a gran escala y el uso
de agentes estabilizantes podra presentar efectos negativos sobre el crecimiento celular y la
aumentar los costos de procesamiento aguas abajo. Huang et al . ( Huang et al . , 2009 )
propuesto una estrategia biorreactor que implica el control del pH para mejorar
produccin de protena extraa funcional en cultivo de clulas de tabaco transgnico,
que puede mejorar la estabilidad de la protena extranjera y minimizar la proteolisis
efectos en cultivos de clulas , lo que demuestra como una alternativa eficaz a la adicin
inhibidores de la proteasa o protena agentes estabilizantes para plantar el cultivo de clulas .
Otros enfoques para reducir los efectos proteolticos en protenas extraas
incluir 1 ) co-expresin de inhibidores de la proteasa endgeno que impiden
actividades de la proteasa a lo largo de la va secretora celular o se libera en la
medio de cultivo ( Komarnytsky et al . , 2006 ) , 2 ) la supresin de la proteasa
la expresin gnica utilizando RNAi ( Kim et al . , 2008 ) , 3 ) el desarrollo de
clulas husped deficientes en proteasas especficas ( Schiermeyer et al . , 2005 ) , 4 ) in situ
recuperacin de protenas ( aadiendo resinas en la cultura o la circulacin del
cultura a travs de una columna de cromatografa externa al biorreactor )
( James y otros , 2002 ; . Sharp y Doran , 2001a ) , y 5 ) la inmovilizacin de
clulas de las plantas para facilitar la recuperacin de la protena secretada a partir del cultivo
caldo ( Osuna et al. , 2008 ) . La capacidad de estrategias para minimizar
la degradacin de protenas extraas en cultivos de clulas de plantas tiene que ser evaluada en
una base de caso por caso .
5 . Oportunidades para mejorar la produccin de protenas extraas en
cultivo de clulas vegetales
Cultivos de clulas vegetales como plataforma bioproduction proporcionan nica
ventajas para la produccin de protenas extraas . Orientaciones futuras para
mejorar el rendimiento de protena extraa y calidad en cultivo de clulas vegetales
sistema de biorreactor incluyen: 1 ) la seleccin de los ejrcitos de las plantas (especies de plantas
y desdiferenciado o clulas vegetales diferenciadas ) , la expresin de genes
sistema ( promotor constitutivo , promotor inducible , amplicn viral o
amplicn viral inducible ) y el gen de inters , 2 ) generacin y
seleccin de la lneas de clulas ms productivos , 3 ) el diseo medio y
optimizacin, 4 ) mejorar la estabilidad de la protena extranjera y prevenir
la degradacin proteoltica, 5 ) la seleccin de los sistemas de biorreactores y scale-up
estrategias ( de acero inoxidable estndar o biorreactores desechables) de acuerdo
a las interacciones entre las clulas husped , la formacin de producto y biorreactor
diseo , consideraciones y econmicos para satisfacer la demanda del mercado, 6 )
optimizacin de las condiciones de biorreactores para crecimiento de clulas y protenas
produccin, 7 ) la incorporacin de genes supresores de silenciamiento , 8 ) el desarrollo
la expresin transitoria de escalable en cultivo de clulas vegetales , 9 ) de adaptacin
de un solo uso de tecnologa, 10 ) celular Formaster largo termcryopreservation
y los bancos de clulas de trabajo de la lnea de produccin , y 11 ) Ingeniera
protenas glicosiladas producidos por plantas humanizados .
6 . Conclusiones
El progreso tecnolgico en los sistemas de biorreactores y operaciones
para la produccin de protena extraa en el uso de cultivos de clulas vegetales in vitro tiene
ha discutido . Los progresos prometedores de Protalix y Biolex tanto
proporcionar oportunidades de utilizar in vitro de plantas de clulas de cultivo del biorreactor
sistemas para biomanufacturing de protenas especializadas, medicamentos hurfanos para los
enfermedades genticas raras , y biosimilares o teraputica biobetter , a
bajar el costo de los productos , manteniendo o mejorando la plantmade
calidad de las protenas . Adems , clula de la planta basado en biorreactor
culturas presentan la ventaja de producir agentes teraputicos producidos por plantas
de una manera similar a las clulas microbianas y de mamferos que se han reunido
requisitos reglamentarios establecidos por la FDA y la EMEA en el ltimo
20 aos . Aunque los rendimientos de produccin de protenas inferior han sido
observado en cultivos de clulas de plantas , lo que implica un aumento de 10-100 veces
requerido para alcanzar los niveles comerciales , las estrategias para hacer que el
cultivo de clulas vegetales a base de un biorreactor prctico y econmico
plataforma no es realista teniendo en cuenta las mejoras impresionantes
en la fermentacin microbiana recombinante y el cultivo de clulas de mamferos
en los ltimos 20 aos .
Referencias
Amanullah A, BC Buckland , Nienow AW . Mezcla en la fermentacin y cultivo celular
industrias . En : Pablo EL , Atiemo - Obeng VA, Kresta SM , editores. Manual de
mezclas industriales : Ciencia y Prctica. Hoboken , Nueva Jersey , EE.UU. : John Wiley & Sons,
Inc. ; 2004 doi : . 10.1002/0471451452.ch18 .
Benchabane M , Goulet C , D Rivard , Faye L , Gomord V , Michaud D. Prevencin
protelisis no deseada en biofbricas de protenas vegetales. Plant Biotechnol J 2008 ; 6 :
633-48 .
Betts JI , Baganz F. biorreactores en miniatura : prcticas actuales y futuras oportunidades.
Hecho Microb Celular 2006 ; 5:21-34 .
Chilton MD, Tepfer DA , Petit A, David C , Casse- Delbart F , Tempe J. Agrobacterium
rhizogenes inserta T - ADN en los genomas de las clulas de la raz de la planta husped .
naturaleza
1982 ; 295:432-4 .
Cosgrove DJ. La relajacin en un ambiente de alta tensin : Las bases moleculares de
paredes celulares extensibles y alargamiento celular . Plant Cell 1997 ; 9:1031-41 .
Curtis WR , Tuerk AL . El transporte de oxgeno en los sistemas de cultivo de tejidos vegetales. El
tejido vegetal
2006:173-86 ingeniera cultura.
Davies HM . Reviewarticle : la comercializacin de los sistemas de la planta entera para
biomanufacturing
de productos de protena : evolucin y perspectivas . Plant Biotechnol J 2010 ; 8:845-61 .
De Dobbeleer C , M Cloutier , Fouilland M , Legros R, Jolicoeur M. Una perfusin de alta velocidad
biorreactor de clulas de la planta . BIOTECNOLO Bioeng 2006 ; 95:1126-37 .
De Muynck B, C Navarra , Boutry M. La produccin de anticuerpos en plantas : estado despus
Veinte aos. Plant Biotechnol J 2010 ; 8:529-63 .
Decker EL , Reski R. El biorreactor musgo . Curr Opin Plant Biology, 2004 ; 7:166-70 .
Decker EL, biorreactores Reski R. Moss productoras mejorados productos biofarmacuticos . curr
Opin Biotechnol 2007 ; 18:393-8 .
Demain AL , Vaishnav P. La produccin de protenas recombinantes por microbios y mayor
organismos . Adv Biotechnol 2009 ; 27:297-306 .
Desai PN , Shrivastava N , pADH H. Produccin de protenas heterlogas en las plantas :
estrategias para la expresin ptima . Biotechnol Adv 2010 ; 28:427-35 .
Diao JP , Young L , Zhou P , Shuler ML . Un mini- biorreactor mezclado activamente para la protena
la produccin de las clulas animales suspendidos. BIOTECNOLO Bioeng 2008 ; 100:72-81 .
Doran PM . Diseo de sistemas de suspensiones celulares de la planta de mezcla en reactores
agitados .
BIOTECNOLO Prog 1999 ; 15:319-35


















408
Doran PM . Degradacin de la protena de Relaciones Exteriores y la inestabilidad en las plantas y
los tejidos de la planta
culturas. Tendencias Biotechnol 2006a; 24:426-32 .
Doran PM . Prdida de anticuerpo secretado a partir de cultivos de tejidos de plantas transgnicas
debido a la superficie
adsorcin . J Biotechnol 2006b ; 122:39-54 .
Ducos JP , Terrier B, biorreactores Courtois D. desechables para la micropropagacin de plantas y
cultivo de clulas vegetales en masa. Biorreactores desechables. Berlin / Heidelberg : Springer;
2009 .
p . 89-115 .
Dunlop EH , Namdev PK, Rosenberg MZ . Efecto de fuerzas de cizallamiento de fluido en - clula de
la planta
suspensiones. Chem. Eng. Sci. 1994 ; 49:2263-76 .
Durocher Y, los sistemas de expresin para la produccin de Butler M. glicoprotena teraputica.
curr
Opin Biotechnol 2009 ; 20:700-7 .
Eibl R , Eibl D. Diseo y uso del biorreactor de onda para cultivo de clulas vegetales . El tejido
vegetal
ingeniera de la cultura. Springer; 2006 . P. 203-27 .
Eibl R, Eibl D. Diseo de biorreactores adecuados para clulas de plantas y cultivos de tejidos .
Phytochem
Rev 2008 ; 7:593-8 .
Eibl R, Werner S , biorreactores Eibl D. desechables para cultivos lquidos de plantas en litros
escala.
Eng Life Sci. 2009a ; 9:156-64 .
Eibl R, Eibl D, Eibl R, Werner S , biorreactor Eibl D. Bolsa basado en el movimiento inducido por las
olas :
caractersticas y aplicaciones. Biorreactores desechables. Berlin / Heidelberg : Springer;
2009b . p . 55-87 .
Eibl R , Kaiser S , Lombriser R, biorreactores Eibl D. desechables : el estado actual de la tcnica
y aplicaciones en biotecnologa recomendada . Appl Microbiol Biotechnol
2010a ; 86:41-9 .
Eibl D, Peuker T, Eibl R. equipos de un solo uso en la fabricacin biofarmacutica : un
breve introduccin. John Wiley & Sons , Inc ; 2010b .
Eibl R, Lffelholz C , Eibl D. SOLO USO biorreactores - una visin general . John Wiley & Sons , Inc ;
2010c .
Franconi R, Demurtas OC , vacunas derivadas de plantas Massa S. y otros productos teraputicos
producido en sistemas contenidos ; 2010 . P . 877-92 .
Ganapathi TR, Kumar GBS , Srinivas L , Revathi CJ, Bapat VA . Anlisis de las limitaciones de los
superficie de la hepatitis B la expresin del antgeno en cultivos en suspensin de clulas de soja.
planta
Cell Rep 2007 ; 26:1575-84 .
Georgiev M , Pavlov A, Bley T. Hairy tipo raz de la planta en sistemas in vitro como fuentes de
sustancias bioactivas . Appl Microbiol Biotechnol 2007 ; 74:1175-85 .
Gilleta F , Roisin C , Fliniaux MA, Jacquin - Dubreuil A, Barbotin JN , Nava - Saucedo JE .
Inmovilizacin de Nicotiana tabacum suspensiones de clulas de plantas dentro de alginato de
calcio
perlas de gel para la produccin de cantidades aumentadas de scopolin . Enzima Microb
Tec 2000 ; 26:229-34 .
Girard LS , Fabis MJ , Bastin M , Courtois D, Petiard V , Koprowski H. La expresin de un ser
humano
anticuerpo monoclonal anti-virus de la rabia en cultivo de clulas de tabaco. Biochem Biophys Res
Commun 2006 ; 345:602-7 .
Giri A, Narasu ML . Races peludas transgnicos: tendencias recientes y las aplicaciones. Biotechnol
Adv 2000 ; 18:1-22 .
Gomord V , Fitchette AC , Menu- Bouaouiche L , Saint- Jore - Dupas C , Plasson C , Michaud
D , et al . Patrones de glicosilacin en plantas especficas en el contexto de la protena teraputica
produccin . Plant Biotechnol J 2010 ; 8:564-87 .
Gorr G, Wagner S. humanizado glicosilacin : la produccin de productos biofarmacuticos en un
biorreactor musgo . Wiley- VCH Verlag GmbH ; 2008 .
SD Gupta , Ibaraki Y, Choi Y- E, Kim Y. S , Paek K -Y. Tipos y diseos de biorreactores para
la cultura de raz peluda. En : Hofman M , Anne J , Nedovid V , Willaert R , editors. plan de tejido
ingeniera de la cultura. Pases Bajos: Springer; 2006 . P. 161-72 .
DL Hacker, De Jesus M , Wurm FM. 25 aos de protenas recombinantes a partir reactorgrown
clulas - hacia dnde vamos desde aqu ? Adv Biotechnol 2009 ; 27:1023-7 .
Hellwig S , Drossard J , Twyman RM, cultivos celulares Fischer R. planta para la produccin de
protenas recombinantes . Nat Biotechnol 2004 ; 22:1415-22 .
Holland T , M Sack , Rademacher T, Schmale K, F Altmann , Stadlmann J , et al. Optimal
suministro de nitrgeno como elemento clave para el aumento y la produccin sostenida de un
monoclonal
anticuerpo de tamao completo en BY- 2 cultivo en suspensin . Biotechnol Bioeng 2010 ; 107:
278-89 .
Hong SY, Kwon TH , Lee JH, Jang YS , Yang MS . La produccin de biolgicos activos hG -CSF por
cultivo en suspensin de clulas de planta transgnica . Enzyme Microb Technol 2002 ; 30:763-7 .
Huang T -K, KA McDonald . Biorreactor de ingeniera para la produccin de protena recombinante
en cultivos en suspensin de clulas vegetales. Biochem Eng J 2009 ; 45:168-84 .
Huang J , Sutliff TD , Wu L , S Nandi , Benge K , Terashima M, et al . Expresin y
purificacin de funcional alfa - 1 - antitripsina humana a partir de clulas de plantas cultivadas .
Biotechnol Prog 2001a; 17:126-33 .
Huang conocimientos tradicionales , Wang PM , Wu PESO . El cultivo de Bacillus thuringiensis en
un reactor de transporte areo
con proyectos de malla de alambre tubo . Biochem Eng J 2001b ; 7:35-9 .
Huang LF, Liu YK , Lu CA, Hsieh SL, Yu SM . La produccin de albmina de suero humano con azcar
inanicin inducida promotor y el cultivo de clulas de arroz. Transgenic Res. 2005 ; 14:569-81 .
Huang conocimientos tradicionales, Plesha MA, Falk BW, Dandekar AM , McDonald KA . Un
biorreactor para estrategias
la mejora de rendimiento de la produccin y la funcionalidad de una protena humana
recombinante en
cultivos de clulas de tabaco transgnicas . BIOTECNOLO Bioeng 2009 ; 102:508-20 .
Huang T -K, Plesha MA , McDonald KA . Produccin biorreactor semicontinuo de un
protena teraputica humana recombinante utilizando un vrica qumicamente inducible
sistema de expresin de amplicn en cultivos en suspensin de clulas de plantas transgnicas .
BIOTECNOLO Bioeng 2010 ; 106:408-21 .
James E, Mills DR , Lee JM . Aumento de la produccin y recuperacin de extranjeros secretada
protenas a partir de cultivos de clulas vegetales utilizando un biorreactor de cromatografa de
afinidad .
Biochem Eng J 2002 ; 12:205-13 .
Jost W , Link S , V Horstmann , Decker EL, Reski R, Gorr G. Aislamiento y caracterizacin de
promotores adecuados para la expresin recombinante derivado de musgo tres beta- tubulina .
Curr Genet 2005 ; 47:111-20 .
Junker BH, Stanik M , Barna C , P Salmon , Buckland BC . Influencia del tipo de impulsor en la masa
transferir en recipientes de fermentacin . Bioprocesos Eng 1998 ; 19:403-13 .
Kaiser J. Es la sequa encima para pharming ? Ciencia 2008 ; 320:473-5 .
Karg SR , Kallio PT. La produccin de productos biofarmacuticos en sistemas de plantas .
Biotechnol
Adv 2009 ; 27:879-94 .
Kieran PM . Diseo de un biorreactor para cultivos en suspensin de clulas vegetales . En :
Vagabundo JMSCMMJ , editor.
Multifase Diseo biorreactor . Routledge, EE.UU. : Taylor & Francis Ltd; 2001 . P . 391-426 .
Kieran PM , MacLoughlin PF , Malone DM . Cultivos en suspensin de clulas de plantas : algunas
consideraciones de ingeniera. J Biotechnol 1997 ; 59:39-52 .
Kieran P , Malone D, MacLoughlin P. Efectos de las fuerzas hidrodinmicas y interfaciales en
sistemas de suspensin de clulas vegetales . Influencia del estrs sobre el crecimiento celular y el
producto
la formacin ; 2000 . P . 139-77 .
Kim NS , Kim TG , Kim OH , Ko EM , Jang YS , Jung ES , et al . Mejora de recombinante
produccin hGM -CSF por la supresin de la expresin gnica cistena proteinasa utilizando
La interferencia de ARN en una cultura del arroz transgnico . Plant Mol Biol 2008 ; 68:263-75 .
Komarnytsky S , Borisjuk N , N Yakoby , Garvey A , Raskin I. cosecrecin del inhibidor de la proteasa
estabiliza anticuerpos producidos por races de las plantas . Plant Physiol 2006 ; 141:1185-93 .
Lico C , Chen Q , Santi L. vectores virales para la produccin de protenas recombinantes en plantas
. J Cell
Physiol 2008 ; 216:366-77 .
Lienard D, Dinh OT , van Oort E, Van Overtvelt L , Bonneau C , Wambre E, et al.
Clulas de tabaco BY- 2 Suspensin - cultivadas producen y maduran inmunolgicamente
alrgenos de los caros del polvo domstico activos. Plant Biotechnol J 2007 ; 5:93-108 .
Liu C , Towler MJ , Medrano G, Cramer CL , Weathers PJ. Produccin de ratn interleucina -
12 es mayor en las races peludas tabaco cultivadas en un reactor de la niebla que en un reactor de
transporte areo .
BIOTECNOLO Bioeng 2009 ; 102:1074-86 .
Lucum A, Posten C. Establecimiento de cultivos de perfusin a largo plazo de recombinante
musgo en un fotobiorreactor tubular piloto. Procesar Biochem 2006 ; 41:2180-7 .
Lukjan S , Srinivasan V , Tous G, Parekh S , C Swindell , Horn M. La produccin a gran escala de
protenas farmacuticas que utilizan cultivos en suspensin de clulas vegetales . In Vitro Cell Dev.
Biol.
Anim 2007 ; 43: S50- 1 .
Maccarthy JJ, Ratcliffe D , Calle Excmo . El efecto de la composicin del medio nutriente en la
- ciclo de crecimiento de las clulas Catharanthus roseus G. Don crecidas en cultivo discontinuo . J
Exp Bot
1980 ; 31:1315-26 .
McDonald KA , Hong LM, Trombly DM , Xie Q , Jackman AP . Produccin de alfa - 1 - humana
antitripsina del cultivo de clulas de arroz transgnico en un biorreactor de membrana .
Biotechnol
Prog. 2005 ; 21:728-34 .
Medina- Bolvar F , C. Cramer Produccin de protenas recombinantes por races peludas
cultivadas
en biorreactores de la manga de plstico. Mtodos Mol Biol. 2004 ; 267:351-63 .
Meuwly F , Ruffieux PA, Kadouri A, von Stockar U. biorreactores con lecho empacado
formammalian
cultivo celular : bioprocesos y aplicaciones biomdicas. Biotechnol Adv 2007 ; 25:45-56 .
Micheletti M , Barrett T , Doig SD , Baganz F , Levy EM , Woodley JM , et al . Fluido de mezclado en
biorreactores agitados : implicaciones para las predicciones a escala -up de microlitro escala
microbiana y cultivos de clulas de mamferos. Chem. Eng. Sci. 2006a; 61:2939-49 .
Micheletti M , Barrett T , Doig SD , Baganz F , Levy EM , Woodley JM , et al . Fluido de mezclado en
biorreactores agitados : implicaciones para las predicciones a escala -up de microlitro escala
microbiana y cultivos de clulas de mamferos ; 2006b . p . 2939-49 .
Mishra BN , Ranjan R. crecimiento de los cultivos de races pilosas en varios biorreactores para la
la produccin de metabolitos secundarios . Biotechnol Appl Biochem 2008 ; 49:1-10 .
Namdev PK , Dunlop EH . Cortante sensibilidad de las clulas vegetales en suspensin - presente y
futuro . Appl Biochem Biotechnol 1995 ; 54:109-31 .
Osuna L , Moyano E, Mangas S , M Bonfill , Cusido RM, Pinol MT, et al. Inmovilizacin de
Suspensiones celulares de la planta glauca Galphimia para la produccin de cantidades
aumentadas de
Galphimine -B. Planta Med. 2008 ; 74:94-9 .
Qi HN, Goudar CT , Michaels JD, Henzler HJ , Jovanovic GN , Konstantinov KB .
Anlisis experimental y terico de la aireacin de la membrana tubular para los mamferos
biorreactores de clulas . BIOTECNOLO Prog 2003 ; 19:1183-9 .
Rao AQ , Bakhsh A, Kiani S , Shahzad K , Shahid AA , Husnain T , et al . El mito de la planta
transformacin . Adv Biotechnol 2009 ; 27:753-63 .
Estacas Ratner M. Pfizer una reclamacin en los productos biofarmacuticos de clulas hechas de
plantas. Nat. Biotechol
2010 ; 28:107-8 .
Cuervo N, Schillberg S , Kirchhoff J , J Brndli , Imseng N, Eibl R. Crecimiento de BY- 2 clulas en
suspensin
y la produccin planticuerpo en un solo uso de biorreactores . John Wiley & Sons , Inc ; 2010 .
Rawel HM , Kroll J , Kulling S. Efecto de los componentes no proteicos sobre la degradabilidad de
protenas . Biotechnol Adv 2007 ; 25:611-3 .
Leer EK , Parque JT , Shah RB , Riley BS, Brorson KA, Rathore AS. Proceso de anlisis
Tecnologa (PAT ) para los productos biofarmacuticos : Parte I. Conceptos y aplicaciones.
BIOTECNOLO Bioeng 2009 ; 105:276-84 .
Ritala A, Wahlstrm EH , Holkeri H , Hafren A, Mkelinen K , Baez J , et al . Produccin de un
protena recombinante industrial utilizando cultivos de clulas cebada . Protein Expr Purif
2008 ; 59:274-81 .
Sajc L , Grubisic D, Vunjak - Novakovic G. biorreactores para la ingeniera de la planta: una
perspectiva
para futuras investigaciones. Ingeniera Bioqumica Diario 2000 ; 4:89-99 .
Schiermeyer A, Schinkel H, Apel S , Fischer R, Schillberg S. Produccin de Desmodus
rotundus salival alfa1 del activador del plasmingeno ( DSPAalpha1 ) en el tabaco es
obstaculizado por proteolisis . BIOTECNOLO Bioeng 2005 ; 89:848-58 .
Schmale K, Rademacher T, Fischer R, Hellwig S. Hacia utilidad industrial - cryocell -
banca de transgnicos BY- 2 en cultivos celulares. J Biotechnol 2006 ; 124:302-11 .
Shaaltiel Y, Baum G, Bartfeld D, Hashmueli S , Lewkowicz A. Produccin de alta manosa
protenas en cultivo de plantas . Patente 20080038232. 2008 Estados Unidos.
Shaaltiel Y, Bartfeld D, Hashmueli S , Baum G, Brill - Almon E, Galili G, et al. Produccin de
glucocerebrosidasa con glicanos manosa terminales para la terapia de reemplazo enzimtico
de la enfermedad de Gaucher usando un sistema de clula de la planta . Plant Biotechnol J 2007 ;
5:579-90 .
Shadwick FS , Doran PM . La propagacin de virus de plantas en cultivos de races peludas : un
potencial
mtodo para la produccin in vitro de vacunas de eptopo y protenas extraas . Biotechnol
Bioeng 2007 ; 96:570-83 .
Shadwick FS , Doran PM . Expresin de la protena de Relaciones Exteriores mediante la
suspensin de clulas vegetales y peludo
cultivos de races , en la agricultura molecular : productos farmacuticos producidos por plantas y
tcnica
protenas . En : Fischer R, Schillberg S, editores. Wiley- CH Verlag GmbH & Co. KGaA,
Weinheim , RFA ; 2005 doi : . 10.1002/3527603638.ch2 .
409
Sharma AK, Sharma MK . Las plantas como biorreactores : desarrollos recientes y emergentes
oportunidades. Adv Biotechnol 2009 ; 27:811-32 .
Afilado JM, Doran PM . Caracterizacin de fragmentos de anticuerpos monoclonales producidos
por
clulas vegetales . BIOTECNOLO Bioeng 2001a; 73:338-46 .
Afilado JM, Doran PM . Estrategias para mejorar la acumulacin de anticuerpo monoclonal en
clula vegetal y cultivos de rganos . Biotechnol Prog 2001b ; 17:979-92 .
Shih SMH , Doran PM . La produccin de protenas de Relaciones Exteriores mediante clula
vegetal y cultivos de rganos :
ventajas y limitaciones. Adv Biotechnol 2009 ; 27:1036-42 .
Shin YJ , Hong SY, Kwon TH , Jang YS , Yang MS . Alto nivel de expresin de recombinante
factor de estimulacin de colonias de granulocitos y macrfagos humano en clulas de arroz
transgnico
cultivo en suspensin . BIOTECNOLO Bioeng 2003 ; 82:778-83 .
Smith ML , Mason SA , Shuler ML . Antgeno de superficie de la hepatitis B ( HBsAg ) en la
expresin
cultivo de clulas vegetales : cintica de la acumulacin de antgeno en cultivo discontinuo y su
forma intracelular . BIOTECNOLO Bioeng 2002 ; 80:812-22 .
SJ Streatfield . Enfoques para lograr la produccin de protena heterloga de alto nivel en
plantas . Plant Biotechnol J 2007 ; 5:2-15 .
Su WW, cultivo en perfusin de clulas Arias R. planta continua: caracterizacin biorreactor
y produccin de la enzima secretada . J Biosci Bioeng 2003 ; 95:13-20 .
Suehara KI , Takao S , Nakamura K, Uozumi N, Kobayashi T. expresin ptima de GUS
gen de metil jasmonato promotor inducible en la cultura alta densidad de
transformado lnea celular de tabaco BY- 2 . J Fermento Bioeng 1996 ; 82:51-5 .
Sunil Kumar GB, Ganapathi TR, Srinivas L , Revathi CJ, Bapat VA . Expresin de la hepatitis B
antgeno de superficie de la patata races peludas . Plant Sci. 2006 ; 170:918-25 .
Problemas Tanaka H. tecnolgicos en el cultivo de clulas de plantas en alta densidad ( reimpresos
de Biotecnologa y Bioingeniera , vol 23 , p 1203/18 , 1981 ) . Biotechnol
Bioeng 2000 ; 67:775-90 .
Terashima M , Ejiri Y, Hashikawa N, Yoshida H. La utilizacin de una alternativa de carbono
fuente para la produccin eficiente de alfa humano ( 1 ) - antitripsina por genticamente
ingeniera de cultivo de clulas de arroz . BIOTECNOLO Prog 2001 ; 17:403-6 .
Terrier B , D Courtois , Henault N , Cuvier A, Bastin M , Aknin A, et al . Dos nuevos desechable
biorreactores para cultivo de clulas vegetales : el biorreactor de olas y resaca y la babosa
biorreactor burbuja . BIOTECNOLO Bioeng 2007 ; 96:914-23 .
Travis J. Es la sequa encima para pharming ? Ciencia 2008 ; 320:473-7 .
Trexler MM , McDonald KA, Jackman AP . Produccin biorreactor de humano 1 - antitripsina
utilizando cultivos de clulas vegetales regulados metablicamente . BIOTECNOLO Prog 2002 ;
18:501-8 .
Trexler MM , McDonald KA, Jackman AP . Un proceso semicontinuo cclico para
produccin de alfa humano ( 1 ) - antitripsina mediante clula vegetal inducida metablicamente
cultivos en suspensin . BIOTECNOLO Prog 2005 ; 21:321-8 .
Tsoi BMY , Doran PM . Efecto de las propiedades medianas y aditivos para la estabilidad del
anticuerpo
y la acumulacin en cultivos de clulas vegetales en suspensin . Biotechnol Appl Biochem
2002 ; 35:171-80 .
Varley J , diseo de reactores de abedul J. para cultivo de clulas animales suspensin a gran
escala.
Cytotechnology 1999 ; 29:177-205 .
Wang PM , Huang conocimientos tradicionales, Cheng HP , Chien YH, Wu PESO . Un reactor de
transporte areo modificado con alta
capacidades de mezcla de lquido y la transferencia de masa . J. Chem. Eng. Jpn 2002 ; 35:354-9 .
Yin JC , Li GX, Ren XF , Herrler G. Seleccione lo que necesitan: una evaluacin comparativa de la
ventajas y limitaciones de los sistemas de expresin de uso frecuente para los extranjeros
genes. J Biotechnol 2007 ; 127:335-47 .
Zhiyu Z , Gerardo P , Paolo B, Anthony JS, Oliver G, Klavs FJ . Microbioreactors para
Bioprocesos Dev. 2007 ; 12:143-51 .
Zhong JJ . Ingeniera bioqumica de la produccin de secundaria especfica de la planta
metabolitos en cultivos en suspensin de clulas . Adv Biochem Eng Biotechnol 2001 ; 72:1-26 .